CN109666696A - 一种连续收获腺相关病毒的生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种连续收获腺相关病毒的生产工艺。本发明提供的连续收获腺相关病毒的生产工艺包括将细胞并用含牛血清及杀菌剂的营养液进行培养，收获悬浮细胞，接入含葡萄糖溶液及改性皂苷的平皿继续培养，然后收获含贴壁细胞的培养液，依次用无血清或含血清，同时含有葡萄糖溶液及改性皂苷的培养液培养，加入转染混合液培养，即得。通过收获上清中腺相关病毒液后补加营养液继续培养，可以实现连续收获3次病毒液。本发明提供的连续收获腺相关病毒的生产工艺，制备方法简单，大大节约了人力物力，同时实现了腺相关病毒的大规模生产，而且，本发明提供的这种生产工艺，适用于1～9血清型的病毒，适用范围极为广泛。

Description

一种连续收获腺相关病毒的生产工艺
技术领域
本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种连续收获腺相关病毒的生产工艺。
背景技术
大约五十年前，科学家假设，外源DNA的遗传修饰可能对遗传性人类疾病的治疗有效。基因疗法通过将遗传物质导入细胞补偿或纠正异常基因，引入的正常基因拷贝能够帮助恢复必需蛋白质的功能。这种“基因治疗”策略为后续研究提供了理论基础，即通过一次治疗就可以获得持久且有效的临床治疗。这基因治疗种技术已从构想中来到了现实，那就是重组腺相关病毒(AAV)基因治疗技术，其具有安全性、有效性、特异性等多种优势，目前作为第一个已被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物Glybera上市了。
目前AAV生产主要的方法为三质粒转染293T细胞方法，其操作简单、快速，但AAV包装颗粒量低产，这大大限制了AAV规模化生产。因此，开发一种提高AAV产量的生产工艺技术，是目前取得大规模AAV生产技术关键之一。
中国专利申请CN105980551A公开了一种腺相关病毒载体的高效生产，该生产过程通过基因编辑获得特定的生产细胞系，然后以该细胞系进行培养，这样转染效率至少提高了20％以上，但是，这种方法生产的腺相关病毒，只适用于2，5及8三种血清类型，其他类型的不适用，而且，这种方法获得生产细胞系的过程太过繁琐，大大增加了人力物力，容易出错。
综上所述，现有的生产腺相关病毒的工艺普遍存在适用范围小，操作过程复杂，出错率高的缺点。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点，本发明提供了一种连续收获腺相关病毒的生产工艺，该生产工艺主要解决了293T细胞生产腺相关病毒产量低的问题，具有适用范围广，出错率低，操作简单的优点。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种连续收获腺相关病毒的生产工艺，包括如下步骤：
S1、细胞培养：将细胞复苏至T75放瓶中，使用含8％～10％牛血清及0.5～1.5g杀菌剂的营养液培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，接种入10～15cm的含葡萄糖溶液及改性皂苷的平皿进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO2培养箱的培养参数，培养20-28h，细胞汇合率达到80％～90％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入15～25mL含牛血清，葡萄糖溶液及改性皂苷的DMEM培养液，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放在CO2培养箱中，培养20～28h，弃掉上清液，加入无血清但是含有葡萄糖溶液及改性皂苷的DMEM培养液，进行孵育培养20～28h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、腺相关病毒液的收集：收获步骤S3所得含腺相关病毒的混合液的上清液，加入15～25mL无血清但是含有葡萄糖溶液及改性皂苷的DMEM培养液，孵育培养20～28h，收获上清液，重复上述操作，连续收获3次，最后一次连细胞一起收获，混合3次收获的病毒液，得混合病毒液；
S5、将步骤S4所得混合病毒液经纯化后，进行分装，于-80℃的温度下保存，即得。
优选地，所述步骤S1中的杀菌剂由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成；所述步骤S1、S2、S3及S4中的葡萄糖溶液的质量浓度为3％～8％，加入量为3～5mL；所述步骤S1、S2中的改性皂苷是通过在皂苷的主链上接一个羧基制得的。
优选地，所述步骤S1中细胞培养参数为接种密度在0.8×106～1.2×106个/mL；所述CO2培养箱的培养参数为温度35～38℃，CO2浓度为3～7％。
优选地，所述步骤S2中所述含腺相关病毒的转染混合液中的血清类型为1～9。
优选地，所述步骤S2中的DMEM培养液中牛血清的质量浓度为1％～50％。
优选地，所述步骤S2中含腺相关病毒的转染混合液中包含包装腺相关病毒的三种质粒，三种质粒分别为包装质粒、辅助质粒及载体质粒，三种质粒的总质量为10～30μg，且三者的质量比为2：2：1。
