CN105543243A - 四个水稻金属硫蛋白基因的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了四个水稻金属硫蛋白OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c及其编码基因在改良植物对重金属的耐受性或富集性中的应用。在水稻中，OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c是重金属Cd、Zn和Cu胁迫诱导表达的基因。该基因在工程菌酿酒酵母中表达可以提高酵母对镉的耐受能力，同时使酵母中镉的含量提高，表明OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c蛋白具有重金属镉解毒的能力。若将该基因在工程菌中进行转基因表达，一方面，可以改变工程菌对重金属镉耐受性，另一方面也可以提高转基因工程菌对重金属镉的积累，从而将该工程菌应用于环境污染中重金属的微生物修复工程。该基因具有应用于植物抗镉的遗传工程育种的潜力，通过调控该基因在植物中的表达，获取重金属镉超积累的转基因植物，用于重金属污染的植物修复工程。

Description

四个水稻金属硫蛋白基因的新应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及四个水稻金属硫蛋白(OryzasativaMetallothionein,OsMT)及其编码基因和在调控酵母镉耐受和积累方面的应用。
背景技术
镉是生物体非必需的毒性元素，和锌是同族元素，一般在自然界中以非活化的化合物状态存在，含量极低。随着社会的发展和工业化进程的加快，人类活动对自然界的干扰导致释放到环境中的活性镉元素日益上升。镉及其化合物被广泛应用于镍镉电池、颜料、合金，以及电镀、塑料制品行业，镉的产量及用途在不断增加。据统计全世界每年向环境中释放的镉达30000吨左右，其中82％-94％的镉会进入到土壤中。由于镉和锌的结构类似，通常作为锌的替代物而被植物和农作物吸收。镉通过食物链进入人体，从而对人体健康造成危害。
水稻是重金属镉富集的农作物之一。统计数据分析表明，按照点位超标率计算，重金属镉污染在我国所有土壤污染物中排名第一，土壤镉污染超标面积已达我国国土总面积的7％，其中我国水稻种植区域的镉污染尤为严重。美国农业部的一项研究表明，水稻是对镉吸收最强的大宗谷类作物，其籽粒镉水平仅次于生菜。而稻米又是超过六成中国人的主食。近几年来，稻米的重金属污染问题日渐浮出水面，稻米的镉超标事件也屡屡被报道，引起了民众巨大的恐慌。克隆和分离水稻体内的镉胁迫应答和解毒基因，具有重要的意义和潜在的应用价值。
金属硫蛋白是生物体内的金属结合蛋白，分子量较低，富含半胱氨酸，可以结合镉、锌、铜在内的多种重金属。同时，由于半胱氨酸残基具有较强的还原性，金属硫蛋白也是一个还原性的蛋白，能清除细胞内富余的活性氧，降低由各种逆境胁迫照成的氧化胁迫伤害。研究表明，金属硫蛋白不仅参与体内微量元素的储存、转运和代谢，拮抗电离辐射，清除自由基以及对重金属的解毒作用，还与生物体生长发育、抗病等有关。由于金属硫蛋白的这种特征，决定了该类蛋白已经在医学、环境、食品、化妆品等领域进行了开发和应用。
水稻体内的4个金属硫蛋白基因在水稻基因组数据库(MSURiceGenomeAnnotationProjectDatabaseandResource,http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中的编号分别为LOC_Os11g47809(OsMT-I-1a)，LOC_Os01g05650(OsMT-I-2a)，LOC_Os01g10400(OsMTI-3a)和LOC_Os12g38270(OsMT-I-4c)。其中OsMT-I-1a蛋白为74个氨基酸残基(SEQIDNO.2)，其编码基因的cDNA阅读框为225个核苷酸(SEQIDNO.1)；OsMT-I-2a蛋白为82个氨基酸残基(SEQIDNO.4)，其编码基因的cDNA阅读框为249个核苷酸(SEQIDNO.3)；OsMT-I-3a蛋白为62个氨基酸残基(SEQIDNO.6)，其编码基因的cDNA阅读框为189个核苷酸(SEQIDNO.5)；OsMT-I-4c蛋白为78个氨基酸残基(SEQIDNO.8)，其编码基因的cDNA阅读框为237个核苷酸(SEQIDNO.7)。
目前，还没有文献报道水稻体内的4个金属硫蛋白基因是否能影响重金属(特别是镉)在生物体内，特别是水稻中的的耐受或者积累。
在本发明中，我们主要公开了水稻体内的4个金属硫蛋白基因，该类基因在水稻体内的表达对重金属胁迫响应。金属硫蛋白基因的表达能够影响重金属镉在生物体内的积累，提供了将该类基因应用于工程菌——酿酒酵母的耐镉遗传改造的应用，也可应用于针对镉污染微生物修复工程菌的遗传改造；本发明也简单阐述了可将该基因应用于植物的遗传改造，培育用于重金属镉污染植物修复的转基因重金属超积累植物。
