CN114854676B - 一种草鱼骨骼肌成肌细胞系的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种草鱼骨骼肌成肌细胞系的构建方法及其应用。本发明所述制备方法包括：原代培养、成肌细胞纯化和传代培养这三个主要步骤。本发明采用胶原蛋白酶和胰蛋白酶结合法基于草鱼背部的肌肉组织建立了一种永生化骨骼肌成肌细胞系，并通过肌源性特征指标和草鱼染色体特征指标进行了确证。该细胞系具有良好转染性能，在不同精氨酸处理下生长性能差异显著，可用于特定基因功能以及营养物质对草鱼肌肉生长、分化的调控作用及其分子机理等研究工作。
Description
技术领域
本发明属于淡水生物细胞培养技术领域，具体涉及一种草鱼骨骼 肌成肌细胞系的构建方法及其应用。
背景技术
草鱼是鲤科、草鱼属鱼类，也是中国的重要淡水养殖鱼类，与鲢、 鳙、青鱼一起构成了中国的“四大家鱼”，是我国人们餐桌上美味的淡 水食品。随着生活水平的不断提高，人们对水产品的消费需求也不断 增加，且对水产品的风味品质等要求也越来越高。肉的感官品质作为 一种消费者可以通过感官直接感受到的指标，已成为水产品品质的一个重要评判标准，也是影响消费者购买决策的一个重要因素。因此， 当前行情下，一方面需要从数量上解决草鱼供应的问题，另一方面， 提高草鱼鱼肉感官品质是促进草鱼养殖发展、满足消费者需求所要解 决的重大问题。从肌细胞生长分化的生理机制以及营养调控研究方面来探究肌肉品质变化时草鱼肉品质调节的重要研究课题。
细胞系作为一种重要的生物学特征研究材料，被大多数研究者青 睐。为了研究骨骼肌在增殖细胞群中维持分化特性的机制，许多研究 人员已经建立了成肌细胞系。最早在1977年，Yafee和Saxel利用小 鼠骨骼肌组织成功建立了世界上第一株成肌细胞系C2C12。随后几年里骨骼肌成肌细胞分离、纯化和培养的方法也逐渐成熟。其中在人类、 猪、鸡、鼠等物种上已经建立了骨骼肌成肌细胞系，也有研究者利用 鱼类的肌肉组织初步建立肌肉细胞系。2018年邓羽成功建立了青鳉 的肌肉细胞系，同年王梦珣等人成功建立了斑石鲷的肌肉细胞系。但 他们都是利用组织块移植培养技术分离的肌肉细胞。
肌肉组织中包含有成纤维细胞、脂肪细胞、肌卫星细胞、成肌细 胞和其他异质前体细胞群，其中成纤维细胞在体外易于贴壁，生长速 度最快，而肌源性细胞(包括肌卫星细胞和成肌细胞)在体外贴壁速 度慢，易分化，难以保持增殖能力。这也是目前在体外分离、纯化和培养骨骼肌成肌细胞系的一大难点，而利用组织块移植培养技术分离 的细胞是否属于成肌细胞，目前在该研究领域还存在很大的争议。
现有技术中，有构建草鱼动脉球组织细胞系的(专利文献 CN113249298A)，有构建草鱼肌肉组织细胞系的(专利文献 CN108148803B)，有构建草鱼皮肤组织细胞系的(专利文献 CN113278580A)，也有构建草鱼输尿管组织细胞系的(专利文献 CN113234660A)，还有构建草鱼胸鳍细胞系的(专利文献 CN107629996A)，尚未发现有构建草鱼骨骼肌的成肌细胞系的报道。 因此，本实验主要探究草鱼骨骼肌成肌细胞系的建立、鉴定以及初步 应用。建立的草鱼骨骼肌成肌细胞系可以用于病毒学、免疫学、细胞 生物学、种质资源保护、基因工程、环境毒理学和研究营养素对肌肉品质的影响以及肌肉组织中各种代谢机制的探究等。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种草鱼 骨骼肌成肌细胞系的构建方法及其应用。所述草鱼骨骼肌成肌细胞系 的构建方法得到的成肌细胞无杂细胞、活性高，构建重复性较强、成 本低。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的草鱼骨骼肌成肌细胞系于2022年5月18日保藏在中国 典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072， 保藏登记入册编号为CCTCC NO：C2022130，请求保藏人为华中农 业大学。
一种草鱼骨骼肌成肌细胞系，保藏号为：CCTCC NO：C2022130。
同时，本发明还提供一种上述草鱼骨骼肌成肌细胞系的构建方法， 包括如下步骤：
S1、原代培养
S11、组织提取和消毒：将草鱼苗麻醉，解剖取草鱼背鳍与侧线 之间的“白色”肌肉组织，随后用灭菌培养基进行消毒，最后将消毒后 的肌肉组织剪碎，得组织碎块；
