CN111808860B - 一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于棉花育种技术领域，具体涉及一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法的专利申请。本发明利用外源的虞美人自交不亲和性基因对PrsS/PrpS，结合基因工程技术将其导入了棉花，证明在棉花中导入虞美人自交不亲和系统，可以实现棉花自交不亲和表型，表明自交不亲和性可以在棉花中成功实现（以转基因株系Gh‑PrsS为父本，Gh‑PrpS为母本，不能正常产生棉铃，可实现棉花的自交不亲和性，也即，可以实现棉花由自交亲和向自交不亲和的转变）。利用该方法可以成功创制不同的棉花自交不亲和新材料，从而大幅节约人工成本，提高制种的纯度和效率，而且可以突破材料的基因型限制，实现高效制种的强优势杂交棉培育。

Description

一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法
技术领域
本申请属于棉花育种技术领域，具体涉及一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法的专利申请。
背景技术
棉花是我国重要的经济作物，其纤维是我国纺织工业必不可少的原材料。棉花为自交亲和作物，在没有外界干预的情况下多为自花授粉。而从棉花育种角度而言，利用杂种优势能够大幅度提高棉纤维产量，改善纤维品质，增强植株抗病虫能力。
目前棉花的杂交制种的方法主要有：人工去雄、化学杀雄和雄性不育系等方法，但这些方法均存在费时费工、环境不友好、效果不稳定等一种或多种问题，使得规模化应用难度较大。其主要原因在于：人工去雄制种时，由于操作繁琐，导致棉花杂交种的人工成本过高，进而严重限制了杂交棉的推广应用；而化学杀雄法存在效果不稳定、施用浓度和施用时间难以把控以及环境污染等问题；利用雄性不育系育种时，无论是核雄性不育的“两系法”还是胞质不育的“三系法”制种时，存在难于选配强优势组合的缺陷。因此，人工制种成本高、雄性不育系育性不稳、不育基因源狭窄和恢复系的恢复力差是限制棉花杂交种广泛应用的关键问题。也因此，降低杂交制种成本、并且开发一种较为稳定优良的雄性不育系育种方法，是棉花杂交制种技术发展的重要前提。
自交不亲和性是正常可育的雌雄同花显花植物自花授粉不能产生合子的一种现象。作为一种种内生殖隔离机制，自交不亲和性在显花植物避免近亲繁殖保持遗传多样性方面发挥重要作用。生产实践中，育种家利用自交不亲和系做母本进行杂交制种，具有无需去雄、省时省工的明显技术优点。而随着对植物自交不亲和性形成分子机理研究的不断深入，利用生物技术人工创造自交亲和作物已经逐渐成为可能。
已有研究表明，在绝大多数自交不亲和植物中，自交不亲和是由复等位基因构成的单一位点控制，称为S位点/基因座。S位点一般包含两类基因：决定花柱识别特异性的柱头S基因和决定花粉识别特异性的花粉S基因，二者构成不同的S单倍（元）型。当花粉的S单倍型与雌蕊两个S单倍型的其中一个相同时，花粉被雌蕊识别为“自己”，导致花粉生长受阻的排斥反应，我们称为自己花粉不亲和反应；而与雌蕊具有不同S单倍型的花粉被识别为“异己”，进而完成整个授粉受精的过程，我们称为异己花粉亲和反应。这些等位基因在雌蕊和花粉中的表达具有组织和时间特异性，受植物生长发育过程调控。
基于现有自交不亲和性研究，如果能够开发一种棉花的自交不亲和性的育种方法，对于棉花的杂交制种技术的发展显然是一种新的技术思路和技术途径。
发明内容
利用现有虞美人自交不亲和性基因对PrsS/PrpS，发明人目的在于提供一种自交不亲和性的棉花育种新方法，从而为棉花杂交制种技术的发展奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
棉花柱头特异启动子Ghstp，长度为2003bp，具体碱基序列如SEQ ID No.1所示。
棉花花粉管特异启动子Ghpop，长度为2001bp，具体碱基序列如SEQ ID No.2所示。
PCR扩增所述棉花柱头特异启动子Ghstp和棉花花粉管特异启动子Ghpop用引物序列，具体如下：
Ghstp-F：5’-CTTTATAGTACCCAAAATTATTCTATT-3’，
Ghstp-R：5’-CATTTTTTTTGAAGATGGA AAATGAATGAG-3’；
