CN104894065A - 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法，该NK细胞培养基以重量份数计，包括以下组分：无血清基础培养基83～93重量份；血浆4～6重量份；白细胞介素-2 0.5～1.5重量份；抗CD3单克隆抗体0.5～1.5重量份；类胰岛素一号增长因子1～5重量份和枸杞多糖1～3重量份。本发明提供的NK细胞培养基安全性较好，在上述组分的培养基下培养的NK细胞快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。实验结果表明：本发明提供的NK细胞培养基培养NK细胞两周后，增殖倍数将近翻了50倍；对K562的杀伤活性在40:1的效靶比时达到了91％。

Description

一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。

NK细胞是机体抗感染、抗肿瘤的第一道天然防线，是机体重要的免疫细胞。活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。目前，NK细胞已经广泛运用于临床进行肿瘤患者的治疗，同时，NK细胞治疗对病毒或细菌感染、免疫调节相关疾病以及抗衰老也有一定的疗效。

目前，体外促进NK细胞的方法有很多，有在培养体系中加入动物血清进行培养，也有研究者将K562细胞通过基因修饰后经过辐照，然后作为饲养层细胞在体外刺激NK细胞的生长。上述方法虽然能够刺激NK细胞高效扩增，但是动物血清成分复杂，取材过程中有可能带入支原体、病毒，对NK细胞培养造成不确定性以及不安全性；K562本身作为一个肿瘤细胞，在临床安全性方面存在很大的质疑，不适用于临床NK细胞治疗。

因此，进一步开发安全且能保证NK细胞增殖速度和肿瘤细胞的杀伤效果的培养基十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法，本发明提供的NK细胞培养基安全，采用其培养的NK细胞快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。

本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括以下组分：

优选地，所述无血清基础培养基为无血清的RPMI 1640培养基。

优选地，所述NK细胞培养基包括以下组分：

优选地，所述NK细胞培养基包括以下组分：

本发明提供了一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤：

将NK细胞接种于上述技术方案所述的NK细胞培养基进行培养。

优选地，所述NK细胞按照以下方法分离得到：

将外周血进行分离，得到PBMC细胞；

将所述PBMC细胞进行磁珠分选，得到NK细胞。

优选地，所述培养的条件为37℃和体积浓度为5％的CO₂。

优选地，所述培养的时间为13～15天。

优选地，所述接种的细胞密度为4.5×10⁵个/mL～5.5×10⁵个/mL。

优选地，所述培养的过程中每3天补加上述技术方案所述的NK细胞培养基。

本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括以下组分：无血清基础培养基83～93重量份；血浆4～6重量份；白细胞介素-2 0.5～1.5重量份；抗CD3单克隆抗体0.5～1.5重量份；类胰岛素一号增长因子1～5重量份；和枸杞多糖1～3重量份。本发明提供的NK细胞培养基安全性较好，在上述组分的培养基下培养的NK细胞快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。实验结果表明：本发明提供的NK细胞培养基培养NK细胞两周后，增殖倍数将近翻了50倍；对K562的杀伤活性在40:1的效靶比时达到了91％。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的NK细胞培养基培养NK细胞的增殖曲线图；

图2为本发明实施例1培养的NK细胞对K562的杀伤活性曲线图；

图3为本发明实施例2制备的NK细胞培养基培养NK细胞的增殖曲线图；

图4为本发明实施例2培养的NK细胞对K562的杀伤活性曲线图；

图5为本发明实施例3制备的NK细胞培养基培养NK细胞的增殖曲线图；

图6为本发明实施例3培养的NK细胞对K562的杀伤活性曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括以下组分：

本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括无血清基础培养基83～93重量份，优选为88～88重量份。在本发明中，所述无血清基础培养基中无任何动物血清，不会带入任何支原体和病毒。在本发明中，所述基础培养基优选为无血清的RPMI 1640培养基、高糖DMEM和DMEM/F12中的一种或多种，更优选为无血清的RPMI 1640培养基。本发明对无血清基础培养基的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的无血清基础培养基即可，如可以采用其市售商品。

本发明提供的NK细胞培养基包括血浆4～6重量份，优选为4.5～5.5重量份。本发明对所述血浆的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的血浆即可，如可以采用其市售商品。在本发明的某些实施例中，所述血浆优选按照以下方法制得：

将外周血进行离心，过滤，得到血浆。

本发明优选将外周血在800g下离心10min，得到上层液体。本发明优选将上层液体再次在3000g下离心10min，然后过滤，得到血浆。

本发明提供的NK细胞培养基包括白细胞介素-2 0.5～1.5重量份，优选为0.8～1重量份。白细胞介素-2(IL-2)是由多细胞来源，主要由活化T细胞产生，又具有多向性作用的细胞因子，主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化；白细胞介素-2对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖；白细胞介素-2能活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。本发明对所述白细胞介素-2的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的白细胞介素-2即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述白细胞介素-2购买于上海麦约尔生物技术有限公司。

