CN103468638B - 一种293细胞的大规模悬浮培养方法 - Google Patents

一种293细胞的大规模悬浮培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种293细胞的大规模悬浮培养方法，该方法先在T形组织培养瓶中对293细胞种子进行传代扩增，再转移到搅拌式细胞培养瓶中进一步传代扩增，而后转移到5L容积生物反应器中进行培养，而后将培养得到的细胞转移接种至250L容积生物反应器中进行培养，过程中定期补加新鲜培养基用于维持培养环境适宜细胞生长。本发明提供的技术方案填补了293细胞悬浮培养技术的技术空白，所选培养条件适于293细胞生长，实现了细胞培养密度的最大化，减少了细胞培养的体积，减少了后续的劳动强度，质量均一稳定，生产过程衔接紧密，易操控。本发明在细胞培养和病毒增殖过程中进行补液，保证了细胞增殖所需的营养物质，又提高了营养液的利用率，节约成本。

Description

一种293细胞的大规模悬浮培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种293细胞的大规模悬浮培养方法。
背景技术
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMasterUniversity的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293细胞属于贴壁细胞系，在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中，
现有技术中，实验证实细胞传代次数过多对293细胞单层培养方式下细胞的生长以及腺病毒载体的表达量产生了明显的影响，但是对于悬浮培养方式下293细胞的生长以及腺病毒载体的表达量确没有影响，但是现有技术针对293细胞悬浮培养工艺鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种利用生物反应器大规模悬浮培养293细胞的方法。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种293细胞的大规模悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取出293细胞，先在T形组织培养瓶中传代扩增，再转移到搅拌式细胞培养瓶中进一步传代扩增，而后转移到小规模反应器中进行培养，而后将培养得到的细胞用于下级培养的种子细胞；
2）将步骤1）得到的用于下级培养的种子细胞的用胰蛋白酶消化液消化，用无血清293SFMII培养基悬浮培养制成细胞悬液，按一定的细胞密度接种到生物反应器调整培养条件为：培养温度在36-38℃；pH维持在7.0-7.4之间；溶氧浓度在40%-50%之间；搅拌速度在100-135rpm之间，在培养的第1-3天搅拌速度设置为100-120rpm，自培养第4天开始在110-135rpm的范围内逐步提高搅拌速度持续培养；
3）培养过程中每24小时补充步骤2）中无血清293SFMII培养基总量20%（v/v）的新鲜无血清293SFMII培养基。
上述技术方案中，步骤1）所述293细胞种子在接种到T形组织培养瓶中之前先进行驯化培养；所述生物反应器为自动控温搅拌罐式反应器；步骤2）所述的细胞接种密度分别优选为0.5×106-1.5×106个/ml和0.6×106个/ml；步骤2）所述的培养温度优选为37℃；步骤2）所述的pH值优选为7.2；步骤2）所述的溶氧浓度优选为45%；步骤2）所述的第1-3天搅拌速度设置为110rpm。
本发明提供的技术方案填补了293细胞悬浮培养技术的技术空白，所选培养条件适于293细胞生长，实现了细胞培养密度的最大化，减少了细胞培养的体积，减少了后续的劳动强度，质量均一稳定,生产过程衔接紧密，易操控。本发明在细胞培养和病毒增殖过程中进行补液，保证了细胞增殖所需的营养物质，又提高了营养液的利用率，节约成本。
具体实施方式
实施例1
5L生物反应器：Biostat公司生产，低剪切桨式搅拌器，旋转滤器（Spinfilter）和无气泡通气系统，以及中空纤维培养系统（强化元件）；温度、PH、搅拌、溶氧PID全自动控制，四气混合控制供气系统，融氧双参数关联、回收液流速。
250L生物反应器：Biostat公司生产,低剪切桨式搅拌器，旋转滤器（Spinfilter）和无气泡通气系统，以及中空纤维培养系统（强化元件）；温度、PH、搅拌、溶氧PID全自动控制，四气混合控制供气系统，融氧双参数关联、回收液流速。
细胞系：HEK-293sus细胞，购自中科院上海细胞所；293SFMII培养基自市面购得。
1.1HEK-293细胞的驯化培养
1.1.1HEK-293细胞的全悬浮驯化培养
