CN105481960B - 水稻水通道蛋白OsPIP1；1及其基因的新应用 - Google Patents

水稻水通道蛋白OsPIP1；1及其基因的新应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了水稻水通道蛋白OsPIP1；1基因，其cDNA全长序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及其用于构建水稻转基因RNAi的核苷酸片段如SEQ ID NO.3所示的核苷酸在水稻中降低重金属镉积累的应用。本发明公开OsPIP1；1基因的表达与酿酒酵母和水稻对重金属镉的积累相关。通过构建OsPIP1；1基因的酿酒酵母转基因超表达载体，将OsPIP1；1基因在酵母中超表达，可以降低酵母中的镉含量，促进酵母体内镉的外排。通过将OsPIP1；1基因在水稻中RNAi，降低转基因水稻株系中OsPIP1；1基因的表达量，可以影响转基因水稻种子中镉含量，得到低镉富集的转基因水稻品系。该基因可应用于工程菌及水稻针对体内镉含量改变的遗传工程育种，也可应用于其他植物的针对体内镉富集的遗传工程育种。

Description

水稻水通道蛋白OsPIP1；1及其基因的新应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及水稻水通道蛋白OsPIP1；1(Oryzasativa Plasma membrane Intrinsic Protein 1；1)及其编码基因和在调控水稻和酵母镉积累方面的应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物，也是重金属镉(Cd)富集农作物之一。近年来，我国土壤污染状况十分严重，其中以土壤镉污染最为突出。土壤中的镉被农作物吸收，并通过食物链富集于人体的肾脏、肝脏等器官造成毒害，并引起人体内骨质钙流失，严重危害人体健康。
水稻是一种重金属镉富集的农作物。2014年4月，国土资源部和环境保护部公布数据表明，我国土地的重金属污染十分严重，按照点位超标率计算，我国土壤中镉超标的土地已达我国国土总面积的7％。按照污染发生的地区来看，重金属污染则主要分布于我国的华中华南地区、泛珠三角地区、长三角地区及东北地区，这些地区均为我国水稻的主要产区，严重影响我国的水稻粮食安全。近年来，由媒体报道的稻米镉超标事件层出不穷，引起了民众巨大的恐慌。克隆和分离水稻体内的镉胁迫应答和解毒基因，具有重要的意义和潜在的应用价值。OsPIP1；1是水稻中的水通道蛋白之一。水通道蛋白首次在人类红细胞中得以鉴定，主要介导水分子的跨膜转运，该项发现于2003年获得了诺贝尔化学奖。植物水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是位于细胞质膜和内膜上的水分子通道蛋白(water channel protein)，同时也可跨膜运输甘油、尿素、CO2、氨气、H2O2等小分子和硅、砷、硼、硒、锑等类金属。植物水通道蛋白参与应答包括盐胁迫、干旱和冷胁迫等多种非生物胁迫，这类胁迫应答主要与维持细胞内水平衡相关；近期的研究发现，部分植物水通道蛋白成员在类金属的跨膜转运和维持细胞内类金属内稳态方面发挥重要作用。
在本发明中，我们描述了水稻水通道蛋白OsPIP1；1基因的表达能够影响重金属镉在生物体内的积累，提供了将该基因应用于重要粮食作物——水稻的低镉遗传育种技术，本发明也可应用于工程菌——酿酒酵母的低镉遗传改造。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种水稻水通道蛋白OsPIP1；1及其编码基因OsPIP1；1的新应用。
实现上述目的的技术方案如下。
氨基酸序列如SEQ ID NO.2的水稻水通道蛋白OsPIP1；1和/或OsPIP1；1基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，所述OsPIP1；1基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ IDNO.2的核苷酸序列。
本发明的水稻胰蛋白酶抑制剂OsPIP1；1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因OsPIP1；1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
