CN109266553B - 一种冻干保护剂、用其制备普洱茶用直投式冻干菌剂的方法与应用 - Google Patents

一种冻干保护剂、用其制备普洱茶用直投式冻干菌剂的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冻干保护剂、用其制备普洱茶用直投式冻干菌剂的方法与应用，该冻干保护剂，在制备普洱茶发酵用直投式冻干菌剂中使用，包括质量百分含量为5‑15wt％生茶汤、0.5‑10wt％蔗糖和余量的水；优选质量百分含量为8％‑12％生茶汤、4‑8％蔗糖和余量的水；更优选质量百分含量为10wt％生茶汤、6wt％蔗糖和余量的水。用本发明的冻干保护剂和方法制备得到的菌剂活菌含量高，存活率高，作为发酵剂时接种量小，能直接使用，避免了繁冗的扩大培养过程，既节约劳动力，缩短生产周期，又可有效地防止菌种在逐级扩培过程中污染及退化，保存管理方便，产品品质稳定，经简单复水处理后可直接作为种子菌株发酵普洱茶使用。

Description

一种冻干保护剂、用其制备普洱茶用直投式冻干菌剂的方法 与应用
技术领域
本发明涉及微生物制品技术领域，特别是涉及一种冻干保护剂，用于制备普洱茶用直投式冻干菌剂、该直投式冻干菌剂的制备方法及其在发酵普洱茶中的应用。
背景技术
目前，菌粉通常是由菌液经真空冷冻干燥的方法得到。真空冷冻干燥是将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为水蒸气除去的干燥方法，该方法分为冻结和干燥脱水两个阶段。由于真空冷冻干燥具有菌粉存活率高，能保持菌种形态、色泽，且复水性好，脱水彻底，保存期长，储存运输使用方便等特点，因此菌种的保存方法中真空冷冻干燥法是最有效的方法之一，对一般活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。
然而，在实际操作中，真空冷冻干燥时由于水的结晶、细胞的失水等情况，使得菌体容易出现死亡或损伤，对于菌种的保存、生产和使用非常不利。有报道称，菌体在无任何保护措施下真空冷冻干燥，其存活率很低，甚至低至0.1％。于是在许多生物制品的真空冷冻干燥过程中，常常采用低聚糖，尤其是二糖作为保护剂。这是因为二糖既能在冻结阶段中起到低温保护剂的作用；又能在干燥脱水阶段中发挥脱水保护剂的作用。
二糖可根据其还原性分为还原性二糖和非还原性二糖，就冻结阶段而言，无论还原性二糖还是非还原性二糖都具有很好的保护效果，但在生物制品真空冷冻干燥后的储存过程中，由于还原性二糖的存在会使得冻干品发生Maillard反应(蛋白质褐变反应)，最终导致冻干品发生变质。所以，在食品、药品以及生物制品的真空冷冻干燥过程中，非还原性二糖是常用的保护剂，其中又以蔗糖和海藻糖最为常用。
现有的发酵菌剂分为直投式菌剂和非直投式菌剂，非直投式菌剂在使用时需临时活化、扩培后才能接种，而直投式菌剂是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥菌剂，可直接加入处理后的原料进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理；有固体和液体两种形式，液体直投式菌剂储存时间较固体菌剂短，且不便于运输，而固体直投式菌剂存在制备周期长的缺点。
目前利用冻干技术制备和贮存各种工业菌种已有许多报道，如公开号为CN103087961 A的专利申请中公开了一种直投式霉豆渣发酵剂，公开号为CN 1915042 A的专利申请中公开了一种直投式酸奶发酵菌剂，公开号为CN 101002580 A的专利申请中公开了一种高活性泡菜直投式菌剂，这三篇专利文献中公开的方法，使用到的保护剂或者为脱脂奶粉、麦芽糊精和蔗糖，或者为谷氨酸钠、乳糖、甘油、聚乙烯吡咯烷酮和Vc，或者为麦芽糊精、吐温、海藻糖和蔗糖。这些保护剂用于普洱茶的发酵会影响普洱茶的香气和滋味。
