CN113980900A - 一种nk细胞无动物源培养基以及nk细胞的培养方法 - Google Patents
一种nk细胞无动物源培养基以及nk细胞的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113980900A CN113980900A CN202111480539.8A CN202111480539A CN113980900A CN 113980900 A CN113980900 A CN 113980900A CN 202111480539 A CN202111480539 A CN 202111480539A CN 113980900 A CN113980900 A CN 113980900A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- algae
- cell
- culture medium
- extracting solution
- nut
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 52
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 8
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims abstract description 69
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 claims description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 16
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 15
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 10
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 10
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 235000006667 Aleurites moluccana Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 claims description 5
- 240000004957 Castanea mollissima Species 0.000 claims description 5
- 235000018244 Castanea mollissima Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000206751 Chrysophyceae Species 0.000 claims description 5
- 241000195620 Euglena Species 0.000 claims description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 5
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 claims description 2
- 241000758791 Juglandaceae Species 0.000 claims description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 abstract description 24
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 abstract description 24
- 238000012136 culture method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 6
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 4
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 4
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 4
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 3
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 3
- 241000758789 Juglans Species 0.000 description 3
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 3
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 3
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/76—Undefined extracts from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
- C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种NK细胞无动物源培养基以及NK细胞的培养方法，涉及细胞培养领域。该NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI‑1640为基础培养基、坚果提取液、单细胞藻类提取液、白介素‑2、白蛋白和抗生素，以每升所述RPMI‑1640基础培养基加入坚果提取液40～80ml、单细胞藻类提取液20～60ml、白介素‑2 30～80μg、白蛋白35～45g和抗生素8×105～106U。通过选取坚果和藻类进行提取，并将提取液加入基础培养基中，实现微量元素的供给，该方式微量元素的添加简单快捷。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种NK细胞无动物源培养基以及NK细胞的培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。
体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。
但是血清、血浆中的成分复杂，同时存在代谢产生废弃物。专利标题为“无血清、无动物源成分、组分明确的培养基及其应用”，专利申请号“CN201910201406.9”，其中微量元素的添加方式为逐一配置，配置过程繁琐，容易配置出错。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种NK细胞无动物源培养基以及NK细胞的培养方法，解决了无动物源培养基微量元素添加繁琐的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI-1640为基础培养基、坚果提取液、单细胞藻类提取液、白介素-2、白蛋白和抗生素，以每升所述RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液40～80ml、单细胞藻类提取液20～60ml、白介素-2 30～80μg、白蛋白35～45g和抗生素8×105～106U。
优选的，所述抗生素是青霉素或者链霉素中的一种。
优选的，所述坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比。
优选的，所述单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比。
优选的，所述坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，每3～5h进行搅拌一次，然后进行过滤，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