本发明的另一的是提供一种RNAi片段的表达载体，该表达载体克隆有上述针对水稻水通道蛋白基因OsPIP1；1的RNAi片段。使用该RNAi载体在水稻体内转基因，可用于培育水稻低镉品种。
实现该目的的技术方案如下。
插入有核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段的RNAi表达载体。
优选地，所述表达载体为pTCK303。
本发明的另一目的是提供上述RNAi表达载体的制备方法。
实现该目的的技术方案如下。
RNAi表达载体的制备方法，包括有以下步骤：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段连接于pGEM T-Vector上形成pGEMT-PIPRI；
(2)用SacI和SpeI双酶切pGEM T-PIPRI，回收得到片段F1，同时用SacI和SpeI双酶切载体pTCK303，将回收后的F1片段与经SacI和SpeI双酶切处理后的pTCK303载体连接，形成pTCK303-PIPRI-F1；
(3)用BamHI和KpnI双酶切pGEM T-PIPRI并回收得到片段F2，然后将片段F2与BamHI和KpnI双酶切处理后pTCK303-PIPRI-F1载体连接，即得。
优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段，通过以下方法得到：以水稻基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物，进行扩增，回收扩增产物。
本发明的另一目的是提供上述RNAi表达载体的应用。
实现上述目的的技术方案如下。
上述RNAi表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。其可用于培育水稻低镉品种。
本发明的另一目的是提供一种降低水稻中重金属镉积累的生物制剂。
实现上述目的的技术方案如下。
一种降低水稻中重金属镉积累的生物制剂，其活性成份为上述的RNAi表达载体，或含有OsPIP1；1基因。
上述的OsPIP1；1基因、水稻超表达载体和/或RNAi表达载体，可以制备成生物制剂，用于降低水稻中重金属镉积累，用于水稻的低镉遗传育种。
本发明的另一目的是提供一种降低水稻中重金属镉积累的方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种降低水稻中重金属镉积累的方法，该方法步骤中包括调控OsPIP1；1基因的表达，所述OsPIP1；1基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
本发明的有益效果如下：
在本发明中，我们通过对筛选文库获得的OsPIP1；1(Oryza sativa Plasmamembrane Intrinsic Protein 1；1)基因的进一步研究，发现该基因具有以下应用：(1)该基因在酿酒酵母中的超量表达能够降低酵母细胞对重金属镉的积累，促进酵母体内镉的外排；(2)通过将OsPIP1；1基因在水稻中RNAi，降低转基因水稻株系中OsPIP1；1基因的表达量，可以影响转基因水稻种子中镉含量，得到低镉富集的转基因水稻品系。该基因可应用于工程菌及水稻针对体内镉含量改变的遗传工程育种，也可应用于其他植物的针对体内镉富集的遗传工程育种。
附图说明
图1示构建完成的酿酒酵母重组表达载体OsPIP1；1-pYES2示意图。
图2示转化OsPIP1；1-pYES2的转基因酵母在含镉培养基中生长后镉积累降低。
图3示构建完成的水稻转基因RNA干涉载体OsPIP1；1-pTCK303示意图。
图4示水稻OsPIP1；1转基因RNAi植株的qRT-PCR检测。
图5示野生型水稻种子和OsPIP1；1转基因RNAi水稻种子中镉含量的比较。
具体实施方式
