CN116162630B

CN116162630B - GhTGA9蛋白及其编码基因在调控植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用

Info

Publication number: CN116162630B
Application number: CN202211080544.4A
Authority: CN
Inventors: 简桂良; 卢美光; 贺浪; 张华崇
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-09-05
Filing date: 2022-09-05
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2042-09-05
Also published as: CN116162630A

Abstract

本发明公开了GhTGA9蛋白及其编码基因在调控植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明验证的棉花GhTGA9基因，该基因为典型的DCD超蛋白家族基因，介导了细胞的程序性死亡，通过基因沉默和超表达分析证实，该基因具有控制棉花或其他农作物抗大丽轮枝菌黄萎病的能力，在功能上证明了GhTGA9基因在陆地棉抗黄萎病性能上起到了重要作用，这对于高产优质感病棉花或其他农作物品种的抗黄萎病性的遗传改良具有重要意义。

Description

GhTGA9蛋白及其编码基因在调控植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及GhTGA9蛋白及其编码基因在调控植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用。

背景技术

棉花是重要的经济作物，在国民经济中占有重要地位，它不仅是纺织、化工、医药和国防工业的重要原料，而且是重要的出口创汇商品。其中，陆地棉(Gossypium.hirsutum)是主要种植种类，占我国棉花面积的99％以上。黄萎病是棉花生产中最重要病害之一。

引起黄萎病发生的病原物是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。病原相关的模式分子引发的免疫反应(Pathogen associated molecular pattern TriggeredImmunity，PTI)在植物抵抗病原物的侵染过程中发挥着重要的作用，植物的识别受体(Pattern Recognition Receptors，PRRs)能识别病原物表面的相关模式分子(PathogenAssociated Molecular Patterns，PAMPs)，促发PTI。富含亮氨酸重复序列受体激酶(LRR-RKS)类的PRRs依赖LRR-RKBAK1的调节来传递信号，BAK1(BRI1-associated receptorkinase1)还与LRR-RKBRI1相互作用，BAK1和BRI1(Brassinosteroidinsen-sitive 1)是类固醇激素油菜素(Brassinosteroid，BR)的主要受体，能够促进BR信号的传递，在植物的免疫机制中，外源病原体侵入的信号能被BAK1接收，经过信号递级传递，BR信号激活磷酸酶PP2A，使BZR1和BES1去磷酸化，与大量基因的启动子结合，从而调节这些基因的表达；BR也是介导植物生长的正调节因子。

BR是植物生活史中广泛的发育和生理过程所必需的激素，在植物生长发育及逆境应答中也发挥重要作用。在过去的大多数报道中，都是研究BRs的生物合成或信号转导相关的基因，与植株矮化、延迟开花，衰老等一系列表型相关。有研究表明，GhTGA7、GhBZR1介导激素代谢途径，BES1/BZR1是BR信号转导途径的唯一转录因子。在病原物侵染植物的过程中，TGA、BR也起着重要的作用，Albrecht等研究发现，BR信号可能通过调控富含亮氨酸重复序列的受体样激酶(LRR-RLK)BAK1下游的免疫信号，在植物生长过程中发挥重要的免疫调节作用，是病原菌侵染过程中潜在的调控位点。生理研究还表明，TGA、BRs促进细胞伸长，增强对环境胁迫的耐受性和对病原体侵染的抵抗力，从而提高作物产量。Lozano-Duran R等对拟南芥的研究发现，BZR1可诱导几种WRKY转录因子(WRKY15、WRKY18、WRKY11)和HBI1的表达，这些转录因子对早期免疫反应具有负面控制作用；此外，BZR1还与WRKY40结合，介导BR与免疫信号之间的拮抗作用，最终BZR1介导的转录改变将导致PTI信号的抑制。可见，TGA、BZR1是BR信号的重要调节因子，可诱导PTI的负调控因子表达，来抑制植物的免疫防线，从而利于病原物的入侵。因此，亟需明确与陆地棉黄萎病相关抗性有关的调节因子，以用于解决黄萎病不时流行对于陆地棉造成的损失。

