CN105670936A

CN105670936A - 一种毛栓菌菌株及其应用，以及加工普洱茶的方法

Info

Publication number: CN105670936A
Application number: CN201410667800.9A
Authority: CN
Inventors: 唐蜀昆; 高林瑞; 卢晓慧; 邹小林; 任万增; 童峰; 童一峰; 卢开阳; 黄华伟; 刘韬; 田飞
Original assignee: MENGHAI TEA INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: MENGHAI TEA INDUSTRY Co Ltd
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2034-11-20
Also published as: CN105670936B

Abstract

本发明涉及一种毛栓菌菌株及其应用，以及加工普洱茶的方法。所述毛栓菌菌株为毛栓菌(Trametes？hirsute)菌株，其保藏编号为CGMCC？No.8752。该菌株可用于普洱茶的加工。所述加工普洱茶的方法包括将分离纯化的毛栓菌(Trametes？hirsute)的菌体接种于大叶种晒青毛茶中，进行发酵培养。本发明能够使普洱茶的发酵品质在人工发酵条件下更易控制，发酵品质更稳定，可得到感官品质提高的普洱熟茶。此外，其还能够有效地促进普洱茶内含物质的转化，增加普洱茶的药理和保健功能，并且能够缩短发酵时间。

Description

一种毛栓菌菌株及其应用，以及加工普洱茶的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种毛栓菌(Trameteshirsute)菌株及其应用，以及加工普洱茶的方法。

背景技术

在普洱茶发酵中，不同类群的微生物在发酵周期内的变化显著不同，细菌在发酵中的早期较多，后期变少；放线菌早期不显著，后期有所发展；酵母在发酵前期很少，后期发展成为优势；丝状真菌由于能够利用多种碳源进行代谢，在发酵中占优势。这些变化是微生物之间颉抗作用的结果，也是代谢产物积累、茶叶内含物质转化的结果。由此形成了普洱茶特殊的色、香、味的特点。

茶叶中含有大量的生物活性成分，包括：茶多酚、茶色素、茶多糖、茶皂素、生物碱、芳香物质、维生素、氨基酸、微量元素等。很多微生物能够产生木聚糖酶和漆酶，木聚糖酶能够降解木质素，漆酶能够降解木质素、酚类等高分子物质。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。通过对该酶的合理开发利用，在农业上不仅可以减少化学药品的使用，而且可以降低生产成本和保护环境。例如：漆酶应用于葡萄酒的生产可以提高葡萄酒的稳定性，减少SO₂的使用；另外，漆酶在果汁生产中能够氧化儿茶素等物质从而促进果汁的澄清。

微生物资源丰富、代谢活跃，普洱茶发酵工艺革新的技术突破需要对微生物资源进行挖掘和开发利用。目前还没有从普洱茶渥堆发酵中分离得到毛栓菌(Trameteshirsute)、以及将该毛栓菌用于普洱茶的发酵加工中的报道。

发明内容

本发明提供了一种毛栓菌(Trameteshirsute)菌株及其应用，以及加工普洱茶的方法。

具体而言，本发明提供了：

一种毛栓菌(Trameteshirsute)菌株，其保藏编号为CGMCCNo.8752，已于2014年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

