CN116496992B - 一种鸡胚成肌永生化细胞及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡胚成肌永生化细胞及其建立方法和应用。所述的鸡胚成肌永生化细胞，命名为鸡胚成肌永生化细胞JIPS‑CPM，其保藏编号CCTCC NO:C202396。试验发现，JIPS‑CPM可以连续传代80代以上，且活性和生物学特性与原代细胞基本一致。本细胞系的构建采用hTERT和SV40t线性化后电转染方法，与常规细胞系构建方法相比，具有效果稳定和操作便捷的优势。本发明可广泛应用于禽类肌肉发育和品质调控等基因功能研究，能够显著降低因反复提取原代细胞的造成的培养成本，加快相关领域的研究进展，在家禽基础研究中具有明显的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种鸡胚成肌永生化细胞及其建立方法和应用。
背景技术
骨骼肌是动物机体的最主要的组织类型，约占体重的40%。肌肉的生长发育性能已成为评价畜禽生产经济效益的首要指标。鸡肉是我国第二大的消费肉类，肉鸡业的发展良好与否直接关系居民肉类供应和农民增收。随着生活水平的提高，人们对鸡肉品质的要求也越来越高，这对肉鸡品种改良又提出新的要求。鉴于以上原因，鸡肌肉发育和品质调控已经成为肉鸡育种学者关注的热点。
成肌细胞（Myoblast）是一种位于肌细胞膜和肌膜之间的具有增殖和分化潜能的多能干细胞，能够增殖融合为多核肌管并最终分化为肌纤维，对于骨骼肌发育、修复和再生有着重要的意义。成肌细胞已经成为肌肉生长、肌肉疾病和肉质调控等研究的重要体外研究材料。成肌细胞的体外分离和培养最早可以追溯到上世纪六十年代，Mauro等首次在青蛙骨骼肌中分离获得成肌细胞。目前，在猪、羊以及鸡等物种上已经建立了较为成熟的原代成肌细胞体外分离培养方法，显著推动了相关研究领域的进展。但在实际研究中发现，原代成肌细胞往往只能稳定培养几个世代，传代世代过多普遍出现细胞形态改变和增殖速度放缓等现象。此外原代细胞分离提取费时耗力，试验效率受到很大影响。因此，建立具有永生化特性的成肌细胞，即可以长期传代且性状稳定的细胞，在当前肌肉功能研究领域尤其是家禽上有着实际的技术需求。
细胞永生化是指体外培养的细胞由于自身改变或者受到外界条件的影响，从增殖衰老危机中逃离，从而获得无限增殖能力的过程。细胞发生自发永生化的概率很低，构建永生化细胞系主要采取外源诱导的方法，包括化学物质、辐射诱变，病毒感染，端粒酶激活等。目前在鸡上完成永生化细胞系构建的仅有前脂肪细胞、成纤维细胞、肾细胞等，未见鸡成肌细胞永生化的相关报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种鸡胚成肌永生化细胞，传代至80代仍能保持较好的细胞活性和生物学特性，可大幅节省反复提取原代细胞的时间和经济成本，提高不同批次的重复性，提高相关研究的效率和准确性。
本发明的第二个目的是提供上述鸡胚成肌永生化细胞的构建方法。
本发明的第三个目的是提供上述鸡胚成肌永生化细胞的应用。
为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种鸡胚成肌永生化细胞，所述鸡胚成肌永生化细胞为JIPS-CPM，其保藏编号CCTCC NO: C202396。本发明的鸡胚成肌永生化细胞，于2023年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
第二方面，本发明提供了一种所述的鸡胚成肌永生化细胞的构建方法，包括以下步骤：
S1：取孵化至11胚龄的鸡胚，利用胰酶消化分离腿部成肌细胞；
S2：将所述成肌细胞利用差速贴壁法去除成纤维细胞，对细胞进行纯化，获得原代成肌细胞；
S3：利用电穿孔转染法将外源性的SV40t和hTERT共同导入所述原代成肌细胞，进一步筛选获得符合成肌细胞特征的鸡胚成肌永生化细胞。
进一步地，所述步骤S1具体操作为，取11胚龄鸡胚用PBS清洗后，剥离腿肌并将肌肉剪碎后，加入含有EDTA的0.25%胰酶，于37℃恒温箱消化20min，随后加入生长培养基终止消化，离心去除胰酶后用所述生长培养基重悬细胞，分别用200目和400目滤筛过滤悬液，置于培养箱培养。
进一步地，所述生长培养基为DMEM+20%胎牛血清+1%青/链霉素。
进一步地，所述步骤S3具体操作为，将生长状态良好的所述原代成肌细胞以1*105/ml的密度接种于6孔板，继续培养至50%融合时，取线性化的pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40T质粒，按照Lonza电转染程序及操作步骤转染细胞，待细胞达到80%融合时，将培养基更换为添加1μg/ml 嘌呤霉素的培养基继续培养，2d更换一次培养基，直至对照孔中的细胞完全死亡。
