CN107517853A - 一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法 - Google Patents

一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107517853A
CN107517853A CN201710919591.6A CN201710919591A CN107517853A CN 107517853 A CN107517853 A CN 107517853A CN 201710919591 A CN201710919591 A CN 201710919591A CN 107517853 A CN107517853 A CN 107517853A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tissue culture
seedling
blueberry
culture seedling
blueberry tissue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710919591.6A
Other languages
English (en)
Inventor
宗树斌
王永平
顾立新
陈少卿
刘春风
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Original Assignee
Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry filed Critical Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority to CN201710919591.6A priority Critical patent/CN107517853A/zh
Publication of CN107517853A publication Critical patent/CN107517853A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，包括如下步骤：将第5代继代蓝莓组培苗装入盛有培养液的容器，放入摆动式间歇浸没生物反应器中，设定摇摆角度、摇摆频率及浸没时间进行增殖。本发明的显著优点为：通过采用第5代蓝莓组培苗、调配营养液、设定摇摆角度、摇摆频率及浸没时间，协同作用下，能够有效提高蓝莓组培苗的增殖系数，其为传统固体培养的3‑6倍，且性状稳定、生长快，组培苗60天后，苗高平均能够达到5.6cm，叶片数达到7.8片，生长健壮，起到壮苗的作用。