发明内容
本发明的目的之一是提供4个水稻金属硫蛋白OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c，及其编码基因OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c的新应用。
实现上述目的的技术方案如下：
OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、和/或OsMT-I-4c基因在改良植物对重金属的耐受性或富集性中的应用，所述OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、OsMT-I-4c基因的cDNA分别为如SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，或为分别与SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7互补配对的的核苷酸序列，或分别为编码SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8所示水稻金属硫蛋白的苷酸序列，所述重金属为Cd、Cu、Zn。
氨基酸序列分别如SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8所示水稻金属硫蛋白OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a、OsMT-I-4c在改良植物对重金属的耐受性或富集性中的应用，所述重金属为Cd、Cu、Zn。
优选地，所述植物为水稻。
优选地，所述重金属为Cd。
本发明的4个水稻金属硫蛋白OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c，其氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6和SEQIDNO.8所示，其编码基因OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c的cDNA核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5和SEQIDNO.7所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
本发明将上述4个水稻金属硫蛋白基因应用于植物基因工程中，用于改变转基因植物对重金属镉的耐受和富集的可能性。本发明公开了4个水稻金属硫蛋白基因在镉、锌、铜胁迫下的诱导表达特征，表明了该基因参与重金属胁迫的应答及解毒。本发明采用realtimeRT-PCR的方法鉴定了4个水稻金属硫蛋白基因在重金属Cd、Cu、Zn胁迫下的表达特征，表明该基因在包括重金属Cd、Cu、Zn在内的多种胁迫处理下均有诱导表达的特征，而在根中的表现尤其明显，论证了该基因为水稻体内应答重金属胁迫的重要基因，进一步延伸了该基因作为影响水稻重金属积累和胁迫的候选功能基因。
本发明的另一目的是公开一组酿酒酵母重组表达载体，该重组载体插入了4个水稻金属硫蛋白基因。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，通过半乳糖诱导该基因在酵母中的超表达，能够在镉胁迫下，提高酵母对重金属镉的耐受，并改变酵母细胞内镉积累。
实现上述目的的技术方案如下。
插入有SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、或SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的酿酒酵母重组表达载体。
本发明的另一目的是提供酿酒酵母重组表达载体的应用。
实现上述目的的技术方案如下。
上述酿酒酵母重组表达载体在改良工程菌株酿酒酵母对重金属镉的耐受性或富集性中的应用。
上述酿酒酵母重组表达载体在培育改良对重金属镉的耐受性或富集性的水稻中的应用。
本发明的另一目的是提供一种改良水稻中重金属镉的耐受性或富集性的生物制剂。
实现上述目的的技术方案如下。
