CN110106194B

CN110106194B - Pod p7基因的orf片段及其在提高植物镉胁迫耐受性、降低镉积累中的应用

Info

Publication number: CN110106194B
Application number: CN201910342173.4A
Authority: CN
Inventors: 丁艳菲; 朱诚; 王飞娟; 孙骏威; 丁丽红; 江琼; 蒋晗
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2039-04-26
Also published as: CN110106194A

Abstract

本发明涉及转基因技术领域，尤其涉及POD P7基因的ORF片段及其在提高植物镉胁迫耐受性、降低镉积累中的应用。POD P7基因的ORF片段，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种载体，该载体含有所述的ORF片段。所述的ORF片段或所述的载体可以用于提高植物镉胁迫耐受性、培育镉胁迫耐受性提高的转基因植物、调控植物镉胁迫、调控植物对镉的吸收和转运，以及用于土壤镉污染修复，其中的植物可以是水稻。

Description

POD P7基因的ORF片段及其在提高植物镉胁迫耐受性、降低镉积累中的应用

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，尤其涉及POD P7基因的ORF片段及其在提高植物镉胁迫耐受性、降低镉积累中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的农作物之一，迄今为止，全球一半以上的人以稻米为主食。Cd大多都以化合物的形式在地壳中存在，含量为2×10-5％。由于快速工业化带来的污染，以及含Cd化肥或农药的广泛施用、采矿等人类活动，大量Cd被释放到土壤、空气和水体中。在包括中国的亚洲国家，高达50％的摄入Cd来自大米及其制品。当重金属进入土壤-作物系统时，不易被降解。Cd对水稻造成毒害并使其减产的同时，特别容易沿食物链逐级往上传递。由于其不易水解和生物难分解的特性，Cd易被植物吸收并积累在一些可食用部位，如叶片和籽粒，最终在食物链末端的生物体中积累并产生毒害作用。自从20世纪中期日本Cd污染水稻引起的“骨痛病”爆发以来，Cd的毒性作用一直受到全世界的关注。近年来我国“Cd米”事件的频发已经引起了社会各部门的高度重视。重金属污染已经成为我国生产安全(无公害)稻米的关键影响因素。因此，如何降低稻米中Cd积累、实现稻米的安全生产成为了一项亟需解决的课题。深入研究重金属吸收、转运及积累机制，对保障农产品和生态安全以及人民身体健康都具有重要及深远的意义。

过氧化物酶(Peroxidase)是一大类广泛分布的酶，通过催化过氧化氢(H₂O₂)与各种有机和无机化合物之间的氧化还原，在活性氧(ROS)的生产和清除中发挥重要作用(Hiraga et al,2001；Passardi et al,2004)。基于他们的蛋白质结构，过氧化物酶分为两组，包括血红素过氧化物酶和非血红素过氧化物酶(Hiraga et al,2001)。除动物过氧化物酶外，血红素过氧化物酶根据其序列和催化特性进一步分为三类。I类过氧化物酶存在于细胞内，可以在除动物之外的大多数生物体中发现，在防止过量积累H₂O₂中起关键作用。II类过氧化物酶是细胞外真菌酶，主要参与木质素降解(Welinder and Gajhede,1993)。III类过氧化物酶(PRXs)包括所有分泌性植物特异性过氧化物酶(Welinder 1992；Cosio andDunand，2009)，由于它们的过氧化或羟基反应循环，在植物生长和发育和对生物和非生物胁迫的响应起着关键作用，包括细胞壁组分交联，伤口愈合，H₂O₂解毒，生长素分解代谢和木质素生物合成和应激反应(创伤，病原体攻击等)(Passardi et al，2005；Bindschedler etal，2006；Cosio and Dunand，2009；Daudi et al，2012)。

