CN1727484A

CN1727484A - 棉花中草甘膦诱导表达的ag2启动子

Info

Publication number: CN1727484A
Application number: CNA2005100886314A
Authority: CN
Inventors: 郭三堆; 尉万聪; 张锐
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2005-07-29
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2025-07-29
Also published as: CN100422327C

Abstract

本发明从棉花中分离到一个ag2基因的启动子序列。该启动子可在0.2％－0.07％的草甘膦浓度下很短时间内诱导目的基因高效表达。ag2启动子也可作为水杨酸等非生物胁迫诱导型启动子使用，或用于其它转基因作物的调控序列。

Description

棉花中草甘膦诱导表达的ag2启动子

技术领域

本发明涉及一种草甘膦诱导表达的棉花启动子，该启动子在草甘膦诱导后表达量显著增强。这种启动子可应用于调控外源目的基因在适当的时间高效表达，而在草甘膦未诱导时只保持很低的本底表达水平或是不表达，从而节省植物体的能量。

背景技术

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型的优秀除草剂：能够防除绝大多数禾本科与阔叶杂草；方法简单，避免了过去传统上采用多种不同除草剂混合及搭配使用的复杂用药技术；用药次数和用药品种减少，除草剂使用成本显著下降；在大量应用后，作物几乎没有产生抗药性。由于草甘膦的突出特性及其广泛应用，引起了人们对抗草甘膦转基因作物研究的极大兴趣。抗草甘膦转基因作物开始在全球范围内大面积种植。以抗草甘膦大豆为例：1996年开始在美国种植，当年种植面积约40万hm²；1997年增至360万hm²；1998年达1130万hm²，占大豆播种总面积的40％；2002年占大豆播种总面积的74％；2003年抗草甘膦大豆种植面积达到全球转基因作物种植面积的61％(4140hm²)。

然而在目前所报道的抗草甘膦转基因作物中，驱动抗性基因的都是强表达的组成型启动子，使这些抗草甘膦基因几乎在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都高效表达，这无疑增加了植株的代谢负担，造成物质和能源上的巨大浪费，有时甚至还会引起植株的形态发生改变，影响植株的生长发育。为了使外源抗草甘膦基因在转基因植物体内发挥作用的同时尽可能减少对受体植物的不利影响，本发明的主要目的是克隆草甘膦胁迫诱导高表达基因的启动子，使由该启动子驱动的外源抗草甘膦基因及其它目的基因(例如：抗病、抗虫基因)，只在杂草、病、虫害发生的域值时才高效表达，在一般情况下不表达或只保持极低水平的本底表达。既可以防治病虫害又可以去除杂草。这样既能避免外源基因长期高效表达引起的负效应，又能使作物具有抗草甘膦及病、虫害的特性，从而有效地解决目前抗草甘膦基因受强组成型表达启动子驱动，外源基因在植物体内长期高效表达，影响植物生长和产量的问题。

克隆草甘膦诱导高表达基因的启动子、增强子及各种决定诱导表达的DNA序列，可以为外源基因在植物体内定时定量表达提供调控元件。

ag2启动子是在草甘膦诱导下高表达的启动子，目前在NCBI/nr/BLAST中尚未见该启动子的注册信息，并且尚未见有关草甘膦诱导表达启动子的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种ag2基因的转录调控区核苷酸序列或与其具有相同功能的类似物衍变体核苷酸序列，该启动子是从棉花中分离的，是一种能被草甘膦等逆境的诱导激活而启动与其相关联的DNA转录的诱导型启动子。

本发明提供的ag2启动子序列具有SEQ ID NO：1所示的第1位到第2063位的启动子区核苷酸序列，由于对本发明的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸序列的插入、替换和/或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的，因而本发明也包括与SEQID NO：1所示的具有至少50％的同源性，优选至少90％的同源性，并同时具有相同功能的类似物。

