CN101838655A - 一个新的棉花基因psp231及其启动子 - Google Patents

Abstract

从棉花中分离鉴定了一个新的花粉特异表达的基因PSP231，其cDNA包含1656bp的开放阅读框架，编码一个新的含有551氨基酸的功能未知蛋白。PSP231基因只在棉花雄性生殖细胞中表达，在营养细胞中不表达。GUS活性分析也证明PSP231启动子具有花粉特异性表达活性。该基因启动子在其起始密码子前236位处含有一个细胞分裂素KT应答因子ARR1结合位点，且KT处理后基因表达量显著上升，表明PSP231可能受到ARR1的调控，并在细胞分裂过程中起着一定的作用。利用RNAi干扰技术，抑制该基因表达会导致花粉败育。相反，在酵母中过量表达PSP231基因能够促进细胞的分裂，显著增加细胞分裂指数。上述资料表明PSP231可能在棉花小孢子进行有丝分裂，形成成熟花粉的过程中起着非常重要的作用。

Description

一个新的棉花基因PSP231及其启动子

技术领域

本发明涉及棉花基因。具体是一个新的花粉特异表达的基因PSP231及其启动子的克隆与功能鉴定。该基因涉及到细胞分裂的调控，在棉花花粉发育过程中起着非常重要的作用。

背景技术

长期以来，棉花是我国重要的经济作物，棉花生产不仅与我国农民的收入直接相关，还关系到纺织工业的健康发展和约2000万纺织工人的就业。随着工业发展和人民生活水平的提高，人们对高质量纺织品的需求量逐步增大。因此，纺织及相关行业在对棉花的需求量增加的同时，对棉纤维品质也有了更高的要求。目前我国原棉年产量基本能够满足纺织工业的需要，但纺高档纱的原棉仍然十分缺乏。另外，在我国，棉花种植过程中农药和化肥使用量偏高，既增加了生产成本，造成了环境污染，也给棉花产品的质量安全带来了隐患。因此，培育高产、抗虫、优质的棉花品种对于促进农业和纺织工业及相关产业的可持续性发展有着重要的作用。

杂种优势是生物界的普遍现象，利用杂种互补效应实现多种优良性状相互组合，是改良作物的重要途径之一。随着棉花高产、优质、抗逆、抗虫等多目标育种的难度增加，利用杂种互补现象进行杂交育种已经成为棉花育种的一个重要发展方向。因为棉花花期长，尚未找到在大田制种中比较有效的化学杀雄剂，所以目前我国生产上大面积推广的杂交种，仍然以人工去雄授粉为主。该方法用工多，制种成本高，在很大程度上限制了棉花杂种优势的利用。因此，通过遗传工程抑制雄性发育相关基因的表达来培育棉花雄性不育系，则可以实现高效率、低投入的棉花杂交育种。而此工作的开展则依赖于棉花雄性生殖发育相关基因及其调控元件的识别与分离。通过克隆棉花花药发育的关键功能基因和核心调控元件，分析基因的表达调控及表达产物的生物学功能，阐明花药发育的分子机制，为培育棉花雄性不育系提供理论依据和基因元件。在利用遗传工程创造新的雄性不育系时，特异性启动子也是重要的功能元件，它决定着基因表达的时间、地点和强度。在培育雄性不育系中，一般选择花药特异性启动子控制目的基因表达，这样可以使外源基因在花药中充分表达，同时还可避免目的基因对其他组织生长发育的干扰。因此，高特异性、高活性的启动子和功能基因的克隆与鉴定是棉花分子育种的重要研究内容。

植物的花粉发育是一个复杂而高度程序化的过程，其中受到很多基因的调控。在过去的十多年里，发现了大量的花药或花粉特异表达基因，它们通过不同的途径在花粉发育过程中发挥作用。其中有些基因影响花药中生殖细胞和营养细胞的分化；有的控制绒粘层和胼胝体的退化、降解；有的控制花药的开裂和花丝的伸长；有的调控花粉母细胞的减数分裂和小孢子的两次有丝分裂；还有的影响花粉内外壁的形成和花粉的成熟。这些资料证明植物花药与花粉相关基因及其调控元件(即启动子)在控制花药与花粉发育上具有决定性作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一个新的棉花花粉特异的基因PSP231及其启动子，分析揭示基因和启动子表达活性与功能，探索其对花药发育调控的分子机制，进而应用该基因元件创造棉花雄性不育系。

在本研究中，申请人从棉花花药cDNA文库中分离获得1个花粉特异性基因PSP231。PSP231 cDNA包含1656bp的开放阅读框架，编码一个551氨基酸的新蛋白。PSP231蛋白分子量为61.74KD，等电点(pI)为8.99，蛋白序列比对分析结果显示该蛋白是一类新的花粉特异性蛋白，含有两个铜离子结合结构域，可能属于抗坏血酸氧化酶家族的同系物。利用RT-PCR技术，验证了该基因的表达谱，表明该基因在棉花花药中特异表达，而在其他组织中未检测到该基因的mRNA(见图1)。进一步研究表明，该基因在棉花花药发育中期，花蕾发育约15天开始表达，并且随着花药发育成熟，该基因的表达量逐步升高，在开花当天表达量达到最高(见图2)。RNA组织原位杂交实验显示，该基因仅在花药发育中后期的雄配子体细胞中表达，在孢子体细胞中不表达(见图3)。

为获取PSP231基因的基因组DNA全长序列，申请人在其开放阅读框(ORF)两端设计一对引物，以棉花基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得该基因的DNA全长序列，与其cDNA序列比较分析发现该基因含有两个内含子，长度分别为96和82bp，第一个内含子插入在第83密码子内，第二个内含子插入在第452密码子内(见图4)。