此外，已经在多种植物物种中鉴定了PRX蛋白家族的许多成员，并且已经进行了许多努力来阐明PRX基因的功能。例如，拟南芥过氧化物酶72(AtPrx72)在木质化中起重要作用(Herrero et al，2013)。在水稻中，对21种过氧化物酶的研究显示出重要性，研究基因表达模式的多样性，特别是对应激诱导刺激的反应(Hiraga et al，2000)。编码III类过氧化物酶的棉花GhPOX1可能是产生高水平活性氧物质的原因(Mei et al，2009)。来自玉米根的几个ZmPRX基因受到调控茉莉酸甲酯，水杨酸和病原体诱导子(Mika et al，2010)。

发明内容

为此，本发明的一个目的是提供一种POD P7基因的ORF片段，其序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的另一个目的是提供所述的ORF片段的制备方法，该方法采用下列引物进行PCR，克隆获得：F:5’gatcgatccaaccgaatgcatg 3’；R:5’ttttctttaacagcaaggattgt 3’。

本发明的另一个目的是提供一种载体，该载体含有所述的ORF片段。进一步，该载体由所述的ORF片段克隆进入过表达载体pBWA(V)HS。

本发明的另一个目的是提供所述的ORF片段或所述的载体在提高植物镉胁迫耐受性、降低镉积累中的应用；或者，在培育镉胁迫耐受性提高、降低镉积累的转基因植物中的应用；或者，在调控植物镉胁迫中的应用；或者，在调控植物对镉的吸收和转运中的应用；或者，在土壤镉污染修复中的应用。

进一步，本发明所述植物为水稻。

本发明的另一个目的是提供一种培育镉胁迫耐受性提高、镉积累降低的转基因植物的方法，该方法将所述的ORF片段或所述的载体导入植物中，获得镉胁迫耐受性提高的转基因植物。

进一步，本发明所述植物为水稻。

作为一个具体的实施方式，该方法包括以下的步骤：

1)胚性愈伤组织的诱导和继代培养

将水稻灌浆期稻穗取回脱粒，种子置于500ml烧杯中，种子数量约为烧杯体积的1/3，70％酒精消毒2min，倒掉酒精加入500ml 25％次氯酸钠溶液，滴入2-3滴吐温-20，抽真空浸泡90min，在超净工作台上倒去溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5次；在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，接种于诱导培养基中，封好膜后28℃/暗培养7d；在超净台上将已经诱导出的愈伤组织去芽，然后置于继代培养基中相同条件继续培养7d；

2)感菌与共培养

共培养前一周将含有重组质粒的农杆菌菌株划YM平板进行活化，提前2-3d挑取单菌落在新的含有抗生素的YM平板上再次化菌，一个单克隆菌落划一条；用金属药匙收集平板上的菌条，置于30ml悬浮侵染培养基中，并使该悬浮菌液OD600＝0.01；挑选淡黄色、致密、大小合适的愈伤组织颗粒放入农杆菌悬浮菌液中侵染30min，取出愈伤组织在无菌滤纸上微晾20-30min，置于铺有无菌滤纸的共培养基上，25℃/暗培养3d；

3)抗性愈伤组织的筛选

共培养后的愈伤组织首先依次用无菌水和含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗3-5次，然后置于无菌滤纸上晾干，最后将它们转入抗性筛选培养基上，28℃/暗培养；14d后将能够长出抗性愈伤的愈伤组织移至新的筛选培养基上，28℃/光照培养14d，直到能够长出淡黄致密的抗性愈伤；

4)抗性愈伤组织的分化和生根

将经过筛选后颜色鲜黄有抗性的愈伤组织转入分化培养基中，密度保持在每支试管3-4粒或每瓶5-7粒，封好膜后于28℃/恒温昼夜交替培养15-30d至分化成苗，将长至1cm左右的分化苗放入生根培养基中培养；