本发明中的ag2基因5′端调控序列的“衍生变体”是指在SEQ ID NO：1序列中1到2063位核苷酸之间序列的基础上，经片段缺失、碱基改变、碱基添加或再次分离的一部分、几部分或其组合。本发明提供了启动子顺式元件所在的大致区段，并构建了从其5′端逐级缺失的衍生变体。本发明中衍生变体的启动子活性可以通过在启动子下游嵌合报告基因，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，以GFP的表达情况得以确认。

本发明的再一个目的是提供包含有上述诱导型启动子序列及其具有相同功能的类似物衍生突变体的表达载体和其重组宿主细胞。包括重组细菌、酵母、农杆菌及棉花重组植物细胞。根据本发明提供的诱导型启动子，可以构建包含该启动子的双元表达载体，其启动子下游可以嵌合感兴趣的将要表达的基因，通过喷施草甘膦，诱导实现目的蛋白质在植物体内的受控表达。

附图表说明

图1Hemispecific PCR扩增结果。其中M代表Marker，1、2是指RPGSIR与H-02引物组合的扩增结果。

图2Cassette Ligation PCR两次扩增结果及启动子扩增示意图。其中a，是指用HindIII酶切基因组后，与带有相应酶切位点的Cassette连接进行扩增的电泳结果；b，是指用EcoRI酶切基因组后，与带有EcoRI酶切位点的Cassette连接进行扩增的电泳结果。

图3ag2基因Northern blot结果0、6、12、24、36h分别指喷施草甘膦后的不同时间。

具体实施方式

下文通过实施例对本发明做进一步说明

实施例1草甘膦诱导棉花高表达ag2启动子克隆

1.DNA和RNA模板的制备：

用改良的CTAB法提取陆地棉品种L14基因组DNA，要求DNA片段大于50Kb，OD260/OD280大于1.8。采用改良的热硼酸法提取陆地棉品种L14的总RNA，用于DDRT-PCR、RT-PCR、RACE及cDNA序列的扩增。

2.草甘膦诱导棉花高表达ag2基因的克隆

用生产使用的草甘膦浓度(2‰)喷施棉苗并分别在喷施后0、6、12、24、36h取样，提取总RNA。利用DDRT-PCR方法，通过筛选40对引物组合(4个锚定引物：T7T12AG/T7T12GC/T7T12CA/T7T12CT，10个随机引物M13RP1-10，组合成40对引物)，并通过RT-PCR及Northern blot检测获得草甘膦诱导后在棉花中高表达的ag2基因。诱导表达从草甘膦喷施处理后6小时开始，持续到36小时，其表达的高峰期在24小时。这说明草甘膦喷施后很快就可以诱导该基因的表达。利用RACE技术获得760bp的ag2基因cDNA全长序列，并设计引物扩增得到853bp的相应基因组序列。具体序列及说明参见草甘膦诱导高表达对逆境具有抗性的ag2基因。

3.利用Hemispecific PCR扩增ag2基因5′端序列

通过对基因特异性引物RPGSIR(5′-AGTATAGACCTTGCTGTTCTCATCTAGTGG-3′)和RPGSR(5′-GGAAGAGTT CCAAAGCTTGCCGTTTGTGC-3′)分别与50条随机引物(RAPD引物Operon编号：B-11～B-20；C-11～C-20；E-11～E-20；H-01～H-10；T-01～T-10)配组后的引物组合进行筛选，结果发现基因特异性引物RPGSIR与随机引物H-02组合扩增出了一条800bp左右的特异条带(图1)，经回收、克隆、测序分析发现：该序列与目的基因序列完全重叠的部分达450bp，因而此次扩增是目的基因特异扩增的结果，序列总长度为896bp，向ag2基因的5′端延伸了446bp。