Description

一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的 方法
技术领域
本发明属于蓝莓组培苗增殖领域，尤其涉及一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法。
背景技术
蓝莓主产于北美和我国长白山与大小兴安岭地区，因富含花青苷、多糖等功能性物质，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。我国蓝莓栽培技术始于20世纪末，因为蓝莓对生长条件要求比较苛刻，苗木繁殖又比较难，使得蓝莓的发展受到限制。
我国蓝莓从20世纪80年代中期开始引种，随着经济社会发展，人民生活水平的提高，蓝莓作为高档健康水果，越来越受到人们的青睐，种植面积也日益扩大，种苗生产供不应求。常规的扦插繁殖已不能满足市场对种苗的需求，目前优质蓝莓种苗的繁育主要通过组织培养技术进行工厂化生产。蓝莓组织培养多采用固体培养的方式，此技术在培养操作过程中需要大量的手工劳动，增殖率较低，是一种劳动密集型技术，且技术操作复杂，自动化半自动化程度低，消耗营养物质多，生成成本也较高。间歇浸没式液体培养技术是一种最新型的组织培养技术，它的出现逐渐克服了这些局限。国外在20世纪80年代就开始了该项技术的研究，目前技术已经成熟，大规模用于农、林业和食品等产业中。而国内相关研究起步较晚，近些年来发展较快，利用该技术扩繁的植物种类逐渐增多，推动了国内一些经济作物优质种苗的大规模生产。
液体间歇浸没培养技术，即间歇浸没式生物反应器培养系统(TemporaryImmersion Bioreactors system简称TIBs)在无菌环境下，将培养材料在培养液中进行周期性的浸泡培养，达到快速繁殖的目的。这种培养方式不仅使植物组织与液体培养基紧密接触，从而刺激和促进外植体对营养元素和植物激素的吸收，而且因为介质的间歇及连续振动避免液体培养基氧气的欠缺，使培养的组培苗有更高的增殖率。同时这种培养方式减少培养环节，降低人工耗费和生产成本。
江苏农林职业技术学院从2010年开始对TIBs进行了引进吸收研究，经过不断改进，研发出新型摇摆式间歇浸没生物反应器(the Swinging type Temporary ImmersionBioreactors system简称S-TIBs)(专利号CN201220094482.8)。该反应器通过摆动架的倾斜摆动，实现了培养架上成排的容器轴向倾斜摇动，容器内的培养液周期性地翻动间歇浸没植物组织，具有结构简单、容量大、繁殖效率高、自动化程度高等特点，可连续高效地进行植物组培的生产。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种利用新型培养装置进行蓝莓组培苗增殖培养的方法，该方法能够有效提高蓝莓组培苗的增殖系数。
技术方案：本发明采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，包括如下步骤：将蓝莓组培苗装入盛有培养液的容器，放入摆动式间歇浸没生物反应器中，设定摇摆角度42-48°，摇摆频率1次/5-7h，浸没时间25-35s/次进行增殖。
优选的，摇摆角度可为45°；摇摆频率可为6h/次。浸没时间可为30s/次。
进一步说，本发明采用的蓝莓组培苗为第5代继代组培苗。培养液包括1/2WPM、25～35g/L蔗糖及6-BA 400～600mg/L。容器中盛有的培养液的体积为200-300ml。容器中的蓝莓组培苗为55-65棵。
有益效果：与现有技术相比，显著优点为：本发明建立了蓝莓组培苗的S-TIBs增殖技术体系，通过采用第5代蓝莓、调制营养液及容积，同时设定摇摆角度、摇摆频率及浸没时间，协同作用下，能够有效提高蓝莓组培苗的增殖系数，其为传统固体培养的3-4倍，且性状稳定、生长快，组培苗60天后，苗高平均能够达到5.6cm，叶片数达到7.8片，生长健壮，起到壮苗的作用，为蓝莓种苗的高效工厂化育苗提供实验数据，促进新型组培育苗系统的推广及应用；同时，该增殖方法的外植体处理简单，效率高、速度提高2倍以上。
附图说明
图1为本发明蓝莓组培苗增殖图；
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
本发明采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择
选择利用固体培养基培养的生长健壮的第5代蓝莓无菌继代苗作为增殖培养的外植体，在无菌操作台上用剪刀剪去顶端较幼嫩部分，减掉底部的愈伤组织。
(2)营养液配制及灭菌
按照1/2WPM+30.0g/L蔗糖+6-BA 500mg/L配方配制培养液，调整pH5.1～5.3，装入长×宽×高为25cm×12cm×13.5cm的长方形大瓶容器内进行灭菌处理，每瓶250ml，横放。
(3)外植体处理及接种
将处理过的外植体平放到超净工作台上放入大瓶容器内，培养中的蓝莓组培苗为60棵。蓝莓外植体平放到容器内，每个腋芽都能分化出一棵幼苗，繁殖系数高，为传统插在固体培养基上的3-4倍。
(4)增殖培养
把容器放到摇摆培养架上，设定培养参数为摇摆角度45°，摇摆频率6h/次，浸没时间30s/次，在培养温度(25±1)℃，光照强度36～54μmol·m-2·s-1，光周期12h光照/12h黑暗条件下进行增殖培养。通过液体间歇浸没，外植体获得充分氧气，从而生长速度快，新分化的幼苗60天后平均能够达到5.6cm，叶片数达到7.8片，培育后的蓝莓增殖苗如图1所示。
实施例2
本发明采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择