本发明主要阐述OsPIP1；1基因在调控镉积累生物工程方面的应用。本发明以水稻日本晴品种幼苗叶片为材料提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，设计引物PIPF：5’-ATGGAGGGGAAGGAGGAGGAC-3’和PIPR：5’-TTAAGACCTGCTCTTGAATGG-3’，并采用高保真的Taq酶扩增OsPIP1；1基因的cDNA阅读框全长，回收得到的片段连接于pGEM T-vector，形成OsPIP1；1-pGEM T重组质粒，并测序。OsPIP1；1基因在水稻基因组数据库(MSU RiceGenome Annotation Project Database and Resource,http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中的编号为LOC_Os02g44630，命名为OsPIP1；1(Oryza sativa Plasma membrane Intrinsic Protein 1；1)。该基因编码一个包含870个核苷酸的开放阅读框，其序列如SEQ ID NO.1所示。其编码蛋白具有289个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，通过构建酵母转基因超表达载体OsPIP1；1-pYES2，并将该载体转化酿酒酵母，通过该基因在酵母体内的诱导表达，可以降低酵母对重金属镉的积累。用于构建酵母表达载体的引物为OsPIP1；1YEF：5’-TACCGAGCTCGGATCCATGGAGGGGAAGGAGGAGGAC-3’和OsPIP1；1YER：5’-TAGATGCATGCTCGAGTTAAGACCTGCTCTTGAATGG-3’。通过该对引物以重组质粒OsPIP1；1-pGEM T为模板，采用高保真Taq酶PCR扩增OsPIP1；1基因的cDNA阅读框片段，回收的DNA片段插入酵母表达载体pYES2的BamHI和XhoI酶切位点之间。经测序验证正确后，即形成OsPIP1；1基因在酵母中的转基因诱导超表达载体OsPIP1；1-p YES2(如图1所示)。将该重组载体OsPIP1；1-pYES2采用醋酸锂的方法转化进入酿酒酵母中，采用诱导的极限培养基(添加半乳糖)培养酵母转化子克隆，以转化pYES2空载体的酵母菌株为对照，30℃培养酵母至OD600为1.5-2，然后在培养基中添加10μM和30μM的CdCl2，重新培养24小时，离心收获酵母细胞，用双蒸水清洗3遍，65℃干燥3-5天，干燥的酵母块将微波消解后，采用火焰法原子吸收光谱测定酵母细胞中镉的积累。
本发明还描述了将OsPIP1；1基因用于水稻的低镉转基因育种。水稻是一种淹水地栽培的农作物，对水分的需求极其旺盛，而水通道蛋白主要负责对水的吸收和转运，因此水稻体内的水通道基因对水稻的正常生长及其重要。在本发明中，我们首次将水稻的水通道蛋白基因和水稻对重金属镉的积累联系起来，通过RNAi技术下调OsPIP1；1基因在水稻中的表达，可以获得稻米中低富集镉的水稻转基因品系。
本发明中，用于构建水稻转基因RNA干涉载体为pTCK303，该载体来源于pCAMBIA1301。以重组质粒OsPIP1；1-pGEM T为模板进行PCR扩增。设计引物为OsPIP1；1RIF:5’-GGGGTACCACTAGTCCGGCATCTCCGGAGGACAC-3’和OsPIP1；1RIR:5’-CGGGATCCGAGCTCTTAAGACCTGCTCTTGAATGG-3’，扩增获得OsPIP1；1的cDNA的靠近3’端的545bp片段。将该片段连接于pGEM T-Vector上，经限制性酶切处理，分别正反向连接于表达载体pTCK303的酶切位点Sac Ⅰ与Spe Ⅰ之间，和酶切位点Kpn Ⅰ与BamH Ⅰ之间，由此而构建干涉载体OsPIP1；1-pTCK303。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干涉载体导入正常粳稻品种中花11。经RT-PCR鉴定OsPIP1；1基因的转录受到抑制之后植株为阳性植株，将其播种于大田，获得纯合株系。将野生型水稻和OsPIP1；1转基因RNAi的水稻经一定浓度的重金属胁迫处理，完成一个生长周期之后，采用原子吸收光谱的方法测量水稻种子和其他组织中的重金属镉含量。结果发现，OsPIP1；1转基因RNAi水稻种子中的重金属镉含量明显低于野生型对照的种子，表明对OsPIP1；1基因的表达调控能够降低水稻种子对重金属镉的富集量，从而证实本发明的OsPIP1；1基因是影响水稻镉积累的关键基因，可以调控水稻植株对镉的吸收和转运，该基因的表达能够调控水稻对重金属镉的积累方式。
SEQ ID NO.1
cDNA的核苷酸序列
>OsPIP1；1