目前大部分普洱茶的发酵仍采用自然接种微生物，也开始有专利文献采用分离自传统渥堆茶叶的微生物进行普洱茶的发酵。如：公开号为CN 102550723A的专利申请中公开了传统普洱茶微生物群种子在普洱茶发酵中的应用，公开号为CN 103371239A的专利申请中利用普洱茶中优势微生物进行普洱茶强化发酵，公开号为CN 101427717A的专利申请中公开了一种普洱茶发酵种曲的制备方法，公开号为CN 1752205A、CN 1752202A、CN1752203A、CN 101028023A、CN 101054556A的专利申请中分别将酿酒酵母真菌、黑曲霉真菌、米曲霉真菌、绿色木霉真菌、少根根霉真菌用于普洱茶的生产中。但这些文献中多以单菌种直接活化接种，或者多菌种混合直接真空冷冻干燥制曲接种，其它菌种未见报道，且已有报道中或者未将分离得到的微生物制成直投式菌剂，或者在制备菌剂过程中未使用冻干保护剂。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种冻干保护剂，在制备普洱茶发酵用直投式冻干菌剂中使用，包括质量百分含量为5-15wt％生茶汤、0.5-10wt％蔗糖和余量的水；优选质量百分含量为8％-12％生茶汤、4-8％蔗糖和余量的水；更优选质量百分含量为10wt％生茶汤、6wt％蔗糖和余量的水。
所述生茶汤的制作过程为：按重量份数，将10份晒青毛茶浸泡于100份水中，80-100℃下浸提30-60min；浸提后冷却，取上清液灭菌，即得生茶汤；优选的，所述灭菌为高压蒸汽灭菌10-15min。
所述直投式冻干菌剂含有的菌种为埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)，优选的，为保藏号CGMCC NO.8684的于2014年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物物中心。
第二方面，提供一种制备普洱茶发酵用直投式冻干菌剂的方法，包括菌种的活化、菌种的增殖培养、菌体收集、预冻、真空冷冻干燥，预冻时使用上述冻干保护剂。
所述预冻为：在由菌体组成的菌泥中按质量比1:1加入冻干保护剂，混合后在-40℃预冻至固体，得到预冻菌剂。
所述真空冷冻干燥为：将预冻得到的预冻菌剂在真空条件下继续-40℃干燥18-50h至含水量5％以下，即得到所述直投式冻干菌剂。
所述菌种的增殖培养为：将活化的菌种接至1/2YPD液体培养基中28-55℃增殖培养18-36h，得到增殖的菌液；
优选的，1/2YPD液体培养基包括大豆蛋白胨1wt％，酵母粉0.5wt％，葡萄糖1wt％和余量的水，pH4-8。
包括以下步骤：
(1)、菌种的活化：将埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)接种至YPD固体平板中28-55℃活化培养30-52h，挑取单菌落活化培养至第三代，得到活化的菌种；
优选的，YPD固体平板作为活化培养基，包括大豆蛋白胨2wt％，酵母粉1wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5wt％和余量的水，pH4-8(pH优选4-7)；
(2)、菌种的增殖培养：将步骤(1)活化的菌种接至1/2YPD液体培养基中28-55℃增殖培养18-36h，得到增殖的菌液；
(3)、菌体收集：将步骤(2)得到的增殖的菌液在0-4℃、7000-12000rpm离心10-20min，弃去上清液，得到菌泥；
(4)、预冻：在步骤(3)的菌泥中加入冻干保护剂，混合后-40℃预冻至固体，得到预冻菌剂；冻干保护剂与菌泥的质量比为1：1；
(5)、真空冷冻干燥：将步骤(4)的预冻菌剂在真空条件下继续-40℃干燥18-50h至含水量5％以下，得到所述直投式冻干菌剂。
第三方面，提供由上述方法制备得到的直投式冻干菌剂，包含的菌种为埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)，保藏号为CGMCC NO.8684。
第四方面，提供由上述方法制备得到的直投式冻干菌剂在人工可控发酵过程和普洱茶液态发酵过程中的应用，所述直投式冻干菌剂在发酵过程中直接对普洱生茶进行发酵，无需对菌种进行活化、扩培等其它预处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次采用真空冷冻干燥法制备直投式埃默森罗萨氏菌(Rasamsoniaemersonii)菌剂，用本发明的方法制备得到的直投式冻干菌剂活菌含量高，存活率高，作为发酵剂时接种量小(最低0.1％，而传统渥堆发酵接种量为5％-15％)，能直接使用，避免了繁冗的扩大培养过程，既节约劳动力，缩短生产周期，又可有效地防止菌种在逐级扩培过程中污染及退化，保存管理方便，易于控制生产工艺，产品品质稳定，经简单复水处理后可直接作为种子菌株发酵普洱茶使用。