为进一步研究PSP231基因的组织特异性表达调控，申请人用基因组步移法分离了该基因的启动子。首先，采用基因组步移试剂盒(Genome Walker Universal Kit，BD BiosciencesClontech，Cat.No.638904)建立棉花基因组步移文库，然后按照GhPSP231基因序列设计CP1和CP2引物，PCR扩增该棉花基因组步移文库，分离获得了PSP231基因的5’-上游序列(包括启动子片段和5’未翻译区)，该序列长度为1253bp。然后构建了PSP231启动子与GUS报告基因的融合表达载体，利用农杆菌介导的DNA转移技术将其导入拟南芥和烟草，获得转基因植株。组织化学染色分析表明，PSP231的启动子驱动GUS基因在转基因拟南芥和烟草植株的花粉中特异表达(图5)。为更进一步分析PSP231启动子的花药特异表达调控元件，我们对该启动子进行了缺失分析。以200bp为一个单位，从该启动子的5’端开始依次缺失，分别构建了5个不同启动子片段序列与GUS报告基因的融合表达载体，然后将这些含不同启动子片段的载体转入烟草，对转基因植株的花粉进行组织化学染色分析。结果显示，包含该启动子400bp片段(基因5’上游-1至-400bp)即具有花粉特异性表达活性，而只包含该基因5’上游200bp的启动子片段不具有启动子活性(图6)。这说明该基因5’上游-200至-400bp之间存在控制花药特异表达的启动子顺式元件，可以作为基因工程培育棉花雄性不育系的基因调控元件。另外，利用PlantCARE程序(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析这一段启动子序列中的顺式作用元件时发现，该启动子含有一个细胞分裂素KT应答因子ARR1的结合位点。而且，在经过KT处理后，花药中该基因表达量显著上调。说明该基因可能参与细胞分裂，并受ARR1的调控。

为进一步检测该基因是否能够引起细胞分裂，申请人利用了单细胞的裂殖酵母系统。构建了PSP231的酵母诱导型过量表达载体，转化酵母，获得表达PSP231基因的酵母转化细胞系。对其中5个酵母转化细胞系进行检测分析，统计诱导表达的细胞系中细胞分裂指数，以转化空质粒的酵母细胞系作为对照。结果表明，过量表达PSP231基因的酵母中处于分裂的细胞占总细胞的百分数远远高于对照组。这些结果说明PSP231蛋白参与细胞周期，对细胞分裂起促进作用(见图7，图8，表1)。为进一步研究PSP231基因在棉花花药发育中的功能，申请人应用了RNA干涉(RNAi)技术。构建了PSP231的RNA干涉载体，并转化棉花，共获得6个转基因棉花株系共50余株棉花转基因植株(见图9)。PCR检测表明，外源DNA已导入棉花基因组。对这些转基因植株中基因表达分析证明PSP231的表达受到明显的抑制。而且，转基因植株出现花药不开裂、不散粉的现象。切片观察结果显示，虽然这些转基因植株的花药能正常形成小孢子，但在花药发育后期，花药表皮细胞异常膨胀，花药囊细胞层数不分明，甚至有多层细胞的现象。大部分小孢子仍然处于液泡化的时期，只有少数小孢子能够发育成熟，因而导致花粉败育(见图10)。上述结果表明，PSP231基因在棉花花药发育后期起重要作用。综合分析实验结果，我们推测PSP231蛋白可能参与棉花小孢子有丝分裂的调控，影响棉花花粉发育成熟。

表1过量表达GhPSP231的酵母细胞分裂统计

                          L1    L2    L3    L4    L5    C1    C2    C3

分裂细胞占总细胞数的百分  44.6  35.3  40.1  28.8  31.4  5.4   5.2   4.8

比(％)

L1-L5：5个转基因菌株；C1-C3：3个野生型菌株

本发明的优点

1、提供了一个新的棉花花粉特异基因PSP231的全长DNA序列及其cDNA序列，该基因含有3个外显子和2个内含子，编码一个功能未知的含有551个氨基酸的新蛋白。

2、提供了一个新的棉花花粉特异性的PSP231启动子序列，分析了其花药特异表达的顺式作用元件，证明该启动子能够驱动GUS基因在拟南芥和烟草花粉中特异表达，为通过基因工程技术培育棉花等农作物雄性不育系提供了特异的调控元件。

3、该基因在棉花花药发育后期高水平表达，若抑制该基因表达，则棉花花粉成熟受阻，不能形成正常的花粉，导致植株雄性不育。相反，在酵母中过量表达该基因促进细胞分裂，细胞分裂指数显著提高。这说明该基因可能通过调节雄配子体发育过程中的细胞分裂，从而在棉花花药发育过程中发挥重要作用。

本发明通过以下附图和实施进行进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

附图说明：

图1荧光定量RT-PCR分析PSP231在棉花各组织中的表达

图2荧光定量RT-PCR分析PSP231在花药不同发育阶段的表达

图中：15d，15天龄的花药；20d，20天龄的花药；25d，25天龄的花药；30d，30天龄的花药。

图3PSP231基因表达的原位杂交分析

图中：小孢子和成熟花粉中能够检测到信号，而在花粉母细胞和花药囊中检测不到信号，表明该基因在花粉中特异表达。

图4 PSP231基因结构简图

图中：PSP231基因包括3个外显子和2个内含子。外显子用黑色方框表示，而启动子、内含子和3’末端用线条表示。

图5 PSP231启动子活性分析

图中：A.拟南芥花药；B.离体培养的烟草花粉；C.萌发中的烟草花粉。转基因烟草和拟南芥花粉和花粉管被染成蓝色，花药其他组织未被染色，表明在PSP231启动子的调控下，GUS基因在花粉中特异表达，从而证实该启动子在棉花中是花粉特异性的。