ATGGAGGGGAAGGAGGAGGACGTGCGGCTGGGGGCGAACAGGTACTCGGAGAGGCAGCCGATAGGGACGGCGGCGCAGGGCGCCGGGGACGACAAGGACTACAAGGAGCCGCCGCCGGCGCCGCTGTTCGAGCCAGGGGAGCTCAAGTCGTGGTCTTTCTACCGGGCCGGGATCGCCGAGTTCGTCGCCACCTTCCTCTTCCTCTACATCACCATCCTCACCGTCATGGGGGTCTCCAAGTCCTCCTCCAAGTGCGCCACCGTCGGCATCCAGGGCATCGCCTGGTCCTTCGGAGGCATGATCTTCGCGCTCGTCTACTGCACCGCCGGCATCTCCGGAGGACACATCAACCCAGCAGTTACTTTTGGGCTGTTCTTGGCCAGGAAGCTGTCCCTGACCCGGGCCATCTTCTACATAGTGATGCAATGCCTAGGGGCCATCTGCGGAGCTGGAGTTGTGAAGGGCTTCCAGCAGGGTCTGTACATGGGCAATGGCGGTGGTGCCAATGTAGTTGCCAGTGGCTACACCAAGGGTGACGGTCTTGGTGCTGAGATTGTTGGCACCTTCATCCTGGTCTACACCGTCTTCTCAGCCACTGATGCCAAGAGGAATGCCAGGGACTCACATGTTCCTATCCTTGCCCCACTGCCAATTGGTTTTGCGGTGTTCCTGGTCCACCTGGCCACCATCCCCATCACCGGTACTGGCATCAACCCAGCCAGGAGCCTTGGCGCTGCCATCATCTACAACAAGGACCATGCCTGGAATGACCATTGGATCTTCTGGGTTGGTCCCTTCGTTGGCGCTGCCCTGGCTGCCATCTACCACCAGGTGATCATCAGGGCGATCCCATTCAAGAGCAGGTCTTAA
SEQ ID NO.2
氨基酸序列
>OsPIP1；1protein
MEGKEEDVRLGANRYSERRPIGTAAQGAGDDKDYKEPPPAPLFEPGELKSWSFYRAGIAEFVATFLFLYITILTVMGVSKSSSKCATVGIQGIAWSFGGMIFALVYCTAGISGGHINPAVTFGLFLARKLSLTRAIFYIVMQCLGAICGAGVVKGFQQGLYMGNGGGANVVASGYTKGDGLGAEIVGTFILVYTVFSATDAKRNARDSHVPILAPLPIGFAVFLVHLATIPITGTGINPARSLGAAIIYNKDHAWNDHWIFWVGPFVGAALAAIYHQVIIRAIPFKSRS
SEQ ID NO3
OsPIP1；1的RNAi核苷酸片段
CCGGCATCTCCGGAGGACACATCAACCCAGCAGTTACTTTTGGGCTGTTCTTGGCCAGGAAGCTGTCCCTGACCCGGGCCATCTTCTACATAGTGATGCAATGCCTAGGGGCCATCTGCGGAGCTGGAGTTGTGAAGGGCTTCCAGCAGGGTCTGTACATGGGCAATGGCGGTGGTGCCAATGTAGTTGCCAGTGGCTACACCAAGGGTGACGGTCTTGGTGCTGAGATTGTTGGCACCTTCATCCTGGTCTACACCGTCTTCTCAGCCACTGATGCCAAGAGGAATGCCAGGGACTCACATGTTCCTATCCTTGCCCCACTGCCAATTGGTTTTGCGGTGTTCCTGGTCCACCTGGCCACCATCCCCATCACCGGTACTGGCATCAACCCAGCCAGGAGCCTTGGCGCTGCCATCATCTACAACAAGGACCATGCCTGGAATGACCATTGGATCTTCTGGGTTGGTCCCTTCGTTGGCGCTGCCCTGGCTGCCATCTACCACCAGGTGATCATCAGGGCGATCCCATTCAAGAGCAGGTCTTAA
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例2：OsPIP1；1基因在酿酒酵母中的表达降低酵母体内镉的积累
按照常规方法，构建酿酒酵母重组表达载体OsPIP1；1-pYES2，如图1所示。
