CN117210335B

CN117210335B - 一种用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法

Info

Publication number: CN117210335B
Application number: CN202310908857.2A
Authority: CN
Inventors: 万祥; 王鹏; 赵伏梅; 纪乐军; 蔡佳佳; 徐庆阳; 耿燕; 周帅
Original assignee: JIANGSU SHENHUA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: JIANGSU SHENHUA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2023-07-24
Filing date: 2023-07-24
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2043-07-24
Also published as: CN117210335A

Abstract

本发明公开了一种用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法，通过添加二次滤液，调节微生物生长环境，缩短菌体生长周期，提高菌体得率；通过溴化锂机组降温放罐，既有效预防菌体自溶导致腺苷流失，又节能环保。本发明有效解决了菌丝体发酵终点到提取终点之间因处理方式不同导致腺苷流失的技术问题，也为提高蝙蝠蛾拟青霉腺苷含量提供发酵端的新思路。

Description

一种用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及到一种用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法。

背景技术

冬虫夏草是一种珍贵的食药用真菌。其体内不仅含有丰富的营养物质，还含有能够对人体多种疾病有预防和治疗功效的功能性成分；比如核苷类、甾醇类、蝙蝠蛾拟青霉素类等。蝙蝠蛾拟青霉是一株从冬虫夏草中分离出来的寄生真菌，利用蝙蝠蛾拟青霉菌株通过深层液态发酵法产生的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中含有与冬虫夏草一致的功能性成分，其优势在于能够人工控制产生大量的菌丝体，同时菌丝体做为蝙蝠蛾拟青霉的初始形态，其多种功能性成分的含量高于子实体。此外，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中的腺苷含量也是考察蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉质量水平主要指标之一(中国药典规定腺苷含量≥0.2％为合格蝙蝠蛾拟青霉菌粉)。

腺苷是冬虫夏草中主要的功能性成分，它做为一种内源性核苷广泛分布在人体之中，对人体的许多系统和组织都具有重要的生理学功能。腺苷可通过核苷类物质的代谢途径参与到人体的免疫和代谢系统之中，对心血管疾病、慢性支气管炎、肝硬化、高血脂等疾病有显著的预防和治疗功效。

在实际大规模生产中，从发酵到提取最终得到的蝙蝠蛾拟青霉菌粉成品腺苷含量并不稳定，甚至会低于中国药典规定标准。究其原因，从发酵结束到烘干结束有一段处理时间，在这期间，菌丝就可能会出现腺苷流失的现象。

因此，本领域亟需在发酵端和提取端预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中腺苷的流失，从而获得高腺苷的蝙蝠蛾拟青霉菌粉。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，

制备蝙蝠蛾拟青霉种子培养液：

一级种子培养：将经扩大培养的菌种接种于灭菌后的液体种子培养基培养36～48小时，得到一级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液；

二级种子培养：将一级种子培养液接种于灭菌后的液体种子培养基培养24～36小时，得到二级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液；

发酵培养：将所得二级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液接种于发酵罐中利用发酵培养基及上批次经微滤膜过滤的二次滤液进行发酵，发酵过程中控制温度在26-28℃之间，在发酵液放罐前将温度降至16-18℃。

收集菌丝体：将发酵液先通过卧螺离心，再通过碟片离心，得到一次滤液和菌丝体，将一次滤液经微滤膜过滤得到截留菌丝和二次滤液，将所得的菌丝体合并烘干，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述液体种子培养基，包括，黄豆饼粉2％、葡萄糖2％、酵母浸粉0.4％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.02％、VB10.0001％、生物素0.0001％、多羟基聚醚0.05％。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述制备蝙蝠蛾拟青霉种子培养液，其中，一级种子培养的菌种接种量为0.1～2％(v/v)，二级种子培养的培养液接种量为10～20％(v/v)，发酵培养的培养液接种量为10～20％(v/v)。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述发酵培养基，包括，黄豆饼粉2％、葡萄糖3％、蛋白胨0.4％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.02％、VB10.0001％、多羟基聚醚0.05％。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述发酵培养，其中，在培养基灭菌前添加二次滤液。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述添加二次滤液，其中，二次滤液为发酵液先经过卧螺离心、碟片离心，再经过微滤膜得到的滤液，其中，二次滤液和水的占比各50％。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述收集菌丝体，其中，卧螺离心进料速度为2.2～2.3吨/小时，碟片离心机转速维持在6000rpm/min左右，微滤膜为陶瓷膜，孔径为50nm。