第三方面，本发明还提供了所述的鸡胚成肌永生化细胞在构建禽类骨骼肌体外模型、肌肉发育等基因功能研究中的应用。
本发明相对于现有技术而言，
1）现有细胞系构建主要采用导入人端粒酶逆转录酶（hTERT）方法，但在非哺乳类动物细胞中应用效果往往不佳，需要辅助导入其他功能因子，如猴肾病毒SV40。本发明在禽类成肌细胞永生化率先采用hTERT和SV40t共同转染方法，获得的细胞系永生化效果好。
2）常规的慢病毒转染在禽类成肌细胞应用效果较差，还容易造成细胞形态改变、核型变化等不利后果。本发明选择适合难转细胞的电穿孔转染方法，本方法不依赖病毒和细胞表面的细胞受体，核酸底物可以直接进入细胞核，使得细胞的转染效率最高有望可达99%，非常适合难转染细胞的转染。因此，本发明获得的鸡胚成肌永生化细胞系稳定性好，更适合在相关研究中使用。
3）采用本发明的鸡胚成肌永生化细胞系，可避免鸡胚成肌细胞繁琐、漫长的分离、纯化、培养过程，提高试验效率；细胞系的同质性优异，可以减少由于不同批次之间细胞活性差异，明显提高研究结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明中原代鸡胚成肌细胞的细胞形态。
图2为本发明中原代鸡胚成肌细胞的细胞生长曲线。
图3为本发明中原代鸡胚成肌细胞的细胞增殖标志蛋白DESMIN表达情况。
图4为本发明中原代鸡胚成肌细胞的成肌分化标志蛋白MyHC表达情况。
图5为本发明中鸡胚成肌永生化细胞系5、20、50、80代次细胞形态。
图6为本发明中传代至5代的鸡胚成肌永生化细胞系和原代细胞的hTERT和SV40t基因检测图。
图7为本发明中传代至80代的鸡胚成肌永生化细胞系的细胞增殖标志蛋白DESMIN表达情况。
图8为本发明中传代至80代的鸡胚成肌永生化细胞系的成肌分化标志蛋白MyHC表达情况。
图9为本发明中传代至80代的鸡胚成肌永生化细胞系的细胞生长曲线。
图10为本发明中应用鸡胚成肌细胞永生化细胞系和原代细胞进行基因功能研究的效果对比图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中如无特别说明，均为常规方法，所用的试剂均为市售试剂。
本实施例的鸡胚成肌细胞永生化细胞系，是通过酶解法分离11胚龄鸡胚腿部成肌细胞，然后利用差速贴壁纯化成肌细胞，最后采用电转染法将外源性hTERT和SV40t基因导入鸡胚原代成肌细胞获得。培养物名称：鸡胚成肌永生化细胞JIPS-CP，其保藏号为CCTCCNO: C202396，于2023年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
实施例1鸡胚成肌细胞永生化细胞系的构建方法
1、原代鸡胚成肌细胞的分离培养
取11胚龄鸡胚用PBS清洗后，剥离腿肌并将肌肉剪碎后，加入含有EDTA的0.25%胰酶，于37℃恒温箱消化20min，随后加入生长培养基（DMEM+20%胎牛血清+1%青/链霉素）终止消化。离心去除胰酶后用生长培养基重悬细胞，分别用200目和400目滤筛过滤悬液，置于培养箱培养。通过两次差速贴壁对获得的细胞进行提纯，继续培养细胞并观察生长情况。
如图1所示，原代分离培养的鸡胚成肌细胞大部分为梭形或纺锤形，较瘦长。
2、原代鸡胚成肌细胞的诱导分化
待细胞汇合至80%时，换用分化培养基（DMEM+5%马血清和1%青/链霉素）诱导分化。
3、原代鸡胚成肌细胞的生长曲线测定
将成肌细胞以1*105/孔的密度接种于96孔板，在接种后1-6d每天测定细胞的增殖情况，每次测定6个重复孔。具体步骤按照CellCounting-Lite2.0试剂盒说明书进行，根据吸光值结果绘制细胞生长曲线。
如图2所示，原代成肌细胞在1-2天增殖较为缓慢，在3-4天细胞数量明显增加，处于对数生长期，之后缓慢增长，在第5天达到最高峰，进入平台期。
4、原代鸡胚成肌细胞的鉴定
取成肌细胞，经爬片、固定、通透、封闭处理后加入1%BSA稀释后的一抗Desmin（碧云天）或一抗MYHC（DHSB）, 4℃孵育过夜，PBS冲洗细胞3次。加入FITC标记的羊抗兔二抗（碧云天）暗室中孵育1h，最后加入DAPI孵育细胞1min，冲洗后显微镜下拍照。
如图3和图4所示，原代成肌细胞能够明确检测到Desmin和MyHC蛋白信号。
5、鸡胚成肌永生化细胞系的建立
5.1 pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40T载体的构建
首先合成获得hTERT和SV40T基因CDS区片段，随后利用以下引物经PCR扩增获得目的基因，然后与pcDNA3.1（+）载体骨架进行连接，构建重组质粒。经测序和双酶切鉴定，最终获得pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40T质粒，线性化处理后保存备用。
5.2电穿孔转染