S12、胶原酶酶解：将步骤S11中所得组织碎块转移至离心管中 进行离心，去除上清液后得组织沉淀；随后用清洗培养基对所得组织 沉淀进行清洗，重复清洗两次；清洗完成后加入胶原酶Ⅳ型消化液、 解离培养基，并在冰上摇床孵育50～90min，随后进行离心处理得沉淀；再用清洗培养基对所得沉淀清洗两次；
S13、胰蛋白酶酶解法：将步骤S12重复处理完后的沉淀重悬于 灭菌培养基中，用移液管研磨5～10次直至沉淀匀浆可以相对容易地 进出移液管，随后离心分离，去除上清液后得沉淀，接着加入胰蛋白 酶溶液、解离培养基，并在冰上摇床孵育10～30min；随后加入完全 培养基终止消化，经离心分离，得上清液和沉淀；将所得上清液转移 至新的离心管中，对所得沉淀重复上述酶解消化、孵育、终止消化、 离心，直至组织碎块被完全消化，最终得完全培养基悬浮液；
S14、细胞悬液收集：将步骤S13中收集到的完全培养基悬浮液 用细胞过滤网过滤去除大的组织碎块；随后进行离心，去除上清液， 收集沉淀；接着，将所得沉淀充分悬浮在完全培养基中，离心处理后 去除上清液，再次收集沉淀；
S15、细胞接种：将步骤S14中最终所得沉淀重悬于完全培养基 中，吹打混匀，确定活细胞的数量；随后将细胞稀释到(1.0～2.5)×105个/mL，并接种到未用多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白处理的T-25细胞 培养瓶中，放入到含5％CO2的28℃细胞培养箱中预培养3～8h后， 将上清液吸出来转移到提前用多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白处理的 T-25细胞培养瓶中继续培养；
S2、成肌细胞纯化
采用差速贴壁法进行成肌细胞的纯化，具体步骤包括：当细胞铺 满培养瓶80～90％左右时进行纯化；每次纯化都先将细胞接种于未用 多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白处理的T-25细胞培养瓶中，放入含5％ CO2的28℃细胞培养箱中预培养3～8h，然后将上清液转移到提前用 多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白处理的T-25细胞培养瓶中继续培养；连 续纯化5～7代；当细胞纯度达到90％时，停止纯化；
S3、传代培养
在T-25细胞培养瓶中，用传代培养基进行正常的传代，细胞每 隔3～5天传代一次，当细胞传代至70代，细胞系建立成功，即得草 鱼骨骼肌成肌细胞系。
作为本发明优选的技术方案，步骤S11和步骤S13中，灭菌培养 基的配制方法为：以体积百分比计，向DMEM培养基中加入5％的 青霉素/链霉素双抗溶液、5％的250μg/mL两性霉素B、1％的10 mg/mL硫酸庆大霉素；所述青霉素/链霉素双抗溶液中青霉素的浓度 为10000IU/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
作为本发明优选的技术方案，步骤S12中，清洗培养基的配制方 法为：以体积百分比计，向DMEM培养基中加入1％的青霉素/链霉 素双抗溶液、1％10mg/mL硫酸庆大霉素；步骤S12和步骤S13中， 解离培养基的配制方法为：以体积百分比计，向DMEM培养基中加 入2％的青霉素/链霉素双抗溶液；步骤S12中，每克肌肉组织碎块 中，胶原酶Ⅳ型消化液的用量为1mL，解离培养基的用量为4mL； 所述青霉素/链霉素双抗溶液中青霉素的浓度为10000IU/mL，链霉素 的浓度为10000μg/mL。
作为本发明优选的技术方案，步骤S13中，每克肌肉组织中，胰 蛋白酶溶液的用量为200μL，解离培养基的用量为4.8mL；
作为本发明优选的技术方案，步骤S13、步骤S14和步骤S15中， 完全培养基的配制方法为：以体积百分比计，向DMEM培养基中加 入1％的青霉素/链霉素双抗溶液、1％的250μg/mL两性霉素B、0.5％ 的10mg/mL硫酸庆大霉素、20％胎牛血清；所述青霉素/链霉素双抗溶液中青霉素的浓度为10000IU/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
作为本发明优选的技术方案，步骤S14中，细胞过滤网的规格为 100μm。
作为本发明优选的技术方案，步骤S3中，传代培养基的配制方 法为：以体积百分比计，向DMEM培养基中加入1％的青霉素/链霉 素双抗溶液和10％胎牛血清；所述青霉素/链霉素双抗溶液中青霉素 的浓度为10000IU/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