发明内容

本发明的目的是提供GhTGA9蛋白及其编码基因在调控植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明利用基因沉默(VIGS)和在拟南芥中超表达证实了该基因可以提高抗大丽轮枝菌黄萎病性的能力，这对于遗传改良高产优质感病棉花或其他农作物品种的抗黄萎病性的具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供GhTGA9基因在调控植物抗黄萎病中的应用，所述GhTGA9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的是，所述植物为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)寄主植物。

优选的是，过表达所述植物的所述GhTGA9基因，降低所述植物对大丽轮枝菌黄萎病的抗性；沉默或敲除所述植物的所述GhTGA9基因，提高所述植物对大丽轮枝菌黄萎病的抗性。

本发明还提供上述的GhTGA9基因编码的蛋白在提高或者降低植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用。

优选的是，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的是，所述植物为大丽轮枝菌寄主植物。

本发明还提供一种培育转基因植物的方法，包括将受体植物中核苷酸序列如SEQID NO：1所示的基因沉默或敲除的步骤。

优选的是，所述转基因植物具有使为大丽轮枝菌寄主植物黄萎病发病率和病情指数降低的功能。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一种陆地棉与大丽轮枝菌黄萎病抗性相关基因GhTGA9，通过从棉花叶片中克隆获得与陆地棉抗大丽轮枝菌相关的GhTGA9基因，依据转基因拟南芥抗黄萎病性评价证实，其具有负调控大丽轮枝菌黄萎病抗性的能力。因此，如果将本发明提供的基因，通过基因编辑、或转基因方法使其被剔除或被沉默，可以提高优质高产感病棉花或其他农作物品种的抗大丽轮枝菌黄萎病的遗传改良，这对于获取具有优质丰产高抗大丽轮枝菌黄萎病陆地棉或其他农作物新品种具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中通过VIGS技术沉默感病棉花品种86-1的GhTGA9基因，沉默植株接种大丽轮枝菌V991培养3周后发病情况；其中，A：野生型86-1不接菌；B：沉默GhTGA9的86-1接菌V991；C：野生型86-1接菌V991；D：转化空载体(CLCrV-00)86-1接菌V991；

图2为实施例3中通过超表达GhTGA9基因拟南芥大丽轮枝菌黄萎病抗性检测结果；其中，A：超表达GhTGA9拟南芥接种V991；B：野生型Col-0型拟南芥接种V991；C：转化空载体拟南芥接种V991。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1陆地棉GhTGA9基因的克隆

1.RNA的提取

使用RNAprep Pure植物多酚多糖总RNA提取试剂盒分别提取棉花品种86-1(本实验室自培育的高感黄萎病品种)叶片样品RNA。

2.cDNA的合成

2.1中间片段cDNA的合成

中间片段cDNA的合成使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒反转录cDNA。

2.23’端的cDNA的合成

3’端的cDNA的合成体系如下：

表1

按上述体系混匀，离心后，置PCR仪上42℃60min，70℃15min，反应结束后冰上冷却，置于-20℃保存。

2.35’端的cDNA的合成

5’RACE的cDNA的合成体系如下：

第一步：

表2

混匀，短暂离心后置于冰上。

第二步：

表3

充分混匀后，将这11μL产物放置在PCR仪中，设置反应的程序：72℃3min→42℃2min。结束后，冷却1min后备用。

第三步：

表4

混匀，短暂离心。

第四步：

表5

用移液枪轻轻吸打混匀，短暂离心。置于PCR仪中，设置程序：42℃90min→70℃10min。用适量Tricine-EDTABuffer稀释反应所得cDNA后，-20℃保存。

3.引物设计

RACE引物(见表6)均由primer5.0设计而成，GSP、UPM引物试剂盒自带，设计的引物送往生工合成。

表6 RACE引物

4.GhTGA9全长克隆

4.1目的基因中间片段克隆

根据已知的cDNA片段，设计中间片段引物，按照下述体系混匀进行PCR扩增。

表7

PCR程序：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物。

4.2目的基因3’末端克隆

3’RACE采用巢式PCR法扩增，

3’RACE的第一轮PCR扩增体系：

表8

按上述体系混匀，短暂离心后，进行PCR扩增。

PCR程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，20个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物。之后把第一轮PCR扩增产物稀释50倍，进行第二轮PCR扩增。