5)转基因植株的炼苗和移栽

挑选根部生长较好的转基因苗置于蒸馏水或无菌水的试管中，炼苗3-7d后移栽至温室中土培并进行检测；获得过表达POD7的转基因水稻。

本发明另一个目的是提供所述的方法获得的转基因植物的PCR鉴定方法，该方法采用潮霉素抗性基因的进行PCR，筛选出转基因阳性株系；潮霉素抗性基因引物序列：Hyg-F:5’-GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3’；Hyg-R:5’-GGAGCATATACGCCCGGAGT-3’。

本申请发现了一种POD P7基因的ORF片段，以水稻为例进行验证。通过构建相关载体并将其导入植物，获得了没有生育缺陷，发育正常的过表达POD P7的转基因水稻。镉处理后，过表达POD P7的转基因水稻提高了对镉胁迫的耐受性，降低了对镉向地上部的转运和积累。该ORF片段以及含有其的载体可用于提高植物镉胁迫耐受性、培育镉胁迫耐受性提高的转基因植物、调控植物镉胁迫、调控植物对镉的吸收和转运，以及修复土壤镉污染，具有良好的应用价值。

附图说明

图1为POD P7克隆进入过表达载体pBWA(V)HS图谱。

图2为过表达载体pBWA(V)HS-POD P7的酶切验证；左边：MARKER；右边EcorV酶切验证。

图3为过表达POD P7转基因水稻的潮霉素抗性基因PCR鉴定。

图4为TAKARA试剂盒操作流程简图。

图5为野生型和转基因水稻中POD P7的表达量检测。

图6为野生型和转基因水稻的表型变化。

图7为野生型和转基因水稻的株长变化。

图8为野生型和转基因水稻MDA和H2O2含量变化；A：MDA含量；B：H2O2含量。

图9为野生型和转基因水稻的Cd含量；A：根中Cd含量；B：地上部Cd含量。

具体实施方式

以下以具体实施方式详细描述本发明，不能将其解释为限制本发明的范围。

实施例1构建过表达载体及水稻转基因

具体步骤如下所示：

1.提取水稻叶片RNA、逆转录并进行PCR：

用TAKARA的RNA提取试剂盒提取水稻中花11幼苗叶片中的总RNA。采用TAKARA第一链cDNA合成试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行RNA逆转录为cDNA。以下列引物及PCR程序进行PCR，克隆获得POD P7基因的ORF序列。POD P7，F:5’gatcgatccaaccgaatgcatg 3’；R:5’ttttctttaacagcaaggattgt 3’。PCR程序：95℃预变性5min，95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min 20s，共35个循环；最后72℃总延伸10min。

POD P7基因的ORF序列：

2.酶切连接进入过表达载体pBWA(V)HS

将上述POD P7目的基因条带克隆进入过表达载体pBWA(V)HS(图1)。构建好载体后，进行酶切验证如图2。并测序，成功构建POD P7基因的过表达载体。

3.过表达载体pBWA(V)HS-POD P7的水稻转基因

1)胚性愈伤组织的诱导和继代培养

将水稻灌浆期稻穗取回脱粒，种子置于500ml烧杯中(种子数量约为烧杯体积的1/3)，70％酒精消毒2min，倒掉酒精加入500ml 25％次氯酸钠溶液(滴入2-3滴吐温-20)，抽真空浸泡90min，在超净工作台上倒去溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5次。在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，接种于诱导培养基中，封好膜后28℃/暗培养7d。在超净台上将已经诱导出的愈伤组织去芽，然后置于继代培养基中相同条件继续培养7d。

2)感菌与共培养

共培养前一周将含有重组质粒的农杆菌菌株划YM(+50mg/L Kan，40mg/L Rif)平板进行活化，提前2-3d挑取单菌落在新的含有抗生素的YM平板上再次化菌，一个单克隆菌落划一条。用金属药匙收集平板上的菌条，置于30ml悬浮侵染培养基中，并使该悬浮菌液OD600＝0.01。挑选淡黄色、致密、大小合适的愈伤组织颗粒放入农杆菌悬浮菌液中侵染30min，取出愈伤组织在无菌滤纸上微晾(20-30min)，置于铺有无菌滤纸的共培养基上，25℃/暗培养3d。