作为本发明优选的技术方案，离心条件均为300×g、4℃。
同时，本发明还要求保护上述草鱼骨骼肌成肌细胞系在基因功能 和营养物质调节肌细胞生长分化研究中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明首次提供了一种从草鱼骨骼肌得到成肌细胞系的分 离、纯化、培养的完整构建方法；其中，原代单细胞悬液是通过胶原 酶和胰蛋白酶结合消化法从草鱼骨骼肌组织中分离得到，活细胞密度 高，成活率高；传代培养的成肌细胞是通过差速贴壁法进行纯化后得到，无其它非肌源性的杂细胞，对于骨骼肌相关的研究结果更加可靠、 可信。
(2)本发明中的培养基配方简单，不添加任何生长因子，只添 加抗生素和胎牛血清，大大降低了实验成本。
(3)本发明通过12s rRNA琼脂糖凝胶电泳和染色体核型分析确 定了所得细胞系的染色体众数为48条，细胞系的线粒体12s rRNA序 列与草鱼所发表的线粒体12s rRNA序列的同源性为99％，鉴定了所 得细胞系确实来自草鱼。
(4)本发明构建得到的草鱼骨骼肌成肌细胞系，增殖速度快， 种群倍增时间为27.24h，可以连续传代，可超低温冻存和复苏，该 细胞系在液氮中冻存了1～6个月后的细胞存活率分别为79.78％-95.06％。
(5)本发明通过肌源性关键基因的表达检测表明，该细胞系主 要由成肌细胞组成；通过蛋白免疫印迹和免疫荧光分析可知，该细胞 系表达结蛋白、Myod和MyHC I蛋白，具有骨骼肌细胞的肌源性特 性；经pEGFP-N1转染可知，该细胞系具有较高的转染效率，可以直接用于鱼类肌肉生长发育相关功能基因的研究。
(6)本发明发现所得细胞系对精氨酸敏感，不同浓度的精氨酸 可以促进成肌细胞的增殖和分化，可以用于研究营养素对肌细胞增殖 分化以及改善肌肉品质的机理机制探究。
总之，本发明提供的草鱼骨骼肌成肌细胞系的构建方法重复性较 强，染色体、微生物污染、物种来源、肌源性鉴定方法可靠可信；配 制的各类培养基营养成分全面，取材的草鱼年龄恰当；所得成肌细胞 系可以作为基因功能研究、营养生理研究、病原特性研究、疫苗研制、 病毒学、免疫学、细胞生物学、种质资源保护、环境毒理学等生物材料，应用价值极大。
附图说明
图1为显微镜下细胞系表观形态图；其中a为原代肌肉细胞接种 72h后；b为10代细胞接种72h后；c为30代细胞接种72h后；d为 60代细胞接种72h后；e为24代细胞冻存前长满瓶底90％时；f为冻 存1个月的第24代细胞复苏96h后；g为冻存3个月的第24代细胞复苏96h后；h为冻存6个月的第24代细胞复苏96h后；
图2为草鱼骨骼肌成肌细胞系的生长曲线、细胞活力和染色体核 型图；其中，a为草鱼第29代骨骼肌成肌细胞的增殖曲线；b为草鱼 第41代骨骼肌成肌细胞的活力曲线图；c为第38代骨骼肌成肌细胞 染色体数目分布图；d为染色体的中期分裂相；e为二倍体染色体核 型分析图；结果以平均值±标准误表示，标尺＝5μm；
图3为第47代草鱼骨骼肌成肌细胞系12s rRNA琼脂糖凝胶电泳 图和序列对比结果；
图4为第46代和60代草鱼骨骼肌成肌细胞支原体检测结果图； 其中，a为46代细胞培养基支原体检测结果；b为60代细胞培养基 支原体检测结果；
图5为结蛋白和MyoD蛋白在原代肌肉细胞、第65代草鱼骨骼 肌成肌细胞和草鱼肌肉组织中的蛋白免疫印迹结果；
图6为MyoD、结蛋白和MyHC I在第74代草鱼骨骼肌成肌细 胞中的免疫荧光图；其中，a～c为MyoD蛋白在不同放大倍数视野中 的免疫荧光图；d～f为Desmin蛋白在不同放大倍数视野中的免疫荧 光图；g～i为MyHC I蛋白在不同放大倍数视野中的免疫荧光图。
图7为pEGFP-N1载体在第70代骨骼肌成肌细胞中的转染图；
图8为不同精氨酸浓度对第75代骨骼肌成肌细胞的生长影响；
图9为不同精氨酸浓度对第78代骨骼肌成肌细胞分化的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合实施 例，对本发明作进一步的详细说明。当然，此处所描述的具体实施例 仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中的步骤虽然用标号进行了排列，但并不用于限定步骤的 先后次序，除非明确说明了步骤的次序或者某步骤的执行需要其他步 骤作为基础，否则步骤的相对次序是可以调整的。可以理解，本文中 所使用的术语“和/或”涉及且涵盖相关联的所列项目中的一者或一者以上的任何和所有可能的组合。