4.利用Cassette ligation PCR通过两次延伸获得启动子序列

分别用Sau3AI、EcoRI、HindIII、PstI、SaII、XbaI等6种限制性内切酶对棉花品种L14基因组DNA进行酶切，再分别与带有相应酶切位点的Cassette连接。然后根据酶切位点在基因组中的分布特点设计引物(LR：5′-GCGCATGAAATTAGTAGACTTCATTC-3′，LR1：5′-GATGTGTCTTTTCACTTTTAAGTAC-3′，LR2：5′-GGTAAACTAC TTCCATTATGATC-3′，LR3：5′-GTCACTGAGCTATTAAAGTTATTG-3′)：对HindIII酶切连接产物以LR做为第一次PCR反应的反向引物、对Sau3AI酶切连接产物以LR2做为第一次PCR扩增的反向引物；由于其余4种限制性内切酶在已知基因序列中没有分布，因而都以LR1做为第一次PCR扩增反应的反向引物，其中正向引物均为试剂盒提供的PrimerC1(5′-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3′)。为保证PCR扩增的特异性，分别以第一次PCR产物做为模板，HindIII酶切位点的第二次PCR反应的反向引物为LR2，Sau3AI酶切位点的第二次PCR反应的反向引物为LR3，其余反向引物均为LR2，第二次PCR扩增反应的正向引物全用试剂盒提供的PrimerC2(5′-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3′)。电泳结果表明：HindIII酶切连接产物的扩增结果具有很高的特异性，在300bp-400bp之间有两条很亮的条带(图2a)。Sau3AI酶切连接产物在200bp-300bp之间有一条特异条带，但由于片段太小，除去重叠区域很可能没有向5′端延伸，因此不作考虑。其余酶切位点连接产物均没有明显扩增条带。分别回收、克隆、测序分析发现，两条带均为特异扩增产物，其中较大的片段长280bp，重叠部分129bp，向5′端延伸了151bp；较小片段长242bp，重叠部分129bp，向5′端延伸了113bp。根据所得的序列设计引物，以6种内切酶酶切后连接的第一次PCR产物为模板，PrimerC2为正向引物，LR3为反向引物进行扩增。电泳结果表明：只有EcoRI酶切连接产物扩增出约1.8kb的条带(图2b)。克隆测序分析发现：该片段长为1710bp，其中与原有序列重叠145bp，是特异扩增片段，此次扩增向ag2基因的5′端又推进了1565bp。至此，启动子序列从预测的转录起始位点经3次扩增，共向前延伸了2063bp。由于启动子的长度一般为1.5-2.0kb，因而初步判断获得了ag2基因的启动子序列。其序列如SEQ ID NO：1所示。NCBI/nr/BLAST结果表明：核酸(nr)库中无任何与ag2启动子同源的序列。

实施例2棉花ag2启动子表达特性分析

1 RNA模板的制备：采用改良的热硼酸法提取草甘膦诱导后0、6、12、24、36h后陆地棉品种L14总RNA，OD260/OD280大于1.8。用于cDNA序列扩增。

2 Northern blot：分别从草甘膦诱导后0、6、12、24、36h的棉花叶片中提取总RNA，各取总RNA 15μg，用1.5％的甲酰胺-甲醛琼脂糖凝胶对RNA进行电泳分级分离，然后按照试剂盒说明书进行转膜、Northern杂交，杂交探针(正向引物：TF：5′-CTAATTTTCAAATGAAAAGAGCTC-3′；反向引物：TR：5′-CCTATCATTTCCG GTAAAACAAAA-3′)为地高辛标记的ag2 cDNA全长序列。结果表明ag2在草甘膦诱导后6h表达量明显增强，这种高表达持续到24h，36h后表达量开始下降(图3)。

实施例3棉花ag2基因启动子功能区域的确定

1根据预测的调控元件分布情况，设计引物(正向引物：P1F：5′-CAG AAGCTTGTGGTGCAAATAGAGAGGCCATACAAT-3′，P2F：5′-CTC AAGCTTAGCTTCAAGCAATGATTCGATCCAAGTC-3′，P3F：5′-CGC AAGCTTCTCATATAATAGCTTGATGG TTAAAGG-3′，P4F：5′-GCGAAGCTTGAGAATTCATGGTTGAATAAGAATATAC-3′；反向引物PR：5′-AGC GGATCCCAAATATTGCAATACACACCTACTTA-3′)利用PCR方法获得了4个ag2启动子5′端渐变缺失片段，分别命名为P1(对应于SEQ ID NO：1第1位至2063位核苷酸)，P2(对应于SEQ ID NO：1第1041位至2063位核苷酸)，P3(对应于SEQ ID NO：1第1498位至2063位核苷酸)，P4(对应于SEQ IDNO：1第1665位至2063位核苷酸)，各自的引物对分别是P1F/PR、P2F/PR、P3F/PR、P4F/PR(见表1)。将这四种启动子片段与pBI121植物表达载体及GFP基因融合，然后分别用农杆菌侵染法转化烟草NC89及agroinfiltration瞬时表达GFP。