3)抗性愈伤组织的筛选

共培养后的愈伤组织首先依次用无菌水和含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗3-5次，然后置于无菌滤纸上晾干，最后将它们转入抗性筛选培养基上，28℃/暗培养。14d后将能够长出抗性愈伤的愈伤组织移至新的筛选培养基上，28℃/光照培养14d，直到能够长出淡黄致密的抗性愈伤。

4)抗性愈伤组织的分化和生根

5)转基因植株的炼苗和移栽

4.过表达POD P7的转基因水稻的PCR鉴定

获得转基因苗后待水稻长到2周龄时，采用植物超纯基因组DNA提取试剂盒提取野生型水稻植株、POD P7过表达转基因水稻叶片的总DNA，进行潮霉素抗性基因的PCR，筛选出转基因阳性株系。潮霉素抗性基因引物序列：Hyg-F:5’-GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3’；Hyg-R:5’-GGAGCATATACGCCCGGAGT-3’。PCR反应体系如下：总共20μL，包括DNA 2μL，Hyg-F 0.50(10μM)μL，Hyg-R 0.50(10μM)μL，10×buffer 2μL，dNTP 2μL，rTaq 0.20μL，RNase FreedH₂O 12.80μL。反应条件如下：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃1min，充分延伸94℃10min，4℃保存，其中“变性-退火-延伸”过程进行35个循环。

PCR结果如图3所示，证明成功获得过表达POD P7的转基因水稻。

实施例2过表达POD P7的转基因水稻提高植物镉胁迫耐受性试验

1.实验材料和生长条件

野生型水稻(Oryza sativa L.，Zhonghua 11，简称ZH11)作为对照组，把Peroxidase P7转基因水稻阳性株系(POD P7#L1；POD P7#L3；POD P7#L4)作为实验组。挑选成熟饱满的野生型和转基因株系种子在28℃暗处理3天，萌发后播种到网格上置于28℃，13小时光照、22℃，11小时黑暗，相对湿度为70％的培养箱中，用一半浓度的木村B营养液进行水培预培养。14天后换成全营养液进行培养。溶液每三天更换一次。培养至7周时在2μM的CdCl₂处理14d后，观察并比较35S:POD P7转基因株系(L1；L3；L4)与野生型ZH11水稻植株在镉处理前后下的表型，并进行相关生理分子分析。

2.基因的表达特性分析

2.1水稻样品总RNA的提取：

用TAKARA的RNA提取试剂盒提取各个不同水稻样品中的总RNA，说明书见图4。

2.2 RNA样品的逆转录

采用TAKARA第一链cDNA合成试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser进行RNA逆转录。在DEPC处理的离心管内将试剂按表1所示混合均匀，进行逆转录反应。2.3实时荧光定量PCR

利用Rotor gene Q荧光定量PCR仪对POD P7表达水平进行检测，每个cDNA样品三个重复，每个样品均以β-actin作为内参。反应体系见表2；PCR反应程序见表3；引物序列见表4。

表1逆转录反应体系(20μL体系)

RNA逆转录的反应程序为：37℃15min，85℃5s，4℃恒温保存。得到的cDNA样品加入2倍体积的去离子水稀释备用。

表2荧光定量PCR反应体系(10μL体系)

表3荧光定量PCR反应程序

表4 qRT-PCR引物序列

3.水稻MDA和H₂O₂含量测定方法

取适量1mL离心管置于冰上，加入0.9mL PBS提取缓冲液(50mM PBS，pH：7.0)；分别称取0.3g左右的新鲜叶片于研钵内，利用液氮研磨成粉末，于漩涡混匀器匀浆后静置2min，置于高速冷冻离心机以12000rpm，4℃离心10min，吸取400μL上清液到新的试管中待用。(整个实验过程保持在4℃环境下)。取2μL上清液，超微量分光光度计测定蛋白浓度。

