CN117363577A - 永生化猪脂肪间充质干细胞的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开一种永生化猪脂肪间充质干细胞的构建方法及其应用。通过将表达猴病毒40大T抗原的慢病毒质粒转导到猪脂肪间充质干细胞系，建立了具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系。通过在原代猪脂肪间充质干细胞中稳定过表达SV40LT蛋白，成功得到了可以接近无限次传代的永生化的猪脂肪间充质干细胞，且永生化后猪脂肪间充质干细胞拥有和原代猪脂肪间充质干细胞相同的成脂分化的能力，并利用永生化的猪脂肪间充质干细胞成功筛选出可以促进猪脂肪间充质干细胞分化的小分子化合物厚朴酚。此发明为研究猪的脂肪代谢提供了一种更加便利的细胞系，使得体外药物筛选更加便利，也有利于推动科研工作的进步。

Description

永生化猪脂肪间充质干细胞的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及永生化猪脂肪间充质干细胞的构建方法及其应用。
背景技术
脂肪组织是人和动物体内重要的物质之一，是机体能量储存的主要方式，脂肪代谢是机体最基本的能量代谢方式，脂肪代谢失衡会严重影响机体的生命活动，近年来由于脂肪沉积过多而引起机体脂类代谢紊乱，产生胰岛素抵抗和胰高血糖素血症，进而导致各种疾病，如肥胖、高血压、高血脂、冠心病、动脉粥样硬化和糖尿病等，已成为世界性的医学难题。猪与人类具有相似的代谢功能、心血管系统以及成比例的器官大小，且猪自身有足够厚的脂肪层，不需要混合不同层或不同动物的脂肪组织，也能得到足够多的脂肪细胞进行研究。因此科研人员更倾向使用猪作为研究人类能量代谢和肥胖的动物模型。在畜牧生产中，虽然已获得了大量的优良品种，但是动物机体的脂肪过度沉积和异位沉积仍是影响育种工作的难题，因此了解动物机体脂肪沉积的规律及其分子调控机理是顺利开展动物育种工作最关键的前提，同时也是科研工作者函待解决的难题。
脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs)是研究脂肪代谢较多的一类来源于脂肪组织的成体干细胞，研究表明，各种物种的脂肪间充质干细胞都能表达干细胞的特性，即高度的自我更新复制能力，分化为多种功能细胞的潜能。猪脂肪间充质干细胞因其来源广泛，储备充足的优点，在研究干细胞方面，有极大的优势，现阶段作为研究脂肪代谢和其相关疾病的模型不断的被研究。但是由于从动物体分离出的脂肪间充质干细胞在体外培养的增殖能力是有限的，不能进行无限的增殖复制，在某个阶段后会处于静止，成为限制研究进展的一个重大不利因素，因此如何永生化猪脂肪间充质干细胞成为了人们的一个关注重点。
SV40大T抗原是一种可以使动物细胞获得永生化的关键物质。SV40大T抗原可干扰视网膜母细胞瘤易感蛋白pRb和肿瘤抑制蛋白p53这两种会使细胞进入复制衰老阶段的细胞周期调节因子。此外，SV40大T抗原能够激活转导细胞中的端粒酶活性。给细胞转染SV40大T抗原是动物细胞永生化的一个关键因素。迄今为止，已有多篇文章报道建立了啮齿动物和人类的永生化脂肪间充质干细胞系，它们都利用了SV40大T抗原。在本研究中，猪原代脂肪间充质干细胞将通过慢病毒转导SV40大T抗原，建立永生化细胞系。
厚朴酚(5,5'-diallyi-2,2'-dihydroxybiphenyl,C18H18O2)属于新木脂素类化合物，是厚朴根皮中的主要成分之一。目前，关于厚朴酚的研究很多，厚朴酚具有丰富的药理作用，比如抗氧化、抗脂质过氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗菌、中枢神经抑制作用和降低胆固醇作用等。而厚朴酚在脂肪细胞分化中的研究较少，特别是猪脂肪间充质干细胞的分化还没有任何相关报道。
猪是世界上肉类生产的主要家畜品种，此外，由于它们在解剖学和生理学方面与人类高度相似，它们也越来越多地被用作生理和药理研究的动物模型。因此，猪脂肪间充质干细胞在猪肉品质和医学猪模型的建立中具有重要的应用价值。尽管如此，但是由于从动物体分离出的脂肪间充质干细胞在体外培养的增殖能力是有限的，不能进行无限的增殖复制，成为限制研究进展的一个重大不利因素。迄今为止，小鼠脂肪间充质干细胞的永生化细胞系已经构建成功，可以在体外进行多年的指数扩增而不丧失干细胞能力。在猪中建立永生化的猪脂肪间充质干细胞系，将提供充足的细胞进行机理研究，从而促进猪脂肪代谢研究的发展，并最终将其应用于畜牧业和医学。
发明内容