本发明的再一目的是，克服现有技术中的不足，提供一种预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，利用溴化锂机组在放罐前进行降温。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述溴化锂机组降温，包括，将灭菌及烘干过程中的尾气进行收集，利用尾气余热来进行降温。

本发明有益效果：

(1)通过本发明方法，使蝙蝠蛾拟青霉菌丝体生长周期缩短20％，最终得率提高20％以上，蝙蝠蛾拟青霉菌粉腺苷含量损失减少50％以上，得到的蝙蝠蛾拟青霉菌腺苷含量高达0.35％以上的同时，甘露醇含量稳定在12％以上。

(2)本发明采用降温放罐的方法，通过降低发酵温度，在不杀死蝙蝠蛾拟青霉活性的基础上，有效预防菌丝体生长过快而出现的自溶现象，从而降低腺苷流失的可能性；与补料方法相比，降温放罐从发酵终点解决了腺苷流失的问题，补料只是在发酵过程中缓解菌丝自溶，在发酵终点仍会面临腺苷流失的问题。

(3)本发明有效解决了灭菌、烘干过程中尾气的回收利用，与常规的降温方式(冷水机组和循环水)相比，比冷水机组更能降耗，也摆脱了循环水温度受季节影响的制约，在保证发酵液达到所需温度的同时，节能环保，也为提高尾气回收利用率提供了新思路。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更去·加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明中所用蝙蝠蛾拟青霉菌种的保藏编号为CGMCC 20758，具体参见遗传资源披露登记表；

本发明中所用原料来源见下表：

原料名称	来源
		黄豆饼粉	克东禹王大豆蛋白食品有限公司
葡萄糖	呼伦贝尔东北阜丰生物科技有限公司
		酵母浸粉	安琪酵母股份有限公司
蛋白胨	上海缘肽生物科技有限公司
		磷酸二氢钾	连云港科德食品配料有限公司
硫酸镁	连云港科德食品配料有限公司
		VB1	江西天新药业股份有限公司
生物素	江西天新药业股份有限公司
		多羟基聚醚	台湾陶氏化学股份有限公司

本发明中所用设备来源见下表：

设备名称	来源
		发酵罐	江苏岭南发酵设备有限公司
LWG4545-D-T3-W卧螺离心机	安徽普源分离机械制造有限公司
		DBY614碟式分离机	江苏巨能机械有限公司
陶瓷膜	三达膜科技(厦门)有限公司
		FZG-15低温真空干燥箱	常州市振兴干燥设备有限公司
溴化锂机组	双良节能系统股份有限公司

本发明中判断发酵终点的方法：还原糖降至0.5％以下；

本发明中计算蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的得率的方法：得率％＝菌粉重量kg/发酵液体积L*100％；

本发明中测定腺苷含量的方法为高效液相色谱法；

本发明中测定甘露醇含量的方法为硫代硫酸钠滴定法。

本发明中使用的菌株为所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株保存在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20758，保藏时间为2020年10月29日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例1

制备实验中所需培养基：

PDA培养基的组成为：马铃薯20.0％、葡萄糖2.0％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、VB11mg/L、琼脂1.3％；制备方法如下：

将40g土豆洗净、去皮切成1cm³左右小丁，加200ml纯化水煮沸30分钟后，4层纱布过滤沉淀，滤液用烧杯收集，然后向滤液中加入其它试剂搅拌溶解，最后加入纯化水定容；使用玻璃漏斗将培养基分装至中15ml试管中，加上硅胶塞装入小不锈钢网篮，然后连同接种用具一同放入真空灭菌器进行灭菌操作。灭菌温度：121℃；灭菌压力0.10MPa；灭菌时间：30分钟。灭菌好的培养基倾斜10°～15°放置，冷却凝固后形成斜面培养基。

蝙蝠蛾拟青霉种子液体培养基的组成为：黄豆饼粉2％、葡萄糖2％、酵母浸粉0.4％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.02％、VB10.0001％、生物素0.0001％、多羟基聚醚0.05％；制备方法如下：

将黄豆饼粉与饮用水按1:15比例混合，用电炉加热温度至煮沸时，保温30min，温度降至室温时，5000rpm离心，取滤液；然后将剩余的各组分混合，加水搅拌混匀，再加入黄豆饼粉滤液，搅拌均匀，补水定容；使用真空灭菌器灭菌，温度121℃，维持30min。