本发明还提供了一种加工普洱茶的方法，包括将分离纯化的毛栓菌(Trameteshirsute)的菌体接种于大叶种晒青毛茶中，进行发酵培养。

优选地，所述大叶种晒青毛茶为已潮水的大叶种晒青毛茶。

优选地，所述已潮水的大叶种晒青毛茶的含水量为基于潮水之前的晒青毛茶的总重量计为20-40％(m/m)。

优选地，将处于生长指数期的所述毛栓菌的菌体接种于所述的晒青毛茶中。

优选地，所述毛栓菌的接种量为每克晒青毛茶接种1.0×10⁵至6.4×10⁵个菌体。

优选地，在所述接种之前，对所述的晒青毛茶进行灭菌处理。

优选地，所述发酵培养在20-50℃的条件下发酵2-4周。

优选地，所述发酵培养在30-40℃的条件下进行。

优选地，在所述发酵培养时，对培养物进行补水。

优选地，在所述发酵培养时，对培养物进行翻堆。

优选地，所述毛栓菌为保藏编号为CGMCCNo.8752的毛栓菌菌株。

本发明还提供了毛栓菌(Trameteshirsute)在普洱茶加工中的应用。

优选地，所述毛栓菌为保藏编号为CGMCCNo.8752的毛栓菌菌株。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明首次从普洱茶渥堆发酵中分离得到毛栓菌(Trameteshirsute)，并且首次将该毛栓菌应用于普洱茶的发酵加工中。本发明发现，该毛栓菌能够使普洱茶的发酵品质在人工发酵条件下更易控制，发酵品质更稳定，可得到汤色红浓、滋味顺滑、甜感明显的普洱熟茶。此外，其还能够有效地促进普洱茶内含物质的转化，增加普洱茶的药理和保健功能，并且能够缩短发酵时间。在20-50℃条件下发酵2-4周，普洱茶中的茶氨酸含量为1.8-2.7％(m/m)，茶褐素含量为9.8-15％(m/m)，可溶性糖含量为1.6-3.2％(m/m)，水浸出物含量为34-39％(m/m)。另外，本发明通过进一步摸索和优化毛栓菌(Trameteshirsute)应用于普洱茶加工时的发酵条件，进一步改善了上述有益效果。

2.本发明提供了一种毛栓菌(Trameteshirsute)菌株，其保藏编号为CGMCCNo.8752。该菌株在普洱茶的发酵加工中尤其能够提供上述有益效果。

生物材料保藏信息

本发明提供的毛栓菌(Trameteshirsute)TMCC70006菌株已于2014年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.8752。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明一个方面提供了一种毛栓菌(Trameteshirsute)菌株(即，TMCC70006菌株)。该菌株已于2014年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.8752。

本发明所述的毛栓菌(Trameteshirsute)是一种多毛毛栓菌，有时也称为白腐菌。下文将该毛栓菌(Trameteshirsute)统称为“多毛毛栓菌”。

罗氏454测序(焦磷酸测序)技术已经广泛的应用于环境微生物的研究当中，为微生物群落结构组成的揭示提供了一种准确的分析技术方法。本发明的发明人通过大量的实验研究，应用454高通量测序技术和Miseq测序技术对普洱茶不同时期的渥堆发酵样品进行了分析，发现了多毛毛栓菌的存在，之后通过纯培养技术得到了所述TMCC70006菌株。

所述TMCC70006菌株在普洱茶的渥堆发酵过程中，利用传统渥堆普洱茶发酵样品，经分离、纯化培养等工序而获得。可使用常规的PDA培养基、SDA培养基、察氏培养基等多种培养基进行复苏活化。

所述TMCC70006菌株的形态学特征为：在PDA养基上培养24小时后开始生长，培养7天后菌落直径约为8cm；气生菌丝和基内菌丝均发达；菌落颜色为黄白色、浅黄色至淡褐色，菌落边缘较薄，生长温度范围10℃-50℃。

所述TMCC70006菌株的理化特征为：

(1)对TMCC70006菌株进行唯一碳源或唯一氮源利用实验呈阳性的物质如下：

(2)TMCC70006菌株的酶活性实验阳性结果如下：

序号	测定的酶	酶活性
			1	碱性磷酸盐酶	+
2	酯酶(C4)	+
			3	类脂酯酶(C8)	+
4	亮氨酸芳胺酶	+
			5	缬氨酸芳胺酶	+
6	胱氨酸芳胺酶	+
			7	胰蛋白酶	+
8	α-胰凝乳蛋白酶	+
			9	酸性磷酸酶	+
10	萘酚-AS-BI-磷酸水解酶	+
			11	α-半乳糖甙酶	+
12	β-糖醛酸甙酶	+
			13	α-葡萄糖甙酶	+
14	β-葡萄糖甙酶	+
			15	N-乙酰-葡萄糖胺酶	+
16	α-甘露糖甙酶	+

