CN107568434A

CN107568434A - 贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶发酵液的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN107568434A
Application number: CN201711042741.6A
Authority: CN
Inventors: 王在贵; 叶淼; 张宽朝; 杨章泽; 洪君衍
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2018-01-12

Abstract

本发明涉及贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶发酵液的制备方法及其应用，具体是在促进乳猪生长中的应用，产蛋白酶发酵液的制备方法包括：A、将分离自猪粪便中的贝莱斯芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于21℃‑53℃下发酵培养48‑72h，B、经步骤A发酵后，将发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min，取上清液，即得发酵液。通过对发酵培养基及培养方法的优化以提高贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶的能力，并将该发酵培养液添加入乳猪日粮中以促进乳猪的生长。

Description

贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶发酵液的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说是一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法及在促进乳猪生长中的应用。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白水解的一类酶，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，广泛应用于食品、纺织、医药、有机合成、洗涤剂及制革脱毛等领域，其份额占整个酶制剂市场的一半以上。蛋白酶可以从动植物中提取，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等；也可以通过微生物发酵工艺进行生产，如固态发酵法和液态发酵法等。

益生菌的代谢产物能促进动物生长，抑制病害发生。可以提高动物对于饲料的利用水平，提高利用率，从而降低购买饲料的成本；益生菌可以除臭，改善饲养环境；还能够增进动物健康，有效控制预防细菌和寄生虫以及呼吸系统疾病的预防；促进动物快速生长，从而缩短饲养的时间；减少使用抗生素，提高禽肉蛋、绿色禽畜产品的质量。

贝莱斯芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界。贝莱斯芽孢杆菌具有十种不同的抗生素合成能力，包括一些聚酮类化合物、脂肽类化合物、多肽类化合物等，是一种具有高效生防性能和植物促生活性的土壤细菌。目前，关于贝莱斯芽孢杆菌的报道多集中于其生防功能的研究。但对该菌产蛋白酶的条件及在动物生长中的应用还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，通过对发酵培养基及培养方法的优化以提高贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶的能力，并将该发酵培养液添加入乳猪日粮中以促进乳猪的生长。

所述贝莱斯芽孢杆菌分离自猪粪中，其基因如序列SEQ ID No：1所示。

所述贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，具体包括如下步骤：

A、将分离自猪粪便中的贝莱斯芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于21℃-53℃下发酵培养48-72h，

B、经步骤A发酵后，将发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min，取上清液，即得发酵液。

进一步，所述发酵培养基是由碳源、氮源和金属离子配制而成的水溶液；；所述碳源和氮源总质量与水的比例为1g：50ml；所述碳源、氮源的质量比为2：3；所述金属离子加入量与水的比例为1g：100ml。

进一步，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉的组合物，按质量比2.5：3：3.8比例混合而成。

进一步，所述氮源为黄豆粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏的组合物，按质量比3：0.5：1.25:0.75比例混合而成。

进一步，所述金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Cu²⁺离子组合物，按摩尔比2：1：1：0.75比例混合而成。

进一步，所述培养基的pH值为7.0。

本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，通过对发酵培养基及培养方法的优化以提高贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶的能力，并将该发酵培养液添加入乳猪日粮中以促进乳猪的生长。

本发明贝莱斯芽孢杆菌为芽孢杆菌一个新的品种，它可以产生能诱导全身抗性并同时抑制真菌生长的化合物，能够直接抑制真菌和细菌病原体的生长，并可以使猪尽量免于真菌和细菌的侵害。加入饲料也可以减少对猪抗生素的使用，可以保护猪的肝脏，减少抗生素对肝脏的损害。

附图说明

图1是菌株筛选结果(10^-5平板)。

图2是四区划线法对筛选出的单菌落进行纯化的结果。

图3是革兰氏染色镜检结果。

图4是PCR扩增产物电泳图。

图5是阳性克隆菌落PCR结果。

图6是发酵培养时间对酶活力的影响。

图7是发酵培养温度对酶活力的影响。

图8是发酵培养pH对酶活力的影响。

图9是发酵培养装液量对酶活力的影响。

图10是发酵培中碳氮源比例变化对酶活力的影响。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施例对本发明技术方案做进一步解释说明。

实施例1菌株的分离鉴定

1材料与方法

1.1实验材料

干燥猪粪。

1.1.1实验主要试剂

琼脂粉、LB肉汤、细菌基因组DNA快速提取试剂盒、多功能DNA纯化回收试剂盒、琼脂糖G-10、Premix Taq酶、6×loading buffer、DNA marker、AL 2000、革兰氏染色液。