其中，本发明中所使用到的各类培养基的制备方法如下：
灭菌培养基：以体积比计，在DMEM培养基中加5％青霉素/链 霉素双抗溶液、5％两性霉素B(250μg/mL)和1％硫酸庆大霉素 (10mg/mL)。
清洗培养基：以体积比计，在DMEM培养基中加1％的青霉素 /链霉素双抗溶液和1％硫酸庆大霉素(10mg/mL)。
解离培养基：以体积比计，在DMEM培养基中加2％青霉素/ 链霉素双抗溶液。完全培养基：在DMEM培养基中加1％青霉素/ 链霉素双抗溶液、1％两性霉素B(250μg/mL)、0.5％硫酸庆大霉素 (10mg/mL)和20％的胎牛血清。
传代培养基：以体积比计，在DMEM培养基中加1％青霉素/ 链霉素双抗溶液和10％胎牛血清。
本发明中，所用青霉素/链霉素双抗溶液中青霉素的浓度为10000 IU/mL，链霉素的浓度均为10000μg/mL。
DMEM培养基购自GibcoTM Invitrogen,USA。
草鱼来自黄冈市太白湖渔场。
实施例1
一种草鱼骨骼肌成肌细胞系的构建方法，包括如下步骤：
S1、原代培养
S11、组织提取和消毒：取体长5.1cm左右的健康草鱼苗，用100 mg/mL的MS-222麻醉剂对鱼苗进行麻醉，使用75％的酒精全身喷洒 消毒后，立即放入超净工作台内的白瓷盘中，于冰上开始解剖，先用 剪刀和镊子将皮去掉，然后取出草鱼背鳍与侧线之间的“白色”肌肉 组织；将组织放入无菌的培养皿中，用无菌PBS洗两次确保无任何结缔组织，将组织浸泡在灭菌培养基中2h，然后，用剪刀将肌肉组 织剪碎至1～2mm3大小的组织碎块；
S12、胶原酶酶解：用10mL移液管将步骤S11中所得组织碎块 转移至50mL离心管中，在300×g、4℃下离心5min，去除上清液 后得组织沉淀；随后用清洗培养基对所得组织沉淀进行清洗，重复清 洗两次；清洗完成后，按照每克肌肉组织碎块加入1mL胶原酶Ⅳ型消化液和4mL解离培养基，并在冰上摇床孵育50min左右，根据肌 肉的量和解离程度来确定孵育时间；随后在300×g、4℃下离心5min 进行离心处理，去除上清液，收集得沉淀；用培养基对所得组织沉淀清洗两次；
S13、胰蛋白酶酶解法：将步骤S12重复处理完后的沉淀重悬于 灭菌培养基中，用10mL移液管研磨5次左右直至沉淀匀浆可以相对 容易地进出移液管，随后在300×g、4℃下离心5min，去除上清液后 得沉淀，接着按照每克肌肉组织碎块加入200μL胰蛋白酶溶液、4.8 mL解离培养基，并在冰上摇床孵育15min；随后加入完全培养基终 止消化，经300×g、4℃下离心分离1min，得上清液和沉淀；将所得 上清液转移至新的50mL离心管中，对所得沉淀重复上述酶解消化、孵育、终止消化、离心，直至组织碎块被完全消化，最终得完全培养基悬浮液；
S14、细胞悬液收集：将步骤S13中收集到的完全培养基悬浮液 用100μm细胞过滤网过滤去除大的组织碎块；随后300×g、4℃下 离心分离15min，去除上清液，收集沉淀；接着，将所得沉淀充分悬 浮在完全培养基中，300×g、4℃下离心分离15min处理后去除上清液，再次收集沉淀；
S15、细胞接种：将步骤S14中最终所得沉淀重悬于5mL完全培 养基中，吹打混匀，确定活细胞的数量(吸出20μL细胞悬浮液放入 1.5mL微量离心管中，加入5μL台盼蓝染液混匀，静置5min，使用 细胞计数器确定活细胞的数量)；随后将细胞稀释到(1.0～2.5)×105个/mL，并接种到未用多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白处理的T-25细胞 培养瓶中，放入到含5％CO2的28℃细胞培养箱中预培养4h后，将 上清液吸出来转移到提前用多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白处理的T-25 细胞培养瓶中继续培养；
S2、成肌细胞纯化
采用差速贴壁法进行成肌细胞的纯化，具体步骤包括：当细胞铺 满培养瓶90％左右时进行纯化；每次纯化都先将细胞接种于未用多聚 -L-赖氨酸和层粘连蛋白处理的T-25细胞培养瓶中，放入含5％CO2的28℃细胞培养箱中预培养4h，然后将上清液转移到提前用多聚-L- 赖氨酸和层粘连蛋白处理的T-25细胞培养瓶中继续培养；连续纯化 5～7代；当细胞纯度达到90％时，停止纯化；
S3、传代培养
在T-25细胞培养瓶中，用传代培养基进行正常的传代(不需要 预培养和用多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白处理细胞培养瓶)，细胞每 隔3～5天以1：2的速度传代一次，当细胞传代至70代，细胞系建立 成功，即得草鱼骨骼肌成肌细胞系，参见图1-a、b、c、d。