1）接种HEK-293细胞于含10mlDMEM完全培养基的10cm培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中培养2天达到100%汇合状态；
2）弃除培养基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293细胞消化脱离培养皿表面，然后加入3mlDMEM完全培养基终止胰酶消化；
3）将上述消化后的细胞用移液管吸取，并转移到15ml的尖底离心管中，1000rpm离心1min，沉降收集HEK-293细胞，并用10mlDMEM完全培养基重悬收集的细胞，再将全部细胞接种于培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中；
4）步骤3）中放入培养箱中的细胞每培养2天重复步骤2）和3），重复7-11次，直至培养皿中同时出现贴壁细胞和悬浮生长的细胞团；吸取及转移过程中注意勿打散细胞团；
5）将最后一次培养的全部细胞消化后转移至摇瓶中培养，每两天按照0.5×106/ml传代一次，每次传代均用0.25%胰酶EDTA消化细胞团至分散状态，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得可连续传代95-105代，并可达到最高密度1.3×107/ml的，适应10%FBSDMEM培养基悬浮培养的HEK-293细胞，命名该悬浮培养细胞为HEK-293sus细胞，以4×106/ml密度冻存即可。
1.1.2对上述驯化后的HEK-293sus悬浮细胞的无血清驯化
1）用含10%FBS的DMEM培养基于培养皿中培养细胞至密度为1.2×106/ml，活力95%以上，收集细胞于离心管中，于1000rpm离心2min沉降，留沉淀；
2）用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，并在此过程中震荡离心管，使细胞均匀分布；
3）加入5ml含10%FBS的DMEM培养基终止胰酶消化作用，并重悬步骤2）得到的HEK-293s细胞，按照0.5×106/ml传代；
4）每两天重复步骤1）至步骤3）一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
5）分步将DMEM培养基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%、1%，重复步骤1）至步骤3），每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得适应1%FBSDMEM培养基悬浮培养的HEK-293细胞；
6）将适应1%FBSDMEM培养基悬浮培养的HEK-293S细胞每两天按照0.5×106/ml传代一次，扩大培养到50ml培养体积，至两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
7）对适应1%FBSDMEM培养基悬浮培养的HEK-293s细胞进行70μm细胞筛过滤处理，观察并记录过滤后的HEK-293s细胞团数量及大小；
8）传代步骤7）中过滤后的HEK-293S细胞于含25%293SFMII及75%DMEM的混合培养基中，该DMEM中含1.0%FBS，每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力90%以上；
9）按照50%、75%和100%的比例增加混合培养基中293SFMII的比率，增加293SFMII比率的同时按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培养基中DMEM中的FBS含量，用此混合培养基依次传代培养步骤8）所得的HEK-293sus细胞，直至所述的HEK-293sus细胞于含100%293SFMII且无FBS存在的培养基中培养两天后能达到1.2×106/ml细胞密度，活力90%以上，且细胞无结团现象；
10）以4×106/ml密度冻存步骤9）得到的适应100%293SFMII悬浮培养生长条件的HEK-293sus于-80℃医用低温冰箱中，次日转移冻存管至液氮罐中保存。
1.2HEK-293细胞的大规模悬浮培养
1）取以上步骤得到的处于冻存状态的HEK-293sus细胞作为293细胞种子，将冷冻管直接投入37℃温水，不时摇动令其尽快融化，解冻1分钟；取出冷冻管，用酒精消毒后打开管盖，吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，再用培养液重复洗一次；用培养液10倍稀释后，接种T形组织培养瓶中，细胞密度为0.2×106cells/ml。置于37℃、5%CO2条件下培养，观察细胞生长状态。