3’RACE的第二轮PCR扩增体系：

表9

按上述体系混匀，短暂离心后，进行PCR扩增。

PCR程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物，之后胶回收、连接和转化，挑取阳性克隆送生工测序。

4.3目的基因5’末端克隆

用适量Tricine-EDTA Buffer稀释反应所得5’RACE cDNA后，进行5’RACE的PCR扩增，PCR体系如下：

step1：

表10

轻轻混匀，短暂离心后，置于冰上。

step2：

表11

按照上述程序配好体系后，轻轻混匀，短暂离心，按照以下程序进行PCR的扩增。

PCR程序：

表12

反应结束后，进行凝胶琼脂糖电泳分析，观察条带情况，若出现弥散条带或者无条带，进行以下操作：

(1)本次模板为此前PCR扩增产物50倍稀释产物(Tricine-EDTA buffer)

(2)引物采用UPMS和5’IGhX，各1μL，采用上述中的PCR体系，并设置反应程序为：94℃3s，65℃30s，72℃1min，20个循环；4℃保存。

反应结束后，进行凝胶琼脂糖电泳分析，之后胶回收、连接和转化，挑取阳性克隆送生工测序。

4.4 GhTGA9全长克隆

将中间片段、3’RACE片段和5’RACE片段通过DNAman拼接，设计GhTGA9全长引物qGhTGA9-F、qGhTGA9-R(表6)，进行全长PCR扩增。选取5’合成的cDNA，用Tricine-EDTABuffer稀释5倍作为模板。

反应体系：

表13

PCR程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物，进行胶回收，加A尾，体系如下：

表14

反应条件：72℃30min。

将全长PCR反应液连接到T1 simple载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送生工测序。

经鉴定，基因GhTGA9的cDNA序列全长为1491bp，起始和终止密码子的位置为下图中下划线部位，5’端UTR(非翻译区)348bp，3’端UTR区69bp，开放阅读框(ORF)1074bp，共编码357aa，序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1：

GCCTTTTGTATGACTGTATCTTTTACAAGCCATGGAGATTTACCCTTAGACAGAGTTGTTTGATAGAGTATGAGCTCTCTGTCAGCCGAACTTACGAGAAGGATGGCAATGTATGAGCAATTCCACCAGATAAACAAGTGGGGAGACACCTTCAACGGTGAAGACAGTCCAAAAACGGGATCATCGACAGTTTTACAAGTGGATGTTAGGCTAGAAAACAAGGCCGAATATATATCTTCCGAGAAAACCGAACCTTCCAGAAGTGATCAAGGAACAAATAAGCCAACAGATAAGATACAGAGACGTCTGGCACAAAATCGTGAAGCTGCTCGCAAAAGTCGTCTGCGGAAAAAGGCCTATGTTCAACAATTAGAATCGAGTCGTTTGAAACTAGCTCAATTGGAGCAAGAGCTCGAAAGAGCTAGGCAGCAGGGGTTATACATAAGCAGTGCATCTACTGGTTATTTTGGACTGTCTGCAGCTGCAAATGCTGGTATTACTGCTTTTGAGATGGAATATGGGAACTGGGTTGAAGAGCAAAATAAAAAGATTTGTGAACTTAGAAGTGCTCTCCAAGCACACATTACTGATATAGAGCTCCGCATTCTGGTAGAAAATAGCTTGAACCACTATTGCAATTTGTTCCACATTAAAGCCGATGCTGCAAAGGCAGACGTCTTCTATTTGATCTCAGGCATTTGGAGAACTACAGCCGAGCGTTTTTTCCACTGGATTGGAGGATTCCGTCCATCAGAACTCTTGAACGTTGTCATGTCACAAATTGAGCCTTTGACCGATCAACAACAGTTGGAGGTTTATAACCTTCAACAATCTTCTCAACAAGCTGAAGATGCTCTTTCTCAGGGAATAGATAGACTTCAGCAGAACTTAGCCGAGAGTGTAGCAACAGATTTGAGTTCAGGAAACTACAGAGCTCAACTAGCTGCTGCAATAGATAAATTGCAAGCCCTAGAGGGCTTTGTGAAGCAGGCTGATCACCTTCGCCAGCAGACTTTGCAACAGATGGCTCGAATCTTAACAACCCGTCAAGCAGCTCGAGGTTTACTTGCTTTGGGGGAATACTTCCATCGTTTACGTGCTCTCAGTTCACTTTGGTCTGCACGTCCACGCGAACCTGCCTAAATCTGAAGTGAAGATAGAAACTTAGACTACCATCAATATTATATCTAGGTTGTAGACGCCAGAAGTTTGTTCCTCAACCGGTAAGAAAATGGTCTTTTGCAGGTCTTGTTGTATGAAACATCAATATATATATATAAGCTTATATTCTTCCTGAGCATGAGACATGTAAATATGAATCCTTATTGCTGTGTATCAAGAATAATTTTAGGTCAGCAAAGTTAGATTTTCTTGTTTTGTATTTATATTGTTTGGAAGCCAAAGAATTATACTAGCAAGCTTGTGAGTACCTCATTTTTTACCCTTTTTTTGAATTGGATCAAGAAATTTAGCGTTTTAATAGCGTTTTAA。