图6 PSP231启动子缺失分析

图6表明：1200bp-400bp的PSP231启动子片段能够驱动GUS基因在花粉细胞中特异表达，而在200bp的启动子控制下，GUS基因不具有表达活性，证明PSP231启动子的花粉特异性元件可能存在于-200至-400bp的区段内。

图7过量表达PSP231促进酵母细胞分裂

图8过量表达PSP231的酵母细胞分裂的流式细胞术分析

图中：A.野生型酵母细胞.；B.转基因酵母细胞。结果显示，与对照相比，过量表达GhPSP231后处于S期和M期的酵母细胞数量都增加了。

图9 PSP231 RNAi转基因棉花植株

图10 PSP231 RNAi转基因棉花植株花药切片分析

图中：A-C.野生型植株；D-I.转基因植株。在野生型植株中，小孢子自四分体中释放出来后，会产生外壁并发生液泡化，此时绒粘层尚未降解，花药囊的四层细胞结构仍能清晰分辨，如图A所示；随着花粉的发育成熟，绒粘层降解，花药囊内壁膨胀，如图B、C所示(其中B图是C图的放大)。从图D-I可以看到，这些转基因植株的花药都处于花药发育晚期，与图B、C中所显示的花药处于同一个发育时期。但从图中可以明显观察到转基因植株的花粉发育滞后，同时花药囊的结构和细胞形态也发生不同程度的异常现象。

具体实施方式

一个新的棉花基因PSP231及其启动子分离鉴定及功能分析

1.棉花GhPSP231 cDNA克隆鉴定

从棉花花药cDNA文库中分离了4,000多个棉花cDNA克隆，通过序列分析和表达谱分析，从中筛选到一些花药特异或高水平表达的基因，其中包括PSP231。

2.荧光定量RT-PCR分析PSP231基因的表达

(1)组织总RNA的提取(按Li XB，Cai L，Cheng NH，Liu JW，2002.Molecular characterizationof the cotton GhTUB1 gene that preferentially expressed in fiber.Plant Physiology 130：666-674进行)。

(2)总RNA的纯化。首先用1U/1μl RQ1 DNase(Promega，Madison，USA)消化残留的DNA。然后，用Qiagen RNeasy mini Kit(Qiagen，Hilden，Germany)试剂盒纯化RNA。

(3)实时荧光定量RT-PCR研究基因的表达(按照Li XB，Fan XP，Wang XL，Cai L，Yang WC，2005.The Cotton A CTIN1 gene is functionally expressed in fibers and participates in fiberelongation.Plant Cell 17：859-875进行)。首先，将棉花不同组织(根、下胚轴、子叶、叶、花瓣、花药、胚珠、纤维、15天龄的花药、20天龄的花药、25天龄的花药、30天龄的花药)的总RNA(2μg/样)用M-MLV reverse transcriptase(Promega，Madison，USA)反转录成cDNA；然后，以cDNA为模板，用基因特异的引物(PPSP231RTP1和PSP231RTP2)和Real-time PCRMaster Mix(TOYOBO，Japan)进行定量PCR反应。以棉花polyubiquitin基因(GhUBI1)作为RT-PCR反应的内参，每个基因的表达水平相对值按公式Y＝10^ΔCt/3.57×100％计算(其中ΔCt＝CtGhUBI1-CtPSP231，3.57是利用GhUBI1制备的标准曲线y＝-0.28x+9.87中斜率的倒数，表示基因表达相差10倍的PCR循环数)。重复3次，统计分析实验结果。

3.RNA组织原位杂交分析PSP231的表达

(1)花药材料的制片

将新鲜花药置于冰冷的FAA中，真空抽气10min后，固定16h后用50％酒精清洗3次，在50％、60％、70％、85％，95％、100％的酒精中逐级脱水30min，接着依次转入体积比为1∶3、1∶1、3∶1的二甲苯∶乙醇溶液和体积比为9∶1的二甲苯∶氯仿溶液中透明。待样品透明完全后，将其包埋在石蜡中进行切片，切片厚度为7μm。选择包含不同发育时期的花药切片的蜡带，在38℃的展片台上展片过夜。

(2)按照DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)(Roche，Cat.No.11175025910)的方法制备RNA探针将PSP231的特异性片段构建到载体pSPT19中，用T7或SP6RNA聚合酶进行体外转录。其中用T7RNA聚合酶合成的为杂交探针，SP6RNA聚合酶合成的为对照探针。

(3)原位杂交分析PSP231的表达

按照Wang XL and Li XB，2009.The GhACS1 gene encodes an acyl-CoA synthetase which isessential for normal microsporogenesis in early anther development of cotton.Plant Journal 57(3)：473-86介绍的方法进行。

4.PSP231基因分离

在其PSP231cDNA开放阅读框(ORF)两端设计一对引物，以棉花基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得该基因的DNA全长序列。

5.PSP231启动子分离

按照Genome Walker Universal Kit(BD Biosciences Clontech，Cat.No.638904)的方法，用CP1和CP2引物从棉花基因组步移文库中分离了PSP231基因5’上游1253bp片段。

5.启动子PSP231p表达活性分析

构建PSP231p:GUS融合表达载体，电击法分别转化农杆菌GV3101和LBA4404，然后分别通过浸花法和浸染法转化拟南芥和烟草。GUS活性的组织化学染色分析按照Li XB，Cai L，Cheng NH，Liu JW，2002.Molecular characterization of the cotton GhTUB1 gene that preferentiallyexpressed in fiber.Plant Physiology 130：666-674介绍的方法进行。