同时，本发明使用生茶汤和蔗糖作为冻干保护剂，相较于传统以脱脂牛奶作为保护剂具有以下优点：以发酵底物生茶汤作为主要保护介质在今后的发酵过程中不会引入外源物质来干扰茶叶发酵后的香气及滋味，同时添加茶叶本身含有的蔗糖作为冻干介质，在冻结和干燥过程中能够防止菌体活性组分发生变性。用本发明方法得到的直投式冻干菌剂能够在以下几个方面得以很好的应用：(1)普洱茶发酵用微生物资源的保存；(2)普洱茶渥堆发酵过程中人为干预接种的直投式发酵剂；(3)人工可控发酵过程中的直投式发酵剂；(4)普洱茶液态发酵过程中的直投式发酵剂。
附图说明
图1所示为实验2中发酵剂菌体的生长情况图。
具体实施方式
随着近年来采用纯培养、分子生物学及高通量测序等方法对普洱茶发酵过程中的微生物群落结构有了一定的认识后，发现目前普洱茶发酵过程中的优势菌为黑曲霉、青霉、酿酒酵母和米曲霉等。使用时，多为直接培养以上菌种，然后接种在茶叶上。另外，也有文献将部分菌株制作成菌剂，即在发酵茶叶前把发酵菌剂平板培养好，液体摇瓶扩大后直接接种发酵茶叶，或者先平板活化接种少量茶叶作为种子，再扩大接种茶叶。以上菌剂必须在较短的保质期内使用，且存活率较低。
本发明的发明人通过长期的探索，发现埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)是发酵普洱茶的重要菌，能赋予普洱熟茶木香显著、汤色红浓的特点，可以改进熟茶产品的品质和香气。而目前埃默森罗萨氏菌主要用于生产多酚氧化酶以及葡聚糖苷酶等酶类，用于直投式菌剂发酵普洱熟茶尚未见报道。
本发明提供的制备普洱茶发酵用直投式冻干菌剂的方法，包括以下步骤：
(1)、菌种的活化：将埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)接种至YPD固体平板中28-55℃活化培养30-52h，挑取单菌落接种于上述培养基(YPD固体平板)，在相同条件下活化至第三代，得到活化的菌种。
埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)，命名为TMCC70008，分离自大益传统熟茶渥堆发酵过程中，并于2014年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物物中心，其保藏号CGMCC NO.8684。
YPD固体平板作为活化培养基，包括大豆蛋白胨2wt％，酵母粉1wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5wt％，其余为水，pH4-8(优选4-7)。
(2)、菌种的增殖培养：将步骤(1)活化的菌种粉碎后接种至1/2YPD液体培养基中，28-55℃增殖培养18-36h，得到增殖的菌液；接种量为0.1g(湿重)菌种/150ml液体培养基。
1/2YPD液体培养基作为增殖培养基，包括大豆蛋白胨1wt％，酵母粉0.5wt％，葡萄糖1wt％，其余为水，pH4-8。
(3)、菌体收集：将步骤(2)得到的增殖的菌液在0-4℃、7000-12000rpm离心10-20min，弃去上清液，得到菌泥；
(4)、预冻：在步骤(3)的菌泥中加入冻干保护剂，混合均匀后在冻干机中常压下-40℃预冻至完全成为固体，得到预冻菌剂。
冻干保护剂与菌泥的质量比为1：1，冻干保护剂由质量百分含量为5-15wt％生茶汤、0.5-10wt％蔗糖和剩余的水组成。
其中生茶汤的制作过程为：按重量份数，先将10份晒青毛茶浸泡于100份蒸馏水中，80-100℃水浴温度下浸提30-60min；浸提后冷却至50℃，先滤除茶渣，然后12000rpm离心15min，得到上清液；115℃高压蒸汽灭菌10-15min，即得生茶汤。
(5)、真空冷冻干燥：将步骤(4)的预冻菌剂在冻干机中真空度15的条件下继续-40℃干燥18-48h至含水量5％以下,取样前2小时将真空度降为0以进一步除去水分，得到埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)TMCC70008的直投式冻干菌剂。
