TWI583789B - 木黴菌之固態培養基及製備方法 - Google Patents

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木黴菌之固態培養基及製備方法
本發明有關於木黴菌(Trichoderma)的培養方法，主要利用固態培養基，大量生產菌株的分生孢子(conidia)及其繁殖體(propagules)。
木黴菌(Trichoderma)屬於半知菌亞門、絲孢菌綱、絲孢菌目，粘孢菌類，是自然界中普遍存在的一類真菌，在土壤、植物根圍、葉圍、種子、球莖表面經常可以分離到。木黴菌是一類有重要生物防治價值的拮抗性真菌，如哈茨木黴(Trichoderma harzianum)、鉤狀木黴(Trichoderma hamatum)、綠色木黴(Trichoderma viride)可以防治真菌病害。現在已經明確其作用機制，包括產生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、競爭作用等。此外，木黴還有刺激植物生長，增加產量的作用。試驗表明，木黴生物制劑對許多農作物、蔬菜、花丼、煙草的猝倒病、立枯病、白絹病、黑脛病、根腐病、霜黴病、赤星病等有良好的防治效果。應用木黴生物製劑防治土傳病害是安全、無污染的防治技術。木黴菌在其生長週期內可以產生三種繁殖體，包括菌絲體、厚垣孢子和分生孢子。目前生產上常用的木黴菌劑多為它的活分生孢子製劑。
木黴菌的培養方法包括液態培養和固態培養。
液態培養之相關文獻：
中國專利申請號200610057339.0揭露木黴菌液體深層發酵以產生厚膜孢子的方法，其液態培養基含有以下重量百分比的物質：2.0~3.5%澱粉，1.0~2.0%酵母粉，4.0~8.0%玉米漿，0.1~0.5%的CaCO3，0.01~0.02%的Zn2+、0.01~0.03%的Mg2+，餘量為水。發酵控制參數包括：溫度控制，發酵第0-40小時，28℃；發酵40小時以後，26℃；通氣量(v/v)：0~10小時：1：0.6，10~40小時：1：1，40小時以後：1：0.6；攪拌速度，180rpm。發酵過程中進行補料，於發酵前期(24~26小時)補料2%(w/v)澱粉，於發酵中後期(60~63小時)補澱粉2%(w/v)。以10%(v/v)木黴菌接種量於培養基，最終每毫升發酵液可產108數量級的厚膜孢子
中國專利申請號200910112607，揭露一種液態深層發酵製備木黴分生孢子的方法，採用液態發酵培養基，所述發酵培養基按質量百分比的組成為脫皮後的馬鈴薯8%~16%，葡萄糖0.7%~2%，餘為水。發酵控制參數包括：培養條件為28~30℃，攪拌速度為90~120rpm，通氣量(V/V)0~12h時，為I：0.6~0.8，12h後，為I：1，在發酵罐中發酵5~7天，得木黴分生孢子，可達1.31×108個/ml。
固態培養基相關文獻如下：
中華民國發明專利I303277，揭露以固態培養基培養木黴菌分生孢子的方法，其固態培養基之成分包括：阿泰母石(55~61wt%)、麥粉(5~10wt%)、米糠(1~5wt%)及水(27~32wt%)。以分生孢子懸浮液(107conidia/ml)作為接種源，接種於固態培養基，置入25~28℃恆溫的無菌培養室，並給予適當的照光量300~500lux，分別培養7~14天，可以大量形成成熟的分生孢子或繁殖體。
中華民國發明專利公開200607855，揭露一種以固態培養基配方以發酵生產木黴菌分生孢子，其係以0.1%~4%的稻殼或米、500ml自來水、0.5%~5%米糠、0.5%~3%玉米浸粉、0.3%~5%蔗渣、0.1%~3.5%相思木屑以及米配製成100%的培養基配方，將米蒸煮後再與其它成份攪拌均勻，於每一發酵罐中裝填250g~500g培養基配方再進行滅菌工作，滅菌冷卻後進行接種工作；接種種源為培養後的斜面木徽菌孢子，孢子洗下後以無菌水調整濃度為1×108conidia/mL之孢子懸浮液，而於每一發酵罐中接種10mL孢子懸浮液，放置於培養箱中培養七天，再將培養基進行乾燥使其含水量介於10~15%即完成發酵工作。過程中進行溫度及濕度調控，前兩天培養箱的溫度控制在25~27℃，濕度控制在RH75~95%，保持空氣循環。培養三天後，培養箱溫度控制在25℃，濕度控制在RH40~50%。培養過程中每天要搖動使發酵基質均勻。發酵完成需經乾燥步驟，將培養基及其上產生的木黴孢子一併進行乾燥，將含水量控制在10~15%即完成。
中國專利CN103881925，揭露一種固態發酵培養方法，把木黴接種在PDA斜面上45℃下培養5天，待形成孢子後用5ml滅過菌的生理鹽水沖洗孢子，把收集到的孢子溶液用血球計數板進行計數，使每毫升溶液中孢子的含量在106-107個，按5%的接種量接種到固體發酵培養基中，28℃下培養146h；所述固體發酵培養基由5g玉米秸加一定量的基礎鹽溶液，3.5g(NH4)2S04，3g KH2PO4，0.5g MgSO4.7H20，0.5g CaCl2，1000ml蒸餾水經121℃滅菌20min配置而成。
中國專利公開CN101565688，揭露一種木黴孢子菌劑，將乾燥後粉碎的按重量份數計8-9份食用菌菌糠與2-4份輔助原料混合，調節混合原料 酸鹼度PH為5.0-6.5，而後將與混合原料品質比為5%-10%的木黴孢子懸浮液接種到混合原料上，在相對濕度60-80%，溫度25-30℃，無光條件下培養4-6天后，在8-12℃低溫無光條件下培養3-4天待產出木黴孢子後，將培養好的物料乾燥、粉碎即為生產木黴孢子菌劑。所述輔助原料按重量份數計為玉米粉1-2份，麩皮1-1.5份；磷酸二氫鉀0.001-0.020份，硫酸鎂0.001-0.020份，複合微維生素B0.001-0.020份；或紅薯粉1-2份，蠶蛹粉1-2份；磷酸二氫鉀0.001-0.020份，硫酸鎂0.001-0.020份，複合微維生素B0.001-0.020份。
中國專利公開CN102613252揭露木黴生防劑的生產方法種子製備：包括：將馬鈴薯澱粉廢水於115℃滅菌20分鐘，冷卻後接種綠色木黴菌種，接種濃度107個孢子/毫升培養基，於26℃，搖瓶150轉/分鐘培養36小時，即得液態種子；液態發酵：將馬鈴薯澱粉廢水於115℃滅菌20分鐘，接種5%液體種子，於26℃，發酵罐中通氣好氧培養36小時，即得液態綠色木黴菌產物；固態發酵：以蘑菇渣為支持物，將培養好的液態種子或液體木黴菌產物按照3倍重量添加到蘑菇渣中，攪拌均勻，於26℃，靜態培養5天，即得固態綠色木黴菌產物；後處理：固態綠色木黴菌產物以分生孢子為主，經通風乾燥處理，使固體產物含水量小於30%，添加微生物菌肥常用穩定劑和助劑，粉碎，包裝；產品孢子含量達到7×109個孢子/克。
另外，關於廣泛使用之真菌類微生物商業培養基PDA(Potato dextrose agar)，其配製方法是將馬鈴薯洗淨去皮後，切成小塊，稱取200克，加自來水1000毫升，煮沸20分鐘，用紗布過濾，向濾液中加入20克葡萄糖和15-20克瓊脂粉(洋菜粉)，加水補足1000毫升，分裝後滅菌備用。這種方法存在如下缺點：1)每次配製時需經過原料加工、煮沸、過濾及加入其他物 質等步驟，整個過程至少要花費40分鐘以上，並且不易長期貯存，一般需現用現配，費工費時。2)切成的馬鈴薯塊較大，內部的營養物質不能被提取出來，原料的利用率較低，浪費較大。3)提取液中的澱粉不易被微生物利用；4)製作成本較高。
改良的商業PDA相關文獻如中國專利授權CN1054636，其配置方法是：1)取新鮮馬鈴薯，洗淨去皮後切成小塊，稱取5kg，置高速組織勻漿機中加0.5-1kg水勻漿20秒鐘，然後加水至馬鈴薯重量的3-4倍，攪拌浸提30分鐘；2)將上述1)的提取液pH值調至6.0-6.5；加入75-100g的α-澱粉酶，加熱至65-75℃，液化10-15分鐘。當提取液溫度降到50-60℃，加入150-200g麩皮或大麥芽粉，糖化120-150分鐘；3)上述2)糖化結束後，調pH值至7.5-8.0，加入20-25g胰蛋白酶，在50-60℃溫度下消化120-180分鐘，然後煮沸10-30分鐘，用8層紗布濾掉殘渣，得到濾液並將濾液減壓濃縮至固形物含量為上述濾液的25-30%；4)將上述3)的減壓濃縮液進行噴霧乾燥，乾燥後與2.5-3.0kg葡萄糖和1.88-2.0kg瓊脂粉混合。最後得到5.2-5.9kg的馬鈴薯葡萄糖瓊脂乾燥培養基。
上開各文獻所揭露之液態培養基，通過液態深層發酵培養木黴分生孢子的方法，其缺點為產孢過程中需對培養基補料，產生大量的廢水、廢氣，並且需要高耗能的機械攪拌，然而木黴的液態發酵產率偏低。而上開各文獻所揭露之固態培養基，雖然可以解決液態培養基的問題，但是配方成分過於複雜，且也涉及了過多的參數控制，例如加熱溫度、加熱時間、濕度控制、照光量、照光時間、pH值，成本高，操作不易，以至於固態培 養基難以量產化，但木黴菌已經是一種極具產業利用價值之菌體，然而在培養基難以量產的問題中，將會抑制木黴菌的產業利用性。因此，本發明為克服上述培養基之諸多弊端提出新的培養基配方。
本發明木黴菌固態培養基，其組成包括：糖蜜(Molasses)10wt%、尿素(Urea)1wt%、洋菜粉2wt%、餘量為蒸餾水。優選的糖蜜為甘蔗糖蜜。
本發明製備木黴菌固態培養基之工藝步驟，包括：將上述固態培養基之基質按重量百分比混合溶解於蒸餾水中，進行高溫高壓滅菌後，取出於室溫降溫凝固為固態培養基。
本發明以上述固態培養基進行木黴菌產孢之工藝步驟為：將吸取定量且飽藏木黴菌孢子之懸浮液或木黴菌菌球接種於固態培養基上，於25℃培養箱培養7-10天，固態培養基之表面具有木黴菌繁殖體。
所述木黴菌之菌種為綠色木黴(Trichoderma viride)、哈茨木黴(Trichoderma harzianum)、鉤狀木黴(Trichoderma hamatum)、黃綠木黴(Trichoderma aureoviride)和桔綠木黴(Tr ichoderma citrinoriride)中的一種或幾種按任意比例複合的真菌菌種。
所述木黴菌繁殖體為木黴菌之分生孢子。
與先前技術相比，本發明具有以下效果：
以秤藥匙刮下培養基表面所有的綠色孢子，放進50c.c.蒸餾水，以磁石攪拌器攪拌約1小時使其孢子均勻分散在水中，以血球計數盤計算每c.c.孢子數，結果每mL溶液中具有3.3*108個孢子。培養基培養10天產孢量為每克固態培養基可產3.3*108個孢子，產孢效能優異。
組成固態培養基中之各物質性能穩定，以糖蜜為碳源，以尿素為 氮源，提供該木黴菌產孢的碳元素和氮元素，滿足木徵菌生長之需要。
固態培養基之組成分簡單，容易配置。產孢條件溫和，容易控制。
糖蜜(molasses)含有糖(42-50%)、粗蛋白質(3%~6%)、泛酸(37mg/kg)、礦物質(鉀、氯、鈉、鎂，總量約8%~10%)、少量微生素，生物素、胺基酸等物質，尿素(Urea)含氮量為46%，提供木黴菌最佳之培養環境，提高木徵菌對營養物質的利用率，促進木黴菌繁殖，縮短培養時間。
固態培養基之組成分容易取得，成本低廉。
固態培養基容易長期貯存及運輸。
本發明固態培養基適合工業化大量生產，提昇木黴菌的產業利用性。
在固態培養基上培養好的菌體可連同固態培養基直接進行乾燥、粉碎、包裝。
本發明生產固態培養基的能耗低、設備投資少、後處理簡單、無廢水、無公害污染。
本發明木黴菌固態培養基，其組成包括：糖蜜(Molasses)10wt%、尿素(Urea)1wt%、洋菜粉2wt%、餘量為蒸餾水。優選的糖蜜為甘蔗糖蜜。
本發明製備木黴菌固態培養基之工藝步驟，包括：將上述固態培養基之基質按重量百分比混合溶解於蒸餾水中，進行高溫高壓滅菌後，取出於室溫降溫凝固為固態培養基。
本發明以上述固態培養基進行木黴菌產孢之工藝步驟為：將吸取定量且飽藏木黴菌孢子之懸浮液或木黴菌菌球接種於固態培養基上，於25℃培養箱培養7-10天，固態培養基之表面具有木黴菌繁殖體。
固態培養基具體的實施例為100g糖蜜、10g尿素、20g洋菜粉與1000c.c.蒸餾水，於高溫高壓滅菌釜以120℃與15磅/平方英吋壓力滅菌，滅菌時間20分鐘，取出後於於室溫靜置降溫凝固。
木黴菌培養：
固態培養基於高溫高壓滅菌釜滅菌後，待冷卻至50℃，在無菌操作台中倒出15c.c.培養基於空培養皿中，降至室溫凝固為固態培養基。切下0.5cm2菌母培養基，將其接種在冷卻後的固態培養基中央，於25℃培養箱培養10天。固態培養基之表面具有木黴菌繁殖體。所述木黴菌之菌母為綠色木黴(Trichoderma viride)、哈茨木黴(Trichoderma harzianum)、鉤狀木黴(Trichoderma hamatum)、黃綠木黴(Trichoderma aureoviride)和桔綠木黴(Trichoderma citrinoriride)中的一種或幾種按任意比例複合的真菌菌種。0.5cm2菌母的孢子含量為105-106個，按0.5%接種量接種於固態培養基，菌母的接種量相對於固態培養基的重量為0.5%。所述繁殖體為木黴菌之分生孢子。
孢子數測定：
以秤藥匙刮下固態培養基表面所有的綠色孢子，放進50c.c.蒸餾水，以磁石攪拌器攪拌約1小時使其孢子均勻分散在水中，以血球計數盤計算每c.c.孢子數，乘以50(50c.c.蒸餾水)，除以15(15c.c.培養基)，結果：每克固態培養基可產3.3×108個孢子)
為驗證本發明之固態培養基之產孢量優於傳統培養基，以下以商 業培養基PDA(Potato dextrose agar)以相同條件進行木黴素培養。
於血清瓶中加入39g PDA、5g洋菜粉與1000c.c.蒸餾水，於高溫高壓滅菌釜以120℃與15磅/平方英吋壓力滅菌，待冷卻至50℃後在無菌操作台中倒出15c.c. PDA培養液於空培養基中，降至室溫後即凝固為PDA培養基。切下0.5cm2菌母培養基，將其黏在PDA培養基中央，於25℃培養箱培養10天。
孢子數測定：
以秤藥匙刮下培養基表面所有的孢子，放進50c.c.蒸餾水，以磁石攪拌器攪拌約1小時使其孢子均勻分散在水中，以血球計數盤計算每c.c.孢子數，乘以50(50c.c.蒸餾水)，除以15(15c.c. PDA培養基)。結果：每克PDA培養基可生產2.1×108孢子
比較：本發明之固態培養基之產孢量明顯優於商業PDA固態培養基。

Claims (5)

  1. 一種木黴菌之固態培養基，其組成包括：糖蜜(Molasses)10wt%、尿素(Urea)1wt%、洋菜粉2wt%及餘量為蒸餾水。
  2. 如申請專利範圍第1項所述木黴菌固態培養基，其中，糖蜜為甘蔗糖蜜。
  3. 如申請專利範圍第1項所述木黴菌固態培養基，其中，糖蜜為100g、尿素為10g、洋菜粉為20g及蒸餾水1000c.c。
  4. 一種如申請專利範圍第1項之固態培養基之用途，是用於繁殖木黴菌分生孢子。
  5. 一種木黴菌之固態培養基之製備方法，包括：將糖蜜(Molasses)10wt%、尿素(Urea)1wt%、洋菜粉2wt%及餘量為蒸餾水，均勻混合溶解，進行高溫高壓滅菌，取出於室溫降溫凝固為固態培養基。
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