试验例1
对于实施例1中构建过程中及构建所得成肌细胞系进行如下试 验：
(1)细胞冻存和复苏
细胞冻存：当细胞可以传代后，采用24代细胞进行冻存和复苏 试验。将细胞扩大到75cm2的培养瓶中，等细胞生长至对数期(约铺 满80％)时进行冻存；将细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化下来， 用细胞计数仪对细胞进行计数，在300×g下离心5min，以2×105cells/mL的标准用冻存液重悬细胞，将细胞悬液分装到冻存管，每管 1.6mL，直接放入-80℃中保存，3个月后转入液氮中进行长期保存。
细胞复苏：从冷冻容器中取出冻存管，立即置于37℃水浴锅中 摇动使其迅速融化，用吸管吸出冻存管中细胞悬液，加入到含有6mL 完全培养基的离心管中，混匀后细胞计数仪计数，300×g离心5min， 弃去上清液，收集沉淀。根据细胞数目加入相应量的完全培养基，将 细胞接种到细胞培养瓶中，放入含5％CO2的28℃培养箱中培养，次 日更换新鲜培养液，再培养24h后观测细胞的形态和生长情况。细胞 冻存复苏后的存活率在79.78～95.06％之间(表1)，细胞冻存复苏 前后细胞形态未发生变化(图1-e、f、g、h)。
表1草鱼骨骼肌细胞的复苏冻存能力
(2)细胞的生长性能评估
取29代的细胞进行生长曲线的测定。用0.25％胰蛋白酶-EDTA 溶液消化已经铺满瓶底90％的细胞，在300×g下离心5min，收集细 胞沉淀，用3mL完全培养基重悬细胞。取20μL细胞悬液用细胞计数 仪进行计数，用完全培养基将浓度调制至3.64×105cells/mL，将该细 胞接种到24孔板中，随后将24孔板放入含5％CO2的28℃培养箱中 培养，每隔24h用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化3个孔收集细胞， 共收集8d。将收集的细胞用细胞计数仪进行计数，计算每孔细胞总 量。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，按照绘制细胞的生长曲 线计算细胞群体倍增时间。如图2-a所示，根据绘制的生长曲线对数生长阶段进行线性回归分析得到，第29代草鱼骨骼肌成肌细胞系的 群体倍增时间为27.24h。
(3)细胞活力检测
使用MTT法检测细胞活力。取41代的细胞进行细胞活力评估。 用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化处于对数生长期的细胞，在300×g 下离心5min，收集细胞沉淀，用3mL完全培养基重悬细胞。取20μL 细胞悬液用细胞计数仪进行计数，用完全培养基将浓度调制至 5×105cells/mL，将该细胞接种到96孔板中，将接种好的细胞培养板 放入含5％CO2的28℃细胞培养箱中培养，培养24h、48h、72h、 96h和120h后测定细胞在570nm处的OD值。细胞培养了一定时间 后，每孔加10μL MTT溶液，继续培养4h后，每孔加入150μL二 甲基亚砜(DMSO)，置于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶 解。使用酶标仪检测570nm处的OD值。如图2-b所示，细胞的活 力曲线与细胞的增殖曲线保持一致。
(4)染色体核型分析
将38代的细胞系接种到75cm2的细胞培养瓶中，待细胞铺满80％ 后更换新鲜培养基，并向培养瓶中加入秋水仙素溶液(使终浓度达到 1.5μg/mL)，放入含5％CO2的28℃细胞培养箱中继续培养12h。用 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化细胞，收集细胞悬液到15mL离心管中， 在300×g离心5min，弃上清液，收集细胞沉淀。加10mL冰水于15mL 离心管中重悬细胞，使细胞低渗吸水膨胀，在冰上冰浴30min，在300×g离心5min，弃上清液，收集细胞沉淀。缓慢加入2mL固定液 (冰醋酸：甲醇＝1：3)重悬细胞，预固定2min，缓慢加入3mL固 定液，轻轻吹打混匀细胞悬液，在冰上固定15min，在300×g离心 5min，弃上清液，收集细胞沉淀。重复此步骤2遍继续固定，最后一 次离心后留2mL固定液重悬细胞。将细胞悬液从高处滴落在提前预 冷1h的载玻片上。自然风干，自然干燥后用吉姆萨染液室温染色20 min。最后用双蒸水冲洗干净，自然风干。在正置显微镜下观察该细 胞的染色体中期分裂相100个，统计染色体数目、拍照并进行核型分 析。结果显示草鱼骨骼肌成肌细胞系的染色体数目在34～65之间，其 中染色体数为48的细胞占80％(图2-c)，该细胞系的48条染色体 中有8对中部着丝粒染色体(m)和16对亚中部着丝粒染色体(sm)， 即染色体核型为：2n＝16m+32sm(图2-d、e)。