1.1.2实验仪器

烧杯(50、500mL)、量筒(10、100mL)、锥形瓶(50、100、200mL)、容量瓶(50、100、1000mL)、玻璃棒、培养皿、试管(25mL)、电热恒温水浴锅、移液枪(1000μL 200μL 20μL 10μL)、分析天平(0.0001)、烘箱、PCR仪、DYY-8B型稳压稳流电泳仪、超净工作台、电热手提高压蒸汽消毒器、Tanon-1600凝胶成像系统、摇床。以及报纸、棉绳、镊子、医用棉花、擦镜纸、玻璃棒、药匙、接种环、三角型涂布棒、封口胶(PM-996)、酒精灯等。

1.1.3培养基配方

LB固体培养基(100mL)：LB肉汤2.5g，琼脂粉2％，PH7.2-7.4，121℃/20min高压蒸汽灭菌；

LB液体培养基(100mL)：LB肉汤2.5g，PH7.2-7.4，121℃/20min高压蒸汽灭菌；

氨苄抗性固体LB培养基(100ml)：LB肉汤2.5g，琼脂粉2％，PH7.2-7.4，121℃/20min高压蒸汽灭菌。冷却培养基至55℃，加入150μl氨苄搅拌均匀，倒平板，待平板冷却后于4℃储存。

1.2菌种的筛选和培养

1.2.1菌种的筛选

准备六瓶10mL的蒸馏水，于121℃/20min高压蒸汽灭菌。称取0.1g的待测样品加入无菌水中，溶解摇匀，并依次稀释获得10^-5、10^-6、10^-7、10^-8这四个浓度的样品溶液，将10^-5、10^-6、10^-7、10^-8这四个浓度的样品溶液分别取100μL滴加在平板表面，再用三角形的无菌玻璃涂布棒将菌液均匀涂布于LB固体培养基上。将平板置于28℃培养30小时，期间不断查看,记录下菌落的生长情况。

将平板从培养箱中取出，观察并从生长单菌落的平板上挑选单菌落，用四区划线法来纯化单菌落，将LB固体培养基分为四个等大的扇形区域，用灼烧后的接种环从上一步长出单菌落的平板挑取单菌落，在扇形区域划线，将平板置于28℃培养24h。

从四区划线的平板上挑选单菌落接种于LB固体斜面上，将LB固体斜面放置于28℃培养30h。

1.2.2菌种的培养

从LB固体斜面挑去单菌落接种至LB液体培养基(20mL)中，置于摇床200r/37℃培养12h。

1.3菌种基因组DNA的提取

1.3.1革兰氏染色

(1)涂片首先在载玻片上面滴一小滴蒸馏水，将接种环在酒精灯上灼烧后，从LB固体斜面培养基上挑取少量细菌，置于载玻片的水滴中与水混合，将水滴涂抹开。涂抹过程中应尽量使菌体分散开，使得后面能够充分染色。

(2)固定将载玻片在火焰上方快速来回通过1-2次，以载玻片的加热不能过烫，冷却，重复上述的操作3-4次至载玻片上涂抹的薄层干；

(3)染色将一滴草酸铵结晶紫染液(草酸铵+结晶紫+乙醇)滴在载玻片的薄层上，染色1分钟，用自来水冲洗。注意不要让水流直接对准薄层；

(4)媒染对准薄层加一滴卢戈式碘液(碘+碘化钾)，作用1分钟，用自来水水冲洗。注意,不要让水流直接冲上薄层，冲洗完成后，用滤纸将水吸干；

(5)脱色在载玻片上滴加95％的乙醇，使薄层脱色，脱色30秒。这一步注意把握好脱色的时长；

(6)水洗用滤纸将载玻片上的乙醇吸干；

(7)复染在载玻片上滴加一滴0.5％的番红染液(番红O+乙醇)，染色10～30秒后，用自来水冲洗；不要让水流直接往薄层上冲。

(8)观察干燥后，在显微镜下用油镜观察细菌的颜色和形态，并做好记录。

1.3.2细菌基因组DNA的提取

具体实验步骤参照试剂盒(康为世纪)说明书进行。

(1)吸取1-5ml培养菌液，12000rmp离心60秒，尽可能的丢弃掉上清液后，收集菌体；

(2)向上清液中加180μl enzymatic lysis butter使菌体重悬；

(3)37℃孵育30分钟；

(4)加入20μL protainase K旋涡震荡，充分混匀。加入200μL buffer GL，涡旋震荡混匀；

(5)56℃孵育30分钟；

(6)加入200μL无水乙醇，涡旋震荡使溶液充分混匀；

(7)将步骤(6)所得溶液全部加入到已经装入收集管的吸附柱(Spin ColumnsDM)。12000rpm离心60秒，弃去收集管中的废液；

(8)将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer GW1，12000rpm离心60秒，弃去收集管中的废液；