在本发明中，通过将表达猴病毒40(SV40)大T抗原的慢病毒质粒转导到猪脂肪间充质干细胞系，建立了具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系，并利用此细胞系研究厚朴酚对猪脂肪间充质干细胞分化的影响。
本发明首先提供一种具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系，其中导入并表达猴病毒40大T抗原的猪脂肪间充质干细胞系而建立。
优选地，所述导入并表达猴病毒40大T抗原是通过慢病毒质粒转导到猪脂肪间充质干细胞系中。
本发明由此提供一种制备具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系的方法，其包括如下步骤：将含有Sv40LT基因构建的慢病毒载体转染哺乳动物细胞系，培养并获得SV40LT病毒液；用SV40LT病毒液感染分离的猪脂肪间充质干细胞。
具体地，所述哺乳动物细胞系为293T细胞。任选地，还包括对感染后的猪脂肪间充质干细胞进行形态观察和贴壁情况，以确定是否获得永生化猪脂肪间充质干细胞。
本发明进一步提供一种利用所述的细胞系或所述方法获得的细胞诱导诱导分化为脂肪细胞的方法。
具体地，将永生化猪脂肪间充质干细胞铺孔板无菌培养，加入诱导培养基，培养1-3天；再加入维持培养基，然后每1-3天更换一次，待细胞诱导至6-10天即可；
所述诱导培养基为DMEM基础培养基+10％FBS+1％双抗+5mg/ml胰岛素+1μM地塞米松+1μM罗格列酮+0.5mM IBMX；所述维持培养基为DMEM基础培养基+10％FBS+1％双抗+10mg/ml胰岛素+1μM罗格列酮。
在一个具体实施方式中，无菌培养条件是37℃、5％CO2培养箱中无菌培养。
进一步包括对诱导后的细胞进行油红O染色，并观察脂滴染色情况，以确定是否分化成为成熟的脂肪细胞。
优选地，在诱导培养基添加厚朴酚以促进永生化猪脂肪间充质干细胞的分化，优选地厚朴酚添加量为10-30μM，更优选为18-22μM。
通过在原代猪脂肪间充质干细胞中稳定过表达SV40LT蛋白，成功得到了可以接近无限次传代的永生化的猪脂肪间充质干细胞，且永生化后猪脂肪间充质干细胞拥有和原代猪脂肪间充质干细胞相同的成脂分化的能力，并利用永生化的猪脂肪间充质干细胞成功筛选出可以促进猪脂肪间充质干细胞分化的小分子化合物厚朴酚。此发明为研究猪的脂肪代谢提供了一种更加便利的细胞系，使得体外药物筛选更加便利，有利于推动科研工作的进步。
附图说明
图1.PCDH-Sv40LT载体的构建。注：(A)Sv40LT扩增泳图；(B)PCDH-Sv40LT质粒图谱。
图2.猪脂肪间充质干细胞。注：(A)原代猪脂肪间充质干细胞；(B)P1代永生化猪脂肪间充质干细胞；(C)P5代永生化猪脂肪间充质干细胞；(D)P10代永生化猪脂肪间充质干细胞；(E)P20代永生化猪脂肪间充质干细胞；(F)P30代永生化猪脂肪间充质干细胞。
图3.分化成熟的脂肪间充质干细胞照片。注：(A)原代猪脂肪间充质干细胞；(B)P1代永生化猪脂肪间充质干细胞；(C)P5代永生化猪脂肪间充质干细胞；(D)P10代永生化猪脂肪间充质干细胞；(E)P20代永生化猪脂肪间充质干细胞。
图4.分化成熟的脂肪间充质干细胞油红O染色图。注：(A)原代猪脂肪间充质干细胞；(B)P1代永生化猪脂肪间充质干细胞；(C)P5代永生化猪脂肪间充质干细胞；(D)P10代永生化猪脂肪间充质干细胞；(E)P20代永生化猪脂肪间充质干细胞。
图5.厚朴酚促进永生化猪脂肪间充质干细胞的分化。注：A)油红O染色图；(B)油红O定量分析图；(C)甘油三酯含量检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步说明，以期更好理解本发明，但并不构成对本发明限制。
实施例1、Sv40LT的克隆和载体的构建
1、PCT扩增Sv40LT的序列
NCBI检索相关Sv40LT的序列，利用SnapGene设计Sv40LT的PCR反应扩增引物如下：Sv40LT F：GTGAACCGTCAGATCTCTAGAGCCACCATGGATAAAGTTTTAAACAG Sv40LT R：ATCCTTCGCGGCCGCGGATCCTTATGTTTCAGGTTCAGGGG。
PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
用1.2％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
2、Sv40LT PCR扩增产物的回收与纯化
(1)将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入干净的离心管(自备)中，称量计算凝胶重量(提前记录离心管重量)。