24h后按照1:2的比例转移至搅拌式细胞培养瓶扩大培养，每个方瓶培养体积为15ml；待组织培养瓶培养体积达到200ml时，接种至1L摇瓶中；将200ml方瓶培养中的HEK-293S细胞经0.25%胰酶消化后，用293FFreestyleSFM培养基分散并调整细胞密度为0.6×106cells/ml，第1～2天搅拌速度40r/min，自培养第3天起搅拌速度为60r/min，置于37℃、5%CO2条件下扩大培养。
按照规程完成生物反应器的安装、校准和灭菌消毒，连接搅拌电极、pH电极导线、融氧电极导线、温度探头、收液瓶、取样管等，检查无误后，开机；
按照标准操作规程补充灌流培养基约2L进入5L生物反应器内，开机运行48小时，观察温度、搅拌速度、pH、融氧等各项参数稳定状况；
接种细胞，待细胞转瓶体积至800ml，细胞密度达到0.6×106cells/ml时，接种到5L生物反应器中，起始培养体积约3.5L。
设置起始培养条件：温度37℃；pH7.2；融氧控制40%；搅拌速度100rpm。培养72小时，至细胞密度达到1.2×106cells/ml。
2）用0.25%胰酶消化罐内细胞，制得细胞悬液，接种至250L生物反应器，起始培养体积75L。
设置起始培养条件：温度37℃；pH7.2；融氧控制40%；搅拌速度110rpm，培养72小时，至细胞密度达到2.1×106cells/ml。
3）自培养第4天起灌流培养补液加入24L的无血清培养基，提高搅拌速度至115rpm，培养24小时，再此补充培养基19.5L，提高搅拌速度至120rpm，培养48小时至细胞密度达到3.3×106cells/ml，收获细胞悬液。
实施例2
5L生物反应器：Biostat公司生产，低剪切桨式搅拌器，旋转滤器（Spinfilter）和无气泡通气系统，以及中空纤维培养系统（强化元件）；温度、PH、搅拌、溶氧PID全自动控制，四气混合控制供气系统，融氧双参数关联、回收液流速。
250L生物反应器:Biostat公司生产,低剪切桨式搅拌器，旋转滤器（Spinfilter）和无气泡通气系统，以及中空纤维培养系统（强化元件）；温度、PH、搅拌、溶氧PID全自动控制，四气混合控制供气系统，融氧双参数关联、回收液流速。
细胞系：HEK-293sus细胞，购自中科院上海细胞所；293SFMII培养基自市面购得。
2.1HEK-293细胞的驯化培养
2.1.1HEK-293细胞的全悬浮驯化培养
1）接种HEK-293细胞于含10mlDMEM完全培养基的10cm培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中培养2天达到100%汇合状态；
2）弃除培养基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293细胞消化脱离培养皿表面，然后加入3mlDMEM完全培养基终止胰酶消化；
3）将上述消化后的细胞用移液管吸取，并转移到15ml的尖底离心管中，1000rpm离心1min，沉降收集HEK-293细胞，并用10mlDMEM完全培养基重悬收集的细胞，再将全部细胞接种于培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中；
4）步骤3）中放入培养箱中的细胞每培养2天重复步骤2）和3），重复7-11次，直至培养皿中同时出现贴壁细胞和悬浮生长的细胞团；吸取及转移过程中注意勿打散细胞团；
5）将最后一次培养的全部细胞消化后转移至摇瓶中培养，每两天按照0.5×106/ml传代一次，每次传代均用0.25%胰酶EDTA消化细胞团至分散状态，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得可连续传代95-105代，并可达到最高密度1.3×107/ml的，适应10%FBSDMEM培养基悬浮培养的HEK-293细胞，命名该悬浮培养细胞为HEK-293sus细胞，以4×106/ml密度冻存即可。
2.1.2对上述驯化后的HEK-293sus悬浮细胞的无血清驯化
1）用含10%FBS的DMEM培养基于培养皿中培养细胞至密度为1.2×106/ml，活力95%以上，收集细胞于离心管中，于1000rpm离心2min沉降，留沉淀；
2）用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，并在此过程中震荡离心管，使细胞均匀分布；
3）加入5ml含10%FBS的DMEM培养基终止胰酶消化作用，并重悬步骤2）得到的HEK-293s细胞，按照0.5×106/ml传代；
4）每两天重复步骤1）至步骤3）一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