优选地，所述步骤S2所述含腺相关病毒的转染混合液的制备方法为：将包装腺相关病毒的三种质粒、无菌水和CaCl2溶液混合并定容到624μL，将等体积2×HBS盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀，并常温静止放置1～10min，即得。
优选地，所述CaCl2溶液为CaCl2水溶液，且CaCl2水溶液的浓度为2mol/L，加入量为10μL～100μL；所述2×HBS盐溶液的pH值为6.0～7.5。
优选地，所述步骤S3中进行孵育培养时所需条件为温度30～37℃，CO2浓度为3～7％。
优选地，所述步骤S4孵育培养时所需条件为温度36～38℃，CO2浓度为5％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供的连续收获腺相关病毒的生产工艺，在细胞复苏后培养时，在营养液中加入了杀菌剂，可以直接杀除细胞培养时的各种杂菌，不需要再单独设置杀菌试验，减少了操作过程；
(2)本发明提供的连续收获腺相关病毒的生产工艺，在转染过程中加入了改性皂苷，改性后皂苷上的羧基与山梨酸醇反应，生成一种酯类物质，这种物质可以提高病毒在体外的存活时间；
(3)本发明提供的连续收获腺相关病毒的生产工艺，可以连续三次收获腺相关病毒，大大提高了腺相关病毒的产量。
附图说明
图1为本发明连续收获的病毒产量对比柱状图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
实施例1改性皂苷的制备方法
选择中性皂苷柴胡皂苷，将柴胡皂苷与氢溴酸作用，得溴化的柴胡皂苷，在于氢氰酸(HCN)反应，得氰化的柴胡皂苷，将氰化后的柴胡皂苷进行水解，即得本发明使用的含羧基的改性皂苷。
实施例2一种连续收获腺相关病毒的生产工艺
所述连续收获腺相关病毒的生产工艺，包括如下步骤：
S1、细胞培养：
细胞复苏：取一支来源于ATCC，可传代的冻存的293T细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，然后加入到10mL的含有10％牛血清，质量浓度为0.3g/L谷氨酰胺溶液、摩尔浓度为0.01mol/L的NaHCO3溶液及质量浓度为0.1mg/mL的硫酸卡那霉素各0.1mL，100000IU青霉素0.1g、pH值为7.0的DMEM培养液中，混合均匀，于1000r/min的条件下离心1min，去掉上清液，再加入10mL上述培养液重悬细胞，将重悬好的细胞接入T75的细胞瓶中，再补加10mL上述培养液，放入CO2细胞培养箱中，于35℃条件下静置培养；
T75细胞瓶传代培养：将T75细胞瓶用PBS缓冲液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含8％牛血清及0.5g的由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂的Gibco DMEM营养液培养3代后，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分装于三个T75规格细胞培养瓶内，在35℃，3％的CO2浓度的培养箱中培养，重复上述操作，培养三代，细胞活率能够稳定维持在95％，用PBS溶液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含8％牛血清及0.5g的由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂的Gibco DMEM营养液，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分别取样进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，取2.0×107个细胞，接入含质量浓度为3％葡萄糖溶液及改性皂苷的10cm平皿，加入含10％牛血清的DMEM补到20mL，细胞密度为8×105个/mL，培养20h，细胞汇合率达到80％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：
含腺相关病毒的转染混合液的配制：将质粒pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP按质量比为2：2：1的比例混合成10μg，浓度2mol/L的CaCl2水溶液10μL，加无菌水定容至624μL，然后逐滴加入2×HBS盐溶液624μL，轻弹管壁，混合均匀，常温静置1～10min，即得。
将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入15mL含1％的牛血清的DMEM培养液20mL，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：
将步骤S2所得转染混悬液放在CO2培养箱中，设置温度30℃，CO2浓度为3％的条件培养20h，弃掉10cm平皿的全部上清液，加入无血清但是含有质量浓度为3％的葡萄糖溶液及改性皂苷0.1g的DMEM培养液，进行孵育培养20h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、腺相关病毒液的收集：