2Confocal显微镜扫描结果表明：对pBIP26FP转基因植株的6FP荧光强度检测结果表明：ag2启动子P2片段具有明显的诱导特性，草甘膦处理后14h，GFP荧光信号增强17倍。对agroinfiltration瞬时表达GFP3天后取样检测发现：4种启动子片段本底表达水平差异不大；P1在0.7‰、1‰、2‰草甘膦诱导14h后，0.7‰草甘膦诱导的荧光强度比1‰增加了0.77倍，比2‰增加了1.95倍，因此0.7‰草甘膦为最佳诱导浓度；P4用0.7‰的草甘膦处理注射叶片后，随着诱导时间的延长，荧光信号增强，16h时强度为处理前的10.7倍；用浓度为0.7‰的草甘膦处理4种启动子片段18h后，P1 GFP荧光强度比P2增加了0.63倍，比P3增强了2.57倍，比P4增强了3.58倍；其中，P4具有启动子诱导表达的核心元件，可诱导GFP表达，并使GFP荧光强度随草甘膦诱导时间延长而增强；P3由于只增加了一个HSF元件，因此表达强度与P4相似；P2中增加了光调控元件GATA、STK和控制转录起始频率的CAATbox等诱导调控元件，表达强度比P4增加了1倍多；P1中因为增加了CAAT box、GATA等多种诱导调控元件，其表达强度增加较大，比P4强度增加了3倍多。

Claims

1 一种来源于棉花的转录调控区DNA序列片段或其功能类似物的衍变体，它具有SEQ ID NO：1所示的第1位至第2063位的启动子区核苷酸序列，其核甘酸序列或其互补链的核甘酸序列与SEQ ID NO：1所示的第1位至第2063位的核苷酸序列具有至少50％同源性，优选至少90％的同源性，并同时具有相同功能的类似物。

2 根据权利要求1所述的功能类似物的衍变体是指5’端第1位到第2063位核苷酸序列渐变、片段缺失、增加、碱基改变得到的衍变体，它们分别是：P1，对应于SEQ ID NO：1第1位至2063位核苷酸；P2，对应于SEQ ID NO：1第1041位至2063位核苷酸；P3，对应于SEQ ID NO：1第1498位至2063位核苷酸；P4，对应于SEQ ID NO：1第1665位至2063位核苷酸。

3 一种能起始并调控与其相关联基因转录的DNA序列是根据权利要求2所述的衍变体P1、P2、P3和P4任选其中之一，包含启动子核心元件的DNA序列是衍变体P1。

4 一种能在能在草甘膦生产使用浓度(2‰)及低于生产使用浓度(1‰，0.7‰)诱导下激活而起始与其相关联基因转录的核苷酸序列片段，是任选权利要求1至3所述核苷酸片段其中之一的核苷酸序列片段。

5 一种含有任选权利要求1至3所述的核苷酸片段的其中之一的DNA片段的重组DNA，是在将其重新导入植物，能够启动相关基因转录、表达的一种重组DNA。

6 含有权利要求5所述的重组DNA的表达载体。

7 含有权利要求5所述基因的细胞系。

8 植物细胞转化方法是通过权利要求5所述的重组根癌农杆菌介导；或原生质体融合、基因枪、电击、PEG介导、花粉管导入方法进行的。

9 启动子功能快速检测方法是通过权利要求5所述的重组根癌农杆菌介导，利用agroinfiltration方法进行的。

10 根据权利要求1至3提供的核苷酸序列片段，任选其中之一核苷酸片段在用作分子标记，棉花中再分离调控序列，或用于其它转基因植物的相关调控序列中的应用。