CN105936889B - 一种ad293球形细胞团的培养方法 - Google Patents

一种ad293球形细胞团的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种AD293球形细胞团的培养方法，包括以下步骤：1)配置悬浮培养基：培养基中包括以下组成成分：无血清培养基、胎牛血清、血清替代物、非必需氨基酸溶液、表皮细胞生长因子、转化生长因子、甲基纤维素；将物质混合溶解均匀，得到悬浮培养基；2)准备AD293细胞：使用10％胎牛血清的DMEM培养基在细胞瓶中复苏AD293细胞，进行传代；3)培养细胞：在摇瓶中加入经步骤2)处理的AD293细胞和步骤1)得到的悬浮培养基；然后置于摇床，温度为37℃的条件下培养48～72h，获得AD293球形细胞团；通过该培养方法形成的AD293球形细胞团，其细胞密度比球形微载体悬浮培养的细胞密度高10倍以上。

Description

一种AD293球形细胞团的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，更具体地，涉及一种AD293球形细胞团的培养方法。
背景技术
细胞培养对于整个生物工程技术是一个必不可少的过程，尤其在研究细胞苗、药物筛选等方面作用更加突出。传统细胞培养是通过转瓶或扁瓶培养细胞，然后发展到生物反应器使用片状载体或球形微载体高密度培养细胞，或通过中空纤维的方式培养细胞。这些细胞培养的方法均存在一些缺陷，例如：转瓶或扁瓶培养细胞的细胞密度低，平均密度仅仅为105个/毫升级别；而生物反应器或中空纤维细胞密度能够达到106个/毫升级别，甚至更高但是成本高、扩大难等缺陷。而目前通过细胞基因改造或者驯化等方法使细胞不需要贴壁生长而直接进行单细胞悬浮培养。目前，已经能够进行悬浮培养的细胞有BH K-21、SP20、MDCK等细胞；但是关于人胚肾细胞AD293细胞的研究少有报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种AD293球形细胞团的培养方法，通过该培养方法形成的AD293球形细胞团，其细胞密度比球形微载体悬浮培养的细胞密度高10倍以上。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种AD293球形细胞团的培养方法，包括以下步骤：
1)配置悬浮培养基：培养基中包括以下组成成分：
体积比85～95％Gibco无血清培养基、
体积比2～5％Gibco胎牛血清、
体积比2～10％Gibco血清替代物、
体积比0.5～2％Gibco非必需氨基酸溶液、
质量体积比1～10ng/mL表皮细胞生长因子、
质量体积比1～10ng/mL转化生长因子、
质量体积比0.5～5mg/mL甲基纤维素；
将上述物质混合溶解均匀，得到悬浮培养基；
2)准备AD293细胞：使用含体积比为10％胎牛血清的DMEM培养基在细胞瓶中复苏AD293细胞，按照体积比1：3的比例进行传代，然后培养AD293细胞直到细胞量为107～6×108个；
3)培养细胞：在摇瓶中加入经步骤2)处理的AD293细胞和步骤1)得到的悬浮培养基；然后置于摇床，放入二氧化碳培养箱中，温度为37℃的条件下培养48～72h，获得AD293球形细胞团。
作为优选，步骤1)中，培养基中包括以下组成成分：
体积比90％Gibco无血清培养基、
体积比4％Gibco胎牛血清、
体积比5％Gibco血清替代物、
体积比1％Gibco非必需氨基酸溶液、
质量体积比3ng/mL表皮细胞生长因子、
质量体积比2ng/mL转化生长因子、
质量体积比1.5mg/mL甲基纤维素。
作为优选，步骤2)中，所述细胞量为5×107～3×108个。
作为优选，步骤2)中，所述细胞量为8×107～1.5×108个。
作为优选，步骤3)中，所述摇床的转速为80～150rpm。
作为优选，步骤3)中，所述摇床的转速为90～130rpm。
作为优选，步骤3)中，所述摇床的转速为100～120rpm。
作为优选，步骤3)中，所述悬浮培养基添加的量为30～50mL。
作为优选，步骤3)中，所述悬浮培养基添加的量为45mL。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明在不进行细胞驯化和基因改造的情况下，直接悬浮AD293细胞；
2、本发明使AD293细胞形成球形团生长，细胞密度比球形微载体悬浮培养的细胞密度高10倍以上；
