CN109402062A - Zip1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用，涉及分子生物学与细胞生物学技术领域，ZIP1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，对骨髓间充质干细胞中ZIP1基因的表达进行调控，能够改变骨髓间充质干细胞的凋亡速度；本发明还提供了用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，该药物可以有效抑制骨髓间充质干细胞的凋亡，提高存活率；此外，本发明还提供了用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒。应用该试剂盒能够实现对骨髓间充质干细胞中ZIP1基因的表达进行调控，进而抑制骨髓间充质干细胞的凋亡。缓解了现有技术中缺乏一种应用ZIP1基因来有效抑制骨髓间充质干细胞凋亡的技术问题。

Description

ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学与细胞生物学技术领域，具体而言，涉及ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用。
背景技术
骨髓间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，是一种存在于骨髓腔和毛细血管的多潜能干细胞，当机体受到损伤和炎症时，可增殖分化成机体需要的相应细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、神经元和神经胶质细胞等，因其高度自我更新和多向分化能力的特性而被广泛应用于再生医学行列。由于BMSCs具有分化为骨、软骨、神经元，神经胶质细胞等的多向分化潜能，并且取材方便、分离获取容易、免疫原性弱等特点，所以在骨组织工程中备受众研究者的广泛青睐，是组织工程中优良的种子细胞。
近年来发现骨髓间充质干细胞可以经不同因素诱导，分化为具体的神经元如胆碱能神经元、胺能神经元、氨基酸能神经元、肽能神经元。最新研究表明骨髓间充质干细胞可以在受损的脑组织及脊髓中生存、增殖、迁移以及分化成神经样细胞，从而有效提高脊髓损伤、脑卒中等神经系统疾病的神经学功能，从而改善患者生存状态。神经细胞移植已为多种中枢神经系统疾病的治疗带来希望。
在骨髓间充质干细胞分化过程中，必须要通过机体相关的信号通路发挥其效能，人体内的电子传递，基因调控表达，酶的活性都对其有或多或少的关系，而金属元素如铁、锌和铜等是所有生物体的必需营养素，在体内这些生物化学过程中均发挥着重要作用。锌是机体内300多种酶及转录因子的重要组成部分，是维持机体正常生理功能以及生长发育过程中所必须的微量元素，在核酸代谢，细胞复制，组织修复，神经功能恢复过程中发挥极其重要的作用，缺锌可能导致免疫功能受损，生长迟缓，脑发育障碍和延迟伤口愈合，还能引起神经功能症状以及影响认知表现。脊髓损伤后ZIP1和脑源性神经营养因子表达呈正相关，脑源性神经营养因子高表达对脊髓损伤的保护起重要作用。然而骨髓间充质干细胞移植后存活率不高，且分化为神经元的比例较低，导致修复效果不理想，研究也表明骨髓间质干细胞并不具有传导能力。因此，如何有效应用ZIP1基因，使其在药物和试剂等方面得到应用，开发ZIP1基因相关产品来抑制骨髓间充质干细胞凋亡，具有十分重要的现实意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用，缓解了现有技术中缺乏一种应用ZIP1基因来有效抑制骨髓间充质干细胞凋亡的技术问题。
本发明的目的之二在于提供一种用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物。
本发明的目的之三在于提供一种用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒。
本发明的目的之四在于ZIP1基因在骨髓间充质干细胞培养中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
根据本发明第一个方面，ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用。
优选地，在本发明方案基础上，ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡产品中的应用，ZIP1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
根据本发明的第二个方面，一种用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，药物包括具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的ZIP1。
优选地，在本发明方案基础上，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，药物包括如下任一项：
(a)含有编码ZIP1序列的DNA分子；
(b)含有编码ZIP1序列的RNA分子；
(c)含有编码ZIP1序列的病毒。
