CN102604889B

CN102604889B - 适应无血清培养的hek293细胞系及其应用

Info

Publication number: CN102604889B
Application number: CN 201210071586
Authority: CN
Inventors: 仇华吉; 孙元
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-03-19
Filing date: 2012-03-19
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2032-03-19
Also published as: CN102604889A

Abstract

本发明公开了一种适应无血清培养的HEK293细胞系及其应用。本发明采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(293SF)，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5824。经检测293SF细胞具有稳定的腺病毒增殖能力与外源蛋白表达能力；平均病变时间为97小时，比HEK293细胞缩短12.9％；毒价达到10^7.48TCID₅₀/mL，比HEK293细胞提高43.3％；并且随着代数的提高稳定性良好，连续传16次后293SF细胞状态与易感性没有发生变化。此细胞系可用于腺病毒载体疫苗的无血清生产。

Description

适应无血清培养的HEK293细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及一种细胞系及其应用，特别涉及一种适应无血清培养的HEK293细胞系及其应用。属于生物技术领域。

发明背景

血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其组成成份包括碳水化合物、血浆蛋白、多肽、脂肪、生长因子、激素、无机物等，这些物质是通过促进细胞生长或抑制细胞生长活性从而达到生理平衡的。除此之外，血清还提供除营养物质外的激素、生长因子，转运大分子的结合蛋白以及能够促使细胞贴壁并免受机械损伤的促接触和伸展因子。

在常规细胞培养中，血清是一个不可或缺的成分，但仍存在一些问题。比如：成份复杂，不同批次之间差异明显；而且对于大多数细胞，血清不是它们在体内的常规内环境，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能会改变某种细胞在体内的正常状态。

无血清培养作为一种新兴的细胞大规模培养方案，在避免了上述采用有血清培养基培养的缺点的同时，并有一些新的特性，例如培养液成分明确，不同批次之间各成分含量没有差异等，这些特性提高了培养基的稳定性和实验数据的一致性，并简化了纯化和下游加工的过程；另外，无血清培养基不含动物源性大分子蛋白，避免了细胞水平和机体水平不必要的副作用(如疫苗过敏反应)。

重组腺病毒载体作为一种基因转移载体系统，具有安全、病毒增殖滴度高、基因转移效率高、宿主谱广等优点，在疫苗开发、基因治疗等方面得到广泛应用。但现行的腺病毒生产工艺存在产量低、纯化困难、依赖血清培养等缺点。

发明内容

为了解决以上问题，本发明发明人驯化了一株能高效包装腺病毒的无血清细胞系。本发明以HEK293细胞为原始材料，筛选了一株适应无血清培养的细胞系，并研究了其产毒性能和稳定性。

本发明的一株适应无血清培养的HEK293细胞系，其特征在于所述HEK293细胞系命名为293SF，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.5824，保藏日期为2012年2月29日。

本发明还提供了一种建立以上所述的HEK293细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)HEK293细胞进行适应培养前，采用10％FBS DMEM对其进行培养，细胞铺满培养瓶底面时用含0.25％EDTA的胰酶消化，1500r/min离心5min收集细胞，用适应液稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL，进入适应阶段；

(2)适应过程中采用培养液渐进替换的方法，按照以下步骤进行适应培养：

第1步：用含有25％的无血清培养基293 SFM II和75％的含10％牛血清DMEM培养基，传代2次；

第2步：用含有50％的293 SFM II培养基和50％的含10％牛血清DMEM培养基，传代2次；

第3步：用含有75％的293 SFM II培养基和25％的含10％牛血清DMEM培养基，传代3次；

第4步：用含有87.5％的293 SFM II培养基和12.5％的含10％牛血清DMEM培养基，传代3次；

第5步：用含有95％的293 SFM II培养基和5％的含10％的牛血清DMEM培养基，根据细胞状态，传代3～5次；

第6步：当第5步细胞生长快速、状态良好后，更换为100％的293 SFM II培养基传代，得到适应无血清培养的293SF细胞系。

在本发明的方法中，其特征在于在适应过程中，当细胞密度＞1×10⁶个细胞/mL时，以3×10⁵～5×10⁵个细胞/mL的细胞密度进行传代培养；完全更换为100％的293SFM II培养基后，当细胞密度达到1×10⁶～3×10⁶个细胞/mL时，以5×10⁵个细胞/mL的细胞密度进行传代培养。