6.PSP231启动子缺失分析

(1)以构建好的PSP231P:GUS载体质粒为模板，在该启动子5’端下游241bp、446bp、650bp、863bp、1067bp处分别设计引物PSP231Pd1、PSP231Pd2、PSP231Pd3、PSP231Pd4和PSP231Pd5，将其分别与PSP231Pp2配对，扩增出包含不同长度的启动子片段。

(2)构建PSP231不同长度的启动子片段与GUS融合表达载体，按照上述方法转化烟草，分析花粉中GUS活性变化。其载体名称分别为PSP231PD1，PSP231PD2 PSP231PD3，PSP231PD4，PSP231PD5。

7.PSP231基因功能分析

构建了PSP231的RNA干涉载体，并转化棉花，共获得6个株系50余株棉花转基因植株。用PCR检测证明外源DNA已导入棉花基因组后，将检测的阳性植株移栽到大田，生长发育至开花。用RT-PCR对这些转基因植株中PSP231基因的表达水平进行检测，选择PSP231的表达受到抑制的植株进行花药切片观察。

构建PSP231的诱导型过量表达载体并转化裂殖酵母，随机挑选5个阳性转化细胞系进行诱导表达，观察细胞分裂并统计分裂指数。同时，用细胞核专一性染料DAPI对所选择的细胞进行染色，观察细胞核分裂情况。然后，用流式细胞术对实验结果进行进一步分析验证。

核苷酸或氨基酸序列表

1.一个新的棉花基因PSP231，该基因的cDNA序列(包括开放阅读框和3’端未翻译区；open readingframe and 3’-untranslated region，简称ORF and 3’-UTR)如下：

   1 ATGGCTCGAT TAACATTAGT ATCGGTGCTA TTTCTCTGGG CAGGATCAAT GCTTATGGTC

  61 CAGGGCGGAG ATCCCACCCT TTTTTTCGAA TGGAACGTCA CCTATGGCAC CATTGCTCCC

 121 TTGGGAGTGC CAGTAAAGGG TATTCTTATT AACGGGCAAT TCCCGGGACC AAATATTAAC

 181 TCTACCACCA ACAACAATAT TGTGGTCAAT GTGTTCAATA ACCTTGATGA GCCATTCCTT

 241 GTAACATGGA ACGGCGTGCA GCATAGGAAG AACTCTTGGC AAGATGGTGT TCTGGGAACC

 301 AACTGTCCTA TCCCCCCTGG GAAGAATTAC ACCTATAAAT TCCAGGTGAA GGATCAGATT

 361 GGCAGCTACA TCTACTATCC GGTGACGGCT ATGCATAAGG CGGTTGGTGG TTTCGGTGGC

 421 CTCCGTGTTA ATAGCCGTCT ACTCATCCCT GTTCCCTACG CTGATCCGGC TGATGACTAT

 481 ACTCTCTTAG TGGGAGACTT TTTCAACAAG GGACACACCA GCCTCAAGAA GATTCTTGAT

 541 AGTGGTCGCA ACCTTGGGAG ATGTGACGGT GTTCACCTTA ATGGGAAAGT TGCAAAAGGT

 601 GATAGGAAGG ATGAACCTCT GTTTACGATG GAGGCAGGCA AAACGTACAA GTACAGGATT

 661 TGCAATACGG GTATCAAGAC ATCTCTGAAC GTCAGGTTCC AAGGCCACAC CATGAAATTG

 721 GTTGAGATGG AGGGTTCCCA CACAATGCAG AATGACTATG ACTCCCTTGA TGTGCATGTT

 781 GGACAGTGCT TCAGTGTGCT TGTTACTGCC AACCAGGAAC CAAGGGATTA CTATGTGGTG

 841 GCCTCTACCC GTTTTACCAG ACGTGAGGTT ACAGCAACTG GCATCATCCG TTACAAGAAT

 901 GGTAAGGGAG CTGCCTCATC CGAGTTGCCA CCACCACCTG TTGGTTGGGC TTGGTCACTC

 961 AATCAATTCC GTACCTTCCG TTGGAACTTG ACTTCTAACG CTGCTAGGCC TAACCCTCAG

1021 GGCTCCTACA AATATGGTTC CATTAACATT ACCCGCACCA TCAAGCTTGC CAACACTGCA

1081 CAAAAAGTAG ATGGCAAGCT CCGATATGCT CTTAATGGAG TCTCCTATGT CGAACCAACC

1141 ACTCCACTAA AACTTGCAGA ATACTACGGC GTAGCCGACA AGGTTTTCAA GTATGATACC

1201 ATTCCCGATG AGCCACAAAG TGACAACACT AAGGTAACTT TGGCACCTAT TGTGCTGAAC

1261 ATGACACACA GAAACTTTGT GGAAATAATC TTCGAGAATC ACGAGAGCGC CATTCAGTCT

1321 TACCACTTGT CTGGCTACTC ATTCTTTGCT GTGGGCATGG ACGTTGGGAA ATGGAGCCCC

1381 GAGAAGAGGA TGAACTACAA TCTTCTTGAC GCCGTGAGCA GACACACCAT ACAGGTATTC

1441 CCCAACTCCT GGTCAGCAAT CCTATTGACA TTCGACAACT GCGGGATGTG GAACCTGAGG

1501 TCGGAGATAT GGGACAGGCA TTACCTTGGG CAACAGCTTT ATGCTAGTGT TATTTCCCCT

1561 AACCGATCCC TCAAGGATGA GTACAACTTG CCGGAAGGTG TATTGACTTG CGGCATCGTG

1621 CAAGGCATGC CAAGGCCTCC ACCTTTCAGC AGTTAATTTA ATTAAGCTTA TAAATCTGTA

1681 TCCAATTATG GTATATGAGG AGAGAGAGGG TGAGAAAAGC TTGAGTTCCA AATGTATTTA

1741 ATGAAATAAA ATGTTTTGGA CCATATGTTT ATACTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1795

基因的编码区(ORF)从起始密码子ATG到终止密码子TAA(1-1656bp)。

 