Ghpop-F：5’-TAATCTAACCCATTAGTGAATGAGGCAA-3’，
Ghpop-R：5’-TTGTGGTT GATGACTTCATCTTCCTCAAAT-3’。
利用所述棉花柱头特异启动子Ghstp和棉花花粉管特异启动子Ghpop所构建的重组载体，包括：由棉花柱头特异启动子Ghstp和虞美人自交不亲和柱头决定基因PrsS融合构建的柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121，和由花粉管特异启动子Ghpop和虞美人自交不亲和花粉管决定基因PrpS融合构建的花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121；这两个重组载体以质粒pBI121为骨架载体构建获得，具体构建步骤为：
（一）准备虞美人自交不亲和决定基因对
虞美人自交不亲和决定基因对PrsS1（全长420 bp）和PrpS1（全长579 bp）具体基因序列如下：
柱头决定基因PrsS（420bp）：
ATGAACATATTTTATGTTATTGTGCTGCTATCGTTCTTCTTGTCCAAGTCAAGCGGTTTCTTTCCTGTTATTGAGGTGCGTATAATGAACAGAAGAGGTAACGGGAGGAGCATTGGCATCCATTGCCGATCCAAAGATAATGATCTTCAAAACCAAACAGTGACATCTGGTCATGACATGAGTTTTTCATTTAGGGAAGATTTTTTCCATACAACTCACTTCTATTGTGACCTACAATGGGATAAAGAAACAAAGTTCGGGTTTTATTCCTATCAGGCAAAGAGGGATGATGACGGTAGGTGCTCTTCCCAGTGCCTCTGGAAGATAATGGATGATGGTTTATACGGTTTTGATCAGGAGCATCAGATCTGGCAGATTTACCATTTGATAAAGAAAGAAAGGAAGGAAGGTCGAACCTGA
花粉管决定基因PrpS（579bp）：
ATGCCCCGAAGTGGAAGTGTTGTTACTTTATTTCAGTTTGTTGGAGGATTATGTACCCTGTTGGGAGTCTCAGTTGCCATAAAAGCTATTTTTGCTCAAGATTATACATTGAAAGATCTCATTATCCTAATTGTATTAGTTGCACTGTCAATAATACTGGGAGGACCAATCACCCTCACATGTGTCAAACTACTTGGCTTGGTTTTACATCGTCTTAGCTTTTCAGAAGATCAAAAGTGGGTAGTCGCATTTGGGACTGCTGCAATCTGTGATGTTCTTCTGGTACCCAAAAATATGTTACCAATGACCATTTTTTCCTTCTTATCTTCCATAATGATCTGTGTGGTCGCTGTTGGTTGGGATTGCGACCGAAGTGGCATGACCGAAGGATTTTTGGTTGGGTTTGGCAAGCTTCTACTAGTATACTTGATCAAACAAGATTTTACTTTTTCATTGTTGTGTGGATCAGTTCTCTGCCTCGCAGTTGTTGCTAAGTTCACAGAAGGTAAGGCTGAAGCCACTCCAAATCCAAATCTCGCTGGAAAAGCGGATTCCCCTCATCTTATAACTCAAGCTTAA；
（二）分别构建柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121
以Hind III和BamH I作为酶切位点，分别对质粒pBI121和含有Ghstp或Ghpop基因的pMD19质粒进行双酶切，并回收酶切片段，再利用T4 DNA酶进行连接，进一步转化、筛选后提取质粒进行验证，以确保重组构建正确；
重组过程中，以启动子Ghstp或Ghpop替换质粒pBI121中原始35S启动子，从而构建获得Ghstp- pBI121或Ghpop- pBI121这一中间质粒载体；