收获步骤S3所得含腺相关病毒的混合液的上清液，加入15mL无血清但是含有葡萄糖溶液及改性皂苷0.1g的DMEM培养液，放在CO2培养箱中，设置温度36℃，CO2浓度为5％的条件，孵育培养20h，收获上清液，重复上述操作，连续收获3次，最后一次连细胞一起收获，混合3次收获的病毒液，得混合病毒液；
S5、将步骤S4所得混合病毒液进行纯化，经检测，病毒液总量达3×1011GC，然后进行分装，于-80℃的温度下保存，即得。
实施例3一种连续收获腺相关病毒的生产工艺
所述连续收获腺相关病毒的生产工艺，包括如下步骤：
S1、细胞培养：
细胞复苏：取一支来源于ATCC，可传代的冻存的293T细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，然后加入到10mL的含有10％牛血清，质量浓度为0.3g/L谷氨酰胺溶液、摩尔浓度为0.01mol/L的NaHCO3溶液及质量浓度为0.1mg/mL的硫酸卡那霉素各0.1mL，100000IU青霉素0.1g、pH值为7.0的DMEM培养液中，混合均匀，于1500r/min的条件下离心10min，去掉上清液，再加入10mL上述培养液重悬细胞，将重悬好的细胞接入T75的细胞瓶中，再补加10mL上述培养液，放入CO2细胞培养箱中，于35℃条件下静置培养；
T75细胞瓶传代培养：将T75细胞瓶用PBS缓冲液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含10％牛血清及1.5g的由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂的Gibco DMEM营养液培养3代后，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分装于三个T75规格细胞培养瓶内，在38℃，7％的CO2浓度的培养箱中培养，重复上述操作，培养三代，细胞活率能够稳定维持在100％，用PBS溶液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含10％牛血清及1.5g的由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂的Gibco DMEM营养液，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分别取样进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，取2.0×107个细胞，接入含质量浓度为8％葡萄糖溶液及改性皂苷的15cm平皿，加入含10％牛血清的DMEM补到20mL，细胞密度为1.2×106个/mL，培养28h，细胞汇合率达到90％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：
含腺相关病毒的转染混合液的配制：将质粒pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP按质量比为2：2：1的比例混合成30μg，浓度2mol/L的CaCl2水溶液100μL，加无菌水定容至624μL，然后逐滴加入2×HBS盐溶液624μL，轻弹管壁，混合均匀，常温静置10min，即得。
将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入25mL含50％的牛血清的DMEM培养液20mL，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：
将步骤S2所得转染混悬液放在CO2培养箱中，设置温度38℃，CO2浓度为7％的条件培养28h，弃掉15cm平皿的全部上清液，加入无血清但是含有质量浓度为8％的葡萄糖溶液及改性皂苷0.15g的DMEM培养液，进行孵育培养28h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、腺相关病毒液的收集：
收获步骤S3所得含腺相关病毒的混合液的上清液，加入25mL无血清但是含有葡萄糖溶液及改性皂苷0.15g的DMEM培养液，放在CO2培养箱中，设置温度38℃，CO2浓度为5％的条件，孵育培养28h，收获上清液，重复上述操作，连续收获3次，最后一次连细胞一起收获，混合3次收获的病毒液，得混合病毒液；
S5、将步骤S4所得混合病毒液进行纯化，经检测，病毒液总量达9x1011GC，然后进行分装，于-80℃的温度下保存，即得。
实施例4一种连续收获腺相关病毒的生产工艺
所述连续收获腺相关病毒的生产工艺，包括如下步骤：
S1、细胞培养：
细胞复苏：取一支来源于ATCC，可传代的冻存的293T细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，然后加入到10mL的含有10％牛血清，质量浓度为0.3g/L谷氨酰胺溶液、摩尔浓度为0.01mol/L的NaHCO3溶液及质量浓度为0.1mg/mL的硫酸卡那霉素各0.1mL，100000IU青霉素0.1g、pH值为7.0的DMEM培养液中，混合均匀，于1300r/min的条件下离心5min，去掉上清液，再加入10mL上述培养液重悬细胞，将重悬好的细胞接入T75的细胞瓶中，再补加10mL上述培养液，放入CO2细胞培养箱中，于35℃条件下静置培养；