优选的，所述单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
根据一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
优选的，所述培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次。
(三)有益效果
本发明提供了一种NK细胞无动物源培养基以及NK细胞的培养方法。具备以下有益效果：
本发明，从坚果和藻类获得提取液，不仅简化了微量元素的补充的问题，还可以补充了NK细胞增殖其它的营养物质
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明实施例提供一种NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI-1640为基础培养基，且RPMI-1640采用无血清的类型，坚果提取液、单细胞藻类提取液，在细胞的增殖中需要到种类不同的微量元素，且微量元素的种类多，并且需要量小，微量元素的配置麻烦，且易于配置发生错误，故坚果提取液和单细胞藻类提取液，用于补充培养基中微量元素，同时操作简单，白介素-2，用于诱导NK细胞活性和增殖，白蛋白，提供类似血清的场景，抗生素，降低培养过程中，杂菌的滋生，以每升RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液40ml、单细胞藻类提取液60ml、白介素-2 30μg、白蛋白30g和抗生素8×105U。
抗生素是青霉素或者链霉素中的一种，坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比，坚果中的果仁中存储有植物生长的丰富的微量元素，单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比，藻类中也富含微量元素，同时也向培养基中补充组成细胞膜所需的磷酸酯，同时所选用的藻类均为对人体细胞无害。
坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，粉末状态的坚果，利于微量元素的浸出，每3～5h进行搅拌一次，促进微量元素的扩散，然后进行过滤，过滤的过程中，也需要去除其中的油脂，坚果中富含油脂，且该类油脂为大分子物质，不利于NK细胞的增殖，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，即在0.5～0.6个大气压下去除上清液中多余的水分，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，尽可能将藻类自身代谢物除去，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，所得的上清液澄清透明，无叶绿素的存在，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
根据一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养，培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
实施例二：
本发明实施例提供一种NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI-1640为基础培养基，且RPMI-1640采用无血清的类型，坚果提取液、单细胞藻类提取液，在细胞的增殖中需要到种类不同的微量元素，且微量元素的种类多，并且需要量小，微量元素的配置麻烦，且易于配置发生错误，故坚果提取液和单细胞藻类提取液，用于补充培养基中微量元素，同时操作简单，白介素-2，用于诱导NK细胞活性和增殖，白蛋白，提供类似血清的场景，抗生素，降低培养过程中，杂菌的滋生，以每升RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液60ml、单细胞藻类提取液40ml、白介素-2 65μg、白蛋白40g和抗生素9×105U。
抗生素是青霉素或者链霉素中的一种，坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比，坚果中的果仁中存储有植物生长的丰富的微量元素，单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比，藻类中也富含微量元素，同时也向培养基中补充组成细胞膜所需的磷酸酯，同时所选用的藻类均为对人体细胞无害。
坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，粉末状态的坚果，利于微量元素的浸出，每3～5h进行搅拌一次，促进微量元素的扩散，然后进行过滤，过滤的过程中，也需要去除其中的油脂，坚果中富含油脂，且该类油脂为大分子物质，不利于NK细胞的增殖，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，即在0.5～0.6个大气压下去除上清液中多余的水分，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，尽可能将藻类自身代谢物除去，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，所得的上清液澄清透明，无叶绿素的存在，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
根据一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养，培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
实施例三：
本发明实施例提供一种NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI-1640为基础培养基，且RPMI-1640采用无血清的类型，坚果提取液、单细胞藻类提取液，在细胞的增殖中需要到种类不同的微量元素，且微量元素的种类多，并且需要量小，微量元素的配置麻烦，且易于配置发生错误，故坚果提取液和单细胞藻类提取液，用于补充培养基中微量元素，同时操作简单，白介素-2，用于诱导NK细胞活性和增殖，白蛋白，提供类似血清的场景，抗生素，降低培养过程中，杂菌的滋生，以每升RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液80ml、单细胞藻类提取液20ml、白介素-2 80μg、白蛋白45g和抗生素106U。
抗生素是青霉素或者链霉素中的一种，坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比，坚果中的果仁中存储有植物生长的丰富的微量元素，单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比，藻类中也富含微量元素，同时也向培养基中补充组成细胞膜所需的磷酸酯，同时所选用的藻类均为对人体细胞无害。
坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，粉末状态的坚果，利于微量元素的浸出，每3～5h进行搅拌一次，促进微量元素的扩散，然后进行过滤，过滤的过程中，也需要去除其中的油脂，坚果中富含油脂，且该类油脂为大分子物质，不利于NK细胞的增殖，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，即在0.5～0.6个大气压下去除上清液中多余的水分，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，尽可能将藻类自身代谢物除去，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，所得的上清液澄清透明，无叶绿素的存在，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