一种改良水稻中重金属镉耐受性或富集性的生物制剂，其活性成份为上述酿酒酵母重组表达载体，或其活性成份含有OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、和/或OsMT-I-4c基因，所述OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、OsMT-I-4c基因的cDNA分别为如SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，或分别为与SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7互补配对的的核苷酸序列，或分别为编码SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8所示水稻金属硫蛋白的苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种调控水稻中重金属镉的耐受性或富集性的方法，该方法通过调控水稻中上述OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、和/或OsMT-I-4c基因的表达而实现。
本发明的有益效果如下：在本发明中，我们通过对筛选文库获得的4个水稻金属硫蛋白基因OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c的进行应用性探索，阐述了该类基因以下应用方式：(1)4个水稻金属硫蛋白在水稻体内的表达均具备重金属Cd、Cu和Zn诱导表达的特征，表明该类基因具有重金属胁迫应答的基本功能，可将该类基因应用于植物(作物)针对重金属的遗传育种，改良植物(作物)对重金属的耐受性或富集性。(2)4个水稻金属硫蛋白基因在酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母对重金属镉的耐受性，可将该类基因应用于工程菌针对重金属镉的耐受性遗传育种；(3)4个水稻金属硫蛋白基因在酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母细胞对重金属镉的积累，促进酵母对外界环境中镉的富集。可将该类基因应用于正对重金属镉污染的微生物修复工程菌的遗传改造。
本发明也可推广至重金属镉污染的微生物和植物修复领域，通过运用该类基因的转基因遗传改造，获得重金属镉超富集的微生物或植物。同时，本发明也可延伸至农业生物技术领域，通过改变水稻金属硫蛋白基因在农作物中的表达，调控农作物对重金属镉的耐受和富集，以及参与农作物对镉污染环境的适应性改造。
附图说明
图1示四个水稻金属硫蛋白基因在表达中受到重金属镉、铜和锌的调控。
图2示构建完成的酿酒酵母重组表达载体OsMT-I-1a-pYES260、OsMT-I-2a-pYES260、OsMT-I-3a-pYES260和OsMT-I-4c-pYES260示意图。
图3示转化OsMT-I-1a-pYES260、OsMT-I-2a-pYES260、OsMT-I-3a-pYES260和OsMT-I-4c-pYES260的转基因酵母Δycf1对镉的耐受性提高，可以在含有0.1mM和0.075mM的CdCl2的固体培养基上生长。
图4示转化OsMT-I-1a-pYES260、OsMT-I-2a-pYES260、OsMT-I-3a-pYES260和OsMT-I-4c-pYES260的转基因酵母Δycf1在添加了10μM的CdCl2的液体培养基发酵瓶中较未转化水稻金属硫蛋白基因的酵母Δycf1生长良好，进一步说明了水稻金属硫蛋白基因在酵母中的表达能够提高酵母对重金属镉的耐受性。
图5示转化OsMT-I-1a-pYES260、OsMT-I-2a-pYES260、OsMT-I-3a-pYES260和OsMT-I-4c-pYES260的转基因酵母WT和Δycf1在添加20μM的CdCl2的液体培养基发酵24小时后，酵母体内的重金属镉含量发生了变化，表明水稻金属硫蛋白基因在酵母中的表达能够影响重金属镉在酵母细胞内的积累。
具体实施方式
本发明描述了该类OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c基因在生物工程方面的应用。将这四个金属硫蛋白基因在酿酒酵母中超量表达，可以提高酵母对重金属镉的耐受性；同时在添加低镉(20μM的CdCl2)的培养基中生长，转入四个金属硫蛋白基因的酵母中的镉含量均增加，能够提高酵母对外界环境中重金属镉污染的富集。依次类推，由于该类基因来源于植物(水稻)，通过控制这四个金属硫蛋白基因在植物中的表达，也可将这一类基因应用于植物基因工程，用于培育耐镉的植物转基因品种，也可用来培育重金属镉超积累转基因植物，应用于环境重金属镉污染的植物修复工程。
本发明首先阐述了4个水稻金属硫蛋白基因受重金属Cd、Cu和Zn诱导表达的特征。以生长2周的水稻日本晴品种幼苗为材料，分别用重金属Cd、Cu和Zn进行胁迫诱导，采用realtimeRT-PCR方法分别检测上述4个基因在水稻幼根和幼叶中的表达特征。本发明中，我们所公开的4个水稻金属硫蛋白基因在水稻中的表达均受到重金属Cd、Cu和Zn的诱导，且在根中的诱导表达特征明显，表明这4个基因均参与了水稻应答重金属Cd、Cu和Zn的胁迫处理，具有进行水稻重金属解毒的基本特征，在本发明中，具有可推广应用于植物(作物)针对重金属的遗传育种的潜力。