T75细胞瓶传代培养：将T75细胞瓶用PBS缓冲液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含9％牛血清及1.0g的由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂的Gibco DMEM营养液培养3代后，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分装于三个T75规格细胞培养瓶内，在37℃，5％的CO2浓度的培养箱中培养，重复上述操作，培养三代，细胞活率能够稳定维持在95％，用PBS溶液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含9％牛血清及1.0g的由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂的Gibco DMEM营养液，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分别取样进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，取2.0×107个细胞，接入含质量浓度为6％葡萄糖溶液及改性皂苷0.2g的12cm平皿，加入含9％牛血清的DMEM补到20mL，细胞密度为1.0×106个/mL，培养24h，细胞汇合率达到85％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：
含腺相关病毒的转染混合液的配制：将质粒pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP按质量比为2：2：1的比例混合成20μg，浓度2mol/L的CaCl2水溶液50μL，加无菌水定容至624μL，然后逐滴加入2×HBS盐溶液624μL，轻弹管壁，混合均匀，常温静置5min，即得。
将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入20mL含25％的牛血清的DMEM培养液20mL，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：
将步骤S2所得转染混悬液放在CO2培养箱中，设置温度36℃，CO2浓度为5％的条件培养24h，弃掉12cm平皿的全部上清液，加入无血清但是含有质量浓度为8％的葡萄糖溶液及改性皂苷0.2g的DMEM培养液，进行孵育培养24h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、腺相关病毒液的收集：
收获步骤S3所得含腺相关病毒的混合液的上清液，加入20mL无血清但是含有葡萄糖溶液及改性皂苷0.2g的DMEM培养液，放在CO2培养箱中，设置温度36℃，CO2浓度为5％的条件，孵育培养24h，收获上清液，重复上述操作，连续收获3次，最后一次连细胞一起收获，3次收获的病毒液及细胞中含病毒的量见图1，然后将所有的病毒液混合，得混合病毒液；
S5、将步骤S4所得混合病毒液进行纯化，经检测，病毒液总量达1.2×1012GC，然后进行分装，于-80℃的温度下保存，即得。
对比例1一种连续收获腺相关病毒的生产工艺
所述连续收获腺相关病毒的生产工艺的操作步骤与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例1的步骤S1细胞培养时的T75细胞瓶传代培养过程中，在加营养液进行3代培养时，营养液中未添加杀菌剂。
对比例2一种连续收获腺相关病毒的生产工艺
所述连续收获腺相关病毒的生产工艺的操作步骤与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例2的步骤S1中细胞培养时的T75细胞瓶传代培养过程中，将培养3代后的病毒接入12cm的平皿中时，不加质量浓度为8％的葡萄糖溶液及改性皂苷。
试验例 腺相关病毒体外存活时间的对比
1.试验样品：以实施例1-3及对比例1-2的方法收获的腺相关病毒液。
2.试验方法：
病毒数量测定：从实施例1-3及对比例1-2收获的纯化后的病毒液中各取50μL，使用qPCR仪对各组取样的样品进行检测。
病毒活性检测：本发明包装出的病毒含荧光蛋白(EGFP)基因，将1.0×107个细胞置于培养皿中，加入完全培养液在37℃，5％的二氧化碳培养箱中培养24小时，向培养皿中滴加病毒液，在37℃，5％的二氧化碳培养箱中培养70小时，利用流式细胞仪检测感染腺相关病毒的细胞中，能够表达荧光蛋白的细胞数量，来判定病毒活性。
病毒活率＝表达EGFP的细胞数/总细胞数×100％
3.试验结果：具体试验结果见表1。
表1不同试验样品的对比结果
测试样品 病毒检测结果/GC 病毒活率/％
实施例1 5.0×10<sup>10</sup> 89％
实施例2 1.0×10<sup>11</sup> 90％
实施例3 2.0×10<sup>12</sup> 93％
对比例1 6.0×10<sup>9</sup> 57％