2.PSP231基因DNA全序列(包括3个外显子和2个内含子)

   1 ATGGCTCGAT TAACATTAGT ATCGGTGCTA TTTCTCTGGG CAGGATCAAT GCTTATGGTC

  61 CAGGGCGGAG ATCCCACCCT TTTTTTCGAA TGGAACGTCA CCTATGGCAC CATTGCTCCC

 121 TTGGGAGTGC CAGTAAAGGG TATTCTTATT AACGGGCAAT TCCCGGGACC AAATATTAAC

 181 TCTACCACCA ACAACAATAT TGTGGTCAAT GTGTTCAATA ACCTTGATGA GCCATTCCTT

 241 GTAACATG

 301

GAACGG CGTGCAGCAT

 361 AGGAAGAACT CTTGGCAAGA TGGTGTTCTG GGAACCAACT GTCCTATCCC CCCTGGGAAG

 421 AATTACACCT ATAAATTCCA GGTGAAGGAT CAGATTGGCA GCTACATCTA CTATCCGGTG

 481 ACGGCTATGC ATAAGGCGGT TGGTGGTTTC GGTGGCCTCC GTGTTAATAG CCGTCTACTC

 541 ATCCCTGTTC CCTACGCTGA TCCGGCTGAT GACTATACTC TCTTAGTGGG AGACTTTTTC

 601 AACAAGGGAC ACACCAGCCT CAAGAAGATT CTTGATAGTG GTCGCAACCT TGGGAGATGT

 661 GACGGTGTTC ACCTTAATGG GAAAGTTGCA AAAGGTGATA GGAAGGATGA ACCTCTGTTT

 721 ACGATGGAGG CAGGCAAAAC GTACAAGTAC AGGATTTGCA ATACGGGTAT CAAGACATCT

 781 CTGAACGTCA GGTTCCAAGG CCACACCATG AAATTGGTTG AGATGGAGGG TTCCCACACA

 841 ATGCAGAATG ACTATGACTC CCTTGATGTG CATGTTGGAC AGTGCTTCAG TGTGCTTGTT

 901 ACTGCCAACC AGGAACCAAG GGATTACTAT GTGGTGGCCT CTACCCGTTT TACCAGACGT

 961 GAGGTTACAG CAACTGGCAT CATCCGTTAC AAGAATGGTA AGGGAGCTGC CTCATCCGAG

1021 TTGCCACCAC CACCTGTTGG TTGGGCTTGG TCACTCAATC AATTCCGTAC CTTCCGTTGG

1081 AACTTGACTT CTAACGCTGC TAGGCCTAAC CCTCAGGGCT CCTACAAATA TGGTTCCATT

1141 AACATTACCC GCACCATCAA GCTTGCCAAC ACTGCACAAA AAGTAGATGG CAAGCTCCGA

1201 TATGCTCTTA ATGGAGTCTC CTATGTCGAA CCAACCACTC CACTAAAACT TGCAGAATAC

1261 TACGGCGTAG CCGACAAGGT TTTCAAGTAT GATACCATTC CCGATGAGCC ACAAAGTGAC

1321 AACACTAAGG TAACTTTGGC ACCTATTGTG CTGAACATGA CACACAGAAA CTTTGTGGAA

1381 ATAATCTTCG AGAATCACGA GAGCGCCATT CAGTCTTACC ACTTGTCTGG CTACTCATTC

1441 TTTGCTGTGG

1501

CATGGAC GTTGGGAAAT GGAGCCCCGA

1561 GAAGAGGATG AACTACAATC TTCTTGACGC CGTGAGCAGA CACACCATAC AGGTATTCCC

1621 CAACTCCTGG TCAGCAATCC TATTGACATT CGACAACTGC GGGATGTGGA ACCTGAGGTC

1681 GGAGATATGG GACAGGCATT ACCTTGGGCA ACAGCTTTAT GCTAGTGTTA TTTCCCCTAA

1741 CCGATCCCTC AAGGATGAGT ACAACTTGCC GGAAGGTGTA TTGACTTGCG GCATCGTGCA

1801 AGGCATGCCA AGGCCTCCAC CTTTCAGCAG TTAA  1834

PSP231基因的内含子用斜体和下划线表示。

 

3.PSP231基因编码区翻译的蛋白质序列如下：

  1 MARLTLVSVL FLWAGSMLMV QGGDPTLFFE WNVTYGTIAP LGVPVKGILI NGQFPGPNIN

 61 STTNNNIVVN VFNNLDEPFL VTWNGVQHRK NSWQDGVLGT NCPIPPGKNY TYKFQVKDQI

121 GSYIYYPVTA MHKAVGGFGG LRVNSRLLIP VPYADPADDY TLLVGDFFNK GHTSLKKILD

181 SGRNLGRCDG VHLNGKVAKG DRKDEPLFTM EAGKTYKYRI CNTGIKTSLN VRFQGHTMKL

241 VEMEGSHTMQ NDYDSLDVHV GQCFSVLVTA NQEPRDYYVV ASTRFTRREV TATGIIRYKN

301 GKGAASSELP PPPVGWAWSL NQFRTFRWNL TSNAARPNPQ GSYKYGSINI TRTIKLANTA

361 QKVDGKLRYA LNGVSYVEPT TPLKLAEYYG VADKVFKYDT IPDEPQSDNT KVTLAPIVLN

421 MTHRNFVEII FENHESAIQS YHLSGYSFFA VGMDVGKWSP EKRMNYNLLD AVSRHTIQVF

481 PNSWSAILLT FDNCGMWNLR SEIWDRHYLG QQLYASVISP NRSLKDEYNL PEGVLTCGIV

541 QGMPRPPPFS S 551

 