(5)线粒体12s rRNA基因分析
待第47代细胞生长至对数期时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液 消化，在300×g离心5min，弃上清液，收集细胞沉淀。用PBS清洗 2遍后，根据通用型柱式DNA提取试剂盒进行细胞总DNA的提取。
用分光光度计法测量DNA浓度和OD260/280值，OD值需在 1.8～2.0，并用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并根据DNA 浓度将DNA稀释到10μg/mL作为工作液。
引物设计根据NCBI数据库中草鱼的12srRNA序列(GenBankAccessionNo.AY897013.1)，利用primer5.0设计引物，由 生工生物工程(上海)股份有限公司合成如下：
F-primer:5'–TTAGATACCCCACTATGCTC-3'
R-primer:5'–ACTAAATCCTCCTTCAAGCA-3'
根据2× PCRMasterMix(WithDye)试剂盒说明书，聚合酶链 反应(PCR)按以下次序，将各成分在0.2mL无菌离心管内混合，总体积20μL。
表2 PCR加入次序
短暂离心混匀，将样品置于PCR仪中按以下条件进行扩增反应：
94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s， 35个循环，72℃保温10min。末轮循环后一直维持在4℃，扩增得到 的产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后，用凝胶成像系统 照相，观察到所需产物的扩增带后，送产物到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序完成后在NCBI上与已知的序列进行 BLAST比对。通过图3-a可知，PCR扩增得到预期的336bp的产物， 经过测序比对分析其序列与已发表的序列有99％的一致率(图3-b)。
(6)微生物检测
根据GMyc-PCR支原体检测试剂盒检测46代和60代细胞培养 基中的支原体情况。GMyc-PCR支原体检测试剂盒主要通过PCR方 法检测细胞培养基中的支原体，所用引物为根据支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计，只特异性扩增支原体DNA。通过1.5％的 琼脂糖凝胶电泳检测结果。通过图4可知，第46代和60代骨骼肌成 肌细胞培养基中没有支原体污染。
(7)骨骼肌源性关键因子的表达
取原代细胞和第64代骨骼肌成肌细胞检测肌源性关键因子的表 达情况。细胞总RNA根据TrizolTM试剂盒说明书进行提取，利用分 光光度计法测量RNA浓度和OD260/280值，OD值需在1.8–2.1左右，并用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，利用 Ⅲ1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus，上海翊圣)将提取的总RNA反转录为cDNA，采用/> qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox，上海翊圣)试剂盒对肌源性关键基因进行实时荧光定量分析，使用NCBI数据库中的已知序列，通过PrimerPremier6.0软件为每个目标基因设计了特定的引物对(表3)。 实时荧光定量条件如下：95℃预变性5min，95℃变性10s，57℃退火 30s，72℃延伸20s，40个循环，72℃保温10min。使用β-actin作为 参考基因，结果表示为相对于内参基因β-actin的表达量，采用2-ΔΔCt法计算。如表4可知，肌源性关键因子β-actin、pax7、myod、myog、 myf5、myh2、myh4、myh1和myh1基因在原代肌肉细胞和第64代骨 骼肌成肌细胞中都有表达，但是肌源性关键因子在传代细胞中的相对 表达量低于原代细胞。