(9)将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer GW2，12000rpm离心60秒，弃去收集管中的废液；

(10)将吸附柱再次放回收集管中，12000rpm离心120秒，倒掉收集管中的废液，将收集管晾至干燥除去残留乙醇；

(11)将吸附柱放在一个新的离心管中，并向吸附柱的中间位置，悬空加入50-200μL Buffer GE，室温下放置2-5min，12000rpm离心60秒，收集DNA溶液；

(12)-20℃保存DNA。

1.4 PCR扩增和产物回收

1.4.1 PCR扩增

引物：

16s.B.a-F AGAGTTTGATCCTGGCTCCAG

16s.B.a-R TACGGYACCTTGTTACGACTT

PCR体系(25μL)：

表1：PCR体系成分

Table1:PCR system components

程序：

1.4.2琼脂糖凝胶电泳

参照《基因工程实验指导》。

(1)配制终浓度1％的琼脂糖，加1×TBE，加热溶解。

(2)将上步所得溶液冷却至50℃左右时，倒入胶板，放入梳子。(注意胶层中不能有气泡)

(3)待凝胶凝固后，小心地拔出梳子，拿出凝胶板。

(4)将凝胶板放入水平电泳槽中，加电泳缓冲液1×TBE，使液面略高于凝胶表面。

(5)点样。

(6)电泳：恒压180V。

(7)当条带过半时，停止电泳。

(8)将凝胶从凝胶板上取出，小心转移至紫外灯下观察。

1.4.3 PCR产物的回收

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳检测，用多功能DNA纯化回收试剂盒(康为世纪)进行胶回收操作：

(1)将凝胶转移至紫外灯下，快速地把所需的DNA片段完整的切割下来，凝胶块体积越小越好；

(2)将带有DNA条带的凝胶块转移至1.5mL已经称重的离心管中，称重并记录凝胶块的重量，近似的确定体积(1μg＝1μL)。

(3)加入等体积的Binding Buffer，于55℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，每2-3min颠倒混匀混合物；

(4)将上步液体转移至吸附柱中，在室温条件中以每分钟一万转速离心60秒，弃去收集管中的滤液，将吸附柱放回收集管中；

(5)若液体超过700μL，可分两次加入，并重复步骤(3)；

(6)加300μL Binding Buffer至吸附柱，10000rpm离心60秒，弃去收集管中的滤液，将吸附柱放回收集管中；

(7)加700μL SPW至吸附柱中，10000rpm离心60秒，倒掉收集管中的滤液，将吸附柱放回收集管中；

(8)加700μL SPW至吸附柱中，10000rpm离心60秒，弃去收集管中的滤液；

(9)将吸附柱放回收集管中，10000rpm离心60秒，以甩干柱内残余液体；

(10)将吸附柱装在一个新的1.5mL离心管中，加入30-50μL洗脱液，10000rpm离心60秒，离心管中的液体即为回收产物；

(11)将回收产物保存于-20℃冰箱。

1.5克隆载体的构建

1.5.1目的基因与克隆载体T3的连接：连接体系成分如表所示，4℃放置12小时。

表2：连接体系成分

Table2:The components of the connection system

1.5.2连接产物转化感受态细胞

(1)加链接产物于50μL Trans-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20-30min；

(2)42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min；

(3)加250μL平衡至室温的LB培养基，37℃培养1h(200rpm)

1.5.3阳性克隆检测

(1)用灼烧后的接种环挑取白色单克隆至10μL无菌水中，涡旋混合(5个单菌落)

(2)取1μL混合液与25μL PCR体系中：

表3：PCR体系成分

Table3:PCR system components

(3)PCR程序

2结果与分析

2.1菌株筛选纯化结果

将10^-5、10^-6、10^-7、10^-8这四个浓度的样品溶液分别取100μL涂布于LB固体培养基上，28℃培养30小时后，10^-5平板上培养出单菌落，结果如图1所示。该菌落固体培养基上菌落呈现为直径在0.5-1.0mm之间、形状为边缘规则的圆形，其乳白色不透明半突状的表面光滑且有光泽不粗糙呈酪样。