在本发明的方法中，其特征在于处于适应初期的细胞传代时使用胰酶消化；当适应液中293 SFM II的比例达到95％时，停止使用胰酶，改用弯头吸管将细胞从培养瓶表面吹下。

在本发明的方法中，其特征在于所述方法还进一步包括待细胞适应无血清培养后，采用含有400mmol/L GlutaMAX-I的293 SFM II培养液在培养条件为37℃、8％CO₂的培养箱中培养。

本发明的HEK293细胞系(命名为293SF)可用于贴壁培养或悬浮培养。为促使细胞在无血清条件下贴壁，本发明在培养细胞前，使用多聚赖氨酸(PDL)处理细胞培养瓶，具体操作如下：用去离子水配制的PBS缓冲液稀释多聚赖氨酸至0.1mg/ml，经0.22μm滤膜过滤备用；将2ml多聚赖氨酸稀释液加入细胞培养瓶中，摇动培养瓶使液体铺满瓶底，放入37℃培养箱中孵育6小时后取出；处理过的培养瓶即可用于所述的HEK293细胞系的培养；

用于悬浮培养时，可直接将细胞置于未经任何处理的培养瓶中培养。

进一步的，本发明还公开了所述的HEK293细胞系在表达外源蛋白中的应用。及所述的HEK293细胞系在培养腺病毒疫苗载体中的应用。

本研究采用目前较为成熟的商品化培养基加以渐进替换法驯化HEK293细胞，最大限度地减少了培养条件对细胞的冲击，对保持细胞株活性、降低细胞株变异有重要作用。由于无血清培养的HEK293细胞具有悬浮生长的特征，难以快速区分正常细胞与病变细胞，因此本实验采用PDL处理过的培养瓶培养使无血清细胞贴壁，使细胞贴壁生长，以提高病毒毒价测定数据的准确性。

目前市售用于无血清培养的293细胞系有多种，如GIBOC 293F、HEK-293N3S。本发明中驯化无血清细胞的原材料(HEK293细胞系)与以上商品化无血清细胞系相同，通过改进驯化工艺和方法获得了本细胞系，本发明的细胞系具有商品化细胞系的稳定性和实用性，同时也为后期实验节约了资金，降低了疫苗的生产成本。

GIBOC 293F所使用的293F细胞是HEK293细胞的一个亚群，而本细胞系是采用HEK293细胞系直接驯化而来；HEK-293 N3S细胞系在国内应用较少，多采用灌流培养，而灌流培养对设备和人员要求较高，成本也较大；本研究建立的无血清HEK293细胞系能以贴壁或悬浮状态的方式生长，是目前商品化细胞系所没有达到的。贴壁生长的特性有利于提高腺病毒包装效率，悬浮生长的特性有利于腺病毒载体疫苗的大规模生产。

由于无血清培养基中不含球蛋白、抗体等干扰腺病毒感染的组分，本研究方案降低了腺病毒的不必要损耗。病变时间由110小时缩短到97小时，同时产率平均提高了43.3％，可降低腺病毒疫苗的生产成本，同时为腺病毒疫苗生产和加工提供了便利条件。

另外由于高滴度接种腺病毒会引起细胞快速裂解死亡，细胞中大部分未成熟的病毒粒子未能组装成为具有感染性的完整病毒粒子，这样可导致毒价下降，影响结果准确性；因此本研究采用低感染复数腺病毒接种，在细胞病变初期采用IFA方法测定外源蛋白表达情况，这样既能避免腺病毒裂解作用对实验结果的影响，也能直观的对比腺病毒增殖对数期的蛋白表达情况。