对比例2 7.0×10<sup>9</sup> 60％
由表1可知，本发明实施例1-3中的病毒液中的病毒颗粒数目远高于对比例1-2中的病毒数，这可以说明本发明实施例1-3获得的病毒液的病毒量大于对比例1-2；而且，实施例1-3中的病毒存活率高达90％左右，而对比例1-2中的病毒存活率仅在40％左右，其中，实施例3中病毒液中含病毒颗粒的总量高达1.0×1012，存活率为93％，故实施例3为本发明的最佳实施例。
最后应当说明的是，上文中已经对本技术及具体实施方案作了详尽的描述，但是本发明并不局限于以上描述的具体实施例。因此本领域的任何技术人员在不偏离本发明精神的基础对之作一些改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1、细胞培养：将细胞复苏至T75放瓶中，使用含8％～10％牛血清及0.5～1.5g杀菌剂的营养液培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，接种入10～15cm的含葡萄糖溶液及改性皂苷的平皿进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO2培养箱的培养参数，培养20-28h，细胞汇合率达到80％～90％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入15～25mL含牛血清，葡萄糖溶液及改性皂苷的DMEM培养液，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放在CO2培养箱中，培养20～28h，弃掉上清液，加入无血清但是含有葡萄糖溶液及改性皂苷的DMEM培养液，进行孵育培养20～28h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、腺相关病毒液的收集：收获步骤S3所得含腺相关病毒的混合液的上清液，加入15～25mL无血清但是含有葡萄糖溶液及改性皂苷的DMEM培养液，孵育培养20～28h，收获上清液，重复上述操作，连续收获3次，最后一次连细胞一起收获，混合3次收获的病毒液，得混合病毒液；
S5、将步骤S4所得混合病毒液经纯化后，进行分装，于-80℃的温度下保存，即得。
2.如权利要求1所述的连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，所述步骤S1中的杀菌剂由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成；所述步骤S1、S2、S3及S4中的葡萄糖溶液的质量浓度为3％～8％，加入量为3～5mL；所述步骤S1、S2中的改性皂苷是通过在皂苷的主链上接一个羧基制得的。
3.如权利要求1所述的连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，所述步骤S1中细胞培养参数为接种密度在0.8×106～1.2×106个/mL；所述CO2培养箱的培养参数为温度35～38℃，CO2浓度为3～7％。
4.如权利要求1所述的连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，所述步骤S2中所述含腺相关病毒的转染混合液中的血清类型为1～9。
5.如权利要求1所述的连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，所述步骤S2中DMEM培养液中牛血清的质量浓度为1％～50％。
6.如权利要求1所述的连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，所述步骤S2中含腺相关病毒的转染混合液中包含包装腺相关病毒的三种质粒，三种质粒分别为包装质粒、辅助质粒及载体质粒，三种质粒的总质量为10～30μg，且三者的质量比为2：2：1。
7.如权利要求6所述的连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，所述步骤S2所述含腺相关病毒的转染混合液的制备方法为：将包装腺相关病毒的三种质粒、无菌水和CaCl2溶液混合并定容到624μL，将等体积2×HBS盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀，并常温静止放置1～10min，即得。
8.如权利要求7所述的连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，所述CaCl2溶液为CaCl2水溶液，且CaCl2水溶液的浓度为2mol/L，加入量为10μL～100μL；所述2×HBS盐溶液的pH值为6.0～7.5。
9.如权利要求1所述的连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，所述步骤S3中进行孵育培养时所需条件为温度30～37℃，CO2浓度为3～7％。
10.如权利要求1所述的连续收获腺相关病毒的生产工艺，其特征在于，所述步骤S4孵育培养时所需条件为温度36～38℃，CO2浓度为5％。
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