发酵罐培养基的组成为：黄豆饼粉2％、葡萄糖3％、蛋白胨0.4％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.02％、VB10.0001％、多羟基聚醚0.05％；制备方法如下：

将黄豆饼粉与饮用水按1:15比例混合，用煮料罐加热温度至煮沸时，保温30min，温度降至室温时，5000rpm离心，取滤液；然后将剩余的各组分混合，加水搅拌混匀，再加入黄豆饼粉滤液，搅拌均匀，补水定容；使用蒸汽灭菌，温度121℃，维持30min。

实施例2

活化菌种(保藏编号为CGMCC 20758)：用接种环取蝙蝠蛾拟青霉斜面，接种于PDA斜面，27℃培养2-4天得到蝙蝠蛾拟青霉菌丝块，在菌丝即可长满斜面时停止，同时目视观察，通过菌落初生时较平坦，白色，绒毛状，质地较紧密判断是否发生菌种污染的情况，

将蝙蝠蛾拟青霉菌丝块从PDA斜面接种到蝙蝠蛾拟青霉种子培养基(100ml)中，置于27℃摇床中，在200rpm条件下培养3天得到蝙蝠蛾拟青霉活化摇瓶菌液。

制备菌种：将活化摇瓶菌液移种至液体摇瓶培养基(1000ml)置于27℃摇床中，在200rpm条件下培养48小时得到蝙蝠蛾拟青霉扩大摇瓶菌液。

实施例3

将实施例2中经扩大培养的菌种按照接种量0.25％接种于灭菌后的液体种子培养基(400L)，27℃培养48小时，得到蝙蝠蛾拟青霉一级种子培养液；

将一级种子培养液按接种量10％接种于灭菌后的液体种子培养基(4000L)，27℃培养36小时，得到二级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液；

将所得二级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液按接种量10％接种于发酵罐(40000L)中利用发酵培养基和上批次的二次滤液进行27℃发酵，得发酵液；

将发酵液通过卧螺离心，控制主电机40Hz，副电机25Hz，进料速度为2.2吨/小时，在离心过程中，为了保证离心充分，可以对于主电机和副电机功率进行适当的提升，进料速度也可以依据实际情况进行0.1吨/小时的微调，再经过碟片离心机，转速维持在6000rpm/min左右，得到一次滤液和菌丝体；

将一次滤液通过孔径为50nm的陶瓷膜，操作温度为55℃，操作压力为进压3bar，出压1bar，得到二次滤液和菌丝体；

将所得的菌丝体在低温真空烘箱中以70℃温度下烘干，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体；

表1实施例3发酵中添加不同比例的二次滤液的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体得率及腺苷含量

本实施例未采取降温放罐措施，研究了添加不同比例的二次滤液对蝙蝠蛾拟青霉菌丝体得率及腺苷含量的影响。本发明优选了发酵中添加的二次滤液比例，由表1可知，随着比例的升高，菌体得率呈先上升后下降趋势，发酵周期呈先下降后上升趋势，比例占50％时，菌体得率最高，周期最短。说明50％的二次滤液更有利于加快菌体生长，从而提高菌体得率。

实施例4

将所得二级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液按接种量10％接种于发酵罐(40000L)中利用发酵培养基和上批次的一次滤液进行27℃发酵，得发酵液；

将发酵液通过卧螺离心，进料速度为2.2～2.3吨/小时，再经过碟片离心机，转速维持在6000rpm/min左右，得到一次滤液和菌丝体；

表2为实施例4发酵中添加不同比例的一次滤液的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体得率及腺苷含量

本实施例未降温放罐，研究了一次滤液添加量对发酵的影响。本发明对比了一次滤液和二次滤液添加效果，二次滤液更能营造出菌体生长的环境，从而达到提高得率，缩短周期的效果。由表2可知，添加一次滤液对菌体得率和生长周期未有显著影响。

实施例5

将所得二级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液按接种量10％接种于发酵罐(40000L)中利用发酵培养基和上批次的50％的二次滤液进行27℃发酵36小时，得发酵液；