用灼烧的接种环在新的LB固体培养基上用四区划线法对筛选出的单菌落进行纯化。纯化结果如图2所示。

2.2革兰氏染色结果

经过革兰氏染色，菌体在显微镜下观察的颜色，视野中观察到细菌细胞为紫色则结果为阳性菌。通过镜检结果如图3所示，菌体为紫色，表示该菌株为革兰氏阳性细菌。同时观察到细菌的菌体杆状且细胞内生芽孢，芽孢为卵圆形。

2.3 PCR扩增获得目的片段

琼脂糖电泳检测反应结果如图4，在1500bp处可观察到一条与预先估计的片段大小相似的特异性条带。说明细菌16S rDNA提取和扩增成功，并且没有污染。

2.4阳性克隆载体鉴定结果

在4℃环境中放置12小时成功将目的基因导入克隆载体后，把导入后产物转化到大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，扩大培养后涂板培养，筛选阳性克隆菌落，然后进行菌落PCR。在琼脂糖凝胶电泳中对菌落PCR产物进行检测，检测结果如图5所示，在1500bp左右可观察到一条与预先估计的片段大小相似的特异性条带，说明克隆载体构建成功。

2.5目的片段测序结果

将上述重组质粒送到通用生物公司进行测序，测序结果下所示，该基因全长为1513bp，序列如SEQ ID No：1所示。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法

1.材料与试剂：

分离自猪粪便中的贝莱斯芽孢杆菌，由安徽农业大学生命科学学院生理学教研室提供；福林-酚试剂，酪蛋白，三氯乙酸，碳酸钠，1mol/L NaOH溶液，pH7磷酸缓冲液。2.主要仪器：

分光光度计722S，台式电子天平，可调恒温水浴锅HH-2，高速冷冻离心机，精密pH计，高温蒸汽灭菌锅，恒温摇床，1000μL微量移液器。

3.发酵培养基的制备：

按质量取碳源、氮源和金属离子物质，将其置于250mL锥形瓶中混合加水至100mL蒸馏水，高压灭菌，即得发酵培养基；其中，碳源和氮源总质量与水的比例为1g：50ml；碳源、氮源的质量比为2：3；金属离子加入量与水的比例为1g：100ml。碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉的组合物，按质量比2.5：3：3.8比例混合而成；氮源为黄豆粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏的组合物，按质量比3：0.5：1.25:0.75比例混合而成；金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Cu²⁺离子组合物，按摩尔比2：1：1：0.75比例混合而成。

4.2％酪蛋白溶液的配制：

称取0.2g酪蛋白置于小烧杯中，用10mL pH7缓冲液溶解酪蛋白。

5.酶活力的测定：

取4支18mm*18mm试管，每一组实验作1个空白、3个重复。取发酵培养液，4000r/m离心20min，反应时发酵液用磷酸缓冲液稀释一倍，将发酵液与2％酪蛋白恒温水浴3-7min；试管中加入发酵液与2％酪蛋白各1ml，反应10分钟，加2mL三氯乙酸溶液终止反应，室温放置15分钟；对照组则直接加入发酵液与三氯乙酸溶液迅速摇匀灭活再加入酪蛋白溶液进行相同条件下的反应。每支试管3000r/min离心7min，吸取滤液1ml，加入0.4ml/L碳酸钠溶液5mL与福林酚试剂(加水按照1:1比例稀释)1mL，充分摇匀，显色15min，660nm处测定吸光值，并通过公式计算酶活。

6.酶活力单位定义：在一定温度和pH条件下，一定时间内从酪蛋白中降解释放1μmol酪氨酸所需要酶量为1个酶活力单位(U)。

7、发酵液的制备：A、将分离自猪粪便中的贝莱斯芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于21℃-53℃下发酵培养48-72h；B、经步骤A发酵后，将发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min，取上清液，即得发酵液。

一、单因素试验

1)培养时间对菌株产蛋白酶能力的影响：选择250mL三角瓶，均装入100mL发酵液，pH6.0，37℃下进行摇瓶发酵，每隔12h取样，测定不同发酵时间(24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h)对发酵产酶的影响。