无血清细胞培养技术一般应用于灌注培养、生物反应器等大规模培养方案，本研究建立的无血清细胞系能够用于较大规模培养，并评价所生产的腺病毒载体疫苗。

附图说明

图1为完全适应无血清培养的细胞的生长状态；

A：293SF细胞；B：HEK293细胞

图2为腺病毒在两种细胞中分别连续传代16次后各代的毒价测定；

图3为不同细胞感染重组腺病毒后的目的蛋白表达情况。

A：感染rAdV-SFV-E2的HEK293细胞；B：感染rAdV-SFV-E2的293SF细胞；C：未感染的293SF细胞

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围之内。

实施例1

1材料与方法

1.1细胞、抗体、培养基、病毒和其它材料

HEK293细胞系由本实验室保存提供；抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体HQ06为本实验室制备；无血清培养液293 SFM II、DMEM、犊牛血清(FBS)、GlutaMAX^TM-1均购自Life Technology公司；细胞培养耗材均购自Corning公司；多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PDL)购自Sigma公司；rAdV-SFV-E2为携带甲病毒复制子载体、表达猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒，具体构建过程记载在申请日为2010年9月30日，申请号为201010297576.0，发明名称为“腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用”的专利文献中。

1.2培养方法

细胞进行适应培养前，采用10％FBS DMEM对其进行培养，细胞铺满细胞培养瓶底面时用含0.25％EDTA的胰酶消化，1500r/min离心5min收集细胞，用适应液稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL，进入适应阶段。

适应过程中采用培养液渐进替换的方法，按照表格中所给出的适应液配比和传代次数进行适应培养。处于适应初期的细胞传代时使用胰酶消化；当适应液中293SFM II的比例达到95％时，停止使用胰酶，改用弯头吸管将细胞从培养瓶表面吹下。

适应过程中，当细胞密度＞1×10⁶个细胞/mL时，以3×10⁵个细胞/mL到5×10⁵个细胞/mL的细胞密度进行传代培养。完全更换为无血清培养基后，当细胞密度达到1×10⁶个细胞/mL到3×10⁶个细胞/mL时，以5×10⁵个细胞/mL的细胞密度进行传代培养。

待细胞完全适应无血清培养后，采用含有400mmol/L GlutaMAX-I的293 SFM II培养液进行培养，培养液在37℃、8％CO₂培养箱中保存备用。

本实验采用分步适应的方法，使HEK293细胞适应无血清培养条件，具体步骤如下：首先配制10％FBS DMEM作为正常细胞生长液。然后用10％FBS DMEM和293SFM II混合配制细胞适应液，并用不同配比的适应液培养数代细胞(表1)。

表1适应液的配比及培养代数

在适应过程中，视细胞密度确定传代时间。细胞处于贴壁生长状态，前四个适应梯度的传代均使用胰酶消化，从第五个梯度开始停用胰酶，改用弯头吸管将细胞从培养瓶表面吹下。

待细胞完全适应无血清培养后，使用以下方法传代细胞：用细胞计数板对台盼蓝染色后的细胞进行计数，当细胞密度达到1.5×10⁶个细胞/mL时进行传代，将细胞培养液倒入50mL离心管中，100×g离心5min，去除原有培养液，用培养液稀释至2.5～3.0×10⁵个细胞/mL，并分装至培养瓶中，于37℃，8％CO₂培养箱中培养。

1.3培养条件的优化

1.3.1多聚赖氨酸(Poly-D-lysine，PDL)促使适应无血清培养的细胞贴壁

用去离子水配制的PBS缓冲液稀释PDL至0.1mg/mL，经0.22μm滤膜过滤备用；将2mL稀释液加入细胞培养瓶中，摇动培养瓶使液体铺满瓶底，放入37℃培养箱中孵育6h后取出，回收用过的PDL稀释液；处理过的培养瓶密封瓶口后放入4℃冰箱保存。