5）分步将DMEM培养基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%、1%，重复步骤1）至步骤3），每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得适应1%FBSDMEM培养基悬浮培养的HEK-293细胞；
6）将适应1%FBSDMEM培养基悬浮培养的HEK-293S细胞每两天按照0.5×106/ml传代一次，扩大培养到50ml培养体积，至两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
7）对适应1%FBSDMEM培养基悬浮培养的HEK-293s细胞进行70μm细胞筛过滤处理，观察并记录过滤后的HEK-293s细胞团数量及大小；
8）传代步骤7）中过滤后的HEK-293S细胞于含25%293SFMII及75%DMEM的混合培养基中，该DMEM中含1.0%FBS，每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力90%以上；
9）按照50%、75%和100%的比例增加混合培养基中293SFMII的比率，增加293SFMII比率的同时按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培养基中DMEM中的FBS含量，用此混合培养基依次传代培养步骤8）所得的HEK-293sus细胞，直至所述的HEK-293sus细胞于含100%293SFMII且无FBS存在的培养基中培养两天后能达到1.2×106/ml细胞密度，活力90%以上，且细胞无结团现象；
10）以4×106/ml密度冻存步骤9）得到的适应100%293SFMII悬浮培养生长条件的HEK-293sus于-80℃医用低温冰箱中，次日转移冻存管至液氮罐中保存。
2.2HEK-293细胞的大规模悬浮培养
1）取以上步骤得到的处于冻存状态的HEK-293sus细胞作为293细胞种子，先在T形组织培养瓶中传代扩增，再转移到搅拌式细胞培养瓶中进一步传代扩增，而后转移到5L容积生物反应器中进行培养，而后挑选形态健康、生长良好的细胞用于下级培养的种子细胞；
2）用0.25%胰酶消化上述下级培养的种子细胞，制得细胞悬液，接种至250L生物反应器，起始培养体积75L；
设置起始培养条件：温度36℃；pH7.1；溶氧控制45%；搅拌速度115rpm，培养72小时，至细胞密度达到2.1×106cells/ml。
3）自培养第4天起灌流培养补液加入24L的无血清培养基，提高搅拌速度至115rpm，培养24小时，再此补充培养基19.5L，提高搅拌速度至120rpm，培养48小时至细胞密度达到3.3×106cells/ml，收获细胞悬液。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种293细胞的大规模悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取293细胞种子，先进行驯化培养，而后在T形组织培养瓶中传代扩增，再转移到搅拌式细胞培养瓶中进一步传代扩增，而后转移到5L容积自动控温搅拌罐式反应器中进行培养，而后将培养得到的细胞作为用于下级培养的种子细胞；
2)将步骤1)得到的用于下级培养的种子细胞用胰蛋白酶消化液消化，用无血清293SFMII培养基悬浮培养制成细胞悬液，按一定的细胞密度接种到自动控温搅拌罐式反应器调整培养条件为：培养温度在36-38℃；pH维持在7.0-7.4之间；溶氧浓度在40％-50％之间；搅拌速度在100-135rpm之间，在培养的第1-3天搅拌速度设置为100-120rpm，自培养第4天开始在110-135rpm的范围内逐步提高搅拌速度持续培养；
3)培养过程中每24小时补充步骤2)中无血清293SFMII培养基总量20％(v/v)的新鲜无血清293SFMII培养基，直至培养结束。
2.根据权利要求1所述的一种293细胞的大规模悬浮培养方法，其特征在于步骤2)所述的细胞接种密度为0.5×106-1.5×106个/ml。
3.根据权利要求1所述的一种293细胞的大规模悬浮培养方法，其特征在于步骤2)所述的培养温度为37℃。
4.根据权利要求1所述的一种293细胞的大规模悬浮培养方法，其特征在于步骤2)所述的pH值为7.2。
5.根据权利要求1所述的一种293细胞的大规模悬浮培养方法，其特征在于步骤2)所述的溶氧浓度为45％。
6.根据权利要求1所述的一种293细胞的大规模悬浮培养方法，其特征在于步骤2)所述的第1-3天搅拌速度设置为110rpm。
7.根据权利要求4所述的一种293细胞的大规模悬浮培养方法，其特征在于步骤2)所述的细胞接种密度为0.6×106个/ml。
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