再以BamH I和Sac I作为酶切位点，对构建正确的Ghstp-pBI121或Ghpop- pBI121这一中间质粒载体和含有PrsS1或PrpS1的pMD19质粒分别进行双酶切，并回收酶切片段，再利用T4 DNA酶进行连接，进一步热激法转化Trans-T1感受态细胞，涂布在含有卡那抗性的LB培养基平板上，37℃培养过夜筛选，挑取阳性克隆进行验证，以确保重组构建正确；
重组过程中，以PrsS1或PrpS1代替中间质粒载体Ghstp-pBI121或Ghpop- pBI121中的GUS基因，从而构建获得柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS1-pBI121。
利用所述重组载体的棉花自交不育系的构建方法，包括如下步骤：
（一）利用组织培养技术，准备棉花无菌幼苗备用；
所采用的棉花品种例如为棉花Z24；
（二）以分别含有柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS1-pBI121的农杆菌菌液作为侵染液，分别侵染步骤（一）中无菌幼苗的下胚轴；
（三）将步骤（二）中侵染后下胚轴进一步培育形成愈伤组织，并进一步诱导分化、形成再生苗；
（四）进一步筛选、鉴定获得含有目的基因片段PrpS1或PrsS1的纯合株系。
一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法，利用农杆菌介导转化技术，分别将棉花柱头特异表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121和花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121导入受体棉花，进一步筛选获得稳定纯合的自交不亲和柱头决定基因与花粉决定基因转基因株系Gh-PrpS和Gh-PrsS；
所述转基因株系Gh-PrpS和Gh-PrsS自交不能发育，或者当以转基因株系Gh-PrsS为母本、以转基因株系Gh-PrpS为父本时，也不能发育成铃。
现有针对罂粟科虞美人的研究中，将罂粟科虞美人的S位点编码柱头和花粉的决定因子分别称为PrsS（Papaver rhoeas stigma S determinant）和PrpS（P. rhoeaspollen S）。虞美人的自交不亲和反应发生在萌动的花粉管与柱头表面之间，当PrsS配体蛋白与花粉管质膜上被识别为自己的受体蛋白PrpS发生特异性相互作用时，以一种目前还不清楚的方式引起花粉管胞外Ca2+的大量涌入，钙信号的瞬时上调会激活下游细胞程序性死亡的信号通路，从而引起花粉管生长受阻，最终导致花粉凋亡脱落。
正是基于上述针对虞美人的研究，以及为克服现有棉花杂交制种中人工制种成本高、雄性不育系育性不稳、不育基因源狭窄和恢复系的恢复力差等缺陷，本发明利用了外源的虞美人自交不亲和性基因对PrsS/PrpS，结合基因工程技术将其导入了棉花，进一步通过遗传杂交实验验证，证明了可以在棉花中导入虞美人自交不亲和系统，实现棉花自交不亲和表型，也即，证明了自交不亲和性可以在棉花中成功实现（以转基因株系Gh-PrsS为父本，Gh-PrpS为母本，不能正常产生棉铃，可实现棉花的自交不亲和性，也即，可以实现棉花由自交亲和向自交不亲和的转变）。换言之，利用该方法可以成功创制不同的棉花自交不亲和新材料，从而大幅节约人工成本，提高制种的纯度和效率，而且可以突破材料的基因型限制，实现高效制种的强优势杂交棉培育。
附图说明
图1为柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121的鉴定结果；其中：M： Trans2KPlus Ⅱ DNA Marker；1：Ghstp-PrsS1-pBI121质粒；2：BamH I和Sac I酶切Ghstp-PrsS1-pBI121质粒；
图2为陆地棉遗传转化过程，其中：A：无菌种子的萌发；B：无菌苗的培养；C：农杆菌侵染及共培养；D：诱导的愈伤组织；E：分化芽；F：再生植株；
图3为Gh-PrpS转基因植株鉴定，其中：1-5 为Gh-PrpS转基因棉花T2代单株基因组DNA，P：Ghstp-PrpS1-pBI121，TM-1为陆地棉TM-1基因组DNA，M：Trans 2000 DNA marker；