选择利用固体培养基培养的生长健壮的第5代蓝莓无菌继代苗作为增殖培养的外植体，在无菌操作台上用剪刀剪去顶端较幼嫩部分，减掉底部的愈伤组织。
(2)营养液配制及灭菌
按照1/2WPM+25.0g/L蔗糖+6-BA 400mg/L配方配制培养液，调整pH5.1～5.3，装入长×宽×高为25cm×12cm×13.5cm的长方形大瓶容器内进行灭菌处理，每瓶200ml，横放。
(3)外植体处理及接种
将处理过的外植体平放到超净工作台上放入大瓶容器内，培养中的蓝莓组培苗为55棵。蓝莓外植体平放到容器内，每个腋芽都能分化出一棵幼苗，繁殖系数高，是传统插在固体培养基上的3-4倍。
(4)增殖培养
把容器放到摇摆培养架上，设定培养参数为摇摆角度42°，摇摆频率7h/次，浸没时间25s/次，在培养温度(25±1)℃，光照强度36～54μmol·m-2·s-1，光周期12h光照/12h黑暗条件下进行增殖培养。通过液体间歇浸没，外植体获得充分氧气，从而生长速度快，新分化的幼苗60天后平均能够达到5.6cm，叶片数达到7.8片。
实施例3
本发明采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择
选择利用固体培养基培养的生长健壮的第5代蓝莓无菌继代苗作为增殖培养的外植体，在无菌操作台上用剪刀剪去顶端较幼嫩部分，减掉底部的愈伤组织。
(2)营养液配制及灭菌
按照1/2WPM+35.0g/L蔗糖+6-BA 600mg/L配方配制培养液，调整pH5.1～5.3，装入长×宽×高为25cm×12cm×13.5cm的长方形大瓶容器内进行灭菌处理，每瓶300ml，横放。
(3)外植体处理及接种
将处理过的外植体平放到超净工作台上放入大瓶容器内，培养中的蓝莓组培苗为65棵。蓝莓外植体平放到容器内，每个腋芽都能分化出一棵幼苗，繁殖系数高，是传统插在固体培养基上的3-4倍。
(4)增殖培养
把容器放到摇摆培养架上，设定培养参数为摇摆角度48°，摇摆频率5h/次，浸没时间35s/次，在培养温度(25±1)℃，光照强度36～54μmol·m-2·s-1，光周期12h光照/12h黑暗条件下进行增殖培养。通过液体间歇浸没，外植体获得充分氧气，从而生长速度快，新分化的幼苗60天后平均能够达到5.6cm，叶片数达到7.8片。
对比例1
基本步骤与实施例1相同，不同之处在于采用的蓝莓继代组培苗不同，分别为第3、4、5及6代继代组培苗。
将该对比例1增殖的蓝莓培育苗与实施例1进行对比发现，采用第3、4、5代继代组培苗增殖系数高，其中第5代继代苗增殖系数最高，达6.3倍，到第6代后随继代代数的增加增殖倍数逐渐降低，这是由于随着继代代数的增加继代苗性状不稳定，生活力降低。
对比例2
基本步骤与实施例1相同，不同之处在于接种的组培苗的密度，具体为：50棵/瓶、55棵/瓶、60棵/瓶、65棵/瓶、70棵/瓶。
将该对比例增殖的蓝莓培育苗与实施例1进行对比发现，采用接种密度为每瓶55-65棵/瓶外植体为好，能够有效控制污染率在1％以内，而接种密度超过65棵/瓶，污染率则会提高，达到5％左右。这是由于密度过大，感染的几率增加，且密通风差易引起污染，同时过密苗，苗长势弱，内生菌感染也较易发生。
对比例3
基本步骤与实施例1相同，不同之处在于摇摆频率，具体为：1次/5h、1次/6h、1次/7h、1次/8h。
将该对比例增殖的蓝莓培育苗与实施例1进行对比发现，在5-7h/次范围内能有效控制污染率和玻璃化率均在1％以内，其中最佳的摇摆频率为6h/次。倘若频率高于1次/7h，玻璃化率会增加到5％左右，而低于1次/4h，污染率同样会增加到5％左右。这是由于频率过高，继代苗浸没频繁，时间长或导致玻璃化；而频率过低，继代苗浸没时间短，苗营养不够，长势弱，内生菌感染易发生。
对比例4
基本步骤与实施例1相同，不同之处在于浸没时间，具体为：20s/次、25s/次、30s/次、35s/次、40s/次。
将该对比例增殖的蓝莓培育苗与实施例1进行对比发现，在25-35s/次范围内差异不显著，能有效控制污染率和玻璃化率均在1％以内，其中以浸没时间30s/次最佳。倘若浸没时间短于25s/次，生长量明显降低，为传统的1倍左右；而浸没时间高于35s/次，玻璃化率明显增加，5％左右。这是由于继代苗浸没频繁，时间长或导致玻璃化；而继代苗浸没时间短，苗营养不够，长势弱，内生菌感染易发生。
对比例5
基本步骤与实施例1相同，不通知之处在于培养液中的蔗糖浓度，具体为20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L。
将该对比例增殖的蓝莓培育苗与实施例1进行对比发现，采用25～35g/L的蔗糖配合1/2WPM及6-BA 500mg/L使用时，其能够有效提高增殖系数，为传统固体培养的3-4倍，增殖苗生长量大，生长健壮；而当蔗糖浓度低于25g/L，增殖苗生长量明显降低，而当蔗糖浓度高于35g/L时，污染率会增加到超过5％。这是由于蔗糖浓度过低营养不够，生长量下降，过高容易感菌污染。
对比例6
基本步骤与实施例1相同，不通知之处在于培养液中的6-BA浓度，具体为350mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、650mg/L。
将该对比例增殖的蓝莓培育苗与实施例1进行对比发现，采用400～600mg/L的6-BA浓度配合1/2WPM及30g/L蔗糖使用时，其能够有效提高增殖系数，为传统固体培养的3-4倍，增殖苗生长量大，生长健壮；而当6-BA浓度低于400mg/L，增殖苗生长量明显降低，为传统的1倍左右；而当6-BA浓度高于600mg/L时，污染率会增加到超过5％。这是由于激素浓度过低增殖效果不明显，浓度过高苗分生较快，苗长势弱，易发生内生菌污染。