结果如图6所示，随着培养时间的增加，酶活力先上升再下降，60h酶活最大。

2)培养温度对菌株产蛋白酶能力的影响：使用250mL锥形瓶，均转入100mL发酵培养基，pH6.0，采取不同的发酵温度(21℃、29℃、37℃、45℃、53℃)发酵培养菌株，摇床200r/min培养60h，研究温度对发酵菌株发酵产酶的影响。

结果如图7所示，随着温度的升高，酶活力先上升再下降，当培养温度为37℃时酶活力最强，超过或低于37℃都不利于产酶。

3)初始pH值对菌株产蛋白酶能力的影响：37℃条件下将菌摇床培养60h，装液量100mL调节发酵培养基的起始pH值，不同起始pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)条件下，研究起始pH对发酵产酶的影响。

结果如图8所示，pH为7时酶活力最大，弱酸弱碱条件下酶活力下降。

4)装液量对菌株产蛋白酶能力的影响：pH为7.0，37℃培养60h，250mL锥形瓶中分别装入不同体积(50mL、75mL、100mL、125mL、150mL)的发酵液，研究不同装液量对菌株发酵产酶的影响。

结果图9所示，装液量75mL时酶活力最大，过多或多少的装液量都对贝莱斯芽孢杆菌的产酶有抑制作用。

5)碳氮比对菌株产蛋白酶能力的影响：碳源和氮源的总量不变，改变添加的比例(1:9,1:4,2:3,1:1,3:2,4:1,9:1)，装液量为75mL，在37℃下培养60h，调节pH为7.0，测定上清液酶活力。

结果如图10所示，该菌株在碳氮比为2:3的发酵培养基中能够更好的生长并有更高的酶活。

根据单因素实验的所测结果，从中选取对菌株液体发酵影响较大的4个因素，选取L9(34)正交设计表，以分光光度计所测的吸光度值为考察指标，酶液的处理仍然按照单因素测定中的进行，以培养温度(A)、培养时间(B)、起始pH值(C)、装液量(D)为试验因素，每个试验因素对应设计3个试验水平，该发酵条件的正交设计如表1所示。

表1正交设计实验因素及水平表

水平	A(温度/℃)	B(时间/h)	C(初始pH)	D(装液量mL)
					1	29	48	6	50
2	37	60	7	75
					3	45	72	8	100

2.正交实验结果

表3 L9(3⁴)正交试验结果

从表2中极差R的大小可以看出，pH值对贝莱斯芽孢杆菌从产酶量的影响最大，其次为培养时间和培养温度，影响最小的是装液量。且最优培养条件为A2B2C2D2，即培养温度为37℃、培养时间为60h、初始pH为7.0、及装液量为75mL/250mL。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌在在促进乳猪生长中的应用

将实施例1所得的发酵液中缓慢地加入固体硫酸铵至80％饱和度，4℃下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，收集沉淀即得菌剂，将菌剂按0.05％的添加量加入饲料中(市购)饲养乳猪；以不添加菌剂的饲料作为对照，在每日早晨喂食前称重，结果显示，实验组的乳猪在精、气、神上显著优于对照组的乳猪，且摄食后静伏时间长于对照组，食欲旺盛、食量大于对照组，试验组的乳猪日均增重较对照组高9.75％。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

本发明不限于以上对实施例的描述，本领域技术人员根据本发明揭示的内容，在本发明基础上不必经过创造性劳动所进行的改进和修改，都应该在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽农业大学

<120> 贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法及其应用

<130> 贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1513

<212> DNA

<213> Bacillus

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctggagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380

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Claims

1.贝莱斯芽孢杆菌在在促进乳猪生长中的应用。

2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在在促进乳猪生长中的应用，其特征在于，所述应用是将贝莱斯芽孢杆菌发酵液添加进动物饲料中。

3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在在促进乳猪生长中的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的基因如序列SEQ ID No：1所示。

4.一种贝莱斯芽孢杆菌制备产蛋白酶发酵液的方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基是由碳源、氮源和金属离子配制而成的水溶液；所述碳源和氮源总质量与水的比例为1g：50ml；所述碳源、氮源的质量比为2：3；所述金属离子加入量与水的比例为1g：100ml。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉的组合物，按质量比2.5：3：3.8比例混合而成。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氮源为黄豆粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏的组合物，按质量比3：0.5：1.25:0.75比例混合而成。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Cu²⁺离子组合物，按摩尔比2：1：1：0.75比例混合而成。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基的pH值为7.0。