本发明提供的NK细胞培养基包括抗CD3单克隆抗体0.5～1.5重量份，优选为0.8～1重量份。本发明对所述抗CD3单克隆抗体(OKT-3)的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的抗CD3单克隆抗体即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述抗CD3单克隆抗体购买于上海麦约尔生物技术有限公司。

本发明提供的NK细胞培养基包括类胰岛素一号增长因子1～5重量份，优选为2～3重量份。在本发明中，所述类胰岛素一号增长因子(IGF-1)是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的产物，是人体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂，同时对维持与细胞分化有关蛋白质水平具有重要作用，与一些生长因子何用能够促进细胞分化成熟。本发明对所述类胰岛素一号增长因子的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的类胰岛素一号增长因子即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述类胰岛素一号增长因子购买于上海遐瑞医药科技有限公司。

在本发明中，所述IGF-1与IL-2和OKT-3细胞因子组合，有利于促进NK细胞分化成熟。

本发明提供的NK细胞培养基包括枸杞多糖1～3重量，优选为1.5～2重量份。在本发明中，所述枸杞多糖是一种生物活性物质，具有促进T、B、CTL、NK和巨噬细胞等免疫功能，促进IL-2、IL-3和TNFβ等细胞因子产生，促进免疫细胞的增殖。枸杞多糖通过多种方式影响免疫调节功能；通过离子交换层析法进一步分离和纯化粗多糖，可得到一种蛋白多糖复合物枸杞多糖3p，具有免疫刺激作用。枸杞多糖3p能增加人类外周血单核细胞中IL-2和TNF的表达，mRNA和蛋白水平都与枸杞多糖呈剂量相关，表明其具有增强免疫和潜在抗肿瘤作用。在本发明中，所述枸杞多糖有利于促进NK细胞的增殖。本发明对所属枸杞多糖的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的枸杞多糖即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述枸杞多糖购买于北京志政生物科技有限公司。

在本发明的具体实施例中，所述NK细胞培养基包括以下组分：

在本发明的具体实施例中，所述NK细胞培养基包括以下组分：

在本发明的具体实施例中，所述NK细胞培养基包括以下组分：

在本发明中，所述NK细胞培养基的制备方法优选包括以下步骤：

将无血清基础培养基83～93重量份、血浆4～6重量份、白细胞介素-20.5～1.5重量份、抗CD3单克隆抗体0.5～1.5重量份、类胰岛素一号增长因子1～5重量份和枸杞多糖1～3重量份混合，得到NK细胞培养基。

在本发明中，所述无血清基础培养基、血浆、白细胞介素-2、抗CD3单克隆抗体、类胰岛素一号增长因子和枸杞多糖的来源和用量与上述技术方案所述无血清基础培养基、血浆、白细胞介素-2、抗CD3单克隆抗体、类胰岛素一号增长因子和枸杞多糖的来源和用量一致，在此不再赘述。

在本发明中，所述混合的温度优选为10℃～30℃，更优选为15℃～25℃；所述混合的时间优选为3min～5min。

在本发明的具体实施例中，本发明优选采用浓度为1000IU/mL的白细胞介素-2溶液加入到培养基中；本发明优选采用浓度为3000IU/mL的抗CD3单克隆抗体溶液加入到培养基中；本发明优选采用浓度为5000IU/mL的类胰岛素一号增长因子溶液加入到培养基中。

本发明提供了一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤：

将NK细胞接种于上述技术方案所述的NK细胞培养基进行培养。

本发明对所述NK细胞的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的NK细胞即可，如可以采用其市售商品，也可以采用本领域技术人员熟知的制备NK细胞的技术方案自行制备。在本发明中，所述NK细胞优选按照以下方法分离得到：

将外周血进行分离，得到PBMC细胞；

将所述PBMC细胞进行磁珠分选，得到NK细胞。

本发明将外周血进行分离，得到PBMC细胞，即外周血单个核细胞。在本发明中，将外周血进行分离得到PBMC细胞的具体过程为：将外周血离心，得到上层血浆和下层细胞；

将下层细胞进行Ficoll分离，离心，得到PBMC细胞。

本发明将外周血进行离心，得到上层血浆和下层细胞。本发明优选将上层血浆离心，过滤，备用。在本发明中，所述上层血浆离心的转速优选为3000g，离心的时间优选为10min。本发明对上层血浆过滤的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的过滤技术方案即可。

本发明对外周血的离心方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的外周血离心的技术方案即可。在本发明中，所述外周血离心的转速优选为800g，离心的时间优选为10min。