3、本发明得到的球形细胞团与单细胞纯悬浮不同，其保持细胞与细胞间的相互接触，有利于病毒繁殖。
附图说明
图1为实施例1中培养24h的AD293细胞形态图；
图2为实施例1中培养48h的AD293细胞形态图；
图3为实施例1中培养72h的AD293细胞形态图；
图4为实施例2中培养24h的AD293细胞形态图；
图5为实施例2中培养48h的AD293细胞形态图；
图6为实施例2中培养72h的AD293细胞形态图；
图7为实施例3中培养24h的AD293细胞形态图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
一种AD293球形细胞团的培养方法，包括以下步骤：
1)配置悬浮培养基：培养基中包括以下组成成分：
体积比85～95％Gibco无血清培养基、
体积比2～5％Gibco胎牛血清、
体积比2～10％Gibco血清替代物、
体积比0.5～2％Gibco非必需氨基酸溶液、
质量体积比1～10ng/mL表皮细胞生长因子、
质量体积比1～10ng/mL转化生长因子、
质量体积比0.5～5mg/mL甲基纤维素；
将上述物质混合溶解均匀，得到悬浮培养基；
Gibco无血清培养基、Gibco胎牛血清、Gibco血清替代物、Gibco非必需氨基酸溶液的购买单位为广东温氏大华农生物科技有限公司的农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室，产地为澳洲，Gibco无血清培养基的货号为：12582011，Gibco胎牛血清的货号为：10099-141，Gibco血清替代物的货号为：10828028，Gibco非必需氨基酸溶液的货号为：11140050；
表皮细胞生长因子EGF(Epidermal growth factorz)，由53个氨基组成的活细胞，藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化；
转化生长因子TGF(Transforming growth factor)，在表皮生长 因子(EGF)同时存在的条件下，改变成纤维细胞内壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去生长中密度信赖的抑制作用；EGF和TGF具有协同刺激细胞生长的作用，对于不同细胞作用有所差异，使用剂量也差异很大；
2)准备AD293细胞：使用含体积比为10％胎牛血清的DMEM培养基在细胞瓶中复苏AD293细胞，按照体积比1：3的比例进行传代，然后培养AD293细胞直到细胞量为107～6×108个；
3)培养细胞：在摇瓶中加入经步骤2)处理的AD293细胞和步骤1)得到的悬浮培养基30～50mL；然后置于摇床，放入二氧化碳培养箱中，温度为37℃、转速为80～150rpm的条件下培养48～72h，获得AD293球形细胞团；
转速对细胞成团的影响很大，转速过慢使细胞不容易悬浮起来，而形成很大的不规则团块；而转速过快时细胞容易因为相互碰撞而变成细胞碎片，不利于病毒繁殖；
4)计数并传代：培养24h、48h、72h时分别取样观察细胞生长状况并进行细胞计数；
5)消化传代：将AD293球形细胞按照体积比1：1.5～2比例进行细胞传代。
实施例1
本实施例公开了一种AD293球形细胞团的培养方法，包括以下步骤：
1)配置悬浮培养基：100mL培养基中包括以下组成成分：
90mL Gibco无血清培养基、
4mL Gibco胎牛血清、
5mL Gibco血清替代物、
1mL Gibco非必需氨基酸溶液、
300ng表皮细胞生长因子、
200ng转化生长因子、
0.15g甲基纤维素；
将上述物质混合溶解均匀，得到总体积100mL的悬浮培养基；
2)准备AD293细胞：使用含体积比为10％胎牛血清的DMEM培养基在细胞瓶中复苏AD293细胞，按照体积比1：3的比例进行传代，然后培养AD293细胞直到细胞量为108个；
3)培养细胞：在摇瓶中加入经步骤2)处理的AD293细胞和步骤1)得到的悬浮培养基45mL；然后置于摇床，放入二氧化碳培养箱中，温度为37℃、转速为110rpm的条件下培养48～72h，获得AD293球形细胞团；
4)计数并传代：培养24h、48h、72h时分别取样观察细胞生长状况并进行细胞计数；
5)消化传代：培养72h后将AD293球形细胞按照体积比1：2比例进行细胞传代。