用本发明方法制备得到的直投式冻干菌剂存活率能达到为90％以上，活菌数为2.0×1010cfu/g以上；真空包装后于-80℃-4℃条件下至少可存放一年，存活率在85％以上。将该直投式冻干菌剂应用于普洱茶固态发酵中，只需0.1％-15％的接种量经36h发酵即可使埃默森罗萨氏菌进入对数期大量繁殖；将其应用于2％普洱生茶汤发酵转化中，只需0.1％-10％的接种量经36h发酵即可得到汤色红浓明亮且带有明显木香的熟茶。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
实施例1直投式冻干菌剂的制备
(1)、菌种的活化：
将埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)TMCC70008接种至无菌YPD固体平板，于50℃活化培养30h，挑取单菌落接种于上述相同培养基中，于相同条件下活化至第三代，得到活化的菌种；
YPD固体平板由2wt％大豆蛋白胨，1wt％酵母粉，2wt％葡萄糖、1.5wt％琼脂和余量的水组成，pH为6。
(2)、菌种的增殖培养：
将活化的菌种粉碎，按接种量为0.1g(湿重)菌种/150ml液体培养基接种于1/2YPD液体培养基中50℃恒温摇床上培养24h，得到增殖的菌液；
摇床转速为150rpm，1/2YPD液体培养基由1wt％大豆蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％葡萄糖和余量的水组成，pH为6。
(3)、菌体收集：
将上述增殖的菌液于4℃、9000rpm下离心20min，弃去上清液，得到菌泥；
(4)、预冻：
将菌泥分为若干等份，向每份菌泥中分别加入等质量的冻干保护剂，混合均匀后于常压下-40℃预冻至完全成为固体，得到预冻菌剂；冻干保护剂的配方及其中生茶汤的制作参数见表1。
(5)、真空冷冻干燥：
将预冻菌剂在真空度为15的条件下继续在-40℃真空冷冻干燥36h，取样前2小时将真空度降为0以进一步除去水分，即得若干份埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)TMCC70008的直投式冻干菌剂；4℃存放两个月后，该直投式冻干菌剂存活率和活菌数见表1。
表1冻干保护剂的配方及生茶汤的制作参数
由表1的结果可以看出，本发明的冻干保护剂在预冻和真空冷冻干燥过程中可以保护菌体不受损伤或者死亡，得到的直投式冻干菌剂的菌体存活率高达90％以上，活菌数可达1.2×1010cfu/g以上，而比较例1A-1F得到的冻干保护剂或者各组分不在本发明的范围内，或者制作参数不在本发明的范围内，用这样的冻干保护剂得到的冻干菌剂存活率不高于85％，活菌数不超过8.7×109cfu/g，比本发明低1-2个数量级。
以下实施例均采用实施例1A中的冻干保护剂。
实施例2直投式冻干菌剂的制备
(1)、菌种的活化：
将埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)TMCC70008接种至无菌YPD固体平板，于40℃活化培养52h，挑取单菌落接种于上述相同培养基中，于相同条件下活化至第三代，得到活化的菌种；
YPD固体平板由2wt％大豆蛋白胨，1wt％酵母粉，2wt％葡萄糖、1.5wt％琼脂和余量的水组成，pH为4。
(2)、菌种的增殖培养：
将活化的菌种按0.1g菌种对应150ml液体培养基的比例接种于1/2YPD液体培养基中40℃恒温摇床上培养22h，得到增殖的菌液；
摇床转速为150rpm，1/2YPD液体培养基由1wt％大豆蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％葡萄糖和余量的水组成，pH为4。
(3)、菌体收集：
将上述增殖的菌液于4℃、12000rpm下离心10min，弃去上清液，得到菌泥；
(4)、预冻：
向菌泥中加入等质量的实施例1A冻干保护剂，混合均匀后于-40℃预冻至固体，得到预冻菌剂。
(5)、真空冷冻干燥：
将预冻菌剂继续在-40℃、真空度＝15下真空冷冻干燥50h，取样前2小时将真空度降为0以进一步除去水分，即得若干份埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)TMCC70008的直投式冻干菌剂；4℃存放两个月后，该直投式冻干菌剂存活率为92％，活菌数为4.5×1010cfu/g。
实施例3直投式冻干菌剂的制备
(1)、菌种的活化：
将埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)TMCC70008接种至无菌YPD固体平板，于45℃活化培养36h，挑取单菌落接种于上述相同培养基中，于相同条件下活化至第三代，得到活化的菌种；
YPD固体平板由2wt％大豆蛋白胨，1wt％酵母粉，2wt％葡萄糖、1.5wt％琼脂和余量的水组成，pH为8。
(2)、菌种的增殖培养：
将活化的菌种接种于1/2YPD液体培养基中45℃恒温摇床上培养18h，得到增殖的菌液；
摇床转速为150rpm，1/2YPD液体培养基由1wt％大豆蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％葡萄糖和余量的水组成，pH为8。
(3)、菌体收集：
将上述增殖的菌液于0℃、7000rpm下离心20min，弃去上清液，得到菌泥；
(4)、预冻：
向菌泥中加入等质量的实施例1A冻干保护剂，混合均匀后于-40℃预冻6h成固体，得到预冻菌剂。
(5)、真空冷冻干燥：
将预冻菌剂继续在-40℃真空冷冻干燥18h，即得若干份埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)TMCC70008的直投式冻干菌剂；4℃存放两个月后，该直投式冻干菌剂存活率为91.3％，活菌数为3.6×1010cfu/g。
比较例1
(1)、菌种的活化：同实施例1；
(2)、菌种的增殖培养：
将活化的菌种按接种量为0.1g菌种/150ml培养基接种于1/2YPD液体培养基(pH＝8)中28℃恒温摇床上培养12h，得到增殖的菌液，摇床转速为150rpm。
(3)-(5)同实施例1。
得到的冻干菌剂4℃存放两个月后存活率为85％，活菌数为7.9×109cfu/g。4℃存放，每两个月定期涂布平板计活菌数，六个月时菌剂的存活率下降至67％，一年时存活率已下降至52％。分析原因可能是由于培养温度较低且培养时间不足，菌株仍处于对数初期，同等培养条件下收集到的菌体少，抵抗力低，所以后期存放过程中存活时间较短。可见，增殖培养过程中的培养时间对冻干菌剂的存活率有着重要影响，收集对数末期及稳定初期的菌体较对数初期的菌体冻干后的存活率高。
比较例2
(1)、菌种的活化：同实施例1；
(2)、菌种的增殖培养：
将活化的菌种接种于1/2YPD液体培养基(pH＝8)中55℃恒温摇床上培养38h，得到增殖的菌液，摇床转速为150rpm。
(3)-(5)同实施例1。
得到的冻干菌剂4℃存放两个月后存活率为77.8％，活菌数为9.3×108cfu/g。4℃存放，每两个月定期涂布平板计活菌数，六个月时菌剂的存活率下降至61％，一年时存活率已下降至44％。分析原因可能是由于培养时间过长，菌体处于稳定期末期开始衰老，对外界环境变化的抵抗力降低，所以后期存放过程中存活时间较短。可见，增殖培养过程中的培养时间对冻干菌剂的存活率有着重要影响，收集对数末期及稳定初期的菌体较稳定期末的菌体冻干后的存活率高。
比较例3
(1)-(3)同实施例1；
(4)、预冻：
将菌泥直接于-40℃预冻10h，得到预冻菌剂；
(5)、真空冷冻干燥：
将预冻菌剂真空冷冻干燥36h，得到直投式冻干菌剂。
该直投式冻干菌剂4℃存放两个月后存活率为60％，活菌数为9.4×107cfu/g。可见，不加冻干保护剂冻干过程中菌株的存活率低，活菌数与实施例1差了三个数量级。
比较例4
(1)-(3)同实施例1；
(4)、预冻：
向每克菌泥中按质量体积比1：1添加冻干保护剂，混合均匀后于-40℃预冻10h，得到预冻菌剂；冻干保护剂的配方为：6wt％蔗糖和94wt％蒸馏水。
(5)、真空冷冻干燥：同实施例1。
得到的直投式冻干菌剂4℃存放两个月后存活率为80％，活菌数为6.3×108cfu/g。可见，冻干保护剂中生茶汤和蔗糖的含量对冻干过程中菌株的存活率影响很大，加入生茶汤会提高冻干菌剂的存活率。
比较例5
(1)-(3)同实施例1：
(4)、预冻：
向每克菌泥中按质量体积比1：1添加冻干保护剂，混合均匀后于-40℃预冻10h，得到预冻菌剂；冻干保护剂的配方为：25wt％生茶汤、6wt％蔗糖和69wt％蒸馏水；生茶汤的制作过程同实施例1。
(5)、真空冷冻干燥：同实施例1。
得到的直投式冻干菌剂4℃存放两个月后存活率为70％，活菌数为3.3×108cfu/g。可见，冻干保护剂中生茶汤和蔗糖的含量对冻干过程中菌株的存活率影响很大，生茶汤含量过高也将造成冻干菌剂的存活率低。