通过测序，所述TMCC70006菌株的18SrRNA基因序列如序列表中的序列1所示，ITS序列如序列表中的序列2所示。

本发明的TMCC70006菌株在普洱茶的发酵加工中具有特别良好的效果。将该TMCC70006菌株应用于普洱茶的渥堆发酵中能够使普洱茶的发酵品质在人工发酵条件下更易控制，发酵品质更稳定，可得到汤色红浓、滋味顺滑、甜感明显的普洱熟茶。此外，其还能够有效地促进普洱茶内含物质的转化，增加普洱茶的药理和保健功能，并且能够缩短发酵时间。

然而，传统的普洱茶发酵需要大概6-8周的时间，且刚出堆的熟茶堆味较重，汤色红褐略混，甜感不明显，需要经过一段时间的纯化才能达到较好的品质。

本发明另一个方面提供了一种加工普洱熟茶的方法，包括将分离纯化的毛栓菌(Trameteshirsute)的菌体接种于大叶种晒青毛茶中，进行发酵培养。

本发明的发明人发现当将多毛毛栓菌应用于普洱茶的发酵加工中时，其能够使普洱茶的发酵品质在人工发酵条件下更易控制，发酵品质更稳定，可得到汤色红浓、滋味顺滑、甜感明显的普洱熟茶。此外，其还能够有效地促进普洱茶内含物质的转化，增加普洱茶的药理和保健功能，并且能够缩短发酵时间。因此，本发明首次将纯化的毛栓菌真菌应用到了普洱茶的发酵加工中。

本发明的多毛毛栓菌能够分泌多酚氧化酶(包括漆酶)、木聚糖酶等。木聚糖酶能够降解木质素，使茶叶细胞壁物质部分水解，提高水浸出物和茶黄素含量。多酚氧化酶通过酶促作用将茶叶中的多酚物质氧化成茶黄素、茶红素和茶褐素等产物，促进普洱茶内含物质的转化，增加普洱茶的药理和保健功能，同时促进普洱茶茶汤晶莹剔透的品质。

优选地，在本发明的方法中，所述大叶种晒青毛茶为已潮水的大叶种晒青毛茶。所述已潮水的大叶种晒青毛茶的含水量优选为基于潮水之前的晒青毛茶的总重量计为20-40％(m/m)。

本文所用的术语“潮水”是指在渥堆前对晒青普洱毛茶人为加水至一定含水量。如本领域已知的，大叶种晒青毛茶是由大叶种茶树鲜叶经摊晾、杀青、揉捻、渥黄、干燥等工序制作而成的。

在提及已潮水的大叶种晒青毛茶的含水量时，其含水量按照以下公式计算：

含水量＝所加水的质量/加水之前晒青毛茶的总质量

优选地，将处于生长指数期的所述多毛毛栓菌的菌体接种于所述晒青毛茶中。生长指数期可通过用常规的方法描绘所述多毛毛栓菌的生长曲线来确定。

发明人通过大量的试验摸索发现，当接种的菌种浓度过低时，菌种繁殖慢，分泌的酶量少，发酵的时间会延长；当接种的菌种浓度过高时，菌种生长较快，茶叶内含物质消耗过多，这会造成发酵熟茶的口感淡，对品质影响较大。因此，优选地，所述多毛毛栓菌的接种量为每克晒青毛茶接种1.0×10⁵至6.4×10⁵个菌体，优选1.8×10⁵至2.2×10⁵个菌体，更优选2.0×10⁵至2.2×10⁵个菌体，最优选2.1×10⁵个菌体。