4.PSP231基因上游启动子序列(包括5’端未翻译区和启动子片段)如下：

   1 ACTATAGGGC ACGCGTGGTC GACGGCCCGG GCTGGTCCTT ATTTTTTTAT CCAAGCCCAT

  61 TTTTCGAGCC TATATTTTTG CTCAAACCCT CTCACATTTC AGACGGGTCT TCGAGCTTGG

 121 CTGAGTGGCC CGACCCATGA ACAAGTCTAA ACAGTACTTA GGTTCTTGGC ATAATTACCA

 181 CTGGCAAATT TGTTTAATTC TTAAATCAAT TCTCTTTATT TTATTCACCT TACAATTTAG

 241 TCTTTGATCA ATAATTACTA TTCTTTCAAT CTAGTCCTTG TACTTAATAA TTTATCTAAT

 301 TTAATCACTT AATAATTCTA ATTTCTAATT TCATGTTCAT CTTGTAAATG TCTCGATTTA

 361 ATATTTTTGG ACTAGTTCGG CTTCGAGAAT TTAGCCTCAA AATCAAATCT TTTGACCCTA

 421 ATGAAAATCA GAATGTTATA TGCAAAATGC TCGACATCCT GCAAGGTCTC CATAATAGAT

 481 TTCTTCATAT TTGTGTCATT GTTGCTCATG TCTGATCCAC CTCTAGTATT CACTTCAACC

 541 GTAACAATGG TCATATTTGT TGCCATGAGT GATGTGGAAA TTTTTTTAAA AATGTCATTA

 601 AGTAATTTGA AATAGACCAT GAATAATGTG GTGGAAAGAG TTAATAAAAT AATTTCTCCA

 661 CATTTTGGGT GATCAATATT TAATTTATTA TAAAATTTCT CGTAGATGAT GTCACAAATG

 721 GATTTGTTAT GTATGCGTAA ACTCTTGAAA AAAAAACTAT AATAAAATTT CTCGTAGATG

 781 ATGTCACATA ATTTGTCATA ATTTAAGCTT TCATATAAGA AGGTTAGTTT CACATTAATA

 841 CAATTTCTAT TTTTAAAAAT TACAATAGTT TATCTATATG TATAATAAAA GAATAAATAA

 901 AAAGGTTAAA AAAAAGCACT AAAGTATTTT TCATAGAAGC AACTACTTTC CTAAAGAAAA

 961 GGTTAGCCAT CCATATAGTG AATATTCAAA TCCTTGTGAT AACAGAAAAG AATGATTCAA

1021 CATTGTAAAA CTAAAAATGG TTAGTGCTAA AAGGAAGGAA ATAAATGAAT GGATGAGCTT

1081 ATTCTAAGGG ATTAAGATGG AAGAATGGAA GAGGGGGTTG TGTGGTATAA AAGGAGAGGT

1141 ATGCATGCAA TTCAAAATCA ACTCAAGCTA ATCATCTCCC TCTTCCTCTA GAGGGGATAA

1201 ACAGTATAAT AAATTATATT GGAGGCGTGG TCGGCAAAAA AAAGGGTTAA GAG 1253

Claims (4)