3.1 MDA含量测定

按照表5在15mL离心管中加入各试剂和样品提取液，旋涡混匀器匀浆，用保鲜膜将试管口扎紧，用枪头刺一个小孔；锅中加入适量自来水煮沸后放入样品架，继续煮沸40min，取出试管架后用流水加速冷却；待完全冷却后，对称放入高速冷冻离心机4000rpm离心10min，在紫外分光光度计于532nm处，用双蒸水调零，取各样品上清液测定吸光度。根据下列公式计算MDA含量。

表5 MDA含量测定反应体系

3.2 H₂O₂含量测定

按照表6在15mL试管中加入各试剂和样品提取液，混匀使充分反应，打开紫外分光光度计，双蒸水调零，然后取各样品上清在405nm处测定吸光度。根据下列公式计算H₂O₂含量。

表6H₂O₂含量测定反应体系

4.Cd含量测定

待水稻生长7周后用2μM CdCl₂处理14d取样，将水稻的根部完全浸入20mM Na₂-EDTA溶液中20min，之后去离子水冲洗数次并用纸巾吸去多余水份。分别将水稻的根和地上部分剪碎混匀后置于信封袋中，于烘箱105℃杀青2h，70℃烘干至恒重，贮存备用。

消化管分别加入根0.1g和地上部0.3g，并于通风橱内分别加3mL、6mL的优级纯HNO₃。旋紧塞子静置2h后对样品进行消解(程序见表7)，消解完全后赶酸，待剩余量1mL时倒出，用去离子水定容至10mL，混匀。利用原子吸收光谱仪测定样品的Cd含量。

表7水稻样品消解程序

5.结果分析

5.1转基因水稻株系鉴定

待水稻生长至2周后取新鲜的水稻叶片，提RNA、逆转录后进行qRT-PCR，检测野生型ZH11和35S:POD P7转基因水稻中POD P7的表达量。由图5可以看出，与ZH11相比，PODP7在35S:POD P7转基因水稻中表达量显著较高，说明课题组前期获得的水稻材料转基因成功。

5.2表型观察

水稻生长至7周，用2μM CdCl₂处理14d后，观察野生型ZH11和转基因水稻的表型。如图6所示，35S:POD P7转基因水稻的三个株系长势较ZH11更好，绿色叶片更多，枯黄相对不严重，且由图7可以明显看出Cd处理后，35S:POD P7转基因水稻的株长也明显大于ZH11。35S:POD P7转基因水稻显示出对Cd胁迫耐受性的增强。

5.3 MDA和H₂O₂含量分析

Cd毒害可以引起水稻的氧化应激反应，产生一定的毒害作用。叶片中MDA和H₂O₂含量会反映植株受胁迫的程度。如图8所示，在Cd处理后，ZH11和转基因水稻中MDA和H₂O₂含量均有所上升，对比ZH11，35S:POD P7转基因水稻上升比例和含量显著较低。结果显示Cd胁迫下，35S:POD P7转基因水稻受到的氧化胁迫程度低于野生型ZH11，表明POD P7的过表达可以在一定程度上增强水稻植株对Cd的耐受性。

5.4 Cd含量分析

采用原子吸收光谱法测定水稻植株根、地上部中Cd含量。在2μM CdCl₂处理14d后，野生型和转基因水稻中Cd含量均表现为根中Cd含量最高。如图9所示，对比ZH11，35S:PODP7转基因水稻在根中积累的Cd显著较高，但在地上部积累的Cd较少。结果表明，POD P7的过表达会在一定程度降低水稻植株由根向地上部的Cd转运。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> POD P7基因的ORF片段及其在提高植物镉胁迫耐受性、降低镉积累中的应用