优选地，在所述接种之前，对所述的晒青毛茶进行灭菌处理，以进一步保证单菌发酵。

发明人还发现，当发酵短于2周时，由于发酵时间短，茶叶内含物质转化不完全，口感不丰富，不能形成熟茶甘后顺滑的品质特点；当发酵大于4周时，茶叶内含物质被过度利用，虽然汤色红浓透亮，但由于内含物质减少较多，造成了发酵熟茶的口感淡。因此，优选地，所述发酵培养在20-50℃的条件下发酵2-4周，更优选在30-40℃的条件下发酵2-4周。还优选地，在所述发酵培养时，对培养物进行补水，优选每周补水一次，每次补水的量可以为：以每次补水之前的培养物的总重量计为4-10％(v/m)，优选10％(v/m)。优选地，在所述发酵培养时，对培养物进行翻堆。

在所述发酵培养过程中，培养基可以使用PDA培养基(葡萄糖20g，土豆200g，琼脂糖2g，蒸馏水1000mL，pH自然(6.8-7.3))、ISP2号培养基(蛋白胨4g，葡萄糖4g，酵母浸膏5g，琼脂糖2g，蒸馏水1000mL，pH自然(6.8-7.3))等多种培养基进行培养，其中优选使用PDA培养基。

优选地，在本发明的方法中，所述多毛毛栓菌为上文所述的毛栓菌TMCC70006菌株。

本发明的又一个方面提供了毛栓菌(Trameteshirsute)在普洱茶加工中的应用。所述毛栓菌优选为上文所述的毛栓菌TMCC70006菌株。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

实施例

实施例1：毛栓菌TMCC70006菌株的分离纯化

从正在发酵的普洱茶渥堆(采集自勐海茶业有限责任公司)中采集新鲜样品，通过下文所述的纯化培养基分离得到300株多毛毛栓菌。经过形态观察和基因测序(委托深圳华大基因公司)分析，选取TMCC70006菌株。

分离纯化方法如下：

(1)纯化培养基准备：

培养基配方：酵母提取粉10g、葡萄糖10g、麦芽提取粉8g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH为自然状态(6.8-7.3)。

将配制好的培养基121℃灭菌30分钟，冷却至50℃左右，倒入无菌培养皿中，每皿约30ml，冷却凝固后备用；

(2)样品处理：取待分离的普洱茶发酵渥堆茶样，研磨粉碎，取10g，在超净台中加入到装有90ml无菌水的三角烧瓶中，振荡制成菌悬液，浓度记为10-1；

(3)稀释：按十倍稀释法逐步稀释，稀释5次为止，分别将浓度记为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。十倍稀释法是指下一管的菌悬液浓度是上一管的十分之一；

(4)接种：将标记有10^-3、10^-4、10^-5浓度的菌悬液分别取150μl注入到步骤(1)中已准制好的培养皿中(每个稀释度三个重复)，并用涂布棒均匀涂布。完成后，三个重复分别放置于20℃、30℃、40℃三个温度梯度下培养，每隔24小时观察一次；

(5)纯化：培养4天，挑取单菌落转接到固体PDA培养基中培养，多次划线纯化直至得到纯化菌株；

(6)选取TMCC70006菌株：经过形态观察和基因测序分析，选取TMCC70006菌株。

(7)毛栓菌菌剂制备：将纯化得到的TMCC70006菌株通过平板挑取单菌落接种于PDA液体培养基中，在摇床中以150rpm、35℃培养48小时至生长指数期。随后进行过滤，并将过滤得到的菌体收集于超低温冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司，型号LGJ-10)上冻干，备用。

实施例2：毛栓菌TMCC70006菌株的生产应用

将大叶种晒青毛茶(采集自勐海茶业有限责任公司)加水至含水量达到基于潮水之前的晒青毛茶的总重量计为35％(m/m)，121℃灭菌30分钟。将实施例1步骤7)得到的TMCC70006菌株的菌体溶于无菌水中，按每克晒青毛茶2.0×10⁵个菌体的量接种于所述灭菌后的晒青毛茶中，然后放置于35℃培养4周，以周为单位补水并翻堆，每次按照10％(v/m)(以每次补水之前的培养物的总重量计)的量补水。在一周后，TMCC70006菌株开始大量繁殖，并分泌多种酶，如多酚氧化酶、木聚糖酶，漆酶等。在木聚糖酶的作用下，木质素被降解，使茶叶细胞壁物质部分水解，提高了水浸出物和茶黄素含量。在多酚氧化酶的作用下，茶叶中的多酚物质氧化成茶黄素、茶红素和茶褐素等产物，促进普洱茶内含物质的转化，增加普洱茶的药理和保健功能，同时促进普洱茶茶汤晶莹剔透的品质。