培养酿酒酵母菌株WT和Δycf1(购自欧洲酵母研究中心Euroscarf,http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/,菌株编号分别为Y00000和Y04069)，用pYES2质粒和重组的OsPIP1；1-pYES2对上述两种酵母菌株进行转化。由于OsPIP1；1基因是置于酵母半乳糖诱导的启动子PGAL1调控之下(见图1所示)，将OsPIP1；1-pYES2转化酿酒酵母并置于添加半乳糖的生长选择合成培养基(Selective Growth Synthetic Medium,SDmedium)上生长，即可诱导OsPIP1；1在酵母中异源超量表达。
酵母转化采用的方法为醋酸锂转化法，具体步骤如下：
1)接种待转化的酵母菌株WT和Δycf1的单菌落于5mL YPD液体培养基中，于30℃恒温摇床(200rpm)，培养过夜达到饱和。
2)按照1:100比例转移上述培养物到20mL YPD液体培养基中于30℃恒温摇床(200rpm)继续培养，摇3-5h至菌液OD600值达0.4-0.6.
3)培养液在室温条件下4000g离心5min，收集细胞。细胞用10mL无菌超纯水重悬，再于室温下5000-6000g离心5min，沉淀细胞。
4)细胞用2mL锂盐溶液重悬，锂盐溶液按照下表配制(现配现用)：
5)将2μL待转化质粒和10μL变性鲑鱼精一起加入1.5mL离心管中混匀。
6)往每个离心管中加入200μL用锂盐溶液重悬的细胞悬液，再加入1mL新鲜配制的PEG溶液。PEG溶液的配方为：
15
30℃摇荡温育30min。
7)于42℃热激15min，室温下离心5s，细胞沉淀用200μL-1mL 1×TE缓冲液(从10×储液新鲜配制)重悬，并取其中200μL涂布在添加了半乳糖的SD固体培养基平板上。30℃培养2-5天，直到出现转化子。
在超净台中用无菌牙签挑取四种酵母转化子(两种酵母菌株WT和Δycf1分别转化pYES2和OsPIP1；1-pYES2)到2mL添加了半乳糖的生长选择合成培养基(Selective GrowthSynthetic Medium,SD medium)液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达2。之后将两种酵母按照1：500的体积比接种于600ml添加了半乳糖的SD液体培养基中，30℃摇床(200-250rpm)培养12-24小时至OD600值达2，之后分别添加CdCl2至终浓度10μM和30μM。继续培养12小时后离心收集菌体。采用双蒸水清洗菌体3遍后，将菌体65℃干燥3-5天，干燥的酵母块进行微波消解后，采用火焰法原子吸收光谱测定酵母细胞中镉的积累。
在本发明中，在所检测的两种酵母菌株WT和Δycf1中，转化OsPIP1；1-pYES2的酵母菌株无论是在添加有10μM和30μM的CdCl2的培养基中，体内积累的镉均显著低于转化pYES2空载体的酵母菌株(见图2所示)，这表明OsPIP1；1基因在酵母体内的表达降低了酵母细胞对重金属镉的富集，促进了酵母体内镉的外排。
实施例2：OsPIP1；1基因的转基因RNAi载体的构建及水稻遗传转化
以实施例1中重组质粒OsPIP1；1-pGEM T为模板，采用引物OsPIP1；1RIF:5’-GGGGTACCACTAGTCCGGCATCTCCGGAGGACAC-3’和OsPIP1；1RIR:5’-CGGGATCCGAGCTCTTAAGACCTGCTCTTGAATGG-3’(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)扩增用于构建转基因RNAi载体OsPIP1；1的cDNA片段。本发明所用的转基因RNAi载体是pTCK303[Wang Z,Chen C,Xu Y,Jiang R,HanY,Xu Z,Chong K(2004).APractical Vector for Efficient Knockdown of GeneExpression in Rice(Oryza sativa L.).Plant Molecualr Biology Reporter 22:409-417]。