<140> 2019103421734

<141> 2019-04-26

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

gatcgatcca accgaatgca tgggccagcg ggtagcatat ggcggcacac tataaattgg 60

aggccacccc tgtgcgtctc gtcccatcca actcatctca ggatcgagtt gtgtacgttt 120

gtagtgtgct gctctctctg ctaccttgtg tcgagatggc cggagtggtg atcaccgggc 180

gggccttggt ggccgccgtc gctgtcgtgg tcgccgtttt gctcggcgga gcggcggagg 240

cgcagcagct gtcccccaac ttctactcga ggacgtgccc caacctggcc accatcgtgc 300

ggtccgggat ggcgtccgcc gtgcggacgg agccccggat gggggcctcc atccttcgcc 360

tcttcttcca tgattgcttc gtcaatggat gtgacggctc gatcctgctt gacgacacgt 420

cgacgttcac cggcgagaag agcgccggcc cgaacgccaa ctcggcccgc gggttcgagg 480

tgatcgacgc catcaagacg caggtggagg cctcctgcaa ggccaccgtc tcctgcgccg 540

acatcctcgc cctcgccgcc cgcgacggcg tcaacctgct gggtgggcca acgtggagcg 600

tggcgctggg gcggaaggac tcgcgcacgg cgagccagag cgcggcgaac agcaacctgc 660

cggggcccgg gtcgagcctc gccacgctca tcagcatgtt cggcaaccag ggcctctcgg 720

cgcgcgacat gacggcgctg tcgggcgccc acaccatcgg ccgcgcccag tgccagttct 780

tccgcagccg catctacacc gagcgcaaca tcaacgcctc cttcgcgtcg ctccggcagc 840

agacgtgccc gcgctccggc ggcgacgcca acctcgcgcc gttcgacgtg cagacgcccg 900

acgccttcga caacgcctac taccagaacc tcgtgtcgca gcgcggcctg ctccactccg 960

accaggagct cttcaatggc ggctcgcagg acggcctcgt caggcagtac agcaccaacc 1020

cctcccagtt ctcctccgac ttcgtctccg ccatggtcaa gatgggcaac ctgctgccgt 1080

cctccggcac cgccacggag gtcaggctca actgcaggaa ggtgaactaa ttaaggatga 1140

taaaccccaa ttcccatcgc attgcatttg caggtgatca tttccgatga tcaccgtctt 1200

cgccgacgcc ctgggaacca atgcgccggt gagatatcaa aacacaagaa gagacgaaac 1260

gtgaaatact tgtttgataa tgtattacca caaagtgtaa taatgtgcga cgcttatata 1320

tgatgatata taccatggta aattatcgca accacgacaa tgtatttttt ttatgatgca 1380

tgataataca atccttgctg ttaaagaaaa 1410

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial primer)

<400> 2

gatcgatcca accgaatgca tg 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial primer)

<400> 3

ttttctttaa cagcaaggat tgt 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial primer)

<400> 4

gtttatcggc actttgcatc g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial primer)

<400> 5

ggagcatata cgcccggagt 20

Claims

1.过氧化物酶（Peroxidase） P7基因的ORF片段的应用，ORF片段的序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于，该应用为在提高水稻镉胁迫耐受性并且降低镉积累中的应用；或者，在培育镉胁迫耐受性提高并且降低镉积累的转基因水稻中的应用。

2.一种载体的应用，该载体含有过氧化物酶P7基因的ORF片段，ORF片段的序列如SEQID NO.1所示，其特征在于，该应用为在提高水稻镉胁迫耐受性并且降低镉积累中的应用；或者，在培育镉胁迫耐受性提高并且降低镉积累的转基因水稻中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该载体由所述的ORF片段克隆进入过表达载体pBWA(V)HS。

4.一种培育镉胁迫耐受性提高，镉积累降低的转基因水稻的方法，其特征在于，将过氧化物酶P7基因的ORF片段或含有过氧化物酶P7基因的ORF片段的载体导入水稻中，获得镉胁迫耐受性提高，镉积累降低的转基因水稻，所述的ORF片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的载体由所述的ORF片段克隆进入过表达载体pBWA(V)HS。