1.一个棉花基因PSP231，该基因包括开放阅读框和3’端未翻译区的cDNA序列如下：

1    ATGGCTCGAT TAACATTAGT ATCGGTGCTA TTTCTCTGGG CAGGATCAAT GCTTATGGTC

61   CAGGGCGGAG ATCCCACCCT TTTTTTCGAA TGGAACGTCA CCTATGGCAC CATTGCTCCC

121  TTGGGAGTGC CAGTAAAGGG TATTCTTATT AACGGGCAAT TCCCGGGACC AAATATTAAC

181  TCTACCACCA ACAACAATAT TGTGGTCAAT GTGTTCAATA ACCTTGATGA GCCATTCCTT

241  GTAACATGGA ACGGCGTGCA GCATAGGAAG AACTCTTGGC AAGATGGTGT TCTGGGAACC

301  AACTGTCCTA TCCCCCCTGG GAAGAATTAC ACCTATAAAT TCCAGGTGAA GGATCAGATT

361  GGCAGCTACA TCTACTATCC GGTGACGGCT ATGCATAAGG CGGTTGGTGG TTTCGGTGGC

421  CTCCGTGTTA ATAGCCGTCT ACTCATCCCT GTTCCCTACG CTGATCCGGC TGATGACTAT

481  ACTCTCTTAG TGGGAGACTT TTTCAACAAG GGACACACCA GCCTCAAGAA GATTCTTGAT

541  AGTGGTCGCA ACCTTGGGAG ATGTGACGGT GTTCACCTTA ATGGGAAAGT TGCAAAAGGT

601  GATAGGAAGG ATGAACCTCT GTTTACGATG GAGGCAGGCA AAACGTACAA GTACAGGATT

661  TGCAATACGG GTATCAAGAC ATCTCTGAAC GTCAGGTTCC AAGGCCACAC CATGAAATTG

721  GTTGAGATGG AGGGTTCCCA CACAATGCAG AATGACTATG ACTCCCTTGA TGTGCATGTT

781  GGACAGTGCT TCAGTGTGCT TGTTACTGCC AACCAGGAAC CAAGGGATTA CTATGTGGTG

841  GCCTCTACCC GTTTTACCAG ACGTGAGGTT ACAGCAACTG GCATCATCCG TTACAAGAAT

901  GGTAAGGGAG CTGCCTCATC CGAGTTGCCA CCACCACCTG TTGGTTGGGC TTGGTCACTC

961  AATCAATTCC GTACCTTCCG TTGGAACTTG ACTTCTAACG CTGCTAGGCC TAACCCTCAG

1021 GGCTCCTACA AATATGGTTC CATTAACATT ACCCGCACCA TCAAGCTTGC CAACACTGCA

1081 CAAAAAGTAG ATGGCAAGCT CCGATATGCT CTTAATGGAG TCTCCTATGT CGAACCAACC

1141 ACTCCACTAA AACTTGCAGA ATACTACGGC GTAGCCGACA AGGTTTTCAA GTATGATACC

1201 ATTCCCGATG AGCCACAAAG TGACAACACT AAGGTAACTT TGGCACCTAT TGTGCTGAAC

1261 ATGACACACA GAAACTTTGT GGAAATAATC TTCGAGAATC ACGAGAGCGC CATTCAGTCT

1321 TACCACTTGT CTGGCTACTC ATTCTTTGCT GTGGGCATGG ACGTTGGGAA ATGGAGCCCC

1381 GAGAAGAGGA TGAACTACAA TCTTCTTGAC GCCGTGAGCA GACACACCAT ACAGGTATTC

1441 CCCAACTCCT GGTCAGCAAT CCTATTGACA TTCGACAACT GCGGGATGTG GAACCTGAGG

1501 TCGGAGATAT GGGACAGGCA TTACCTTGGG CAACAGCTTT ATGCTAGTGT TATTTCCCCT

1561 AACCGATCCC TCAAGGATGA GTACAACTTG CCGGAAGGTG TATTGACTTG CGGCATCGTG

1621 CAAGGCATGC CAAGGCCTCC ACCTTTCAGC AGTTAATTTA ATTAAGCTTA TAAATCTGTA

1681 TCCAATTATG GTATATGAGG AGAGAGAGGG TGAGAAAAGC TTGAGTTCCA AATGTATTTA

1741 ATGAAATAAA ATGTTTTGGA CCATATGTTT ATACTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1795

基因的编码区从起始密码子ATG到终止密码子TAA为1656bp。

2.如权利要求1所述的一个棉花基因PSP231，其特征在于，PSP231基因包括3个外显子和2个内含子的DNA全序列为：

1   ATGGCTCGAT TAACATTAGT ATCGGTGCTA TTTCTCTGGG CAGGATCAAT GCTTATGGTC

61  CAGGGCGGAG ATCCCACCCT TTTTTTCGAA TGGAACGTCA CCTATGGCAC CATTGCTCCC

121 TTGGGAGTGC CAGTAAAGGG TATTCTTATT AACGGGCAAT TCCCGGGACC AAATATTAAC

181 TCTACCACCA ACAACAATAT TGTGGTCAAT GTGTTCAATA ACCTTGATGA GCCATTCCTT

241 GTAACATGGT AAGCGACTAC CAAGAGTATT TTCTTTTTTA CATTAATATG ATTATGCTAG

301 TGAAGAGTTG AGCTAATTAT ATGTGGAAAT GGGATTTGTT GCAGGAACGG CGTGCAGCAT

361 AGGAAGAACT CTTGGCAAGA TGGTGTTCTG GGAACCAACT GTCCTATCCC CCCTGGGAAG

421 AATTACACCT ATAAATTCCA GGTGAAGGAT CAGATTGGCA GCTACATCTA CTATCCGGTG

481 ACGGCTATGC ATAAGGCGGT TGGTGGTTTC GGTGGCCTCC GTGTTAATAG CCGTCTACTC

541 ATCCCTGTTC CCTACGCTGA TCCGGCTGAT GACTATACTC TCTTAGTGGG AGACTTTTTC

601 AACAAGGGAC ACACCAGCCT CAAGAAGATT CTTGATAGTG GTCGCAACCT TGGGAGATGT

661 GACGGTGTTC ACCTTAATGG GAAAGTTGCA AAAGGTGATA GGAAGGATGA ACCTCTGTTT

721  ACGATGGAGG CAGGCAAAAC GTACAAGTAC AGGATTTGCA ATACGGGTAT CAAGACATCT

781  CTGAACGTCA GGTTCCAAGG CCACACCATG AAATTGGTTG AGATGGAGGG TTCCCACACA

841  ATGCAGAATG ACTATGACTC CCTTGATGTG CATGTTGGAC AGTGCTTCAG TGTGCTTGTT

901  ACTGCCAACC AGGAACCAAG GGATTACTAT GTGGTGGCCT CTACCCGTTT TACCAGACGT