GhTGA9基因编码蛋白共357氨基酸；蛋白的分子量为40.49958kDa，等电点为8.40，分子式C₁₇₇₁H₂₈₂₆N₅₂₄O₅₄₉S₈；不稳定指数为58.14，属于不稳定蛋白；总平均亲水性-0.558，属于亲水性蛋白；组成蛋白的20种氨基酸种，异亮氨酸(Leu)所占比例最高(11.5％)，含42个负电荷的氨基酸残基，以及44个带正电荷的氨基酸残基。该蛋白无信号肽，无跨膜螺旋区；CDD预测TGA7蛋白上有典型的bZIP蛋白的DNA结合域与DOG1蛋白结构域。蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：2：

MSSLSAELTRRMAMYEQFHQINKWGDTFNGEDSPKTGSSTVLQVDVRLENKAEYISSEKTEPSRSDQGTNKPTDKIQRRLAQNREAARKSRLRKKAYVQQLESSRLKLAQLEQELERARQQGLYISSASTGYFGLSAAANAGITAFEMEYGNWVEEQNKKICELRSALQAHITDIELRILVENSLNHYCNLFHIKADAAKADVFYLISGIWRTTAERFFHWIGGFRPSELLNVVMSQIEPLTDQQQLEVYNLQQSSQQAEDALSQGIDRLQQNLAESVATDLSSGNYRAQLAAAIDKLQALEGFVKQADHLRQQTLQQMARILTTRQAARGLLALGEYFHRLRALSSLWSARPREPA。

实施例2大丽轮枝菌胁迫下沉默感黄萎病陆地棉品种86-1中GhTGA9基因对黄萎病抗病性影响

1.材料

以野生型感大丽轮枝菌V991黄萎病陆地棉品种86-1和沉默GhTGA9基因的86-1为实验材料。

2.实验分组

对照组：86-1(本实验室自培育的高感黄萎病品种)；

实验组：沉默GhTGA9基因的86-1，转化空载体(CLCrV-00)86-1(方法参考张华崇硕士论文“VIGS技术解析陆地棉抗黄萎病相关基因及GHB2功能初步鉴定”，中国农业科学院研究生院，2016；以及贺浪硕士论文“陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究”，中国农业科学院研究生院，2021)。

