CN106635829A - 一种桑黄颗粒菌种的制备方法 - Google Patents

一种桑黄颗粒菌种的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种桑黄颗粒菌种的制备方法，属于食用菌栽培技术领域。本发明的方法，以石膏粉、蔗糖、真菌激发子与熟化谷物的混合物作为培养基质；其特殊之处在于：采用带壳或带皮谷物作为颗粒菌种培养基质的主要材料，添加有真菌激发子。采用带壳或带皮谷物作为颗粒菌种的主要材料，营养丰富全面，可满足桑黄菌丝生长的需求，菌种活力强，接种后萌发点多，能缩短培养时间。相对没有添加真菌激发子的制备方法，在其他条件相同的情况下（培养时间相同的情况下），采用本发明的制备方法所获得的菌种胞外酶的活性明显提高，所得菌种的活性提高。

Description

一种桑黄颗粒菌种的制备方法
技术领域
本发明涉及一种桑黄颗粒菌种的制备方法，属于食用菌栽培技术领域。
背景技术
桑黄Sanghuangporus sanghuang是我国最为著名的药用真菌之一，专性寄生于桑属Morus树木上，分类学上隶属担子菌门Basidiomycota，伞菌纲Agaricomycetes，锈革孔菌目Hymenochaetales，锈革孔菌科Hymenochaetaceae，桑黄属Sanghuangporus。 据《药性论》记载：桑黄味微苦，性寒，在我国传统中药中用于治疗痢疾、盗汗、血崩、血淋、脐腹涩痛、脱肛泻血、带下、闭经；《神农本草经》将桑黄描述为“久服轻身不老延年”，还有解毒、提高消化系统机能的作用。一直以来，桑黄野生资源稀缺，且有日益枯竭的危险。面对巨大的市场需求，桑黄人工栽培具有巨大的市场前景和经济效益。
菌种作为桑黄人工栽培生产中的重要一环，至关重要。传统的原种、栽培种培养基材料多以木屑、棉籽壳等材料为主，采用塑料袋、大口罐头瓶或小口盐水瓶等进行封装。该类菌种生产方式，通常存在接种效率低，生长周期长，长满菌丝后结成块状，使用时不易将其捣碎，转接栽培种速度慢，捣碎后的菌种块也常因菌丝部分受损而影响定植速度和吃料效果，以及培养过程中因密封不严或通气过小等造成杂菌污染及菌丝缺氧、生长受抑制等情况发生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养周期短、菌种活力强的桑黄菌种制备方法。
技术方案
一种桑黄颗粒菌种的制备方法，包括以下步骤：
一、准备原料：带壳/带皮谷物、石膏粉、蔗糖和真菌激发子；其中，带壳谷物96-98％、石膏粉1-2％、蔗糖1-2％，三者的总量为100％，所述％为质量百分数；真菌激发子的质量为带壳谷物、石膏粉和蔗糖总质量的0.001-0.002％；
二、带壳谷物在水中浸泡至吸水充足，然后煮制至无白心时捞出、沥干表面水分，得熟化谷物；
三、将石膏粉、蔗糖、真菌激发子与熟化谷物混合，得培养基质；
四、将培养基质置于培养容器，然后灭菌；所述培养基质占培养容器体积的三分之二；
五、将桑黄液体菌种接种于培养容器中的培养基质，于25-30℃恒温、避光、静置培养至菌丝充满培养容器，即得桑黄颗粒菌种；
所述真菌激发子，其制备方法包括以下步骤：
（1）10g菌株菌丝体用200-400mL质量浓度为70%乙醇浸泡24h后，5000r/min离心20-30min，收集残渣；
（2）向步骤（1）收集的残渣中加入100-200mL蒸馏水，100℃提取1-2h，5000r/min离心20-30min，分别收集上清液、残渣；
（3）步骤（2）收集的残渣按步骤（2）的方法重复1次；
（4）合并步骤（2）和（3）收集的上清液，加入800-1600mL的质量浓度为95%乙醇醇沉24h，5000r/min离心30min后收集沉淀；所得沉淀即为真菌激发子；
所述菌株为T型异担子菌或薄多年卧孔菌。
用薄多年卧孔菌菌株制备的真菌激发子简称P激发子；用T型异担子菌菌株制备的真菌激发子简称H激发子。实验证明，本发明的这两种真菌激发子对桑黄颗粒菌种CMC酶、半纤维素酶和漆酶这三种胞外酶的酶活均有激发作用，即提高酶活。所述漆酶为含铜的多酚氧化酶。
本发明的制备方法，接种2-4天后，菌种萌发并开始吃料；接种10-15天，菌丝充满容器，培养结束。所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋，接种后萌发率可达100%。对于暂时不使用的颗粒菌种或用于菌种保藏的颗粒菌种，可用透明胶带密封瓶盖透气孔后，置4℃冰箱中，避光保藏1-2年，使用时取出即可，接种后萌发率仍可达100%。
相对没有添加真菌激发子的制备方法，在其他条件相同的情况下（培养时间相同的情况下），采用本发明的制备方法所获得的菌种胞外酶的活性明显提高，所得菌种的活性提高。