图4为Gh-PrsS转基因植株鉴定，其中：M：Trans 2000 DNA marker,4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、17、18、19、21、23、24、27、28、30、32、34、35、37为Gh-PrsS转基因棉花T2代单株因组DNA，P：Ghstp-PrsS1-pBI121，TM-1为陆地棉TM-1基因组DNA；
图5为Gh-PrpS-a2株系PrpS1基因后代分离情况，其中：M：Trans 2000 DNAmarker；1-24为Gh-PrpS-a2株系自交后代基因组DNA，P：Ghstp-PrpS1-pBI121，TM-1为陆地棉TM-1基因组DNA；
图6为 Gh-PrsS-30-7株系PrsS1基因后代分离情况，其中：M：Trans 2000 DNAmarker；P：Ghstp-PrsS1-pBI121，1-10为Gh-PrsS-30-7株系自交后代基因组DNA，TM-1为陆地棉TM-1基因组DNA；
图7为转基因棉花材料的自交不亲和表型鉴定，其中：a、TM-1、Gh-PrsS和Gh-PrpS正反交遗传学实验，杂交授粉15天成铃情况统计；b、杂交成铃数据统计，分母代表杂交总数，分子代表成铃数；c、不同的杂交组合在授粉6小时后花粉管苯胺蓝染色；注：所有实验均在温室条件下进行，TM-1为陆地棉遗传标准系，Gh-PrsS和Gh-PrpS分别为自交不亲和柱头决定基因PrsS和花粉决定基因PrpS的转基因棉花株系；
图8 自交不亲和转基因棉花材料大田表型鉴定（图8数据与图7数据主要是实验室与大田数据区别）。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
实施例1
首先需要解释的是，本申请的主要技术构思是：通过构建棉花表达载体，利用棉花柱头和花粉管特异启动子，来驱动外源的PrSI柱头决定基因PrsS1和花粉决定基因PrpS1进行表达。在将表达载体转化受体棉花并获得稳定纯合的转基因株系Gh-PrpS和Gh-PrsS后，结合陆地棉标准系TM-1，通过两两配对进行正反交，通过花粉管发育情况观察及成铃数量统计，对自交不亲和性进行实际验证。
由于外源基因表达过程中，需要用到棉花柱头和花粉管特异启动子，即棉花柱头和花粉管特异表达基因的上游约2000bp序列。 因此，本实施例首先就相关启动子获得过程简要介绍说明如下。
根据现有文献中拟南芥柱头和花粉管的特异表达基因（At5g19880和At2g25630），基于现有相关棉花测序比对结果，设计PCR扩增用引物对如下：
Ghstp-F：5’-CTTTATAGTACCCAAAATTATTCTATT-3’，
Ghstp-R：5’-CATTTTTTTTGAAGATGGA AAATGAATGAG-3’；
Ghpop-F：5’-TAATCTAACCCATTAGTGAATGAGGCAA-3’，
Ghpop-R：5’-TTGTGGTT GATGACTTCATCTTCCTCAAAT-3’；
随后，以棉花基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增；
将PCR扩增产物与pMD19（TAKARA公司产品)载体连接后，测序获得棉花柱头Ghstp和花粉管特异启动子Ghpop序列（具体操作参考现有技术即可，不再赘述）。
具体棉花柱头启动子Ghstp和花粉管特异启动子Ghpop序列如下：
棉花柱头特异启动子Ghstp（2003bp），如SEQ ID No.1所示，具体为：
CTTTATAGTACCCAAAATTATTCTATTAAAAATGGGGTAAATTAATCTCTTACATTTATCAAAAAAAAAAATTCAGTCCTCTATTAAAATTTTTATCTATTTTTATATCAACACGTGTTTTTGTTTATTTATTCTATCAGCTAAATTAATTCTTAACAACATAAATATCTGGAATTTTTAATAAAAAAATTTAATTTGTTTTTTATCTTAATTTCAATTAATTGATTCCTAATATCTATCCATACTTTCAATGTTAAAATATAAAAAGAAATCACTCAATTGGATGACATAATATAATATATATTTAATATTTCCTCCTTCTTTTTTCTGTCAAATCAAATATCAATAAAACCTTTTCTAGATTAGTCTAGCCTTAATCTATTTATTTTGGTATTTCATCAAAATTTGAAATTATTTTATAAGTTTATCACCTTGATTCTATTTTATAAAAAAAAAGTAAAGATTCCTTCTCTTTTTTTGGATTGTCCATTACGTAGTATATTATACTTATTTCGACTTATTTTATACTTATTATATTATCCTTATTACTTATTCTATTATAAGTAAATCGAAAAAATAAAGGGTTCTGAAAAATCTGGAAAAATCGAAACTAAGAATAGAAATCTTTGACGAACGGGTCCCGGAATTGTTATTATTTCGACACAAGAAAAGGGCAAGTAAACTAATATAAGAGTGATGATGAATTTAGTAATTCTATCTTGCTCTATTGTCATCCTTAATCTCTACTATAATAAAATCATTGATTGAATTGAAGTGACTCATCAACCGAGTTTTAATTCAGTTGATAAATCATTAAAAATTTATTATTTTTACAAAAAAATTATATTATTATATAAATTAATAAAAAAATTACGTATAAAAAATTTTATCATTAAAATCAAAACATCGACTCTTACATAAATTTTTAATAAATATATTTATTATTGATAATCTAAAGTATAATAAAATATATTCTAACATAATAATAAAAAACTCACTACAAAAAGAGATATACACGTACATGGCGGTGTTAAAAATAACATACATGCATGGTATTTTTTGTTTACATCATTTGACCTAAAAGGAATAAGAAGCCTTGTTCACACACACATGAATATATATATCCACATGCATGCATGGACAAAATATAATGGAACTAAGTCTACCAATTCCACGTCAGCAGCAAAAAGAAGCCAAATTATTGGTCAACTTTTGCAACCATGGAATCTGCAGTGAGAAGCCACCCAGTAATTTCTCAACTTGAAAATAGACATTCATCATTGATAGATAAGAAAATTTTTATAAAAACCCTAGAGTTTGTCGTTTTATTAAAATAACTTTTTATAATCACTTACATTTAAATAATCTTTCATAATCGAATTATGGTTTATTGATTGATGTTTACCGTTTAAAATTGTTTAGGTTCGAATTATAAAAAGATTATTTATTTTGGTGTGTGTTGATTTTTAGGGTTAAAAATAAATAATAAAATTTTAGAGAGGGTAACCTACAATTGTATCAATATATTAACAAGTGATTTCATTAATTTTGAAGGGTCTCTGTAAAAAAATTACCATTTTAGGAGGGCAGAGATATTATCAGCCCTTGTTCCAGCCCTGGCAATGATTTGCTCTTGTTCCCAAGTAAGCCTACGTTAATATATATAACTACATTTGGATTAGGTCTTGCTTGTAAAGAAAAACAGTGTAAAATGATATTTAAAAAGAAAGACATGCATGAACCCCAGATGTTAGGCTTTGAAAGTCAAAAATTAAATAAAAAGAGAAAAGATGGCAGACACGCGTTTGCATTATTGATTATCACAGAATATTACTAAAACTAATCATGATTCACACTGCAAGTCAGTAGTCACCCTATAGCAGATATACTCAAGATGCAACTTGCTAAACCCCCCAGCTATAAGCCTCTCTACCCTCTATATAAAGGACCTTCAATGGCGTCTCTTAAAGCATCTCATTCATTTTCCATCTTCAAAAAAAATG
棉花花粉管特异启动子Ghpop（2001bp），碱基序列如SEQ ID No.2所示，具体为：