通过该TMCC70006菌株单菌发酵的普洱茶，其感官品质为汤色红浓、滋味顺滑、甜感明显。茶氨酸含量为2.7％(m/m)，茶褐素含量为15％(m/m)，可溶性糖含量为3.2％(m/m)，水浸出物为37％(m/m)。其中，茶氨酸、茶褐素、可溶性糖、水浸出物的含量的测定方法均按照国家标准方法检测。

按照上述相同的方法，在不同的发酵条件下将TMCC70006菌株应用于普洱茶的发酵，同样获得了良好的效果。即，所得普洱茶的感官品质为汤色红浓、滋味顺滑、甜感明显，内含物质含量得到提高。具体数据请参见表1和表2。

表1：不同发酵条件下，TMCC70006菌株发酵普洱茶的内含物质检测结果：(发酵条件：40℃发酵4周；接种量单位：个菌体/克晒青毛茶)

表2：不同温度、时间下，TMCC70006菌株发酵普洱茶的内含物质检测结果：(接种量：每克晒青毛茶2.1×10⁵个菌体)

表3：传统的渥堆发酵普洱熟茶(渥堆发酵6周)(大益2012年7572普洱熟茶)的品质检测结果：

检测项目	水浸出物	茶氨酸	可溶性糖	茶褐素
					含量(m/m)	34.5％	2.3％	3.2％	10.2％

本实施例发酵的普洱熟茶与传统渥堆发酵的普洱熟茶相比，汤色、香气、滋味等感官品质提高(见表4)。

由本发明可知，将多毛毛栓菌应用于普洱茶的生产，不仅促进了普洱茶内含物质的转化，而且稳定了发酵的品质，得到了感官优良的普洱熟茶，并且相对于传统发酵(通常6-8周)缩短了发酵时间，为将来单菌株人工发酵提供了优良的微生物材料。

表4：实施例2发酵的普洱熟茶与传统渥堆发酵的普洱熟茶(渥堆发酵6周，大益2012年7572普洱熟茶)的感官评价比较：(+代表程度)

Claims

1.一种毛栓菌(Trameteshirsute)菌株，其保藏编号为CGMCCNo.8752。

2.一种加工普洱茶的方法，包括将分离纯化的毛栓菌(Trameteshirsute)的菌体接种于大叶种晒青毛茶中，进行发酵培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述大叶种晒青毛茶为已潮水的大叶种晒青毛茶。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述已潮水的大叶种晒青毛茶的含水量为基于潮水之前的晒青毛茶的总重量计为20-40％(m/m)。

5.根据权利要求2所述的方法，其中将处于生长指数期的所述毛栓菌的菌体接种于所述的晒青毛茶中。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述毛栓菌的接种量为每克晒青毛茶接种1.0×10⁵至6.4×10⁵个菌体。

7.根据权利要求2所述的方法，其中在所述接种之前，对所述的晒青毛茶进行灭菌处理。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述发酵培养在20-50℃的条件下发酵2-4周。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述发酵培养在30-40℃的条件下进行。

10.根据权利要求2所述的方法，其中在所述发酵培养时，对培养物进行补水。

11.根据权利要求2所述的方法，其中在所述发酵培养时，对培养物进行翻堆。

12.根据权利要求2所述的方法，其中所述毛栓菌为保藏编号为CGMCCNo.8752的毛栓菌菌株。

13.毛栓菌(Trameteshirsute)在普洱茶加工中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其中所述毛栓菌为保藏编号为CGMCCNo.8752的毛栓菌菌株。