上述制备方法，真菌激发子的用量变化，会对制备方法及所制备的菌种产生影响。优选的，真菌激发子的质量为带壳谷物、石膏粉和蔗糖总质量的0.0015％。
上述制备方法，所述谷物可以谷子、高粱、大麦、小麦、玉米等。选择不同的谷物，所制备的菌种萌发及菌丝生长速度以及菌种生长状态等均存在差异，优选为谷子。
上述制备方法，桑黄液体菌种以50mL/kg的接种量接种后第5-8天，晃动培养容器，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀，以增加发菌点，促进培养速度。
上述制备方法，所用容器为配有通气滤膜瓶盖的组培瓶。组培瓶身透明，便于随时观察菌种生长情况及有无杂菌污染，瓶盖所带滤膜可有效保证菌种培养过程中对无菌空气的需求，瓶盖为螺旋式上紧，密封性好，相比传统方式操作更加简便、防污染及通气保障更加有效；组培瓶形状规整，可多层摞放，有效增加空间利用率，便于运输及储藏。
有益效果
与传统的桑黄原种生产方式相比，本发明提供了一种简单易操作的桑黄颗粒菌种配方及制备方法，使接种效率、菌种活力及成功率均有效提高，并适宜进行大规模生产。具体来说：
本发明采用带壳或带皮谷物作为颗粒菌种的主要材料，营养丰富全面，可满足桑黄菌丝生长的需求，菌种活力强；本发明中颗粒菌种采用桑黄液体菌种进行接种，接种后萌发点多，能缩短培养时间；
本发明在带壳或带皮谷物中添加有真菌激发子，能激发桑黄颗粒菌种胞外酶的酶活，从而使得菌种活力强，可将传统菌种培养时间从1-3个月缩短到10-15天；
本发明所获得颗粒菌种为分散颗粒状菌种，可有效避免传统菌种使用过程中，因捣碎接种块而造成的菌丝损伤，有效保证菌种活力，另颗粒状分散菌种发菌点多，用于栽培用种量少、成活快、封面早，产量可提高10-20％以上；
本发明颗粒菌种培养所用容器为配有通气滤膜瓶盖的组培瓶，瓶身透明，便于随时观察菌种生长情况及有无杂菌污染，瓶盖所带滤膜可有效保证菌种培养过程中对无菌空气的需求，瓶盖为螺旋式上紧，密封性好，相比传统方式操作更加简便、防污染及通气保障更加有效；
本发明颗粒菌种培养所用组培瓶形状规整，可多层摞放，有效增加空间利用率，便于运输及储藏；
本发明颗粒菌种所用组培瓶可多次循环使用，整体生产成本低，便于推广应用。
具体实施方式
实施例1
桑黄液体菌种的制备：
将桑黄母种无菌操作接种于液体菌种培养基中进行震荡培养，培养条件为：温度26℃、摇床转速150r/min、避光振荡培养5天，即得桑黄液体菌种；液体培养基组成：玉米粉40g/L、葡萄糖25g/L、酵母抽提物10g/L、麸皮20g/L、KH2PO4 1.25g/L、MgSO4·7H2O 0.625g/L、去离子水余量。
实施例2
真菌激发子的制备：
（1）10g菌株菌丝体用200-400mL质量浓度为的70%乙醇浸泡24h后，5000r/min离心20-30min，收集残渣；
（2）向步骤（1）收集的残渣中加入100-200mL蒸馏水，100℃提取1-2h，5000r/min离心20-30min，分别收集上清液、残渣；
（3）步骤（2）收集的残渣按步骤（2）方法重复1次；
（4）合并步骤（2）和（3）收集的上清液，加入800-1600mL的质量浓度为95%乙醇醇沉24h，5000r/min离心30min后收集沉淀；所得沉淀即为真菌激发子；
所述菌株为T型异担子菌或薄多年卧孔菌。用薄多年卧孔菌菌株制备的真菌激发子简称P激发子；用T型异担子菌菌株制备的真菌激发子简称H激发子。
实施例3
桑黄颗粒菌种的制备：
（1）材料的选择：选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料；
（2）材料预处理：称取98kg带壳谷子，在自来水中浸泡12小时，确保吸水充足；
（3）沸水煮制：将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内，加水没过料面3cm，逐渐加温至水沸，谷子煮制熟而不烂，无白心时，即可捞出沥水；
（4）拌料：将沥干表面水分的谷子加入1kg石膏粉、1kg蔗糖和1.5g实施例2制备的H激发子后，搅拌均匀；
（5）装瓶：选用240mL组培瓶，将拌好的料装至总体积的三分之二后，拧上带有通气滤膜的瓶盖；
（6）灭菌：将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中，121℃，高压蒸汽灭菌2小时；
（7）接种：待料温降至30℃以下时，无菌操作，以5mL/瓶的接种量，接入实施例1制备的桑黄液体菌种；
（8）培养：接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中，避光静置培养；
（9）摇瓶：接种1天后，菌种萌发并开始吃料，接种后5天时，晃动组培瓶，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀，增加发菌点，促进培养速度；