优选地，在本发明方案基础上，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，药物还包括药学上可接受的载体，载体包括壳聚糖、胆固醇、脂质体、环糊精、微球或微囊中的一种或多种。
根据本发明的第三个方面，一种用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒包括如下任一项：
(a)含有编码ZIP1序列的DNA分子；
(b)含有编码ZIP1序列的RNA分子；
(c)含有编码ZIP1序列的病毒。
优选地，在本发明方案的基础上，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒还包括用于细胞转染的转染试剂、骨髓间充质干细胞培养基、PCR相关试剂、RNA抽提试剂和免疫荧光相关试剂中的一种或多种。
优选地，在本发明方案基础上，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，骨髓间充质干细胞培养基包括转染用培养基和骨髓间充质干细胞生长完全培养基。
优选地，在本发明方案基础上，用于抑制骨髓间充质干细胞的药物或用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，含有编码ZIP1序列的DNA分子包括含有编码ZIP1序列的重组质粒和/或含有编码ZIP1序列的线性DNA片段。
根据本发明的第四个方面，ZIP1基因在骨髓间充质干细胞培养中的应用。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用，缓解了现有技术中缺乏一种应用ZIP1基因来有效抑制骨髓间充质干细胞凋亡的技术问题。
(2)本发明提供的用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，应用该药物可以有效抑制骨髓间充质干细胞的凋亡，有效提高骨髓间充质干细胞的存活率。
(3)本发明提供的用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，应用该试剂盒能够实现对骨髓间充质干细胞中ZIP1基因的表达进行调控，进而抑制骨髓间充质干细胞的凋亡。
(4)本发明提供的ZIP1基因在骨髓间充质干细胞培养中的应用，ZIP1基因可以应用与骨髓间充质干细胞的培养，通过对ZIP1基因的表达量进行调控，可以抑制或促进骨髓间充质干细胞的凋亡。
附图说明
图1a为本发明兔原代骨髓间充质干细胞常规培养1d后细胞生长情况示意图；
图1b为本发明兔原代骨髓间充质干细胞常规培养2d后细胞生长情况示意图；
图1c为本发明兔原代骨髓间充质干细胞常规培养3d后细胞生长情况示意图；
图2a为对照组细胞凋亡率Tunel检测示意图；
图2b为对照组细胞凋亡率DAPI染色核定位示意图；
图2c为对照组细胞凋亡率Tunel检测示意图与DAPI染色核定位merge图；
图3a为ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图；
图3b为ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率DAPI染色核定位示意图；
图3c为ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图与DAPI染色核定位merge图；
图4a为ZIP1表达载体转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图；
图4b为ZIP1表达载体转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率DAPI染色核定位示意图；
图4c为ZIP1表达载体转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图与DAPI染色核定位merge图；
图5a为缺氧缺糖模型骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图；
图5b为缺氧缺糖模型骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率DAPI染色核定位示意图；
图5c为缺氧缺糖模型骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图与DAPI染色核定位merge图；
图6a为本发明流式细胞仪检测正常细胞组细胞凋亡率结果图；
图6b为本发明流式细胞仪检测缺氧缺塘组细胞凋亡率结果图；
图6c为本发明流式细胞仪检测缺氧缺糖ZIP1过表达组细胞凋亡率结果图；
图6d为本发明流式细胞仪检测缺氧缺糖ZIP1 siRNA组细胞凋亡率结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
根据本发明的第一个方面，ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用。
ZIP(Zrt/Irt-like protein，ZIP)是锌转运蛋白，锌转运蛋白家族能够促进锌离子从细胞外或细胞器的内室涌入到细胞质中，ZIP1是ZIP家族的成员，其与骨代谢和成骨分化有密切的关系。
骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，是一种存在于骨髓腔和毛细血管的多潜能干细胞，当机体受到损伤和炎症时，可增殖分化成机体需要的相应细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、神经元和神经胶质细胞等。对骨髓中的造血干细胞(HSC)不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子(如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等)来支持造血。
细胞凋亡(apoptosis)指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
骨髓间充质干细胞在医疗等领域广泛应用，但是骨髓移植过程中细胞存活率不高，由于ZIP基因与骨代谢和成骨分化有着复杂而密切的关系，本发明实验证明ZIP1基因可以应用于制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品。
在一种优选的实施方式中，ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡产品中的应用，ZIP1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
根据本发明的第二个方面，一种用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，药物包括具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的ZIP1。
在一种优选的实施方式中，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，药物包括如下任一项：
(a)含有编码ZIP1序列的DNA分子；
(b)含有编码ZIP1序列的RNA分子；
(c)含有编码ZIP1序列的病毒。
用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，可以为包括编码ZIP1序列的DNA或RNA分子，也可以为含有ZIP1序列的病毒，通过ZIP1基因来对细胞的凋亡进行调控。
在一种优选的实施方式中，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，药物还包括药学上可接受的载体，载体包括壳聚糖、胆固醇、脂质体、环糊精、微球或微囊中的一种或多种。
制备药物，一般应用可药用载体来承载目的药物，能够获得更好的药效。
根据本发明的第三个方面，一种用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒包括如下任一项：
(a)含有编码ZIP1序列的DNA分子；
(b)含有编码ZIP1序列的RNA分子；
(c)含有编码ZIP1序列的病毒。
试剂盒应该包含用于转染的核酸分子，或者含有ZIP1序列的病毒也可以进行转染，将ZIP基因的表达情况进行调控，ZIP基因与细胞凋亡有紧密关系，ZIP基因的过表达可以影响与细胞凋亡相关的其他蛋白的表达，进而对细胞的凋亡速度产生影响，过表达ZIP基因可以抑制细胞的凋亡，提高细胞存活率，此外，用ZIP1基因直接对骨髓间充质干细胞的凋亡进行调控也是可以的。本发明不限制外源DNA或RNA导入骨髓间充质干细胞的方式，只要能使目的片段导入骨髓间充质干细胞，进而实现对ZIP基因的表达调控，都可以实现ZIP基因的过表达，进而抑制骨髓间充质干细胞的凋亡，提高骨髓间充质干细胞的存活率。
用ZIP1基因转染骨髓间充质干细胞，能够有效增加ZIP1基因的表达量，细胞内ZIP1的过表达，抑制细胞凋亡，提高存活率；因为细胞中Bax蛋白及Caspase-6蛋白是与细胞凋亡关系紧密的两种蛋白，抑制ZIP1的表达，细胞中Bax蛋白及Caspase-6蛋白表达增加，而增加ZIP1基因的表达量，Bax蛋白及Caspase-6蛋白表达量减少，从而能够通过增加ZIP1基因的表达而抑制细胞凋亡。
在一种优选的实施方式中，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒还包括用于细胞转染的转染试剂、骨髓间充质干细胞培养基、PCR相关试剂、RNA抽提试剂和免疫荧光相关试剂中的一种或多种。
试剂盒中包含转染相关试剂以及转染后的检测试剂使用更方便，转染无需另外准备试剂，转染是否成功的检验也无需另外准备试剂，使用更为方便。
在一种优选的实施方式中，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，骨髓间充质干细胞培养基包括转染用培养基和骨髓间充质干细胞生长完全培养基。
转染时细胞的外环境需求，以及转染后细胞生长所需的细胞外环境是不同的，因此转染以后数小时，要对培养基进行更换，换为细胞生长完全培养基，有利于细胞的生长分化。
在一种优选的实施方式中，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，含有编码ZIP1序列的DNA分子包括含有编码ZIP1序列的重组质粒和/或含有编码ZIP1序列的线性DNA片段。