961  GAGGTTACAG CAACTGGCAT CATCCGTTAC AAGAATGGTA AGGGAGCTGC CTCATCCGAG

1021 TTGCCACCAC CACCTGTTGG TTGGGCTTGG TCACTCAATC AATTCCGTAC CTTCCGTTGG

1081 AACTTGACTT CTAACGCTGC TAGGCCTAAC CCTCAGGGCT CCTACAAATA TGGTTCCATT

1141 AACATTACCC GCACCATCAA GCTTGCCAAC ACTGCACAAA AAGTAGATGG CAAGCTCCGA

1201 TATGCTCTTA ATGGAGTCTC CTATGTCGAA CCAACCACTC CACTAAAACT TGCAGAATAC

1261 TACGGCGTAG CCGACAAGGT TTTCAAGTAT GATACCATTC CCGATGAGCC ACAAAGTGAC

1321 AACACTAAGG TAACTTTGGC ACCTATTGTG CTGAACATGA CACACAGAAA CTTTGTGGAA

1381 ATAATCTTCG AGAATCACGA GAGCGCCATT CAGTCTTACC ACTTGTCTGG CTACTCATTC

1441 TTTGCTGTGG GGTAAGTATA GCTTCTAACA TAGCCAATAC ATGTGGTGAT TTGCTTGAGT

1501 TGAAGTAATA AGTTGTATAA TGATTTGTCG CAGCATGGAC GTTGGGAAAT GGAGCCCCGA

1561 GAAGAGGATG AACTACAATC TTCTTGACGC CGTGAGCAGA CACACCATAC AGGTATTCCC

1621 CAACTCCTGG TCAGCAATCC TATTGACATT CGACAACTGC GGGATGTGGA ACCTGAGGTC

1681 GGAGATATGG GACAGGCATT ACCTTGGGCA ACAGCTTTAT GCTAGTGTTA TTTCCCCTAA

1741 CCGATCCCTC AAGGATGAGT ACAACTTGCC GGAAGGTGTA TTGACTTGCG GCATCGTGCA

1801 AGGCATGCCA AGGCCTCCAC CTTTCAGCAG TTAA  1834

PSP231基因的内含子用斜体和下划线表示。

3.如权利要求1所述的一个棉花基因PSP231，其特征在于，PSP231基因编码区翻译的蛋白质序列如下：

1   MARLTLVSVL FLWAGSMLMV QGGDPTLFFE WNVTYGTIAP LGVPVKGILI NGQFPGPNIN

61  STTNNNIVVN VFNNLDEPFL VTWNGVQHRK NSWQDGVLGT NCPIPPGKNY TYKFQVKDQI

121 GSYIYYPVTA MHKAVGGFGG LRVNSRLLIP VPYADPADDY TLLVGDFFNK GHTSLKKILD

181 SGRNLGRCDG VHLNGKVAKG DRKDEPLFTM EAGKTYKYRI CNTGIKTSLN VRFQGHTMKL

241 VEMEGSHTMQ NDYDSLDVHV GQCFSVLVTA NQEPRDYYVV ASTRFTRREV TATGIIRYKN

301 GKGAASSELP PPPVGWAWSL NQFRTFRWNL TSNAARPNPQ GSYKYGSINI TRTIKLANTA

361 QKVDGKLRYA LNGVSYVEPT TPLKLAEYYG VADKVFKYDT IPDEPQSDNT KVTLAPIVLN

421 MTHRNFVEII FENHESAIQS YHLSGYSFFA VGMDVGKWSP EKRMNYNLLD AVSRHTIQVF

481 PNSWSAILLT FDNCGMWNLR SEIWDRHYLG QQLYASVISP NRSLKDEYNL PEGVLTCGIV

541 QGMPRPPPFS S 551

4.如权利要求1所述的一个棉花基因PSP231，其特征在于，PSP231基因上游序列包括5’端未翻译区和启动子片段下：

1   ACTATAGGGC ACGCGTGGTC GACGGCCCGG GCTGGTCCTT ATTTTTTTAT CCAAGCCCAT

61  TTTTCGAGCC TATATTTTTG CTCAAACCCT CTCACATTTC AGACGGGTCT TCGAGCTTGG

121 CTGAGTGGCC CGACCCATGA ACAAGTCTAA ACAGTACTTA GGTTCTTGGC ATAATTACCA

181 CTGGCAAATT TGTTTAATTC TTAAATCAAT TCTCTTTATT TTATTCACCT TACAATTTAG

241 TCTTTGATCA ATAATTACTA TTCTTTCAAT CTAGTCCTTG TACTTAATAA TTTATCTAAT

301 TTAATCACTT AATAATTCTA ATTTCTAATT TCATGTTCAT CTTGTAAATG TCTCGATTTA

361 ATATTTTTGG ACTAGTTCGG CTTCGAGAAT TTAGCCTCAA AATCAAATCT TTTGACCCTA

421 ATGAAAATCA GAATGTTATA TGCAAAATGC TCGACATCCT GCAAGGTCTC CATAATAGAT

481 TTCTTCATAT TTGTGTCATT GTTGCTCATG TCTGATCCAC CTCTAGTATT CACTTCAACC

541 GTAACAATGG TCATATTTGT TGCCATGAGT GATGTGGAAA TTTTTTTAAA AATGTCATTA

601 AGTAATTTGA AATAGACCAT GAATAATGTG GTGGAAAGAG TTAATAAAAT AATTTCTCCA

661 CATTTTGGGT GATCAATATT TAATTTATTA TAAAATTTCT CGTAGATGAT GTCACAAATG

721 GATTTGTTAT GTATGCGTAA ACTCTTGAAA AAAAAACTAT AATAAAATTT CTCGTAGATG

781  ATGTCACATA ATTTGTCATA ATTTAAGCTT TCATATAAGA AGGTTAGTTT CACATTAATA

841  CAATTTCTAT TTTTAAAAAT TACAATAGTT TATCTATATG TATAATAAAA GAATAAATAA

901  AAAGGTTAAA AAAAAGCACT AAAGTATTTT TCATAGAAGC AACTACTTTC CTAAAGAAAA

961  GGTTAGCCAT CCATATAGTG AATATTCAAA TCCTTGTGAT AACAGAAAAG AATGATTCAA

1021 CATTGTAAAA CTAAAAATGG TTAGTGCTAA AAGGAAGGAA ATAAATGAAT GGATGAGCTT

1081 ATTCTAAGGG ATTAAGATGG AAGAATGGAA GAGGGGGTTG TGTGGTATAA AAGGAGAGGT

1141 ATGCATGCAA TTCAAAATCA ACTCAAGCTA ATCATCTCCC TCTTCCTCTA GAGGGGATAA

1201 ACAGTATAAT AAATTATATT GGAGGCGTGG TCGGCAAAAA AAAGGGTTAA GAG 1253

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