TAATCTAACCCATTAGTGAATGAGGCAAGTCAATTAGTTGAAGTCCGGTGCACATTTTCTTGTGAGTTTGAATCCTTAAAATACTTACCGTTTGGTTGTAATTATTTATGCATTTCTTATGAAGCAATATGGCTTTAATTTAATATCTACTCAGCCACAGATGACCCGCTAGTTACTACAAAATTACTATTTCCATAGTCGTTCTTCCTGTTATTTTTTCCAGTTCAGTTCTTAGCTTGATCTCAAGGGCTTCTAGAATTCCTCTAAATCGACTCCTAACCCTCCATTTTCTAATCCTGATATTGCCATACACTTCCTTATTACATGTTCTCACAGCCTACATAAATTTTGATATCATTTTAGAAAATGATCGTTGGTCCTTCCACGACTTCTTGACCAGGCCATCAATTGATGGAAGGACCAGCCTGAAGACTTAATCAAAACATTTTAAAGTTTAAGAGCTGATTCAAAATCTGGGCCATAATTTGAGGACATTGGTAAAATTAACCCCAAAAGAAATGATCAGATTCTCGATCTACAAATACGAACACCAGAGCAATTGCAGTTGTTAGCACCATTAATTAACATCAAATTTTGGTGATGGCAACCTAACATTGTATCATATTTTATCCCTGCCTTGCCGCCAATGATGTCAGTCTAACCTTATATGTTGTTCCAAAAATTAAACTAGTTGATTCGGTGTTGAAAGCCTACCAATATTTTATTATCGTCATACCTGCCATGAGATTCGTTCATCTCATGGTCTTCAAAAAATTAGCTTATTCCGACAAGCAGGCCCTCCTATCTAAAGTGTAAGGTTTCAACTGCTCTCACCCAACATCCACTTGTGTCCCTCCTTTCCAGGCGACTGCTATTTCTTTTGAACAGAACATGGGGTGACCCCTTTTTGGGGAATTATTATTACAGCAATGGTTACTCTAGGGAAACTCAGAATCTATGATGGACATTCAACTTCCTCCCATGTATAAAGTTGTTTTTTATTGAAATTTACAAGCAACATGCACTTTCTTTCTACACTCATCAAAATTAATTTAGTTAAAAGTACTATCATTTTCGTAATTCTCCGTCCCCTCCCTCGGATTGCGGAAAAATAAGGAAAACTTTTTACCAACAAATTTTCATTGCGTCCAAGTAAATCAGATGTAACGTTAACTCTTTGGCTTGGAGATATTTCACATGTTAGATCACTGGAAAGCACTAAACTTTATCTGTTAGGCAGAAGCAAAAAATAAAGGTAATATGTCTACGTTGTACCATTATTGATTTATTGTTGCATGTTGAAGTCAAGTTTCTTTTTTCTGGGTTTCTTAGCCATATTAAAAGTGACAGAAAAATGTTAAAATTGCTTTAAAATTTTGCCAAATCGATGGCGTAATTTGTGGGATAAATGGAGCACTTAATGGCAATATATGTATCTAGTTCCCGACATTCATAGATTCAATAATTTGTAAGACAGCCTTTAAATTTACCAACTTTTATTGACTTTAAGAACTTATGTTCAACATTTTTCAGTCATTTTTATAAACTTTTTGTTTAAATGCTTGTGATGTACATTGAAACCTTTCTGGATTTAACCATATGTTTCCTTTTCGTCATAAACAAACTTGTTGACAGGGTTGCAAAGACTATGTGCCCCCGGCCCTTTCATCATTTAACTTTATCGTAAAACTATTTCTTTCTTTATGAATGGAGTTGTCGGTGAAACAATACACGTATGTAGATACTGTAGACCTTTTAATTGTGTGCATGCATACACACACGCGAAAGTGAGAGGAAAAGAGATTGGTCCCATAAAAGAAAAAAAAAATGCTCTCAAGTTGGTGATGAATCCTTACATACTAAGTTAATATATATATAATACAAACAAAAACAGAGATTGGCGCCCGAAAGTTTAGCAGTATATATAAAGGCTAAAAGGAAGATCTTATGCATTCACGGACTAATAAACCTATTTGAGGAAGATGAAGTCATCAACCACAA。
实施例2