本发明以水稻日本晴品种幼苗的叶片及幼根为材料，提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，设计以下引物分别扩增OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a和OsMT-I-4c基因的cDNA全长序列，用于获取插入至酵母表达载体pYES260的cDNA阅读框片。四个基因的引物如下所示：
OsMT-I-1aYEF:TTTCAGGGCGCCATGTCTTGCAGCTGTGGATCTAG和OsMT-I-1aYER:CGTTACTAGTGGATCTTAGCAGTTGCAAGGGTTGC(SEQIDNO.9、SEQIDNO.10)用于扩增OsMT-I-1a的cDNA阅读框，可以获得252bp的DNA片段；
OsMT-I-2aYEF:TTTCAGGGCGCCATGTCGTGCTGCGGAGGAAACT和OsMT-I-2aYER:CGTTACTAGTGGATCTCACTTGCCGCAGTTGCAGG(SEQIDNO.11、SEQIDNO.12)用于扩增OsMT-I-2a的cDNA阅读框，可以获得276bp的DNA片段；
OsMT-I-3aYEF:TTTCAGGGCGCCATGTCGGACAAGTGCGGC和OsMT-I-3aYER:CGTTACTAGTGGATCTCACTTGCCGCACTTGCAG(SEQIDNO.13、SEQIDNO.14)用于扩增OsMT-I-3a的cDNA阅读框，可以获得216bp的DNA片段；
OsMT-I-4cYEF:TTTCAGGGCGCCATGTCTTGCTGCGGAGGAAGCT和OsMT-I-4cYER:CGTTACTAGTGGATCTTAGCAGTTGCAGGGATTGC(SEQIDNO.15、SEQIDNO.16)用于扩增OsMT-I-1a的cDNA阅读框，可以获得264bp的DNA片段。
以上PCR均采用高保真的Taq酶进行扩增，并将得到的目的DNA片段进行回收，连接于酵母表达载体pYES260，分别形成重组载体OsMT-I-1a-pYES260，OsMT-I-2a-pYES260，OsMT-I-3a-pYES260和OsMT-I-4c-pYES260，并测序。
采用醋酸锂的方法将上述4个水稻金属硫蛋白重组载体转化进入酿酒酵母中，采用诱导的极限培养基(添加半乳糖)培养酵母转化子克隆，以转化pYES260空载体的酵母菌株为对照，30℃培养酵母至OD600为1.5-2，用于检测转基因酵母菌对重金属镉胁迫的耐受性以及对镉积累的变化。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1：4个水稻金属硫蛋白基因在水稻体内受重金属Cd、Cu和Zn诱导表达的检测
本发明首先采用水稻幼苗检测这4个水稻金属硫蛋白的表达特征。采用1/2液体MS培养基萌发水稻种子，浸种催芽后，将水稻幼苗转移到23℃培养室(16h光照/8h黑暗)，用1/2MS液体培养基继续培养2周。然后分别用含有CdCl2(50μM)、ZnSO4(2mM)和CuCl2(150μM)采用1/2液体MS培养基萌发水稻种子，浸种催芽后，将水稻幼苗转移到23℃培养室(16h光照/8h黑暗)，用1/2MS液体培养基继续培养2周。然后分别用含有CdCl2(50μM)、ZnSO4(2mM)、CuCl2(150μM)的1/2MS液体培养基继续培养，在如图1所示的时间段进行取材，提取总RNA，并逆转录成cDNA。以cDNA为模板，采用下列引物进行realtimeRT-PCR检测。
通过网站QuantPrime(http://www.quantprime.de/)在线设计real-timeRT-PCR引物。引物序列如下所示。
OsMT-I-1aRTF：TGTCTTGCAGCTGTGGATCTAGC和OsMT-I-1aRTR：AGGGTACTTCTTTCCGCAGGAG用于检测OsMT-I-1a基因的表达量；(SEQIDNO.17、SEQIDNO.18)
OsMT-I-2aRTF：TGCTCGTGTGTTGTGCGATCAG和OsMT-I-2aRTR：TCTCCGGGTACATCTTGCATCCTC用于检测OsMT-I-2a基因的表达量；(SEQIDNO.19、SEQIDNO.20)
OsMT-I-3aRTF：GTCATAGTTGAAGCCGAGAAGAGC和OsMT-I-3aRTR：GAGTGTTCGGTTGCTTCGTGAC用于检测OsMT-I-3a基因的表达量；(SEQIDNO.21、SEQIDNO.22)
OsMT-I-4cRTF：TGCGGAAAGATGTACCCTGACC和OsMT-I-4cRTR：ATTCAGCTGCTTTGCCAACTCC用于检测OsMT-I-4c基因的表达量；(SEQIDNO.23、SEQIDNO.24)