DNA分子相对RNA分子具有更稳定的优点，DNA转染技术相对成熟，转染成功率高，用于转染的DNA分子构建技术成熟，操作简便，用于转染的DNA分字可以是环状的重组质粒，也可以是线性DNA片段。
根据本发明的第四个方面，ZIP1基因在骨髓间充质干细胞培养中的应用。
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明方法和效果做进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例中计量资料均采用x±s表示，采用SPSS 17.0统计学软件对多组间数据差异进行单因素方差分析检测，组间数据两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有显著性意义。
实施例1
1、兔原代骨髓间充质干细胞的提取、培养及传代
实验材料：成年雄性新西兰兔10只，平均体质量3.2kg，由广西中医药大学动物实验室提供，许可证号：SYXK(桂)2003-0001。
实验方法：兔全身麻醉后，用18号硬膜外穿刺针接5mL注射器，将0.1mL含3000U/mL的肝素穿入髓腔，抽出骨髓血约2mL；用平衡液洗涤2次后，离心沉淀用HAMF12-体积分数10％FBS培养液重新打匀；用灭菌的0.17mol/L饱和NH4Cl溶液按1∶5的体积比加入已重新打匀的悬液中，以800r/min的转速离心5min；弃去上清后，加入HAMF-12培养液，即可进行原代培养接种用。用体积分数0.25％胰酶-1mmol/L的EDTA液分离消化已贴壁的细胞，然后按照比例为1：3进行骨髓间充质干细胞传代接种培养，隔日换液。
将兔骨髓间充质干细胞常规培养1d，2d，3d后观察细胞生长情况，可见细胞逐渐增多，形态由梭形变为细长梭形，兔骨髓间充质干细胞常规培养1d见图1a、兔骨髓间充质干细胞常规培养2d见图1b和兔骨髓间充质干细胞常规培养3d见图1c。
2、ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞
以5×104个/孔的密度将骨髓间充质干细胞接种在6孔板上，然后将其充分摇晃均匀，用含有PBS及青链霉素的完全培养基培养细胞。培养3d观察细胞融合度达到体积分数40％后使用ZIP1 siRNA转染。Si RNA靶序列，SEQ ID No.2，5’GCTCATAGCAGGCTTTGCT3’。
正义链SEQ ID No.3:5’GCUCAUAGCAGGCUUUGCU3’
SEQ ID No.3这段序列的3’末端加序列dTdT
本领域技术人员常规写法为5’GCUCAUAGCAGGCUUUGCUdTdT3’
反义链SEQ ID No.4:3’CGAGUAUCGUCCGAAACGA5’
SEQ ID No.4这段序列的3’末端加序列dTdT
本领域技术人员常规写法为3’dTdTCGAGUAUCGUCCGAAACGA5’
转染步骤如下：①将完全培养基吸弃，同时用PBS洗涤细胞2次，每孔加入含体积分数20％胎牛血清的DMEM高糖培养基；②A管使用RNAase-free的去离子水溶解ZIP1 siRNA，直至浓度达到20nmol/L，然后将其溶于500μL opti-MEM中，充分摇匀后，在室温下放置5min；③B管使用500μL opti-MEM溶解5μL LipofectamineTM RNAiMAX，充分混匀后室温下放置5min；④将A管与B管轻轻摇匀，室温下放置20min，从而形成复合物siRNA/LipofectamineTMRNAiMAX；⑤各孔中加入复合物siRNA/LipofectamineTMRNAiMAX，培养过程中来回轻柔地摇晃培养板，在37℃的CO2培养箱中温育细胞。⑥培养4-6h后，将培养基吸弃，用PBS洗涤细胞2遍，在每孔中加入2mL完全培养基；⑦转染后24h，再次将完全培养基吸弃，各孔均加入Trizol共1mL，用定量RT-PCR方法检测ZIP1基因表达的情况明确各组siRNA的干扰抑制效率。
3、ZIP1表达载体转染骨髓间充质干细胞
以全基因合成法合成Zinc transporter ZIP1 pseudogene的全长序列984bp，5’端加入KpnI酶切位点，3’端加入EcoRI酶切位点，目的片段经KpnI和EcoRI双酶切，暴露粘性末端，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切后DNA片段，在300nm紫外灯下用清洁的刀片切下含有所需984bp的DNA带的凝胶条，置于新的灭菌的1.5mLEppendorf管中；70℃水浴8min，2min摇晃一次，使胶块完全融化；立即加入等体积Tris-Cl饱和酚，摇晃混匀；12000rpm离心2min；小心将分层后的水相移至新的体积为1.5ml的EP管中，加入两到三倍体积预冷无水乙醇；12000rpm离心6min；迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，即为回收的目的片段。再加入无水乙醇洗涤，除去杂质后放到55℃恒温器上干燥五到十分钟，当无乙醇气味消失后，再加入20μlddH2O溶解，最后将回收的目的片段用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行验证。
空载体pc DNA3.1(+)(5428bp)中同样加入FD KpnI和FD EcoRI进行双酶切，37℃温育1h，暴露粘性末端，75℃灭活5min。目的片段和pc DNA3.1(+)载体的双酶切体系见表1。