构建RNAi载体OsPIP1；1-pTCK303则采用限制性内切酶酶切及连接的方式，该载体的构建步骤如下：(1)水稻基因组DNA为模板，采用引物对OsPIP1；1RIF和OsPIP1；1RIR，PCR扩增用于构建RNAi载体的OsPIP1；1基因片段，片段为545bp，采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段；(2)将该片段连接于pGEM T-Vector上形成pGEM T-PIPRI，经测序分析正确后，序列为SEQ ID NO.3所示；(3)用SacI和SpeI双酶切pGEM T-PIPRI，回收545bp片段F1，同时用SacI和SpeI双酶切载体pTCK303，将回收后的F1片段与经SacI和SpeI双酶切处理后的pTCK303载体连接，形成pTCK303-PIPRI-F1，经测序正确后，用BamHI和KpnI双酶切处理pTCK303-PIPRI-F1载体；(4)同时用BamHI和KpnI双酶切pGEM T-PIPRI并回收545bp片段F2，然后将F2片段与BamHI和KpnI双酶切处理pTCK303-PIPRI-F1载体连接，经测序鉴定正确后，形成OsPIP1；1-pTCK303转基因RNAi载体。该转基因RNAi载体OsPIP1；1-pTCK303如图3所示。该转基因干涉载体是将如SEQ ID NO.3所示的序列，分别正反向插入表达载体pTCK303的酶切位点SacI与SpeI之间，和酶切位点KpnI与BamHI之间，在宿主细胞中，该转基因干涉载体在Maize Ubil pro启动子的启动下，正、反向插入序列转录，并互补形成dsRNA，而对OsPIP1；1基因进行干扰。
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation ofrice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)将转基因RNAi载体OsPIP1；1-pTCK303导入正常粳稻中花11水稻品种，通过GUS染色检测，染色为蓝色的则为转基因阳性植株。在本发明中，我们采用qRT-PCR检测了3株转基因RNAi株系，经田间播种后，获得纯合株系。
在本发明中，qRT-PCR主要为了检测转基因水稻株系中OsPIP1；1的表达变化。主要实施步骤如下：1)待到水稻开花期分别收集成熟叶片，RNA的提取依照Magen公司HiPurePlant RNA Kits(R4151)的说明书进行；2)cDNA链的合成依照全式金公司TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书进行；3)通过网站QuantPrime(http://www.quantprime.de/)在线设计qRT-PCR引物。水稻内参基因OsUBQ5引物为OsUBQ5F:5’-CGCCGTGCTCCAGTTCTA-3’和OsUBQ5R:5’-CGATTTCCTCCTCCTTCCTT-3(SEQID NO.6和SEQ ID NO.7)。OsPIP1；1的引物为PIPqRTF：5’-GCCAGGGACTCACATGTTCCTATC-3’和PIPqRTR：5’-ATGGTCCTTGTTGTAGATGATGGC-3’(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9)。4)参考BIO-RAD公司iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix的说明书配制qRT-PCR反应体系，采用两步法进行PCR检测。所有检测均采用两个生物学样本重复，每个生物学样本进行三次重复检测反应。引物第一次使用时添加程序Stage3检测溶解曲线，确认引物的特异性。qRT-PCR检测转基因水稻株系中OsPIP1；1的表达情况如图4所示。在3个OsPIP1；1转基因RNAi株系(OsPIP1；1RI1,OsPIP1；1RI2,OsPIP1；1RI3)中，与对照(野生型WT水稻)相比，OsPIP1；1的表达量被大大降低了，表明OsPIP1；1转基因RNAi效果很好。
实施例3：采用原子吸收光谱法测定转基因水稻种子中的重金属镉含量