选用的水稻内参基因为水稻泛素基因OsUBQ5，引物如下：OsUBQ5F(5’-CGCCGTGCTCCAGTTCTA-3’)和OsUBQ5R(5’-CGATTTCCTCCTCCTTCCTT-3’)。(SEQIDNO.25、SEQIDNO.26)。
参考BIO-RAD公司ITaqTMUniversalSYBRGreenSupermix的说明书配制realtimeRT-PCR反应体系(冰上操作)。采用两步法PCR反应，扩增标准程序如下：
所有检测均采用两个生物学样本重复，每个生物学样本进行三次重复检测反应。引物第一次使用时添加程序Stage3检测溶解曲线，确认引物的特异性。
如图1A、1B和1C所示，在Cd、Cu和Zn胁迫处理下，在水稻幼苗的根中，OsMT-I-1a基因的表达都受到重金属Cd、Cu和Zn胁迫的诱导，其最大诱导量均可达到对照的数倍至数十倍；其中OsMT-I-1a基因在Cd胁迫下的诱导表达最为明显，表现为无论在根或是在叶中，均有较强的诱导表达的特征，而在Cu和Zn胁迫处理下，该基因诱导表达仅体现在幼根中，而在叶片中的表达并未受到诱导，反而表达有所下降。
同样，如图1D、1E和1F所示，在水稻幼苗的根中，OsMT-I-2a基因的表达都受到重金属Cd、Cu和Zn胁迫的诱导；而在水稻叶片中，仅Cd胁迫处理诱导了该基因的表达，Cu和Zn胁迫处理并未上调OsMT-I-2a基因的表达。
如图1G、1H和1I所示，在水稻幼苗的根中，OsMT-I-3a基因的表达都受到重金属Cd、Cu和Zn胁迫的诱导；而在水稻叶片中，仅Cd胁迫处理诱导了该基因的表达，Cu和Zn胁迫处理并未上调OsMT-I-3a基因的表达。
如图1J、1K和1L所示，在水稻幼苗的根中，OsMT-I-4c基因的表达都受到重金属Cd、Cu和Zn胁迫的诱导；而在水稻叶片中，仅Cd胁迫处理诱导了该基因的表达，Cu和Zn胁迫处理并未上调OsMT-I-4c基因的表达。
以上公开的内容表明了这4个水稻金属硫蛋白基因是一类广泛的重金属胁迫应答基因，参与水稻体内重金属镉、锌和铜的胁迫应答及解毒。该类基因具备应用于针对重金属镉、锌和铜的胁迫和富集的水稻和其他作物遗传工程改良的潜力，也可作为相应正对重金属污染土壤植物修复基因工程的备选功能基因。
实施例2：4个水稻金属硫蛋白基因的克隆和酵母重组表达载体的构建
取水稻粳稻品种日本晴(华南植物园保存)的幼苗叶片，提取幼叶的RNA，并逆转录成cDNA，以cDNA为模板，设计引物OsMT-I-1aYEF:TTTCAGGGCGCCATGTCTTGCAGCTGTGGATCTAG和OsMT-I-1aYER:CGTTACTAGTGGATCTTAGCAGTTGCAAGGGTTGC，用于扩增OsMT-I-1a的cDNA阅读框，并获得252bp的DNA片段；
设计引物OsMT-I-2aYEF:TTTCAGGGCGCCATGTCGTGCTGCGGAGGAAACT和OsMT-I-2aYER:CGTTACTAGTGGATCTCACTTGCCGCAGTTGCAGG，用于扩增OsMT-I-2a的cDNA阅读框，并获得276bp的DNA片段；
设计引物OsMT-I-3aYEF:TTTCAGGGCGCCATGTCGGACAAGTGCGGC和OsMT-I-3aYER:CGTTACTAGTGGATCTCACTTGCCGCACTTGCAG，用于扩增OsMT-I-3a的cDNA阅读框，并获得216bp的DNA片段；
设计引物OsMT-I-4cYEF:TTTCAGGGCGCCATGTCTTGCTGCGGAGGAAGCT和OsMT-I-4cYER:CGTTACTAGTGGATCTTAGCAGTTGCAGGGATTGC，用于扩增OsMT-I-1a的cDNA阅读框，并获得264bp的DNA片段。
上述扩增获得的DNA片段依照Magen公司HiPureGelPureDNAKits说明书进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收得到的片段用于插入至酵母表达载体pYES60中。酿酒酵母表达载体pYES260经NcoI和BamHI双酶切处理，回收线性化质粒。回收后的4个水稻金属硫蛋白cDNA阅读框片段和线性化pYES260质粒经Nanodrop公司紫外分光光度计测定浓度，采用TaKaRa(Clontech)公司的HDCloningKit进行DNA片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒备用。经测序分析后，4个水稻金属硫蛋白基因的cDNA核苷酸序列如SEQ1，SEQ3，SEQ5和SEQ7所示，所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ2，SEQ4，SEQ6和SEQ8所示。构建好的4个水稻金属硫蛋白今酿酒酵母重组表达载体如图2所示。
实施例3：4个水稻金属硫蛋白基因在酿酒酵母中的表达提高酵母对重金属镉的耐受性