3.试验设计和性状测定

种子播种前用浓硫酸脱绒处理后，均挑选饱满大小一致的种子进行后续试验，用70％乙醇浸泡种子5min进行表面灭菌，而后用3％的过氧化氢浸泡种子2h，最后用无菌水冲洗干净。灭菌完的种子点种于花盆中(营养土：蛭石＝2：1)，放置于温度24℃，16h光照，8h黑暗，相对湿度为70％的温室生长，当棉株长出真叶时，移至烧杯中，采用营养栽培法培养棉株。

测定黄萎病抗性的菌系为大丽轮枝菌落叶型强致病力菌系V991。首先，将保存的V991接种于PDA培养基中，在26℃条件下培养一周，将活化的V991于查氏培养基中26℃，200rpm，培养6d；将达到所需浓度的菌液过滤至灭菌的烧杯中，用血球计数板测定孢子悬浮液的浓度，稀释孢子悬浮液的浓度至10⁷个/mL。

在含营养土蛭石培养花盆中生长的野生型和转基因植株根系均能良好生长。在棉花苗生长一月后，用落叶型强致病力病菌V991孢子悬浮液(浓度10⁷个/mL)，采用蘸根法接种病菌，接种5、10、15、21天调查黄萎病发病情况。

4.测定结果

结果表明，沉默GhTGA9基因可以显著提高植株抗病性(见图1)，其发病率和病情指数见表15。野生型86-1接菌V991发病率高达90.3±1.2％，病情指数高达67.5±1.3，转化空载体(CLCrV-00)86-1接菌V991发病率和病情指数均很高，与野生型86-1差异不明显；而把感黄萎病陆地棉品种86-1的GhTGA9基因沉默，黄萎病的发病率仅仅12.5±2.3％，病情指数仅仅8.1±2.2，极显著低于野生型的发病率和病情指数，黄萎病抗病性达到高抗水平，高感黄萎病品种变成为高抗品种。表中大写字母代表1％水平的显著差异。

表15

实施例3超表达GhTGA9基因拟南芥大丽轮枝菌黄萎病抗性检测

1.材料

以转GhTGA9基因的第二代拟南芥和野生型拟南芥为实验材料。

2.栽培基质

培养基：1/2MS培养基；1/2MS+50mg/L卡那霉素培养基

栽培基质：蛭石+1/4MS营养液

3.试验设计和抗病性测定

野生型拟南芥在1/2MS培养基中培养，转基因拟南芥在1/2MS+50mg/L卡那霉素培养基中培养，待幼苗长到2-3片真叶后移栽至营养钵，移栽7天后进行大丽轮枝菌胁迫处理；超表达植株采用蘸根法接种黄萎病菌V991。

共设置3个处理条件：1)对照(CK)：野生型Col-0型拟南芥和转化空载体拟南芥分别接种V991后，分别作为阳性和阴性对照；2)超表达GhTGA9植株。采用灌根法接种大丽轮枝菌V991(孢子悬浮液的浓度10⁵个/mL)。接菌15天后进行拍照观察(见图2)、发病率测定。

4.测定结果

野生型Col-0型拟南芥和转化空载体分别接种V991后，发病率和病情指数差异不明显，但超表达GhTGA9植株黄萎病发病率和病情指数极显著高于野生型Col-0型拟南芥和转化空载体(见表16)。

大丽轮枝菌胁迫下，超表达GhTGA9的植株发病率和病情指数极显著高于野生型。这意味着GhTGA9基因在植株响应大丽轮枝菌侵扰中起到了重要负调控作用。结果表明，GhTGA9基因具有控制植物抗黄萎病的能力，在功能上证明了GhTGA9基因在陆地棉抗黄萎病性能上起到重要作用。

表16

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.GhTGA9基因在调控植物抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述GhTGA9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述植物为陆地棉；

沉默或敲除所述植物的所述GhTGA9基因，提高所述植物对大丽轮枝菌黄萎病的抗性。

2.如权利要求1所述的GhTGA9基因编码的蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用，所述植物为陆地棉。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种培育转基因植物的方法，包括将受体植物中核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因沉默或敲除的步骤，所述植物为陆地棉。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转基因植物具有使大丽轮枝菌黄萎病发病率和病情指数降低的功能。