(2)向胶块中加入1倍体积Buffer PG(如凝胶重为100mg，其体积可视为100μl，依此类推)。
(3)60℃以上水浴温育，其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管，待溶胶液为黄色，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全溶解。
(4)柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱(Spin Columns DM)中加入200μl BufferPS，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(5)将步骤3或4所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
(6)向吸附柱中加入450μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
(7)重复步骤7。
(8)13000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液。
(9)将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管(自备)中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μlBuffer EB，室温放置2分钟，13，000rpm离心1分钟。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，室温放置2分钟，13，000rpm离心1分钟。收集DNA溶液，-20℃保存。
3、双酶切和无缝克隆
将PCDH空质粒进行双酶切，体系如下：
37℃酶切1小时，随后进行琼脂糖凝胶电泳，回收载体片段。
利用碧云天Seamless Cloning试剂盒将所得到的基因片段和载体片段进行同源重组。
无缝克隆反应体系：
50℃孵育30min。
通过上述实验，以包含Sv40LT序列的质粒为模板，进行PCR扩增，结果如图1-A所示，1号泳道中为扩增出的Sv40LT片段；对PCDH空载进行XbaI和BamHI双酶切线性化处理；将Sv40LT片段与PCDH线性化质粒胶回收，进行同源重组，后对阳性菌落测序，测序结果与图1-B中图谱序列完全相同，说明PCDH-Sv40LT载体构建成功。
实施例2、细胞转化和质粒提取
1、转化
(1)取感受态于冰上解冻，在100μl感受态细胞中加入10μl已经重组好的产物混匀后在冰上放置30分钟，期间调好水浴锅至42℃；
(2)取出该离心管在水浴锅中42℃热击90s，后冰浴3min；
(3)在超净工作台环境下，加入500μL LB培养基，置于37℃摇床上摇60分钟；
(4)5000rpm离心3min弃去300μl上清，重悬菌体，然后涂到含有氨苄亲霉素的细菌板上，然后置于37℃培养过夜。
2、挑单克隆进行测序
选用平整、圆滑的接种环，消毒后按无菌操作法挑取单菌落于液体LB培养基中，置于37℃摇床180rpm培养8h，然后吸取500μl菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
3、质粒提取
(1)取20ml过夜培养的菌液，加入离心管中，5000rpm离心5min收集细菌，尽量吸弃全部上清。
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl Buffer P1，转入2ml离心管后使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。
(3)向离心管中加入500μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8-10次(温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。)，使菌体充分裂解，室温放置3-5min。
(4)向离心管中加入500μl Buffer E3，立即上下颠倒混匀8-10次避免产生局部沉淀，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5min。13000rpm离心10min，吸取上清。
(5)向滤液中加入450μl异丙醇，上下颠倒混匀。