培养酿酒酵母菌株野生型WT和镉敏感突变株Δycf1(购自欧洲酵母研究中心Euroscarf,http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/,菌株编号分别为Y00000和Y04069)，用pYES260质粒和重组的4个含有水稻金属硫蛋白的pYES260质粒(如图2所示)对上述酵母进行转化。由于插入的外源水稻金属硫蛋白基因是置于酵母半乳糖诱导的启动子PGAL1调控之下(见图1所示)，将转化获得的酿酒酵母单克隆置于添加半乳糖的生长选择合成培养基(SelectiveGrowthSyntheticMedium,SDmedium)上生长，即可诱导外源的水稻金属硫蛋白基因在酵母中异源超量表达。
酵母转化采用的方法为醋酸锂转化法，具体步骤如下：
1)接种待转化的酵母菌株WT和Δycf1的单菌落于5mLYPD液体培养基中，于30℃恒温摇床(200rpm)，培养过夜达到饱和。
2)按照1:100比例转移上述培养物到20mLYPD液体培养基中于30℃恒温摇床(200rpm)继续培养，摇3-5h至菌液OD600值达0.5。
3)培养液在室温条件下4000g离心5min，收集细胞。细胞用10mL无菌超纯水重悬，再于室温下5000-6000g离心5min，沉淀细胞。
4)细胞用2mL锂盐溶液(1×TE缓冲液，pH7.5；1×乙酸锂)重悬。
5)将2μL待转化质粒和10μL变性鲑鱼精一起加入1.5mL离心管中混匀。
6)往每个离心管中加入200μL用锂盐溶液重悬的细胞悬液，再加入1mL新鲜配制的PEG溶液(40％PEG；1×TE缓冲液，pH7.5；1×乙酸锂)。30℃摇荡温育30min。
7)于42℃热激15min，室温下离心5s，细胞沉淀用200μL-1mL1×TE缓冲液(从10×储液新鲜配制)重悬，并取其中200μL涂布在添加了半乳糖的SD固体培养基平板上。30℃培养2-5天，直到出现转化子。
挑取酵母菌株WT和Δycf1转化空载体pYES260和4个水稻金属硫蛋白基因超表达载体(OsMT-I-1a-pYES260,OsMT-I-2a-pYES260,OsMT-I-3a-pYES260和OsMT-I-4c-pYES260)的单克隆，接种于2ml添加了半乳糖的SD液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有0.075mMCd的SD(添加半乳糖)固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。
如图3所示，超表达4个水稻金属硫蛋白基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES260的Δycf1酵母突变株而言，能够在添加0.075mMCd和0.1mMCd的SD培养基平板中生长，而未表达外源基因的Δycf1酵母菌株(转化空载体pYES260)则不能生长，表明本发明公布的4个水稻金属硫蛋白基因在酵母中的表达能够提高酵母对重金属镉的耐受性。
我们同样检测了该类基因在发酵瓶中对于提高酵母对重金属镉的耐受性方面的应用。将上述转化空载体pYES260的酵母对照菌株和转化有4个水稻金属硫蛋白基因的转基因酵母菌株接种于2ml添加了半乳糖的SD液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达0.5。此时，菌株的生长状态一致，且处于生长分裂较旺盛的时期。按照1:100的比例将各种菌株接种于添加了半乳糖的20ml的SD液体培养基的发酵瓶中，以添加了10μM的Cd的发酵瓶为检测对象，而未添加Cd的发酵瓶作为对照。将发酵瓶置于30℃恒温摇床(200rpm)培养，分别在培养后的2小时、10小时、24小时、48小时和72小时取菌液测定其OD600，作为酵母菌的生长指标。如图4所示，在未添加Cd的发酵瓶中，6个待检的酵母株系均有一致的生长状态；而添加了10μM的Cd的发酵瓶中，作为对照的转化有空载体的野生型WT生长状态良好，作为负对照的酵母菌株Δycf1转化空载体pYES260则在10μM的Cd的胁迫下不能正常生长发酵，转化了4个水稻金属硫蛋白基因的酵母Δycf1则基本上可以恢复其正常生长的状态，表明这4个水稻金属硫蛋白基因能够提高工程菌株酵母对重金属镉的耐受性。
实施例4：4个水稻金属硫蛋白基因在酿酒酵母中的表达提高酵母体内镉的积累
取实施例3中分别转化空载体pYES260和含有4个水稻金属硫蛋白基因重组载体pYES260(如图2所示)酵母菌株野生型WT和Δycf1，在超净台中用无菌牙签挑取十种酵母转化子(酵母菌株野生型WT和Δycf1分别转化pYES260和4个水稻金属硫蛋白重组载体pYES260)到2mL添加了半乳糖的生长选择合成培养基(SelectiveGrowthSyntheticMedium,SDmedium)液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达2。之后将两种酵母按照1：500的体积比接种于600ml添加了半乳糖的SD液体培养基中，30℃摇床(200-250rpm)培养约12小时至OD600值达2，之后分别添加CdCl2至终浓度20μM。继续培养24小时后离心收集菌体。采用双蒸水清洗菌体3遍后，将菌体65℃干燥3-5天，干燥的酵母块进行微波消解后，采用火焰法原子吸收光谱测定酵母细胞中镉的积累。