根据一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养，培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
实施例四：
对实施例一至实施例三所制备的培养基进行培养，并设置对比组，对比组中的组分为将原先的坚果提取液、单细胞藻类提取液等量替换成胎牛血清，具体实验结果如下表：
从上表得出，施例一至实施例三所制备的培养基培养NK细胞，培养效果并不落于对比组，且有一定程度优于对比组。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于，包括以RPMI-1640为基础培养基、坚果提取液、单细胞藻类提取液、白介素-2、白蛋白和抗生素，以每升所述RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液40～80ml、单细胞藻类提取液20～60ml、白介素-2 30～80μg、白蛋白35～45g和抗生素8×105～106U。
2.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述抗生素是青霉素或者链霉素中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比。
4.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比。
5.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，每3～5h进行搅拌一次，然后进行过滤，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
6.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
7.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
8.根据权利要求7所述的NK细胞的培养方法，其特征在于：所述培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111480539.8A CN113980900A (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种nk细胞无动物源培养基以及nk细胞的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111480539.8A CN113980900A (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种nk细胞无动物源培养基以及nk细胞的培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113980900A true CN113980900A (zh) | 2022-01-28 |
Family
ID=79733331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111480539.8A Pending CN113980900A (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种nk细胞无动物源培养基以及nk细胞的培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113980900A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104894065A (zh) * | 2015-07-09 | 2015-09-09 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法 |
| CN110951684A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-03 | 吉林省中科生物工程股份有限公司 | 一种人外周血nk细胞培养体系及培养方法 |
-
2021
- 2021-12-06 CN CN202111480539.8A patent/CN113980900A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104894065A (zh) * | 2015-07-09 | 2015-09-09 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法 |
| CN110951684A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-03 | 吉林省中科生物工程股份有限公司 | 一种人外周血nk细胞培养体系及培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2878676A2 (en) | Method using micro-algae for high-efficiency production of astaxanthin | |
| CN102206590B (zh) | 一种草分枝杆菌Sq-1及复合微生态制剂的制备方法 | |
| CN104402575A (zh) | 一种牛樟芝培养基配方及牛樟芝的栽培方法 | |
| CN111560321A (zh) | 一种海洋红酵母高效发酵工艺 | |
| CN110352797A (zh) | 一种高活性杏鲍菇液体菌种的发酵方法 | |
| CN111248026A (zh) | 一种栎松茸培养基及其应用 | |
| CN103320379A (zh) | 番茄植物干细胞分离培养提取与口服液、饮料和白酒的制备方法 | |
| TW201742919A (zh) | 具有蛹蟲草的咖啡豆之製備方法及其咖啡豆 | |
| CN113980900A (zh) | 一种nk细胞无动物源培养基以及nk细胞的培养方法 | |
| CN110964761B (zh) | 一株银耳菌及其应用 | |
| CN111759863A (zh) | 一种含有间充质干细胞外泌体的冻干粉胶囊及其制备方法 | |
| CN117322559A (zh) | 一种海水鱼抗病促生长饲料添加剂及其制备方法 | |
| CN109055456A (zh) | 一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺 | |
| KR0179725B1 (ko) | 상황버섯 자실체의 비닐포트 재배방법 | |
| CN109076881B (zh) | 一种富硒猴头菇菌丝体的培养方法及其应用 | |
| CN111449241A (zh) | 一种提高海参皂甙提取液抗氧化能力的方法 | |
| CN113136321A (zh) | 异养-自养联合培养光合微生物的方法及其系统和生产生物质和生物能源的方法 | |
| CN110972806A (zh) | 朱红硫磺菌菌株培育方法、人工栽培方法 | |
| TW201506158A (zh) | 以超臨界萃取的糙米培養北冬蟲夏草之方法 | |
| CN116982516B (zh) | 一种在金耳混养中微生物群的培育工艺 | |
| CN109097422A (zh) | 一种提高小球藻多糖产量的方法 | |
| CN116548247B (zh) | 一种基于微生物技术的香菇培育方法 | |
| CN115232752B (zh) | 一种用于制备云芝菌丝体的深层液态发酵法及其应用 | |
| CN113559248A (zh) | 复方番茄干细胞分离培养提取与口服液制作方法及工艺 | |
| CN117210335B (zh) | 一种用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |