CN108004202A - 一种用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液，是以不含L‑谷氨酰胺的高糖DMEM‑F12培养基为基液，添加L‑丙氨酰‑L谷氨酰胺、维生素C、HEPES、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、脂质浓缩物、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝素钠和Pluronic F‑68制成。本发明公开的培养液不含任何血清成分，成分明确、批次稳定、质量可控、成本低廉，不仅适用于实验室常规培养，也适用于大规模生产培养，应用前景广泛。

Description

一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液。
背景技术
293T细胞是由293细胞派生并表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，是包装病毒的主要细胞。随着细胞治疗和基因治疗技术的快速发展，尤其在CAR-T疗法药物成功上市以来，293T无血清悬浮培养的产业化和规模化更为迫切。
尽管ATCC将293T细胞进行了商业化处理后得到比较稳定的细胞系，但在实际生产过程中，由于293T细胞的用量较大且传代次数过多，细胞的生物学特性就会发生改变，影响病毒的包装效率。目前293T细胞的常规培养方法多采用贴壁并添加血清进行培养，贴壁培养导致培养效率低，空间利用率低，仪器、耗材、人工等成本的增加；而血清成分复杂，批次间差异较大，血清质量的检定较为复杂，用此细胞生产的病毒质量难以控制，并且增加产品的检测项目，耗费大量的人力物力。而目前市售的悬浮无血清培养基，多存在悬浮驯化效率低、细胞增殖慢、细胞特性不稳定、价格昂贵等问题。针对这一问题，迫切需要结合中国2015版《中国药典》和《药品生产质量管理规范》等政策要求，设计一套无血清悬浮培养293T细胞培养液，以提高细胞增殖效率、保持细胞特性、增强病毒包装效率、降低商品成本及价格。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液。
本发明所述用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液，该培养液不含血清成分，是以市售DMEM-F12培养基为基液添加L-丙氨酰-L谷氨酰胺、维生素C、HEPES、类胰岛素生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、脂质浓缩物、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝素钠、Pluronic F-68制成；其特征在于：所述培养液中的DMEM-F12培养基为不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养基，其中含有500～1500mg/L L-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.1～1mg/L维生素C、2383～11915mg/L HEPES、5～200μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、10～100μg/L表皮生长因子(EGF)、1～5ml/L脂质浓缩物、1～2g/L人血白蛋白、0.1～1mg/L转铁蛋白、1～4mg/L海藻糖、1250～12500U/L肝素钠和1～20ml/L Pluronic F-68(10％，100×)。
上述的用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液中：所述培养液中优选含有700～1100mg/L L-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.2～0.6mg/L维生素C、4000～6500mg/L HEPES、10～28μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、40～60μg/L表皮生长因子(EGF)、2～3ml/L脂质浓缩物、1.5～2g/L人血白蛋白、0.3～0.7mg/L转铁蛋白、2～3mg/L海藻糖、10000～12500U/L肝素钠和5～15ml/L Pluronic F-68(10％，100×)。
上述的用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液中：所述培养液中最优选含有862mg/L L-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.4mg/L维生素C、5958mg/L HEPES、20μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、50μg/L表皮生长因子(EGF)、2ml/L脂质浓缩物、2g/L人血白蛋白、0.5mg/L转铁蛋白、2mg/L海藻糖、12500U/L肝素钠和1～20ml/L Pluronic F-68(10％，100×)。
上述用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液中所涉及的原料均为市售产品，其中类胰岛素生长因子包括重组人胰岛素样生长因子，人血白蛋白包括重组人血白蛋白，脂质浓缩物特指Thermo Fisher供应的货号为11905031的产品，规格为100ml/瓶。
上述用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液的制备：
1.使用电子天平精确称量500～1500mg L-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.1～1mg维生素C和2383～11915mg HEPES，将称量好的成分倒入烧杯中，加入500ml不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养液为基液进行溶解。
2.待步骤1中所述固体组分完全溶解后，再依次加入0.25～10ml IGF-1溶液，0.2～2ml EGF溶液，1～5ml脂质浓缩物，5～10ml人血白蛋白，0.01～0.1ml转铁蛋白，0.1～0.4ml海藻糖，0.2～2ml肝素钠，1～20ml Pluronic F-68，充分混匀。
3.将步骤2中配制的混合液转入1L容量瓶中，再补加不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养液定容至1L，并使用NaHCO3调节混合液pH值至7～7.2，无菌环境下进行0.22μm过滤除菌，得到无血清悬浮培养293T细胞的培养液，4℃储存备用。
4.此时得到的无血清悬浮培养293T细胞的培养液中各成分终浓度为L-丙氨酰-L谷氨酰胺500～1500mg/L、维生素C 0.1～1mg/L、HEPES 2383～11915mg/L、IGF-1 5～200μg/L、EGF 10～100μg/L、脂质浓缩物1～5ml/L、人血白蛋白1～2g/L、转铁蛋白0.1～1mg/L、海藻糖1～4mg/L、肝素钠1250～12500U/L、Pluronic F-68(10％，100×)1～20ml/L。
上述制备过程均在20～30℃的无菌车间中进行，保证产品无菌。
上述无血清悬浮培养293T细胞的培养液可用于293T细胞的无血清悬浮驯化培养和传代培养。其中所述培养液将常用的L谷氨酰胺改为L-丙氨酰-L谷氨酰胺，以减少细胞大规模培养过程中毒性氨的浓度，增加氨基酸的利用；该培养液还含有类胰岛素生长因子、转铁蛋白、人血清白蛋白、脂质浓缩物、海藻糖、肝纳素、Pluronic F-68和表皮生长因子(EGF)，可作为血清替代物为细胞提供必需的营养物质，肝纳素的添加可缓解细胞培养过程中的结团现象，以增加细胞的培养效率。
本发明公开的无血清悬浮培养293T细胞的培养液，各成分稳定，来源明确，培养的细胞批次间稳定，质量可控。使用该细胞培养液培养的细胞增殖快，细胞活性保持周期长，长期培养细胞不结团，冻存效率高，成本低廉；并与传统293T细胞贴壁培养基的相比，该配方培养的悬浮细胞在转染HIV慢病毒时转染效率更高。
本发明所述的无血清悬浮培养293T细胞的培养液适用于规模化生产，能为生物医疗行业提供质美价廉的293T细胞无血清悬浮培养液。
附图说明
图1为本发明的无血清悬浮培养293T细胞的培养液培养与市售无血清培养基培养的293T细胞形态比较。
其中：A为本发明的无血清悬浮培养293T细胞的培养液培养的293T的形态；B为市售的无血清培养基培养的293T的形态。
图2为本发明的无血清悬浮培养293T细胞的培养液培养与市售无血清培养基培养的293T细胞包装HIV慢病毒的效率对比。
其中：A为本发明的无血清悬浮培养293T细胞的培养液培养的293T细胞的包装效率；B为市售的无血清培养基培养的293T细胞的包装效率。
具体实施方式
说明：本发明中所涉及的原料均为市售产品，其中类胰岛素生长因子包括重组人胰岛素样生长因子，人血白蛋白包括重组人血白蛋白，脂质浓缩物特指Thermo Fisher供应的货号为11905031的产品，规格为100ml/瓶。
实施例1：最佳配方无血清悬浮培养293T细胞的培养液的制备
1.使用电子天平精确称量862mg L-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.4mg维生素C和5958mgHEPES，将称量好的成分倒入烧杯中，加入500ml不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养液为基液进行溶解。
2.待步骤1中所述固体组分完全溶解后，再依次加入1ml IGF-1溶液，1ml EGF溶液，2ml脂质浓缩物，10ml人血白蛋白，0.05ml转铁蛋白，0.2ml海藻糖，2ml肝素钠，10mlPluronic F-68，充分混匀。
3.将步骤2中配制的混合液转入1L容量瓶中，再补加不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养液定容至1L，并使用NaHCO3调节混合液pH值至7～7.2，无菌环境下进行0.22μm过滤除菌，得到无血清悬浮培养293T细胞的培养液。
4.将步骤3中得到的无血清悬浮培养293T细胞的培养液转入带螺旋盖的塑料瓶中，得到无血清悬浮培养293T细胞的培养液商品，4℃储存，保质期6个月。
上述的IGF-1、EGF、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝纳素、Pluronic F-68等成分以市售产品为例，但不限定于所述产品，按照药典规定即可。
优选的，IGF-1供应商为货号PHG0078，规格20μg/瓶；EGF供应商为货号PHG0311，规格100μg/瓶；人血白蛋白品牌为安普莱士，国药准字S10920009，规格为10g，50ml/瓶；转铁蛋白供应商为sigma，货号为T2252，规格为100mg/瓶；海藻糖供应商为sigma，货号为T9531，规格为10mg/瓶；肝素钠供应商为南京新百，国药准字H32025851，规格为2ml，12500U/支；Pluronic F-68(10％，100×)供货商为货号24040032，规格100ml/瓶。
其中，IGF-1使用1ml 0.9％医用生理盐水完全溶解，浓度为20μg/ml；EGF使用2ml无菌PBS缓冲液完全溶解，浓度为50μg/ml；转铁蛋白使用10ml 0.9％医用生理盐水完全溶解，浓度为10mg/ml；海藻糖使用1ml 0.9％医用生理盐水完全溶解，浓度为10mg/ml。
实施例2：293T细胞的悬浮驯化培养
1. 293T细胞的复苏和接种
(1)从液氮灌中取出冻存的293T细胞，每支体积为1ml，迅速丢入40℃水浴锅中并快速晃动，在1～2min内使细胞溶液完全溶解。
(2)将细胞溶液转入15ml离心管中，每支离心管中以1:9的比例加入无血清培养基，即1ml细胞溶液加9ml培养基，300g，离心3min。
(3)加入1ml培养基将细胞重悬，两支并一支，共2ml细胞溶液加入含有18ml实施1例1中无血清完全培养基的T75cm2瓶中，置37℃，5％CO2的培养箱中培养2天达到70％～80％汇合状态。
2. 293T细胞的悬浮驯化
(1)吸弃除无血清培养基，并加入并加入0.05％胰酶消化剂使293T细胞消化脱离培养瓶表面，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时加入10ml无血清完全培养基终止消化。
(2)收集细胞，300g离心3min，用无血清完全培养基重悬，再将全部细胞接种于新的培养瓶中；置37℃，5％CO2的培养箱中培养2天，重复步骤2中(1)和(2)7-9次，直至细胞开始悬浮增殖，将全部细胞转入细胞培养袋(规格2L)培养至密度为2×106cell/ml，培养过程中定期晃动细胞培养袋，并及时进行补液。
(3)培养结束时，观察细胞状态并拍照，见图1(A)。
3.细胞冻存
将细胞培养液收集至250ml离心管中，离心收集细胞，并使用无血清冻存液进行冻存，冻存密度均为4×106cell/支/ml。
4.对照组
对照组中使用的培养基为无血清293SFM II培养基(GIBCO，Cat.No.10970-010)，操作按照本实施例中1～3进行，培养结束时，观察细胞状态并拍照，见图1(B)。
5.结果分析
对比两组培养基悬浮驯化培养293T细胞的细胞状态发现，本发明中的293T细胞培养基比无血清293SFM II培养基培养速率快，培养效率高，在培养结束时，本发明的培养基培养的细胞不易结团，而市售培养基培养的细胞易结团，结团则会影响细胞生长效率，降低细胞的生物学活性。
实施例3：293T细胞的包装效率
1.细胞的复苏、接种和培养
(1)从液氮灌中取出冻存的293T细胞，每支体积为1ml，迅速丢入40℃水浴锅中并快速晃动，在1～2min内使细胞溶液完全溶解。
(2)将细胞溶液转入15ml离心管中，每支离心管中以1:9的比例加入无血清培养基，即1ml细胞溶液加9ml培养基，300g，离心3min。
(3)加入1ml培养基将细胞重悬，两支并一支，共2ml细胞溶液加入含有18ml实施1例1中无血清完全培养基的T75cm2瓶中，置37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，观察细胞状态，收集细胞，300g，离心3min。
(4)加入培养基重悬细胞，将细胞转移至1L摇瓶中，0-48h搅拌速度为40r/min，培养48h后，搅拌速度为60r/min，置于37℃，5％CO2条件下扩大培养。
2.HIV慢病毒的包装
(1)HIV慢病毒是由psPAX2包装质粒、pMD2G包装质粒和pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒三种质粒包装而成，三种质粒由本实验室保存，三种质粒经过无内毒素高纯度抽提获得。
(2)将三种质粒按照下表添加到50ml离心管中。
(3)加入CaCl2溶液156.25μl，快速摇匀，约10s；
(4)加入2×HBS 1250μl，快速摇匀30s，静置2min 30s；
(5)吸取2.5ml 293T无血清完全培养基加入上述混合物中，充分吹打混匀，获得复合物；
(6)取摇瓶中细胞，计数4×107个293T细胞，转移至离心管中，离心后，使用293T无血清完全培养基50ml重悬，并接种于新的细胞培养袋(规格500ml)中。
(7)将复合物逐滴均匀地分别加入含有4×107个293T细胞中，混匀，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
(8)培养12-14h后进行细胞补液，混匀，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
(9)继续培养细胞36h后，荧光显微镜下观察细胞形态与转染情况，见图3(A)。
3.对照组
对照组中使用的培养基为293SFM II无血清培养基，操作按照本实施例中1—2中的步骤进行，转染结束时，荧光显微镜下观察细胞形态与转染情况，见图3(B)。
4.结果分析
在转染36h后，本发明公开的无血清培养基的转染效率明显高于293SFM II无血清培养基。
实施例4：293T细胞的一次性生物反应器大规模悬浮培养
1. 293T细胞的复苏接种和培养
(1)从液氮灌中取出冻存的293T细胞，每支体积为1ml，迅速丢入40℃水浴锅中并快速晃动，在1～2min内使细胞溶液完全溶解。
(2)将细胞溶液转入15ml离心管中，每支离心管中以1:9的比例加入无血清培养基，即1ml细胞溶液加9ml培养基，300g，离心3min。
(3)加入1ml培养基将细胞重悬，两支并一支，共2ml细胞溶液加入含有18ml实施1例1中无血清完全培养基的T75cm2瓶中，置37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，观察细胞状态，收集细胞，300g，离心3min。
(4)加入培养基重悬细胞，将细胞转移至1L摇瓶中，0-48h搅拌速度为40r/min，培养48h后，搅拌速度为60r/min，置于37℃，5％CO2条件下扩大培养。
2.一次性生物反应器的大规模培养