比较例6
(1)-(3)同实施例1：
(4)、预冻：
向每克菌泥中按质量体积比1：1添加冻干保护剂，混合均匀后于-40℃预冻10h，得到预冻菌剂；冻干保护剂的配方为：10wt％生茶汤、20wt％蔗糖和70wt％蒸馏水；生茶汤的制作过程同实施例1。
(5)、真空冷冻干燥：同实施例1。
得到的直投式冻干菌剂4℃存放两个月后存活率为78.2％，活菌数为5.1×108cfu/g。可见，冻干保护剂中生茶汤和蔗糖的含量对冻干过程中菌株的存活率影响很大，蔗糖含量过高也将造成冻干菌剂的存活率低。
比较例7
(1)-(3)同实施例1：
(4)、预冻：
向每克菌泥中按质量体积比1：1添加冻干保护剂，混合均匀后于-40℃预冻10h，得到预冻菌剂；冻干保护剂的配方为公开号为CN 103087961A的专利申请的实施例1中运动发酵单胞菌的保护剂配方：10wt％脱脂乳、7wt％麦芽糊精、3wt％蔗糖、7wt％谷氨酸钠、5wt％山梨醇和余量的水。
(5)、真空冷冻干燥：同实施例1。
得到的直投式冻干菌剂4℃存放两个月后存活率为89.8％，活菌数为18×109cfu/g。虽在菌株存活率和活菌数较不使用冻干保护剂，有很大的提高，但仍显著低于本发明。此外，由于冻干保护剂中含有10wt％的脱脂乳，其作为外源物质在后续液体茶汤和固体茶叶发酵过程中对茶汤及茶叶的香气和口感产生影响，带异杂味；由于保护剂的干扰，木香不显著。而本发明的保护剂能赋予普洱熟茶木香显著、汤色红浓的特点。
实验1直投式冻干菌剂应用于人工可控发酵过程
(1)、固体茶叶灭菌：取云南大叶中晒青毛茶，潮水40％，间歇混匀，30min后分装于500ml锥形瓶，每瓶装样80g，3个平行，115℃灭菌15-20min，冷却备用。
(2)、直投式发酵剂接种：将实施例1-3得到的直投式发酵剂0.24g分别加入15ml无菌水中，按0.1wt％的接种量进行复水15-20min，向步骤(1)灭菌后的锥形瓶中接种5ml直投式发酵剂，混匀后置于50℃恒温摇床中静置培养。
(3)、涂布计数：每8小时，混匀茶叶，取5g发酵茶样品置于45ml无菌水中，50℃震荡混匀15min，浓度计为1；按10倍稀释梯度法进行稀释，选取10-2、10-4、10-6三个稀释度的样品于培养皿中，每皿150μl涂布于YPD固体平板，于50℃恒温培养箱中静置培养，40h后观察计数各时间段下的菌株生长情况。以实施例1为例，起始接种活菌数为3.1×103cfu/g，8小时活菌数为7.5×104cfu/g，16时活菌数为8.2×103cfu/g，24时活菌数为4.6×104cfu/g，32小时活菌数为1.7×105cfu/g，40小时活菌数为6.5×106cfu/g，48小时活菌数为9.1×107cfu/g。
可以发现，本发明得到的埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)TMCC70008的直投式冻干菌剂在固体茶叶中生长迅速，延滞期较短，36h即可在茶叶表面看到白色菌丝体，即进入对数期开始大量繁殖。
实验2直投式冻干菌剂应用于普洱茶液态发酵过程
(1)、生茶汤制作：取云南大叶中晒青毛茶9g，按茶、水重量比1：10于80℃条件下浸提30min，2层纱布过滤除去茶渣，将茶汤于高速冷冻离心机中4℃12000rpm离心15min，去除沉淀，将上清液定容至450ml，分装于三个500ml锥形瓶，每瓶装样150ml，115℃灭菌15min，冷却即得生茶汤，备用。
(2)、发酵剂接种：将实施例1-3所得的直投式冻干菌剂称取0.45g加入15ml无菌水中，按0.1wt％的接种量进行复水15-20min，得到发酵剂；向步骤(1)灭菌后的每个锥形瓶中接种5ml发酵剂，混匀后置于50℃恒温摇床中培养，转速为120rpm。每2小时取3ml生茶液态发酵液，用滤纸过滤称湿重(菌体重量可反映菌体密度，即生长情况)。以实施例1为例，结果见图1。