将生长状态良好的原代成肌细胞以1*105/ml的密度接种于6孔板，继续培养至50%融合时，取线性化的pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40T质粒，按照Lonza电转染程序及操作步骤转染细胞。待细胞达到80%融合时，将培养基更换为添加1μg/ml 嘌呤霉素的培养基继续培养，2d更换一次培养基，直至对照孔中的细胞完全死亡。将存活的感染孔细胞经0.25%胰酶消化后铺板至6cm细胞皿中，用于后续的常规传代和培养。
实施例2 鸡胚成肌永生化细胞系的传代
待细胞生长至80%融合时，弃培养基用PBS清洗两遍后，用0.25%胰酶消化约1min，直至大部分细胞变圆后，加入培养基终止消化，以1:3的比例转至新皿培养。持续传代至80代，每代传代1d拍照记录。
如图5所示，永生化的鸡胚成肌细胞形态与原代细胞基本一致。
实施例3 鸡胚成肌永生化细胞系的鉴定
1、过表达效果的检测
取培养至5代的成肌细胞，通过Trizol法提取细胞总RNA，NanoDrop1000微量分光光度计检测总RNA的浓度和质量。按照诺唯赞HiScriptIII反转录试剂盒说明书进行cDNA合成，随后利用诺唯赞ChamQ SYBR荧光定量试剂盒进行SV40t和hTERT基因的定量分析。使用的引物序列如下表所示。
如图6所示，原代成肌细胞无SV40t和hTERT表达，永生化后在成肌细胞中能够检测到两种基因信号，说明SV40t和hTERT成功导入所获得的鸡胚成肌细胞中。
2、免疫荧光鉴定
取培养至80代的永生化细胞系，经爬片、固定、通透、封闭处理后加入1%BSA稀释后的一抗Desmin（碧云天）或一抗MYHC（DHSB）, 4℃孵育过夜，PBS冲洗细胞3次。加入FITC标记的羊抗兔二抗（碧云天）暗室中孵育1h，最后加入DAPI孵育细胞1min，冲洗后显微镜下拍照。
如图7和图8所示，建立的永生化细胞系能够明确检测到Desmin和MyHC蛋白信号，说明该细胞系为鸡成肌细胞。
实施例4 鸡胚成肌永生化细胞系生长曲线测定
将培养至80代的永生化细胞系以1*105/孔的密度接种于96孔板，在接种后1-6d每天测定细胞的增殖情况，每次测定6个重复孔。具体步骤按照CellCounting-Lite2.0试剂盒说明书进行，根据吸光值结果绘制细胞生长曲线。
如图9所示，永生化细胞系在3-4天为对数生长期，在第5天进入平台期，与原代细胞基本一致。说明本发明建立的成肌细胞系传代至80代仍能保持较好的细胞活性。
实施例5 鸡胚成肌永生化细胞系和原代细胞在基因功能研究中的效果对比
根据鸡METTL16基因mRNA序列信息，设计合成用于敲低鸡METTL16 （siR-METTL16）和阴性对照（siR-NCs）的小干扰RNA 。在永生化细胞系和原代细胞生长至50%密度，利用Lipofectamine 3000将siR-METTL16和siR-NC分别转染到两种细胞中，继续培养48 h后收集细胞，检测METTL16基因的敲减效果。
如图10所示，在永生化细胞系和原代细胞转染siR-METTL16均能获得较好的敲减效果，说明鸡胚成肌细胞永生化后仍维持原有的生物学特性，适合用于禽类肌肉发育和品质调控等基因功能研究。
Claims (4)
1. 一种鸡胚成肌永生化细胞，其特征在于，所述鸡胚成肌永生化细胞为JIPS-CPM，其保藏编号CCTCC NO: C202396。
2.一种权利要求1所述的鸡胚成肌永生化细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取11胚龄鸡胚用PBS清洗后，剥离腿肌并将肌肉剪碎后，加入含有EDTA的0.25%胰酶，于37℃恒温箱消化20min，随后加入生长培养基终止消化，离心去除胰酶后用所述生长培养基重悬细胞，分别用200目和400目滤筛过滤悬液，置于培养箱培养；所述生长培养基为DMEM+20%胎牛血清+1%青/链霉素;
S2：将所述成肌细胞利用差速贴壁法去除成纤维细胞，对细胞进行纯化，获得原代成肌细胞；
S3：利用电穿孔转染法将外源性的SV40t和hTERT共同导入所述原代成肌细胞，进一步筛选获得符合成肌细胞特征的鸡胚成肌永生化细胞。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3具体操作为，将生长状态良好的所述原代成肌细胞以1*105/ml的密度接种于6孔板，继续培养至50%融合时，取线性化的pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40T质粒，按照Lonza电转染程序及操作步骤转染细胞，待细胞达到80%融合时，将培养基更换为添加1μg/ml 嘌呤霉素的培养基继续培养，2d更换一次培养基，直至对照孔中的细胞完全死亡。
4.权利要求1所述的鸡胚成肌永生化细胞在构建禽类骨骼肌体外模型和肌肉发育中的应用。
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