（10）培养结束：接种后10天，菌丝满瓶，培养结束，即得桑黄颗粒菌种；所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋，接种后成活率可达100%。
实施例4
桑黄颗粒菌种的制备：
（1）材料的选择：选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料；
（2）材料预处理：称取98kg带壳谷子，在自来水中浸泡12小时，确保吸水充足；
（3）沸水煮制：将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内，加水没过料面3cm，逐渐加温至水沸，谷子煮制熟而不烂，无白心时，即可捞出沥水；
（4）拌料：将沥干表面水分的谷子加入1kg石膏粉、1kg蔗糖和1.0g实施例2制备的H激发子后，搅拌均匀；
（5）装瓶：选用240mL组培瓶，将拌好的料装至总体积的三分之二后，拧上带有通气滤膜的瓶盖；
（6）灭菌：将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中，121℃，高压蒸汽灭菌2小时；
（7）接种：待料温降至30℃以下时，无菌操作，以5mL/瓶的接种量，接入实施例1制备的桑黄液体菌种；
（8）培养：接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中，避光静置培养；
（9）摇瓶：接种2天后，菌种萌发并开始吃料，接种后5天时，晃动组培瓶，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀，增加发菌点，促进培养速度；
（10）培养结束：接种后11天，菌丝满瓶，培养结束，即得桑黄颗粒菌种；所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋，接种后成活率可达100%。
实施例5
桑黄颗粒菌种的制备：
（1）材料的选择：选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料；
（2）材料预处理：称取98kg带壳谷子，在自来水中浸泡12小时，确保吸水充足；
（3）沸水煮制：将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内，加水没过料面3cm，逐渐加温至水沸，谷子煮制熟而不烂，无白心时，即可捞出沥水；
（4）拌料：将沥干表面水分的谷子加入1kg石膏粉、1kg蔗糖和2.0g实施例2制备的H激发子后，搅拌均匀；
（5）装瓶：选用240mL组培瓶，将拌好的料装至总体积的三分之二后，拧上带有通气滤膜的瓶盖；
（6）灭菌：将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中，121℃，高压蒸汽灭菌2小时；
（7）接种：待料温降至30℃以下时，无菌操作，以5mL/瓶的接种量，接入实施例1制备的桑黄液体菌种；
（8）培养：接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中，避光静置培养；
（9）摇瓶：接种2天后，菌种萌发并开始吃料，接种后5天时，晃动组培瓶，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀，增加发菌点，促进培养速度；
（10）培养结束：接种后10天，菌丝满瓶，培养结束，即得桑黄颗粒菌种；所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋，接种后成活率可达100%。
实施例6
（1）材料的选择：选择带壳高粱作为颗粒菌种的主要材料；
（2）材料预处理：称取97kg带壳高粱，在自来水中浸泡18小时，确保吸水充足；
（3）沸水煮制：将浸泡后吸水充足的高粱转入锅内，加水没过料面3cm，逐渐加温至水沸，高粱煮制熟而不烂，无白心时，即可捞出沥水；
（4）拌料：将沥干表面水分的高粱加入1.5kg石膏粉、1.5kg蔗糖和1.5g实施例2制备的H激发子后，搅拌均匀；
（5）装瓶：选用240mL组培瓶，将拌好的料装至总体积的三分之二后，拧上带有通气滤膜的瓶盖；
（6）灭菌：将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中，121℃，高压蒸汽灭菌2.5小时；
（7）接种：待料温降至30℃以下时，无菌操作，以4mL/瓶的接种量，接入实施例1制备的桑黄液体菌种；
（8）培养：接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中，避光静置培养；
（9）摇瓶：接种3天后，菌种萌发并开始吃料，接种后7天时，晃动组培瓶，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀，增加发菌点，促进培养速度；
（10）培养结束：接种后14天，菌丝满瓶，培养结束，即得桑黄颗粒菌种；所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋，接种后成活率可达100%。
实施例7
（1）材料的选择：选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料；
（2）材料预处理：称取96kg带壳谷子，在自来水中浸泡18小时，确保吸水充足；
（3）沸水煮制：将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内，加水没过料面3cm，逐渐加温至水沸，谷子煮制熟而不烂，无白心时，即可捞出沥水；
（4）拌料：将沥干表面水分的谷子加入2kg石膏粉、2kg蔗糖和1.5g实施例2制备的H激发子后，搅拌均匀；
（5）装瓶：选用240mL组培瓶，将拌好的料装至总体积的三分之二后，拧上带有通气滤膜的瓶盖；
（6）灭菌：将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中，121℃，高压蒸汽灭菌2.5小时；
（7）接种：待料温降至30℃以下时，无菌操作，以4mL/瓶的接种量，接入实施例1制备的桑黄液体菌种；
（8）培养：接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中，避光静置培养；
（9）摇瓶：接种2天后，菌种萌发并开始吃料，接种后6天时，晃动组培瓶，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀，增加发菌点，促进培养速度；
（10）培养结束：接种后12天，菌丝满瓶，培养结束，即得桑黄颗粒菌种；所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋，接种后成活率可达100%。
对比例1
桑黄颗粒菌种的制备：
（1）材料的选择：选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料；
（2）材料预处理：称取98kg带壳谷子，在自来水中浸泡12小时，确保吸水充足；
（3）沸水煮制：将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内，加水没过料面3cm，逐渐加温至水沸，谷子煮制熟而不烂，无白心时，即可捞出沥水；
（4）拌料：将沥干表面水分的谷子加入1kg石膏粉和1kg蔗糖后，搅拌均匀；
（5）装瓶：选用240mL组培瓶，将拌好的料装至总体积的三分之二后，拧上带有通气滤膜的瓶盖；
（6）灭菌：将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中，121℃，高压蒸汽灭菌2小时；
（7）接种：待料温降至30℃以下时，无菌操作，以5mL/瓶的接种量，接入实施例1制备的桑黄液体菌种；
（8）培养：接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中，避光静置培养；
（9）摇瓶：接种2天后，菌种萌发并开始吃料，接种后6天时，晃动组培瓶，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀，增加发菌点，促进培养速度；
（10）培养结束：接种后13天，菌丝满瓶，培养结束，即得桑黄颗粒菌种；所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋，接种后成活率可达100%。
对比例2
（1）取木屑85g、麸皮10.5g、玉米粉2g、石膏粉1g、磷酸二氢钾0.5g和蔗糖1g混合均匀，得拌料；拌料与水按照1：1.2的质量比混合均匀，得培养基；
（2）装瓶：选用240mL组培瓶，将培养基装至总体积的三分之二后，拧上带有通气滤膜的瓶盖；
（3）灭菌：将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中，121℃，高压蒸汽灭菌2小时；
（4）接种：待料温降至30℃以下时，无菌操作，以5mL/瓶的接种量，接入实施例1制备的桑黄液体菌种
（5）培养：接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中，避光静置培养；；
（6）摇瓶：接种5天后，菌种萌发并开始吃料，接种后9天时，晃动组培瓶，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀，增加发菌点，促进培养速度；；