其中24h、48h、72h的细胞生长形态如图1～3所示，细胞先形成无规则的细胞团快，然后慢慢形成小球形，最后小球形逐渐长大其直径达到30～90um，72h时，细胞总数量为1.91×108个。
实施例2
本实施例公开了一种AD293球形细胞团的培养方法，包括以下步骤：
1)配置悬浮培养基：100mL培养基中包括以下组成成分：
90mL Gibco无血清培养基、
4mL Gibco胎牛血清、
5mL Gibco血清替代物、
1mL Gibco非必需氨基酸溶液、
0.15g甲基纤维素；
将上述物质混合溶解均匀，得到总体积100mL的悬浮培养基；
2)准备AD293细胞：使用含体积比为10％胎牛血清的DMEM培养基在细胞瓶中复苏AD293细胞，按照体积比1：3的比例进行传代，然后培养AD293细胞直到细胞量为108个；
3)培养细胞：在摇瓶中加入经步骤2)处理的AD293细胞和步骤1)得到的悬浮培养基45mL；然后置于摇床，放入二氧化碳培养箱中，温度为37℃、转速为110rpm的条件下培养48～72h，获得AD293球形细胞团；
4)计数并传代：培养24h、48h、72h时分别取样观察细胞生长状况并进行细胞计数；
5)消化传代：培养72h后将AD293球形细胞按照体积比1：2比例进行细胞传代。
不添加表皮细胞生长因子和转化生长因子悬浮培养基培养得到 的AD293球形细胞团，其中24h、48h、72h的细胞生长形态如图4～6所示，细胞先形成无规则的细胞团快，然后慢慢形成小球形，最后小球形逐渐长大其直径达到25～50um，72h时，细胞总数量为1.35×108个。
实施例3
1)配置悬浮培养基：100mL培养基中包括以下组成成分：
90mL Gibco无血清培养基、
4mL Gibco胎牛血清、
5mL Gibco血清替代物、
1mL Gibco非必需氨基酸溶液、
0.15g甲基纤维素；
将上述物质混合溶解均匀，得到总体积100mL的悬浮培养基；
2)准备AD293细胞：使用含体积比为10％胎牛血清的DMEM培养基在细胞瓶中复苏AD293细胞，按照体积比1：3的比例进行传代，然后培养AD293细胞直到细胞量为108个；
3)培养细胞：在摇瓶中加入经步骤2)处理的AD293细胞和步骤1)得到的悬浮培养基45mL；然后置于摇床，放入二氧化碳培养箱中，温度为37℃、转速为70rpm的条件下培养24h后，发现细胞相互结合形成巨大团块沉淀于摇瓶瓶底，如图7所示，无法继续培养。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种AD293球形细胞团的培养方法，其特征在于包括以下步骤：
1）配置悬浮培养基：培养基中由以下成分组成：
体积比90% Gibco无血清培养基、
体积比4% Gibco胎牛血清、
体积比5% Gibco血清替代物、
体积比1% Gibco非必需氨基酸溶液、
质量体积比3ng/mL表皮细胞生长因子、
质量体积比2ng/mL转化生长因子、
质量体积比1.5mg/mL甲基纤维素；
将上述物质混合溶解均匀，得到悬浮培养基；
2）准备AD293细胞：使用含体积比为10%胎牛血清的DMEM培养基在细胞瓶中复苏AD293细胞，按照体积比1：3的比例进行传代，然后培养AD293细胞直到细胞量为107~6×108个；
3）培养细胞：在摇瓶中加入经步骤2）处理的AD293细胞和步骤1）得到的悬浮培养基；然后置于摇床，放入二氧化碳培养箱中，温度为37℃的条件下培养48~72h，获得AD293球形细胞团。
2.如权利要求1所述的AD293球形细胞团的培养方法，其特征在于：步骤2）中，所述细胞量为5×107~3×108个。
3.如权利要求2所述的AD293球形细胞团的培养方法，其特征在于：步骤2）中，所述细胞量为8×107~1.5×108个。
4.如权利要求1所述的AD293球形细胞团的培养方法，其特征在于：步骤3）中，所述摇床的转速为80~150rpm。
5.如权利要求4所述的AD293球形细胞团的培养方法，其特征在于：步骤3）中，所述摇床的转速为90~130rpm。
6.如权利要求5所述的AD293球形细胞团的培养方法，其特征在于：步骤3）中，所述摇床的转速为100~120rpm。
7.如权利要求1所述的AD293球形细胞团的培养方法，其特征在于：步骤3）中，所述悬浮培养基添加的量为30~50mL。
8.如权利要求7所述的AD293球形细胞团的培养方法，其特征在于：步骤3）中，所述悬浮培养基添加的量为45mL。
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