293T细胞被用于基因治疗过程的慢病毒包装工艺，基因治疗属于个体化治疗，293T细胞不需要持续培养，慢病毒现用现包，这样生产的慢病毒滴度高，侵染效率也高，所以使用一次性生物反应器既能节约成本，又能进行个体化设计，比较符合基因治疗的要求。
一次性生物反应器主要包括：细胞培养袋、呼吸袋、取样器。
主要步骤为：
(1)当实施例5步骤1中细胞培养至3×105—6×105cell/ml，将细胞全部接种至5L振荡激流式一次性生物反应器中，通入CO2和0.5mmol/L NaOH调节pH 7.0-7.2，控制温度为37℃，通过自动控制系统通入混合O2/N2/空气控制DO 40％-50％，起始转速55r/min，随培养体积扩大提高至65r/min。
(2)每24h取样，计算细胞密度及存活率，测定葡萄糖和乳酸浓度。
(3)当细胞密度大于1×106cell/ml开始流加培养，流加率为0.6-1，即前24h培养体积的0.6-1倍。
(4)培养4-6天，当细胞密度达到2×106个cell/ml，按照一定的质粒浓度，添加质粒进行病毒包装，此时包装的病毒即可满足一个患者的需求。
实施例5：无血清悬浮培养293T细胞的培养液配方
是以市售不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养基为基液，其中含有500mg/L L-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.1mg/L维生素C、2383mg/L HEPES、5μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、10μg/L表皮生长因子(EGF)、1ml/L脂质浓缩物、1g/L人血白蛋白、0.1mg/L转铁蛋白、1mg/L海藻糖、1250U/L肝素钠和1ml/L Pluronic F-68(10％，100×)。
配制方法同实施例1。
实施例6：无血清悬浮培养293T细胞的培养液配方
是以市售不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养基为基液，其中含有1500mg/L L-丙氨酰-L谷氨酰胺、1mg/L维生素C、11915mg/L HEPES、200μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、100μg/L表皮生长因子(EGF)、5ml/L脂质浓缩物、2g/L人血白蛋白、1mg/L转铁蛋白、4mg/L海藻糖、12500U/L肝素钠和20ml/L Pluronic F-68(10％，100×)。
配制方法同实施例1。

Claims (3)

1.一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液，所述培养液不含血清成分，是以市售DMEM-F12培养基为基液添加L-丙氨酰-L谷氨酰胺、维生素C、HEPES、类胰岛素生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、脂质浓缩物、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝素钠、Pluronic F-68制成；其特征在于：所述培养液中的DMEM-F12培养基为不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养基，其中含有500～1500mg/L L-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.1～1mg/L维生素C、2383～11915mg/L HEPES、5～200μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、10～100μg/L表皮生长因子(EGF)、1～5ml/L脂质浓缩物、1～2g/L人血白蛋白、0.1～1mg/L转铁蛋白、1～4mg/L海藻糖、1250～12500U/L肝素钠和1～20ml/L Pluronic F-68。
2.根据权利要求1所述的用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液，其特征在于：所述培养液中含有700～1100mg/L L-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.2～0.6mg/L维生素C、4000～6500mg/LHEPES、10～28μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、40～60μg/L表皮生长因子(EGF)、2～3ml/L脂质浓缩物、1.5～2g/L人血白蛋白、0.3～0.7mg/L转铁蛋白、2～3mg/L海藻糖、10000～12500U/L肝素钠和5～15ml/L Pluronic F-68。
3.根据权利要求1所述的用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液，其特征在于：所述培养液中含有862mg/L L-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.4mg/L维生素C、5958mg/L HEPES、20μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、50μg/L表皮生长因子(EGF)、2ml/L脂质浓缩物、2g/L人血白蛋白、0.5mg/L转铁蛋白、2mg/L海藻糖、12500U/L肝素钠和1～20ml/L Pluronic F-68。
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