将上述水稻野生型对照和纯合株系的种子播种到直径9cm培养皿中37℃萌发，7d后将幼苗分别移至营养液(对照)和附加0.01mM的Cd的营养液中栽培生长。营养液组成为：母液1：91.4g NH4NO3，32.4g MgSO4·7H2O，加水定容至1L；母液2：88.6g CaCl2，加水定容至1L；母液3：40.3g NaH2PO4，71.4g K2SO4，加水定容至1L；母液4：0.943g H3BO4，1.5g MnCl2·4H2O，0.074g(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.031g CuSO4·5H2O，0.035g ZnSO4·7H2O，加水定容至1L；母液5：6.9g FeSO4·7H2O，9.3g Na2EDTA·2H2O，加水定容至0.5L。使用时，每4L营养液加1-5号母液各5mL，余量为水。为使水稻生长健壮，可另加偏硅酸钠50-100ppm，调节pH至5-5.1。待水稻生长至完熟期后，将水稻从营养液中移出，用流水洗净根部营养液后再用蒸馏水冲洗两次。水稻根、茎叶和种子分别收获，115℃高温杀青15min，65℃烘箱中烘至恒重。万能粉碎机将种子磨碎，储存。称取约0.3g水稻种子材料于玻璃瓶中，HNO3:H2O2＝4:1(体积比)的溶液浸泡过夜，密封玻璃瓶，80℃水浴加热至消解液澄清，打开玻璃瓶盖，100℃挥酸，再用原子吸收分光光度计(型号：GBC932AA)测定不同样本中重金属Cd离子的含量。以野生型水稻作为对照。
结果如图5显示，从图5中可以看出OsPIP1；1基因的3个转基因RNAi株系(OsPIP1；1RI1,OsPIP1；1RI2,OsPIP1；1RI3)中种子的Cd含量均低于水稻野生型植株，由此表明，本发明的OsPIP1；1基因是调控稻米镉含量的关键基因，伴随基因OsPIP1；1表达量的下降，水稻种子对重金属镉的富集量也有降低。该基因可应用于水稻的低镉遗传育种，也可应用于其他植物中针对体内重金属镉含量的基因工程育种。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2的水稻水通道蛋白OsPIP1；1和/或OsPIP1；1基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，所述OsPIP1；1基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
2.插入有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段的RNAi表达载体。
3.根据权利要求2所述的RNAi表达载体，其特征是，所述表达载体为pTCK303。
4.权利要求2所述的RNAi表达载体的制备方法，其特征是，包括有以下步骤：
(1)将如SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段连接于pGEM T-Vector上形成pGEM T-PIPRI；
(2)用SacI和SpeI双酶切pGEM T-PIPRI，回收得到片段F1，同时用SacI和SpeI双酶切载体pTCK303，将回收后的F1片段与经SacI和SpeI双酶切处理后的pTCK303载体连接，形成pTCK303-PIPRI-F1；
(3)用BamHI和KpnI双酶切pGEM T-PIPRI并回收得到片段F2，然后将片段F2与BamHI和KpnI双酶切处理后pTCK303-PIPRI-F1载体连接，即得。
5.根据权利要求4所述的RNAi表达载体的制备方法，其特征是，所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段是通过以下方法制备得到：以水稻基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.4和SEQID NO.5为引物，进行扩增，回收扩增产物，即得。
6.权利要求2所述的RNAi表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。
7.一种降低水稻中重金属镉积累的生物制剂，其特征是，其活性成份包括有权利要求2所述的RNAi表达载体，或活性成份包括有氨基酸序列如SEQ ID NO.2的水稻水通道蛋白OsPIP1；1和/或OsPIP1；1基因，所述OsPIP1；1基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
8.一种降低水稻中重金属镉积累的方法，其特征是，该方法步骤中包括调控OsPIP1；1基因的表达，所述OsPIP1；1基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ IDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
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