Claims (9)

1.一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，其特征在于包括如下步骤：将蓝莓组培苗装入盛有培养液的容器，放入摆动式间歇浸没生物反应器中，设定摇摆角度42-48°，摇摆频率1次/5-7h，浸没时间25-35s/次进行增殖。
2.根据权利要求1所述的采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，其特征在于：所述摇摆角度为45°。
3.根据权利要求1所述的采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，其特征在于：所述摇摆频率为6h/次。
4.根据权利要求1所述的采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，其特征在于：所述浸没时间为30s/次。
5.根据权利要求1所述的采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，其特征在于：所述蓝莓组培苗为第3、4或5代继代组培苗。
6.根据权利要求5所述的采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，其特征在于：所述蓝莓组培苗为第5代继代组培苗。
7.根据权利要求1所述的采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，其特征在于：所述培养液包括1/2WPM、25～35g/L蔗糖及6-BA 400～600mg/L。
8.根据权利要求1所述的采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，其特征在于：所述容器中盛有的培养液的体积为200-300ml。
9.根据权利要求1所述的采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法，其特征在于：所述容器中的蓝莓组培苗为55-65棵。
CN201710919591.6A 2017-09-30 2017-09-30 一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法 Pending CN107517853A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710919591.6A CN107517853A (zh) 2017-09-30 2017-09-30 一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710919591.6A CN107517853A (zh) 2017-09-30 2017-09-30 一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107517853A true CN107517853A (zh) 2017-12-29

Family

ID=60684310

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710919591.6A Pending CN107517853A (zh) 2017-09-30 2017-09-30 一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107517853A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111034528A (zh) * 2019-12-26 2020-04-21 东北林业大学 一种东北地区叶用杜仲林培育装置及方法
US11299700B1 (en) 2021-02-19 2022-04-12 Acequia Biotechnology, Llc Bioreactor containers and methods of growing hairy roots using the same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101720668A (zh) * 2009-09-18 2010-06-09 广西壮族自治区农业科学院 利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁
CN102618441A (zh) * 2012-03-14 2012-08-01 江苏农林职业技术学院 摆动式液体间歇浸没培养装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101720668A (zh) * 2009-09-18 2010-06-09 广西壮族自治区农业科学院 利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁
CN102618441A (zh) * 2012-03-14 2012-08-01 江苏农林职业技术学院 摆动式液体间歇浸没培养装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARIEL D. ARENCIBIA等: "An Approach for Micropropagation of Blueberry (Vaccinium corymbosum L.) Plants Mediated by Temporary Immersion Bioreactors (TIBs)", 《AMERICAN JOURNAL OF PLANT SCIENCES》 *
石琨等: "间歇浸没式液体培养技术及其在莓类果实植物微扩繁中的应用", 《植物生理学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111034528A (zh) * 2019-12-26 2020-04-21 东北林业大学 一种东北地区叶用杜仲林培育装置及方法
CN111034528B (zh) * 2019-12-26 2021-02-05 东北林业大学 一种东北地区叶用杜仲林培育装置及方法
US11299700B1 (en) 2021-02-19 2022-04-12 Acequia Biotechnology, Llc Bioreactor containers and methods of growing hairy roots using the same

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106576910B (zh) 离体无菌寄主植物-菌根食用菌共生苗的培养方法
CN105638477A (zh) 一种竹叶石斛种子快速繁殖方法
CN101790935A (zh) 马铃薯离体培养一步成苗培养基及其优化方法及成苗方法
CN104823824B (zh) 石斛的间歇浸没式培养方法和培养装置
CN105684901B (zh) 一种荒漠区药用植物黑果枸杞的快速繁殖方法
CN102648698A (zh) 一种梨茎尖组织培养快速繁殖方法
Yoeup et al. Micropropagation of woody plants using bioreactor
CN107517853A (zh) 一种采用摇摆式间歇浸没生物反应器进行蓝莓组培苗增殖的方法
CN103798140B (zh) 显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法
CN103548660B (zh) 一种能自动吸液的植物育苗盆
CN103070078A (zh) 一种利用芋头茎尖进行组织培养的快繁方法
CN104542296B (zh) 一种甘蔗组培苗开放式生根方法
CN103651141A (zh) 亳菊工厂化试管苗快繁的方法
CN102342248A (zh) 马铃薯茎尖脱毒育种方法及双层培养基
CN104855289B (zh) 一种利用浅层培养生产藏红花微球茎方法
CN101606468B (zh) 一种地木耳的简易培养方法及培养装置
CN105850740A (zh) 一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法
CN103828718B (zh) 一种菊花离体育种方法
CN106718902B (zh) 间歇浸没式荔浦芋组培苗快速增殖的方法及荔浦芋种苗
CN102668991B (zh) 青霉素在葡萄试管简易繁殖上的应用及葡萄试管繁殖新技术
CN114521489A (zh) 一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法
KR20080073388A (ko) 체세포배 세포 급속증식을 이용한 나리류의 자구 대량생산방법
Wu et al. Establishment of a large-scale micropropagation system for Anoectochilus formosanus in bioreactors
CN113598058A (zh) 一种甘蔗茎尖培养的改良方法
CN103430841B (zh) 一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171229

RJ01 Rejection of invention patent application after publication