在本发明中，转化4个水稻金属硫蛋白基因重组载体pYES260的两种酵母菌株(WT和Δycf1)在添加有20μM的CdCl2的培养基中，体内积累的镉均高于于转化pYES260空载体的酵母菌株(见图5所示)，这表明水稻金属硫蛋白基因在酵母体内的表达提高了酵母细胞对重金属镉的富集，促进了工程菌酵母对镉的吸收。本发明公布的4个水稻金属硫蛋白基因可应用于针对重金属镉污染微生物修复的工程菌遗传改造，用于获得重金属超积累工程菌，用于环境保护工程中重金属的清除。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、和/或OsMT-I-4c基因在改良植物对重金属的耐受性或富集性中的应用，所述OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、OsMT-I-4c基因的cDNA分别为如SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，或分别为与SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7互补配对的的核苷酸序列，或分别为编码SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8所示水稻金属硫蛋白的苷酸序列，所述重金属为Cd、Cu、Zn。
2.氨基酸序列分别如SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8所示水稻金属硫蛋白OsMT-I-1a，OsMT-I-2a，OsMT-I-3a、OsMT-I-4c在改良植物对重金属的耐受性或富集性中的应用，所述重金属为Cd、Cu、Zn。
3.根据权利要求1或2的应用，其特征是，所述植物为水稻。
4.根据权利要求1或2的应用，其特征是，所述重金属为Cd。
5.插入有SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、或SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的酿酒酵母重组表达载体。
6.权利要求5所述的酿酒酵母重组表达载体在培育改良对重金属镉的耐受性或富集性的水稻中的应用。
7.一种酿酒酵母，其特征是，其转化有权利要求5所述的酿酒酵母重组表达载体。
8.权利要求7所述的酿酒酵母在对环境中重金属镉污染的微生物修复中的应用。
9.一种改良水稻中重金属镉的耐受性或富集性的生物制剂，其特征是，其活性成份来源于权利要求5所述的酿酒酵母重组表达载体或权利要求8所述的酿酒酵母，或其活性成份含有OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、和/或OsMT-I-4c基因，所述OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、OsMT-I-4c基因的cDNA分别为如SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，或分别为与SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7互补配对的的核苷酸序列，或分别为编码SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8所示水稻金属硫蛋白的苷酸序列。
10.一种调控水稻中重金属镉的耐受性或富集性的方法，其特征是，该方法中包括有调控水稻中OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、和/或OsMT-I-4c基因的表达，所述OsMT-I-1a、OsMT-I-2a、OsMT-I-3a、OsMT-I-4c基因的cDNA分别为如SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，或分别为与SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7互补配对的的核苷酸序列，或分别为编码SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8所示水稻金属硫蛋白的苷酸序列。
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