（7）培养结束：接种后18天，菌丝满瓶，培养结束，即得桑黄菌种；所得菌种可用于转接栽培种或栽培袋，接种后成活率可达99%。
对比例3
（1）取木屑45g、棉籽壳40g、麸皮10g、玉米粉2g、石膏粉1g、磷酸二氢钾1g和蔗糖1g混合均匀，得拌料；拌料与水按照1：1.2的质量比混合均匀，得培养基；
（2）装瓶：选用240mL组培瓶，将培养基装至总体积的三分之二后，拧上带有通气滤膜的瓶盖；
（3）灭菌：将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中，121℃，高压蒸汽灭菌2小时；
（4）接种：待料温降至30℃以下时，无菌操作，以5mL/瓶的接种量，接入实施例1制备的桑黄液体菌种
（5）培养：接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中，避光静置培养；；
（6）摇瓶：接种6天后，菌种萌发并开始吃料，接种后11天时，晃动组培瓶，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀，增加发菌点，促进培养速度；；
（7）培养结束：接种后21天，菌丝满瓶，培养结束，即得桑黄菌种；所得二级菌种可用于转接栽培种或栽培袋，接种后成活率可达98%。
效果实验：
分别观察实施例3-7、对比例1接种10天后组培瓶中菌丝的分布状态；分别取实施例3-7、对比例1-3接种10天后的培养产物，检测其胞外酶酶活（采用常规方法检测酶活即可，单位为U/g，即每g培养产物的酶活）；结果如表1所示；
表1
CMC酶酶活 半纤维素酶酶活 漆酶酶活
实施例3 19.97U/g 11.76U/g 5.31U/g
实施例4 18.79U/g 10.35U/g 5.09U/g
实施例5 19.54U/g 11.29U/g 5.27U/g
实施例6 19.05U/g 11.31U/g 5.18U/g
实施例7 18.93U/g 10.52U/g 5.07U/g
对比例1 11.4U/g 8.49U/g 2.07U/g
对比例2 3.77U/g 4.34U/g 0.99U/g
对比例3 2.95U/g 1.99U/g 2.55U/g
另外，本发明采用实施例1制备的P激发子代替实施例3-7中的H激发子；所获得的培养产物的酶活与实施例3-7的相当。

Claims (5)

1.一种桑黄颗粒菌种的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、准备原料：带壳/带皮谷物、石膏粉、蔗糖和真菌激发子；其中，带壳谷物96-98％、石膏粉1-2％、蔗糖1-2％，三者的总量为100％，所述％为质量百分数；真菌激发子的质量为带壳谷物、石膏粉和蔗糖总质量的0.001-0.002％；
二、带壳谷物在水中浸泡至吸水充足，然后煮制至无白心时捞出、沥干表面水分，得熟化谷物；
三、将石膏粉、蔗糖、真菌激发子与熟化谷物混合，得培养基质；
四、将培养基质置于培养容器，然后灭菌；所述培养基质占培养容器体积的三分之二；
五、将桑黄液体菌种接种于培养容器中的培养基质，于25-30℃恒温、避光、静置培养至菌丝充满培养容器，即得桑黄颗粒菌种；
所述真菌激发子，其制备方法包括以下步骤：
（1）10g菌株菌丝体用200-400mL质量浓度为70%乙醇浸泡24h后，5000r/min离心20-30min，收集残渣；
（2）向步骤（1）收集的残渣中加入100-200mL蒸馏水，100℃提取1-2h，5000r/min离心20-30min，分别收集上清液、残渣；
（3）步骤（2）收集的残渣按步骤（2）的方法重复1次；
（4）合并步骤（2）和（3）收集的上清液，加入800-1600mL的质量浓度为95%乙醇醇沉24h，5000r/min离心30min后收集沉淀；所得沉淀即为真菌激发子；
所述菌株为T型异担子菌或薄多年卧孔菌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，真菌激发子的质量为带壳谷物、石膏粉和蔗糖总质量的0.0015％。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述谷物为谷子、高粱、大麦、小麦、玉米。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，桑黄液体菌种以50mL/kg的接种量接种后第5-8天，晃动培养容器，使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所用容器为配有通气滤膜瓶盖的组培瓶。
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