表3草鱼肌源性关键因子的基因引物
表4原代肌肉细胞和64代骨骼肌成肌细胞关键生肌因子的基因表达
(8)蛋白免疫印迹
将0.1g肌肉组织/细胞置于1.5mL离心管中，加入适量RIPA裂 解液(使用前加入PMSF，PMSF终浓度1mM)于4℃充分研磨裂解， 再在4℃下12000×g离心15min，取上清液分装于0.5mL离心管中并 置于-80℃保存；用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白质提取液中的蛋 白质浓度；将制备好的SDS-PAGE电泳胶放入电泳槽中并加入适量电泳缓冲液，向胶孔中加入预先制备好的蛋白质(50μg)样品进行 SDS-PAGE，设置恒压90V电泳30～40min，然后调高电压至120V， 电泳1～1.5h至溴酚蓝到达胶的底部即终止电泳，进行转膜。裁剪大 小跟凝胶完全一致的PVDF膜，置于甲醇中浸泡30～45s使其激活， 并浸泡于预先冷却的转膜缓冲液中备用。组装滤纸、蛋白胶、活化的 PVDF膜、滤纸“三明治”结构后，转膜复合体置于加满转膜缓冲液的转印槽中于恒定电流250mA下进行转膜，根据所需检测蛋白的大小 设置适宜的转膜时间；转膜后将PVDF膜置于丽春红染色液中以确定 转膜成功，后用TBST缓冲液在脱色摇床上洗涤PVDF膜。取出用洗 涤缓冲液漂洗过的印迹膜，置于5％脱脂牛奶中室温封闭2h。将一抗 用TBST稀释适宜倍数后，加入附着有相应分子量的PVDF膜，于4℃ 过夜孵育。次日用TBST洗涤孵育过一抗的PVDF膜三次，每次10min。 将相应的二抗用TBST稀释后和PVDF膜于室温下孵育2h，再用 TBST洗涤3次，每次10min。使用Bio-Rad公司的ECL试剂盒对蛋 白信号进行检测。将试剂盒中的A液和B液等体积混合均匀，将转 有蛋白的PVDF膜面朝上平铺在显色板上，然后取适量显色混合液加到膜上避光静置5min，吸水纸吸掉多余的显色液并用保鲜膜包好蛋 白膜以防变干，于凝胶成像系统中进行成像分析。如图5可知，Myod 蛋白和结蛋白在肌肉组织、原代肌肉细胞和第65代骨骼肌成肌细胞 中都有表达，Myod蛋白在传代细胞中的表达量是最高的，但是结蛋 白在传代细胞中的表达量是最低的。
(9)细胞免疫荧光
将74代骨骼肌成肌细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化，在 300×g离心5min，弃上清液，收集细胞沉淀。取20μL细胞悬液用细 胞计数仪进行计数，用完全培养基将浓度调制至2.5×104cells/mL，将 该细胞接种到提前放置了细胞爬片的24孔板中。在培养板中将已爬 好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次5min；用4％的多聚甲醛固定 爬片15min，用PBS浸洗爬片3次，每次5min；0.2％TritonX-100(PBS 配制)室温通透20min，PBS浸洗爬片3次，每次5min；吸水纸吸干 PBS，在爬片上滴加封闭液(5％NGS，1.5％BSA，0.1％TritonX-100)，室温封闭60min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的 稀释好的一抗(一抗：封闭液＝1：50)并放入湿盒，4℃孵育过夜。 接下来的所有操作步骤都在较暗处进行。用PBST浸洗爬片3次，每 次5min；吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗(二 抗：封闭液＝1：200)，放入含5％CO2的28℃细胞培养箱中孵育1h， 用PBST浸洗爬片3次，每次5min；滴加10μg/ml的DAPI溶液避 光孵育5min，对标本进行核染，用PBST浸洗爬片4次，每次5min， 洗去多余的DAPI溶液；用吸水纸吸干爬片上的液体，用抗荧光淬灭 剂封片液封片，然后在激光共聚焦下观察采集图像。如图6所示，在 第74代骨骼肌成肌细胞中检测到了MyoD、结蛋白和MyHC I(由 myh7基因编码)的表达，而且通过图6-a,b,c可知，MyoD蛋白不仅仅在胞质表达，在细胞核里面也有表达；通过图6-d,e,f可知，结蛋白主要在细胞核周围表达；通过图6-g,h,i可知，MyHC I蛋白主要在细 胞质表达。
(10)细胞转染能力评估