本发明优选将下层细胞先采用本领域技术人员公知的生理盐水稀释后再进行Ficoll分离。在本发明中，所述Ficoll分离为单次密度梯度离心法。在本发明中，所述生理盐水和下层细胞的体积比优选为1:2。在本发明中，进行Ficoll分离时，本发明优选将稀释后的下层细胞缓慢倒入Ficoll分离液中。本发明对Ficoll分离液和稀释后的下层细胞的混合液进行离心，得到白膜层细胞，即PBMC细胞。在本发明中，所述Ficoll分离液和稀释后的下层细胞的混合液离心的转速优选为700g，离心的时间优选为20min。

完成Ficoll分离液和稀释后的下层细胞的混合液离心后，本发明优选将得到的白膜层细胞进行清洗。本发明优选采用本领域技术人员公知的1640培养基进行清洗。本发明采用1640培养基将白膜层细胞重悬和离心，弃去上清液，再次重悬和离心，得到PBMC细胞；优选地，本发明优选采用1640培养基将白膜层细胞在转速400g下离心5min。本发明优选再次重悬白膜层细胞时取部分细胞悬液进行细胞计数。

得到PBMC细胞后，本发明将所述PBMC细胞进行磁珠分选，得到NK细胞。本发明优选将所述PBMC细胞进行磁珠分选前进行重悬。本发明优选采用本领域技术人员熟知的NK细胞分选缓冲液(Buffer)重悬PBMC细胞。在本发明中，所述PBMC细胞的密度优选为5×10⁷个/mL。本发明优选在PBMC细胞中加入抗体孵育。本发明优选在室温下孵育10min。在本发明中，所述抗体为人NK细胞富集抗体混合物；所述抗体的加入剂量为50微升/mL。本发明优选在孵育后的PBMC细胞中加入磁珠后再次孵育。在本发明中，所述磁珠的加入剂量为100微升/mL；所述再次孵育的时间优选为5min。本发明优选在再次孵育后的PBMC细胞中再次加入NK细胞分选Buffer进行重悬，得到细胞悬液。本发明优选将细胞悬液离心，弃上清，清洗，得到NK细胞。本发明优选将细胞悬液400g离心5min。本发明优选采用1640培养基进行清洗。

在本发明中，所述NK细胞经过磁珠分选能够得到纯度较高的NK细胞；经过磁珠分选纯化后，避免了在培养过程中其它免疫细胞对NK细胞的影响。

在本发明中，所述培养的条件优选为37℃和体积浓度为5％的CO₂。

在本发明中，所述培养的时间优选为13～15天，更优选为14天。

在本发明中，所述接种的细胞密度优选为4.5×10⁵个/mL～5.5×10⁵个/mL，更优选为5×10⁵个/mL。

在本发明中，所述培养的过程中优选每3天补加上述技术方案所述的NK细胞培养基。

本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括以下组分：无血清基础培养基83～93重量份；血浆4～6重量份；白细胞介素-2 0.5～1.5重量份；抗CD3单克隆抗体0.5～1.5重量份；类胰岛素一号增长因子1～5重量份；和枸杞多糖1～3重量份。本发明提供的NK细胞培养基不采用异源血清和修饰的K562细胞，安全性较高，在上述组分的培养基下培养的NK细胞快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。实验结果表明：本发明提供的NK细胞培养基培养NK细胞两周后，增殖倍数将近翻了50倍；对K562的杀伤活性在40:1的效靶比时达到了91％。

本发明提供的培养基中不含有任何动物血清，不会带入任何支原体和病毒；不带入经过处理的K562，避免可能存在的安全性风险。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

NK细胞的分离过程：

1、PBMC的分离：

1)取40mL外周血，转移到50mL离心管中，在800g下离心10min；

2)收集上层血浆，并用两倍体积的生理盐水稀释下层细胞，轻轻吹打混合均匀；

3)另取新的50mL离心管，按照稀释血液体积的1/2加入Ficoll分离液(购买于上海山进生物科技有限公司)，再将稀释血液缓慢加入到Ficoll液面上；另将收集到的血浆3000g离心10min，过滤后备用。

4)将离心机特有刹车按键Brake调为零，700g离心20min，离心后用巴氏吸管小心吸取白膜层细胞，并收集于离心管中；

5)加1640培养基(购自上海玉博生物科技有限公司)至40mL，轻轻吹打混匀PBMC细胞，在400g下离心5min；

6)弃步骤5)离心得到的混合液的上清液，再加所述1640培养基至40mL，轻轻吹打重悬PBMC细胞，取少量PBMC细胞悬液进行计数，其余悬液在400g下离心5min；