表1双酶切反应体系
双酶切后用T4 DNA连接酶将984bp的ZIP1目的片段与双酶切后的pcDNA3.1(+)空载体连接，，在0.2mL的离心管中配置连接反应液，用移液器吹打混匀连接反应物，常温反应30min。连接体系见表2。
表2连接反应体系
转化感受态细胞Trans1T1，步骤如下：从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上融化；无菌状态下取50μL的感受态细胞置于灭菌后的1.5ml的离心管中；加入10μl连接产物，冰中放置30分钟；42℃放置30秒(热休克)，不要摇动离心管；快速转移离心管于冰中放置2～3min(冷休克)；加入200μlLB液体培养基，吹打混匀，涂布于LA琼脂平板培养基上，37℃倒置培养12～16h。
(1)阳性菌落的PCR鉴定：挑取单个菌落接种于LA培养液中，37℃摇床220rpm培养4h后取1μl菌液作为模板进行PCR扩增。然后灌制1.5％琼脂糖凝胶，取5μl PCR产物进行电泳检测。
(2)取上述阳性菌进行重组序列鉴定：将通过菌液PCR检测的阳性菌液委托艾基生物技术有限公司测序，将得到的序列进行BLAST序列对比分析，确定其是为目的基因ZIP1的序列。
开始转染的前1d对细胞株进行传代培养，使其汇合度达到70％-80％后再进行转染，采用Lipofectamine 2000(invitrogen，Cat.No.11668019)转染试剂进行转染，并使用Opti-MEM(invitrogen，Cat.No.31985070)培养基进行培养。转染过程中使用24孔板，将1μg的ZIP1表达重组质粒加入至各孔中，稀释到100μL Opti-MEM培养基，将其标注为A液，然后将1μL的Lipofectamine TM 2000溶解在Opti-MEM培养基中并将其标注为B液，待充分混匀B液5min后，再充分混合A液与B液，室温下静置20min后再将其平铺至细胞培养板中；孵育4-6h后更换为细胞生长培养基，并在36-48h后开始进行收样和检测。
4、缺氧缺糖模型制备
用DMEM完全培养基37℃、饱和湿度、5％CO2正常传代培养，待细胞处于对数生长期进行后面实验，用密封罐制造缺氧模型，充入氮气和放入厌氧指示剂(MGC公司，货号C-22)，同时放入细胞培养皿，37℃、饱和湿度培养细胞，用真空泵抽出密封罐中气体，再次充入氮气。反复多次，当指示剂在氧含量低于0.1％时呈粉红色，开始计时，分别处理2小时，缺氧结束后进行2小时复氧，缺氧实验前进行更换培养基，用无糖基础培养基代替完全培养基。
5、分组及干预
将兔骨髓间充质干细胞进行培养及传代后，取第3代细胞，计数完毕后以1×104个/ml分别接种于6孔培养板中。将兔骨髓间充质干细胞分为4组，第1组为正常细胞培养空白对照组，第2组为缺氧缺糖细胞培养实验对照组，第3组为ZIP1过表达缺氧缺糖培养组，第4组为ZIP1 siRNA缺氧缺糖培养组。
实施例2
1、Tunel检测ZIP1蛋白对兔骨髓间充质干细胞调亡的影响
(1)细胞爬片
根据需要将爬片裁剪成合适的大小，以方便置于6孔板中。将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗5遍，再用三蒸水超声清洗3遍后进行高压灭菌消毒。用移液枪往培养板每孔中加入一滴培养基，将高压消毒好的爬片置于液滴上压紧；载玻片上加0.5％明胶包被玻片。将4组细胞培养2小时后常规消化，离心，重悬，将细胞悬液直接滴在玻片上，静置4小时后再轻轻加入培养液，然后再培养约24小时，使细胞适当扩增后取出载玻片进行固定。
(2)Tunel检测细胞凋亡
用PBS洗净培养好的细胞中的培养液，甲醛溶液4℃固定25分钟，后再用PBS洗涤2次。按照美国Promega公司TUNEL试剂盒说明。先加入0.2％Triton X-100室温孵育5分钟后用PBS洗涤2次，每次5分钟。后加入100μl Equilibration Buffer室温平衡10分钟，50μlTdT工作液37℃湿盒避光孵育60分钟，用2X SSC溶液洗涤15分钟，PBS溶液室温洗涤3次；再加入DAPI染液(用时现配)室温湿盒避光孵育10分钟，去离子水室温洗涤3次。最后使用荧光抗淬灭剂封片，最后避光，4℃保存，以备荧光显微镜镜检。
Tunel法检测4组细胞凋亡率分别为(0.66±0.18)％、(13.19±1.8)％、(1.76±0.57)％、(24.43±6)％，与正常对照组比较，各实验组凋亡率显著增高(P＜0.05)；与缺氧缺糖对照组比较，过表达ZIP1可显著降低rabBMSCs凋亡率(P＜0.05)，siRNA则无显著差异(P＞0.05)，ZIP1过表达与siRNA比较存在显著差异，结果有统计学意义(P＜0.05)。