(6)柱平衡：向已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DL)中加入200μl BufferPS，13000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(7)将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱(已装入收集管)中。
(8)13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(9)向吸附柱中加入750μl Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
(10)将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心3min。
(11)将吸附柱置于一个新的离心管中，Endo-Free Buffer EB在65-70℃水浴预热。向吸附膜的中间部位加入50μl Endo-Free Buffer EB，室温放置5min，13000rpm离心2min。将得到的溶液重新加入到吸附柱中13000rpm离心2min。在核酸浓度检测仪上按照操作要求进行核酸浓度的检测,-20℃保存质粒。
实施例3、慢病毒包装
1、293T细胞培养
细胞复苏
(1)从液氮容器中取出冻存的293T细胞，排净渗入的液氮后迅速浸入37℃温水中，并快速摇动使其尽快融化；
(2)吸取5mL培养液(含10％FBS)至15mL离心管中，用1mL的枪头将冻存管内的细胞移至装有培养液的离心管中，轻轻吹打几下混匀；
(3)将装有293T细胞的离心管放入低速离心机中，1000rpm离心5min，弃上清。向离心管中加入1mL培养液，用枪头吹打混匀后移至10cm培养皿中。轻轻摇晃培养皿，使培养液与细胞充分混匀；
(4)在培养皿上标记好细胞代数及日期，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。
细胞传代
(1)用移液枪将培养皿中的原培养基吸出，用2mL PBS洗涤一次；
(2)向培养皿中加入2mL的胰蛋白酶(含EDTA溶液)消化，当看到细胞开始从培养皿底部脱落时，加入等体积的新鲜培养基终止消化；
3用移液枪对培养皿底部尚未脱落的细胞进行反复吹打，然后将吹打好的细胞悬液吸入15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；
(4)向装有293T细胞沉淀的离心管中加入1mL培养基，用枪头将细胞吹打均匀，吸取200μL细胞悬液于装有9mL培养液的10cm培养皿中，轻轻摇晃培养皿；
(5)在培养皿上标记好细胞代数及日期后，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。
细胞转染
(1)接种至10cm 293T细胞培养皿的细胞达到60％-80％的细胞密度时可以转染；
(2)准备溶液A:PCDH-Sv40LT 15μg，包装质粒psPAX2 10μg和Pmd2.G 5μg，Opti-MEM 100μL；溶液B:Lip3000 50μL,Opti-MEM 100μL；
(3)将溶液A与B混匀，室温静置20min。将上述混合液加入步骤1准备好的293T细胞中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2培养12-15h，然后更换新鲜完全培养基；
(4)培养48h后收集上清液，加入50ml离心管中，并向原培养皿中添加10ml新鲜、预热至37℃完全培养基，继续培养，48h后再次收集上清液。两次收集的上清液可以合并，用0.45μm滤膜过滤后-80℃保存或立即使用。
实施例4、永生化猪脂肪间充质干细胞的构建
1、猪脂肪间充质干细胞的分离
(1)取6日龄以内健康仔猪，心脏注射空气将其处死。用10％新洁尔灭浸泡5min，再用75％的酒精消毒一次，蒸馏水冲洗2次；
(2)在无菌手术台上，将仔猪背部朝上摆放，用手术刀轻轻将背部皮肤划开，取颈、背、臀部皮下脂肪组织，放进含有6％双抗的PBS中。用含有6％双抗的PBS在室温下重复清洗3-4次，尽可能去除油脂；
(3)用手术剪刀将脂肪组织剪成碎块，加入2mg/ml胶原酶I，37℃水浴消化2h；
(4)将消化液过200目细胞筛过滤，收集滤液，1000rpm离心5min，去除上清液，加入DMEM完全培养基打混匀，转移到25cm2的细胞培养瓶中，再加入4mLDMEM完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中无菌培养。48h更换培养液，待细胞长至90％，用胰酶消化并传代。