将第70代骨骼肌成肌细胞以2×105cells/孔的初始密度接种到24 孔培养板中，放入含5％CO2的28℃细胞培养箱中继续培养，当细胞 铺满瓶底90％时。采用脂质体法测定细胞的转染效率，根据 Lipofectamine2000试剂盒说明书将PEGFP-N1载体与转染试剂混合后加入细胞，将细胞放入含5％CO2的28℃细胞培养箱中继续培养 6h后更换新鲜培养基。将细胞放入含5％CO2的28℃细胞培养箱中 培养48h后用荧光显微镜检测PEGFP-N1载体的表达情况。如图7 所示，草鱼骨骼肌成肌细胞系的转染效率在23～24％左右。
(11)不同精氨酸浓度对骨骼肌成肌细胞系增殖的影响
设置Arg的终浓度梯度为0，50，100，200μg/mL。用0.25％胰 蛋白酶-EDTA溶液消化已经铺满瓶底90％的细胞，在300×g下离心 5min，收集细胞沉淀。提前在培养基中添加精氨酸分别配制成终浓度为0，50，100，200μg/mL的浓度梯度，用含不同浓度梯度精氨酸的 培养基重悬细胞。取20μL细胞悬液用细胞计数仪进行计数，用完全 培养基将浓度调制至3.5×105个/mL，将细胞悬液接种到24孔板中， 随后将24孔板放入含5％CO2的28℃培养箱中培养，每隔24h用0.25％ 胰蛋白酶-EDTA溶液消化3个孔收集细胞，共收集8d。将收集的细 胞用细胞计数仪进行计数，计算每孔细胞总量。以培养时间为横坐标， 细胞数量为纵坐标绘制生长曲线。如图8所示，不同浓度的精氨酸会 对骨骼肌成肌细胞系的生长产生促进作用，使骨骼肌成肌细胞系生长最佳的精氨酸处理浓度是100μg/mL。
(12)不同精氨酸浓度对骨骼肌成肌细胞系分化的影响
设置Arg的终浓度梯度为0，50，100，200μg/mL。用0.25％胰 蛋白酶-EDTA溶液消化已经铺满瓶底90％的骨骼肌成肌细胞，在 300×g下离心5min，收集细胞沉淀。提前在培养基中添加精氨酸配制成终浓度为0，50，100，200μg/mL的浓度梯度，用含不同浓度梯 度精氨酸的培养基重悬细胞。将细胞接以2.1×106个/mL接种到六孔 板中，分别培养1d、2d、3d和4d后通过荧光定量检测精氨酸对骨 骼肌成肌细胞分化的影响。根据Trizol试剂盒提取细胞总RNA，通 过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和纯度；根据Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒将 RNA反转录成cDNA，根据 qPCR SYBR Green Master Mix试 剂盒对分化相关基因pax7、myod、myog、myh2、myh4、myh1和myh7 进行荧光定量分析。分析结果表明，不同精氨酸浓度和处理的时间对 骨骼肌成肌细胞分化会产生影响(图9)。pax7的相对表达量随着时 间的增加先下降再上升，精氨酸在处理的第2d和3d的最佳浓度是 50μg/mL，处理的第4d的最佳浓度是200μg/mL(图9-a)；myod 的相对表达量随着时间的增加而增加，精氨酸的最佳浓度随着处理时 间变化而发生变化(图9-b)；myog的相对表达量随着时间的增加先 下降再上升，随着处理时间的变化发现，精氨酸的最佳浓度是50 μg/mL(图9-c)；myh2的相对表达量随着时间的变化没有发生显著 性变化，精氨酸的最佳浓度随着处理时间变化而发生变化(图9-d)； myh4的相对表达量随着时间的增加先下降再上升，随着处理时间的变化发现，精氨酸的最佳浓度是50μg/mL(图9-e)；myh1的相对表 达量随着时间的增加而下降，随着处理时间的变化发现，精氨酸的最 佳浓度是100μg/mL(图9-f)；myh7的相对表达量随着时间的增加 而上升，精氨酸在处理的第1d和2d的最佳浓度是50μg/mL，处理的第3d和4d的最佳浓度是100μg/mL(图9-g)。
综上，用本发明方法建立的草鱼骨骼肌成肌细胞系可以直接运用 于外源基因功能和营养代谢机制研究。除此之外，用本发明方法建立 的草鱼骨骼肌成肌细胞系还可以运用于病毒学、免疫学、细胞生物学、 种质资源保护、基因工程和环境毒理学等领域的研究。
Claims (2)
1.一种草鱼骨骼肌成肌细胞系，其特征在于，保藏号为：CCTCC NO：C2022130。
2.一种权利要求1中所述草鱼骨骼肌成肌细胞系在基因功能研究和营养物质调节肌细胞生长分化研究中的应用。
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Non-Patent Citations (3)
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