详见表1，各组细胞凋亡情况见：图2a为对照组细胞凋亡率Tunel检测示意图；图2b为对照组细胞凋亡率DAPI染色核定位示意图；图2c为对照组细胞凋亡率Tunel检测示意图与DAPI染色核定位merge图；图3a为ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图；图3b为ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率DAPI染色核定位示意图；图3c为ZIP1siRNA转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图与DAPI染色核定位merge图；图4a为ZIP1表达载体转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图；图4b为ZIP1表达载体转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率DAPI染色核定位示意图；图4c为ZIP1表达载体转染骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图与DAPI染色核定位merge图；图5a为缺氧缺糖模型骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图；图5b为缺氧缺糖模型骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率DAPI染色核定位示意图；图5c为缺氧缺糖模型骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率Tunel检测示意图与DAPI染色核定位merge图；箭头指示凋亡细胞。
表1 4组细胞tunel检测凋亡率比较(x±S)
注：与1组比较△P＜0.05，▲P＞0.05；与2组比较□P＜0.05，■P＞0.05；与3组比较☆P＜0.05，★P＞0.05。
2、流式细胞仪检测细胞凋亡率
4组细胞培养2小时后，先收集漂浮的细胞放入15ml离心管中，加0.25％胰酶消化细胞，1000rpm、离心5min，再加PBS洗涤细胞2次。然后每管加入500μL的1×BindingBuffer，轻轻吹打使细胞与Binding buffer充分反应后，再加入1.25μl Annexin V-FITC，再加入10μl Propidium Iodide混匀，室温(18-24℃)避光反应5～15分钟。将样本放置在冰上避光保存。在1h内上流式细胞仪检测分析。流式细胞仪激发光波长用488nm，发射波长为530nm。
流式细胞仪检测4组细胞凋亡率分别为(0.56±0.02)％、(1.29±0.05)％、(0.77±0.04)％、(2.53±0.02)％，与正常对照组比较，各实验组凋亡率显著增高(P＜0.05)；与缺氧缺糖对照组比较，过表达ZIP1可显著降低rabBMSCs凋亡率，siRNA可显著升高rabBMSCs凋亡率(P＜0.05)；ZIP1过表达与siRNA比较存在显著性差异，结果有统计学意义。统计分析比较结果如表2，流式细胞仪检测结果见：图6a为本发明流式细胞仪检测正常细胞组细胞凋亡率结果图；图6b为本发明流式细胞仪检测缺氧缺塘组细胞凋亡率结果图；图6c为本发明流式细胞仪检测缺氧缺糖ZIP1过表达组细胞凋亡率结果图；图6d为本发明流式细胞仪检测缺氧缺糖ZIP1 siRNA组细胞凋亡率结果图。
表2 4组细胞流式细胞仪检测凋亡率比较
注：与1组比较△P＜0.05；与2组比较□P＜0.05；与3组比较☆P＜0.05
3、Western Bloing检测细胞内凋亡相关蛋白Bax、Caspase6表达
流式细胞仪检测兔骨髓间充质干细胞凋亡，4组细胞培养至48小时，收集细胞，1000rpm离心10分钟，弃培养液，PBS缓冲液清洗一至两遍；再次1000rpm离心5min，吸除上清液，PBS缓冲液清洗；1000rpm离心5分钟，吸去PBS溶液。取2mL裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。每个孔加入RIPA裂解液约100μl，置于冰上裂解15分钟，并来回轻摇动使细胞充分裂解。收集裂解液到EP管中，4℃14000rpm离心15min，将上清转移到新的EP管中，放于液氮罐中保存。用EP管收集细胞裂解液，BCA法对蛋白样品初步定量测定，经12％SDS-PA GE分离电泳后，用甲醇将PVDF膜预处理3-5s后，然后用转印液将其浸润0.5h，低温条件下，100V恒压60-120min转移至PVDF膜。取出杂交膜使用TBST漂洗5min，反复3次，然后使用将膜放入脱脂牛奶溶液中，在室温下封闭1h后，分别加入1∶1 000稀释的鼠抗兔Bax、Caspase6多克隆抗体(用TBST稀释)，在37℃恒温下孵育2h，加入1∶1 000稀释的羊抗鼠IgG稀释溶液，在37℃恒温下孵育1h，漂洗5min×3次，加入化学荧光底物，使其充分反应5min，最后吸去杂交膜表面的底物溶液将其放于暗室中显影，胶片使用扫描仪进行扫描，使用Quantity One软件对扫描后得到的图片进行分析，统计灰度值，目的样品的灰度值与内参样品的灰度值之比即为蛋白表达量，得到比值后再进行统计分析。
Western blotting检测4组细胞中Bax蛋白相对表达量分别为0.36±0.02、0.68±0.04、0.68±0.04、1.14±0.31，组间比较均存在显著性差异，具有统计学意义(P＜0.01)；Caspase 6蛋白相对表达量分别为0.30±0.05、0.63±0.02、0.38±0.02、0.95±0.03，组间比较均存在显著性差异，具有统计学意义(P＜0.01)。统计分析结果如表3。
表3各组凋亡蛋白表达统计学比较(x±S)
注：与1组比较△P＜0.01；与2组比较□P＜0.01；与3组比较☆P＜0.01.