可以发现，本发明埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)TMCC70008的直投式冻干菌剂在生茶液态发酵液中生长迅速，延滞期较短，12h即进入对数期开始大量繁殖，茶汤颜色开始加深，留取12h、24h、36h、48h的发酵液各10ml，于高速冷冻离心机中4℃12000rpm离心15min，去沉淀，审评发现36h下TMCC70008发酵的生茶液其汤色红浓明亮，口感接近熟茶，苦涩感明显降低，且带有明显木香。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种制备普洱茶发酵用直投式冻干菌剂的方法，包括菌种的活化、菌种的增殖培养、菌体收集、预冻、真空冷冻干燥，其特征在于，预冻时使用一种冻干保护剂，其包括质量百分含量为5-15wt％生茶汤、0.5-10wt％蔗糖和余量的水，所述生茶汤的制作过程为：按重量份数，将10份晒青毛茶浸泡于100份水中，80-100℃下浸提30-60min；浸提后冷却，取上清液灭菌，即得生茶汤；
所述直投式冻干菌剂含有的菌种为于2014年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO.8684的埃默森罗萨氏菌(Rasamsoniaemersonii)。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括质量百分含量为8％-12％生茶汤、4-8％蔗糖和余量的水。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括质量百分含量为10wt％生茶汤、6wt％蔗糖和余量的水。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述灭菌为高压蒸汽灭菌10-15min。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述预冻为：在由菌体组成的菌泥中按质量比1:1加入冻干保护剂，混合后在-40℃预冻至固体，得到预冻菌剂。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥为：将预冻得到的预冻菌剂在真空条件下继续-40℃干燥18-50h至含水量5％以下，即得到所述直投式冻干菌剂。
7.根据权利要求1-6任一所述方法，其特征在于，所述菌种的增殖培养为：将活化的菌种接至1/2YPD液体培养基中28-55℃增殖培养18-36h，得到增殖的菌液。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述1/2YPD液体培养基包括大豆蛋白胨1wt％，酵母粉0.5wt％，葡萄糖1wt％和余量的水，pH 4-8。
9.根据权利要求1-6任一所述方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、菌种的活化：将埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)接种至YPD固体平板中28-55℃活化培养30-52h，挑取单菌落活化培养至第三代，得到活化的菌种；
(2)、菌种的增殖培养：将步骤(1)活化的菌种接至1/2YPD液体培养基中28-55℃增殖培养18-36h，得到增殖的菌液；
(3)、菌体收集：将步骤(2)得到的增殖的菌液在0-4℃、7000-12000rpm离心10-20min，弃去上清液，得到菌泥；
(4)、预冻：在步骤(3)的菌泥中加入冻干保护剂，混合后-40℃预冻至固体，得到预冻菌剂；冻干保护剂与菌泥的质量比为1：1；
(5)、真空冷冻干燥：将步骤(4)的预冻菌剂在真空条件下继续-40℃干燥18-50h至含水量5％以下，得到所述直投式冻干菌剂。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，步骤(1)中所述YPD固体平板作为活化培养基，包括大豆蛋白胨2wt％，酵母粉1wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5wt％和余量的水，pH4-8。
11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述YPD固体平板作为活化培养基，pH为4-7。
12.由权利要求1-11任一所述方法制备得到的直投式冻干菌剂。
13.由权利要求1-11任一所述方法制备得到的直投式冻干菌剂在人工可控发酵过程和普洱茶液态发酵过程中的应用，所述直投式冻干菌剂在发酵过程中直接对普洱生茶进行发酵，无需对菌种进行活化、扩培。
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