2、SV40LT病毒液感染猪脂肪间充质干细胞
(1)将3.1中分离出的猪脂肪间充质干细胞铺6孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中无菌培养；
(2)细胞长至贴壁时细胞密度在40％左右时，在6孔板中加入1ml的实施例3中收集的病毒上清液和1ml DMEM完全培养基，48h后重复上述操作；
(3)待细胞长至90％-100％时，用胰酶消化并传代至75cm2的细胞培养瓶，后继续扩大培养并冻存。
3、永生化猪脂肪间充质干细胞的形态观察
在光学显微镜下，观察原代猪脂肪间充质干细胞，SV40LT病毒液感染后P0、P1、P5、P10、P20、P30代次的细胞的形态和贴壁情况，并拍照。
实验结果：如图2-A为分离的原代猪脂肪间充质干细胞，图2-(B-C)分别为P1、P5、P10、P20、P30六种代次的永生化猪脂肪间充质干细胞，永生化后的猪脂肪间充质干细胞与原代细胞相比也未发生变化，说明永生化的猪脂肪间充质干细胞在细胞形态上和原代细胞相同且在传代多次后细胞仍具有正常的细胞形态和增殖能力。
4、永生化猪脂肪间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞
(1)将P5、P10和P20代次的永生化猪脂肪间充质干细胞铺24孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中无菌培养；
(2)待细胞长至100％时，加入诱导培养基(DMEM基础培养基+10％FBS+1％双抗+5mg/ml胰岛素+1μM地塞米松+1μM罗格列酮+0.5mM IBMX)培养2天；
3 2天后将诱导培养基更换为维持培养基(DMEM基础培养基+10％FBS+1％双抗+10mg/ml胰岛素+1μM罗格列酮)，然后每2天更换一次，待细胞诱导至8天后，进行油红O染色。
5、油红O染色
细胞诱导至8天，可进行油红O染色。在细胞染色前，用PBS将细胞清洗3次，加入10％多聚甲醛固定30min，去除10％多聚甲醛，并用PBS清洗3次，加入油红O染液染色15min，用60％的异丙醇清洗浮色，快速去除60％的异丙醇，再用PBS清洗3次，显微镜下观察脂滴染色情况并拍照。
在对P1、P5、P10、P20四种代次的永生化猪脂肪间充质干细胞和原代的猪脂肪间充质干细胞进行成脂分化，分化8天后，显微镜拍照结果如图3所示，均有明显的脂滴形成；随后进行油红O染色，染色后拍照结果表明5种细胞均成功分化成为成熟的脂肪细胞(图4)。综合上述结果，P1、P5、P10、P20都具有和原代猪脂肪间充质干细胞一样成功分化成为成熟脂肪细胞的能力。
实施例5、Sv40LT表达量检测
1、RNA提取
(1)将12孔板中的永生化猪脂肪间充质干细胞在室温下去除培养基，用PBS洗一次，加入1ml Trizol裂解液；
(2)将细胞裂解液转移到1.5ml无RNA酶EP管中，置冰上，静置10min，后每管加入200μl氯仿，充分混合后室温静置10min，使核蛋白复合物完全解离；
(3)在4℃下以13000rpm离心10min，将上清转移至新的无RNA酶EP管中，向其中加入等体积的异丙醇(4℃预冷)，颠倒混匀，室温静置10min。
(4)在4℃下以13000rpm离心10min，去除上清液。
(5)沉淀加入70％乙醇(无水乙醇加DEPC处理的去离子水配制)，4℃，13000rpm离心3min，倒掉乙醇，按这样的方法洗涤两次。
(6)用200ul枪头吸干液体，再放到4℃，13000rpm离心1min，再用10ul枪头吸尽液体。(7)沉淀自然风干，用适量DEPC处理过的去离子水，加入0.5μl抑制剂，4℃静置30min溶解，-80℃保存。
2、逆转录
cDNA的合成(20μl体系)
PCR管中按以下体积加入各种试剂:
65℃反应5min，冰上迅速冷却，然后向其中依次加入：
42℃反应60min,90℃灭活10min，合成的cDNA储存于-20℃备用。
3、荧光定量PCR
Sv40LT qPCR引物：
qPCR反应体系如下表：
qPCR反应条件:
qPCR反应条件
最后进行熔解曲线分析，记录CT值。
在对原代和永生化猪脂肪间充质干细胞中Sv40LT表达量检测中发现，原代的猪脂肪间充质干细胞中无Sv40LT的表达，而在P1、P5、P10、P20、P30的永生化猪脂肪间充质干细胞中Sv40LT正常表达，说明在原代的猪脂肪间充质干细胞中导入Sv40LT基因后，猪脂肪间充质干细胞可以进行多次稳定传代。
表1.猪脂肪间充质干细胞qPCR检测结果
实施例6、厚朴酚促进永生化猪脂肪间充质干细胞的分化