2、磁珠分选得NK细胞：

1)弃PBMC细胞悬液中的上清液，用新鲜配制的NK细胞分选Buffer重悬PBMC细胞，将细胞密度调整为5×10⁷/mL，并转移至1.5mL离心EP管中；

2)按照50μL/mL的人NK细胞富集抗体混合物(购买于上海世仪生物科技有限公司)加入量，加入抗体后轻轻混匀，室温下孵育10min；

3)将磁珠吹打均匀后，按照100μL/mL的磁珠加入量，加入磁珠后轻轻混匀，室温孵育5min；

4)将细胞悬液转移到分选专用的5mL圆底管中，加入NK细胞分选Buffer至2.5mL，轻轻吹打均匀后，插入到磁极中(不盖盖子)，静置2.5min；

5)将圆底管连同磁极一并拿起，倾倒细胞悬液至新的15mL离心管中，400g离心5min；

6)弃上清，加入2mL 1640培养基(购买于上海玉博生物科技有限公司)重悬细胞，并取少量悬液计数，记录分选得到的NK细胞数量以及活率。

将上述血浆、IL-2、OKT-3、IGF-1以及枸杞多糖逐一添加至无血清RPMI培养基中，所述血浆、IL-2、OKT-3、IGF-1、枸杞多糖和RPMI培养基的质量比为4：0.5：0.5：1：1：93；将它们充分摇晃均匀，得到NK细胞培养基；按照5×10⁵/mL的密度把NK细胞接种于培养瓶中，加入上述配方配制的完全培养基，记录生长情况以及检测培养两周后对K562杀伤效果，结果见图1和图2；图1为本发明实施例1制备的NK细胞培养基培养NK细胞的增殖曲线图；图2为本发明实施例1培养的NK细胞对K562的杀伤活性曲线图。

实施例2

将血浆、IL-2、OKT-3、IGF-1以及枸杞多糖逐一添加至无血清RPMI培养基中，所述血浆、IL-2、OKT-3、IGF-1、枸杞多糖和RPMI培养基的质量比为5：1:1:3:2:88，将它们充分摇晃均匀，得到NK细胞培养基；按照5×10⁵/mL的密度把NK细胞接种于培养瓶中，加入上述配方配制的完全培养基，记录生长情况以及检测培养两周后对K562杀伤效果，结果见图3和图4，图3为本发明实施例2制备的NK细胞培养基培养NK细胞的增殖曲线图；图4为本发明实施例2培养的NK细胞对K562的杀伤活性曲线图。

实施例3

将血浆、IL-2、OKT-3、IGF-1以及枸杞多糖逐一添加至无血清RPMI培养基中，所述血浆、IL-2、OKT-3、IGF-1、枸杞多糖和RPMI培养基的质量比为6:1.5:1.5:5:3:83，将它们充分摇晃均匀，得到NK细胞培养基；按照5×10⁵/mL的密度把NK细胞接种于培养瓶中，加入上述配方配制的完全培养基，记录生长情况以及检测培养两周后对K562杀伤效果，结果见图5和图6，图5为本发明实施例3制备的NK细胞培养基培养NK细胞的增殖曲线图；图6为本发明实施例3培养的NK细胞对K562的杀伤活性曲线图。

由图1～图6可以看出，NK细胞在本发明培养基配方培养两周后，增殖倍数最高将近翻了50倍，对K562的杀伤活性最高在40:1效靶比时达到了91％。综合以上结果，可以说明本发明提供的培养基配方有利于提高NK细胞增殖倍数，而且很好的保证了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

由以上实施例可知，本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括以下组分：无血清基础培养基83～93重量份；血浆4～6重量份；白细胞介素-20.5～1.5重量份；抗CD3单克隆抗体0.5～1.5重量份；类胰岛素一号增长因子1～5重量份；和枸杞多糖1～3重量份。本发明提供的NK细胞培养基安全性较好，在上述组分的培养基下培养的NK细胞快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。实验结果表明：本发明提供的NK细胞培养基培养NK细胞两周后，增殖倍数将近翻了50倍；对K562的杀伤活性在40:1的效靶比时达到了91％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的NK细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基为无血清的RPMI 1640培养基。

3.根据权利要求1所述的NK细胞培养基，其特征在于，所述NK细胞培养基包括以下组分：

4.根据权利要求1所述的NK细胞培养基，其特征在于，所述NK细胞培养基包括以下组分：

5.一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤：

将NK细胞接种于权利要求1～4任意一项所述的NK细胞培养基进行培养。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述NK细胞按照以下方法分离得到：

将外周血进行分离，得到PBMC细胞；

将所述PBMC细胞进行磁珠分选，得到NK细胞。

7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述培养的条件为37℃和体积浓度为5％的CO₂。

8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述培养的时间为13～15天。

9.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述接种的细胞密度为4.5×10⁵个/mL～5.5×10⁵个/mL。

10.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述培养的过程中每3天补加权利要求1～4任意一项所述的NK细胞培养基。