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西中医药大学附属瑞康医院
<120> ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 984
<212> DNA
<213> 兔
<400> 1
gagttgctgg aaccacaact gccatggggc cctggggaga gccagagccc ctggtgtggt 60
gcttagaggc tgtggctttg gagccccagt gcccgggggg ctggaggccc tggtgctgct 120
gctggtgctc accctcctct gaagcctggt gcccctctgc atgctgtggc agcctggagc 180
cagccatgaa gcctcaggtt ccctccagaa agccctgagc ctagtgagct gcttgggggg 240
ggtgtttttg gccacctgtc tcctggacct gctgcctgac tacgtagctg tgatagatga 300
ggccctgggc agccctgcac atgacactcc agtttctcct acaagagttc atcttagcca 360
tgagattctt cctggtcctc gtgatggaac agatcaccct ggcttacaag gagcagttgg 420
ggctaccacc acgggaggaa acaagggctc tgcttgggaa cagtgcatgg tgggccacag 480
cattggcaag atggtccagg catcccacag gcacatggag ccccggcagc ccctcagccc 540
tgcgtgcctg tgtactggtc ttctctctgg ccctgcgctc ggtgttcgag gggctagcag 600
tggggctgca gcaggaccag gctcgggcca tggagctcta tctggctttg ctgctccaca 660
agggtatcct ggctgttagc ctgtctctat ggctgctgca gagccacctg cgagtaaagg 720
tcgtggctgg ctgtgggatc ctcttctcaa gcatgacacc tctaggcact gggctgggtg 780
tgcagctctg gtagagttgg cagaaccttg caccagctgg cccagtctgt gctagagggc 840
ttggcagtgg gcaccttccc ctatatcacc ttactgggaa tcttgcctca ggagctggcc 900
acttctgagc agagggtcct caaggtcatt ctgctcatag caggctttgc tctgctcact 960
gacctgctcc tcactcaaat ctag 984
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 兔
<400> 2
gctcatagca ggctttgct 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcucauagca ggcuuugcu 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgaguaucgu ccgaaacga 19

Claims (10)

1.ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的ZIP1基因在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品中的应用，其特征在于，所述ZIP1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.一种用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，其特征在于，所述药物包括具有如SEQID No.1所示的核苷酸序列的ZIP1。
4.根据权利要求3所述的用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，其特征在于，所述药物包括如下任一项：
(a)含有编码ZIP1序列的DNA分子；
(b)含有编码ZIP1序列的RNA分子；
(c)含有编码ZIP1序列的病毒。
5.根据权利要求4所述的用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体，所述载体包括壳聚糖、胆固醇、脂质体、环糊精、微球或微囊中的一种或多种。
6.一种用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，其特征在于，所述用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒包括如下任一项：
(a)含有编码ZIP1序列的DNA分子；
(b)含有编码ZIP1序列的RNA分子；
(c)含有编码ZIP1序列的病毒。
7.根据权利要求6所述的用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，其特征在于，所述用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒还包括用于细胞转染的转染试剂、骨髓间充质干细胞培养基、PCR相关试剂、RNA抽提试剂和免疫荧光相关试剂中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞培养基包括转染用培养基和骨髓间充质干细胞生长完全培养基。
9.根据权利要求3所述的用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物或权利要求6所述的用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡的试剂盒，其特征在于，所述含有编码ZIP1序列的DNA分子包括含有编码ZIP1序列的重组质粒和/或含有编码ZIP1序列的线性DNA片段。
10.ZIP1基因在骨髓间充质干细胞培养中的应用。
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