在放罐前通过溴化锂机组将发酵液温度降至24-26℃。

再将发酵液通过卧螺离心，进料速度为2.2～2.3吨/小时，再经过碟片离心机，转速维持在6000rpm/min左右，得到一次滤液和菌丝体；

将所得的菌丝体在低温真空烘箱中以70℃温度下烘干，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体。

实施例6

在放罐前通过溴化锂机组将发酵液温度降至20-22℃。

实施例7

在放罐前通过溴化锂机组将发酵液温度降至16-18℃。

实施例8

在放罐前通过溴化锂机组将发酵液温度降至12-14℃。

实施例9

在放罐前通过蒸汽将发酵液温度升温至100℃，保温半小时后降为室温。

表3实施例5～9发酵终点不同处理方式对蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷的影响

	得率/％	腺苷/％	甘露醇/％
				对比例	1.75	0.16	8
实施例5	2.18	0.18	9
				实施例6	2.18	0.23	10
实施例7	2.18	0.35	14
				实施例8	2.15	0.32	12
实施例9	1.80	0.11	10

本发明通过溴化锂机组降温，在不杀死蝙蝠蛾拟青霉活性的基础上，有效预防菌丝体生长过快而出现的自溶现象；由实施例5-8可以看出，随着温度的降低，菌体得率先维持不变，当降至12-14℃时发酵液开始出现泡沫，导致菌体得率下降，另一方面菌体的腺苷含量随着温度的降低先升高后降低，在16-18℃时腺苷含量达到0.35％；由实施例9可以看出，将发酵液进行灭活并不能预防菌体腺苷流失，相反还会导致菌体腺苷含量降低。

本发明进行蝙蝠蛾拟青霉发酵液分离通过卧螺离心、碟片离心、陶瓷膜得到，采用这种分离方式能够实现自动连续作业，过滤精度覆盖面广，分离速度快，比起常规分离方式更加高效便捷。

本发明采用溴化锂机组进行降温，与传统方式相比，既减少碳排放，保护环境，也节约降温所需的能源消耗。

本发明有效解决了菌丝体发酵终点到提取终点之间因处理方式不同导致腺苷流失的技术问题，也为提高蝙蝠蛾拟青霉腺苷含量提供发酵端的新思路。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法，其特征在于：包括如下步骤:

制备蝙蝠蛾拟青霉种子培养液：制备PDA培养基，将PDA培养基作为种子培养液使用；

一级种子培养：将经过扩大的菌种接种在种子培养中进行培养，得到一级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液；

二级种子培养：将一级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液接种在培养基中培养制得二级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液；

发酵培养：将二级蝙蝠蛾拟青霉种子培养液接种在发胶罐中同时使用发酵培养基及上批次经微滤膜过滤的二次滤液进行发酵，放罐前进行降温处理；

所述降温处理的发酵过程中控制温度在26~28℃之间，在发酵液放罐前将温度降至16~18℃；

收集菌丝体：将发酵液进行离心，得到一次滤液和菌丝体，接着进行滤膜过滤得到菌丝和二次滤液，将得到的菌丝体合并烘干，得到蝙蝠蛾拟青霉菌丝体；

二次滤液为二次滤液为发酵液先经过卧螺离心、碟片离心，再经过微滤膜得到的滤液，其中，二次滤液的占比为50%；

所述卧螺离心进料速度为2.2~2.3吨/小时，碟片离心机转速维持在6000rpm/min左右，微滤膜为陶瓷膜，孔径为50nm；

所述降温为利用溴化锂机组回收灭菌和烘干过程中生产的尾气余热来进行降温。

2.根据权利要求1所述的用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法，其特征在于：所述种子培养液具体为按照重量计，黄豆饼粉2%、葡萄糖2%、酵母浸粉0.4%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.02%、VB10.0001%、生物素0.0001%、多羟基聚醚0.05%。

3.根据权利要求1或2所述的用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法，其特征在于：所述一级种子培养中，所述一级种子的菌种接种量为0.1～2％(v/v)，二级种子培养基中，菌种接种量为10～20％(v/v)，所述发酵培养中，菌种接种量为10～20％(v/v)。

4.根据权利要求1所述的用于预防蝙蝠蛾拟青霉菌丝体腺苷流失的方法，其特征在于：所述发酵培养中，按照重量计，发酵培养基组成为，黄豆饼粉2%、葡萄糖3%、蛋白胨0.4%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.02%、VB10.0001%、多羟基聚醚0.05%。