在诱导永生化猪脂肪间充质干细胞分化的过程中，在诱导培养基中加入20μM的厚朴酚，诱导成成熟的脂肪细胞后，进行油红O染色，与对照组相比，厚朴酚处理组脂滴明显多于对照组(图4中A和B)。
通过对细胞内甘油三酯的检测发现，厚朴酚处理组甘油三酯的含量显著高于对照组(图4中C)。综合上述实验结果，说明厚朴酚可以促进永生化猪脂肪间充质干细胞的分化。
其中，酶法测定细胞甘油三酯方法如下：
(1)细胞裂解(在裂解前，细胞用PBS洗涤两次以去除甘油)：在6孔板中加入300μL裂解液，混匀后4℃静置10分钟。
(2)裂解液处理：将6孔板中的裂解液转移到1.5mL的离心管中，13000rpm离心10分钟，上层清液即可用于酶学测定。
(3)工作溶液配制：按4:1比例，取4ml试剂R1与1ml试剂R2混合即可，立即使用。
(4)标准品稀释：用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液一致的液体，将4mM甘油标准品倍比稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μmol/L，取其中6管，设置0浓度对照反应管。
(5)甘油三酯浓度测定：
参见下表进行加样(96孔微板测定)。
加样比例
37℃反应15分钟。反应平衡后颜色在60分钟内稳定。先用蒸馏水+工作液的空白管调零，然后用酶标仪检测OD550nm值。绘制标准曲线并计算甘油三酯浓度(以每mg蛋白浓度或细胞数校正甘油三酯含量)。
综合上述的实验结果，我们通过在原代猪脂肪间充质干细胞中稳定过表达SV40LT蛋白，成功得到了可以接近无限次传代的永生化的猪脂肪间充质干细胞，且永生化后猪脂肪间充质干细胞拥有和原代猪脂肪间充质干细胞相同的成脂分化的能力，并利用永生化的猪脂肪间充质干细胞成功筛选出可以促进猪脂肪间充质干细胞分化的小分子化合物厚朴酚。此发明为研究猪的脂肪代谢提供了一种更加便利的细胞系，使得体外药物筛选更加便利，有利于推动科研工作的进步。

Claims (10)

1.一种具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系，其特征在于，其中导入并表达猴病毒40大T抗原的猪脂肪间充质干细胞系而建立。
2.如权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述导入并表达猴病毒40大T抗原是通过慢病毒质粒转导到猪脂肪间充质干细胞系中。
3.一种制备具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系的方法，其包括如下步骤：
将含有Sv40LT基因构建的慢病毒载体转染哺乳动物细胞系，培养并获得SV40LT病毒液；用SV40LT病毒液感染分离的猪脂肪间充质干细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞系为293T细胞。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，还包括对感染后的猪脂肪间充质干细胞进行形态观察和贴壁情况，以确定是否获得永生化猪脂肪间充质干细胞。
6.一种利用如权利要求1或2所述的细胞系，以及如权利要求3至5任一项所述方法获得的细胞诱导分化为脂肪细胞的方法。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将永生化猪脂肪间充质干细胞铺孔板无菌培养，加入诱导培养基，培养1-3天；再加入维持培养基，然后每1-3天更换一次，待细胞诱导至6-10天即可；
所述诱导培养基为DMEM基础培养基+ 10% FBS +1%双抗+5 mg/ml胰岛素+1μM地塞米松+1μM罗格列酮+0.5 mM IBMX；
所述维持培养基为DMEM基础培养基+ 10% FBS +1%双抗+10 mg/ml胰岛素+1μM罗格列酮。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，无菌培养条件是37℃、5% CO2培养箱中无菌培养。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，进一步包括对诱导后的细胞进行油红O染色，并观察脂滴染色情况，以确定是否分化成为成熟的脂肪细胞。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在诱导培养基添加厚朴酚以促进永生化猪脂肪间充质干细胞的分化，优选地厚朴酚添加量为10-30μM，更优选为18-22μM。
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