1.3.2使用谷氨酰胺替代物代替谷氨酰胺

以400mmol/L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAX^TM-1)代替L-谷氨酰胺加入培养液中，配好的培养液在37℃，8％CO₂培养箱中保存。

1.4细胞系鉴定

1.4.1形态学观察

每代细胞传代24h后观察细胞是否贴壁和生长状态。

1.4.2细胞稳定性

细胞连续传代16次，72h时观察细胞形态、密度，并接毒进行病毒培养，72h后收获病毒，并用有限稀释法测定病毒滴度。

1.4.3接毒后外源蛋白的表达

将适应无血清培养的HEK293细胞(称之为293SF)和普通HEK293细胞分别铺6孔板，铺板时适当提高293SF的初密度，以使两种细胞生长速度同步；生长36h后接种10⁴TCID₅₀/mL重组腺病毒rAdV-SFV-E2，继续培养48h后收获细胞，用4％甲醛固定20min，0.2％TritonX100透膜10min；加入抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体HQ06，室温孵育1h；再加入FITC标记的羊抗鼠IgG(Sigma，1∶100)室温孵育1h；置荧光显微镜下观察。

2结果

2.1适应无血清培养的293SF细胞的形态学

从Step1 F1代开始，每代细胞传代24h后使用显微镜观察细胞形态和生长状态的变化。Step1 F1至Step4 F3细胞逐渐收缩变圆，转变为半贴壁状态，细胞分裂减慢，平均传代时间由48h延长至96h；待到Step5F2时，细胞开始变为悬浮状态；去除血清和DMEM成分后细胞生长速度加快，平均传代时间达到72h左右，单个细胞呈透明圆形，胞质清亮，静止培养时呈现细胞团状，且始终悬浮于培养液中。完全适应无血清培养的细胞的生长状态如图1所示。

2.2细胞稳定性

细胞连续传代16次，72h时观察细胞形态、密度。取每代细胞，按照之前方法测定毒价(图2所示)，期间统计完全病变所需时间。使用普通HEK293细胞培养，110.30±10.70h病变完全，毒价为10^7.32±0.54TCID₅₀/mL；使用适应无血清培养的293SF细胞培养，97.00±11.50h细胞病变完全，毒价为10^7.48±0.71TCID₅₀/mL。293SF细胞增殖腺病毒的能力较普通HEK293细胞提高43.3％，且平均生产时间降低了12.9％。腺病毒在两种细胞中分别连续传代16次后各代的毒价测定结果如图2所示。

2.3蛋白表达情况

将接种rAdV-SFV-E2 48h后的293SF和HEK293细胞收获，用IFA检测E2蛋白表达情况(图3所示)。可见293SF细胞系在支持病毒复制的同时仍具有对外源蛋白的表达能力。

Claims

1.一株适应无血清培养的HEK293细胞系，命名为293SF，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5824。

2.培养权利要求1所述的HEK293细胞系的方法，其特征在于，所述的方法分为贴壁培养和悬浮培养两种；

用于贴壁培养时，在培养细胞前，使用多聚赖氨酸处理细胞培养瓶促使适应无血清培养的细胞贴壁，具体操作如下：用去离子水配制的PBS缓冲液稀释多聚赖氨酸至0.1mg/ml，经0.22μm滤膜过滤备用；将2ml多聚赖氨酸稀释液加入细胞培养瓶中，摇动培养瓶使液体铺满瓶底，放入37℃培养箱中孵育6小时后取出，处理后的培养瓶即可用于所述的HEK293细胞系的培养；

用于悬浮培养时，直接将细胞置于未经任何处理的培养瓶中培养。

3.权利要求1所述的HEK293细胞系在表达外源蛋白中的应用。

4.权利要求1所述的HEK293细胞系在培养腺病毒疫苗载体中的应用。