在实施例1基础上，发明人以质粒pBI121为骨架载体（一种常用的可公开获得质粒），以外源的虞美人自交不亲和决定基因对为目的基因，结合实施例1所获得的启动子，构建两个表达载体：将棉花柱头特异启动子Ghstp和虞美人自交不亲和柱头决定基因PrsS融合构建柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121；将花粉管特异启动子Ghpop和虞美人自交不亲和花粉管决定基因PrpS融合构建花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121。具体构建过程简介如下。
（一）准备虞美人自交不亲和决定基因对
本申请中所采用的虞美人自交不亲和决定基因对PrsS1（全长420 bp）和PrpS1（全长579 bp），可采用PCR扩增或人工合成方式等现有方法获得；本实施例中所采用基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成后重组在pMD19载体上，从而便于后续应用。
所述虞美人自交不亲和决定基因对PrsS/PrpS具体基因序列可参考如下：
柱头决定基因PrsS（420bp）：
ATGAACATATTTTATGTTATTGTGCTGCTATCGTTCTTCTTGTCCAAGTCAAGCGGTTTCTTTCCTGTTATTGAGGTGCGTATAATGAACAGAAGAGGTAACGGGAGGAGCATTGGCATCCATTGCCGATCCAAAGATAATGATCTTCAAAACCAAACAGTGACATCTGGTCATGACATGAGTTTTTCATTTAGGGAAGATTTTTTCCATACAACTCACTTCTATTGTGACCTACAATGGGATAAAGAAACAAAGTTCGGGTTTTATTCCTATCAGGCAAAGAGGGATGATGACGGTAGGTGCTCTTCCCAGTGCCTCTGGAAGATAATGGATGATGGTTTATACGGTTTTGATCAGGAGCATCAGATCTGGCAGATTTACCATTTGATAAAGAAAGAAAGGAAGGAAGGTCGAACCTGA
花粉管决定基因PrpS（579bp）：
ATGCCCCGAAGTGGAAGTGTTGTTACTTTATTTCAGTTTGTTGGAGGATTATGTACCCTGTTGGGAGTCTCAGTTGCCATAAAAGCTATTTTTGCTCAAGATTATACATTGAAAGATCTCATTATCCTAATTGTATTAGTTGCACTGTCAATAATACTGGGAGGACCAATCACCCTCACATGTGTCAAACTACTTGGCTTGGTTTTACATCGTCTTAGCTTTTCAGAAGATCAAAAGTGGGTAGTCGCATTTGGGACTGCTGCAATCTGTGATGTTCTTCTGGTACCCAAAAATATGTTACCAATGACCATTTTTTCCTTCTTATCTTCCATAATGATCTGTGTGGTCGCTGTTGGTTGGGATTGCGACCGAAGTGGCATGACCGAAGGATTTTTGGTTGGGTTTGGCAAGCTTCTACTAGTATACTTGATCAAACAAGATTTTACTTTTTCATTGTTGTGTGGATCAGTTCTCTGCCTCGCAGTTGTTGCTAAGTTCACAGAAGGTAAGGCTGAAGCCACTCCAAATCCAAATCTCGCTGGAAAAGCGGATTCCCCTCATCTTATAACTCAAGCTTAA。
（二）分别构建柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121
由于两种重组表达载体构建方法相同，因此仅以柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121为例，就具体构建过程简介如下。
以Hind III和BamH I作为酶切位点，分别对质粒pBI121和实施例1中含有Ghstp基因的pMD19质粒进行双酶切，并回收酶切片段，再利用T4 DNA酶进行连接，进一步转化、筛选后提取质粒进行验证，以确保重组构建正确。
重组过程中，以启动子Ghstp替换质粒pBI121中原始35S启动子，从而构建获得Ghstp- pBI121这一中间质粒载体。
再以BamH I和Sac I作为酶切位点，对构建正确的Ghstp-pBI121这一中间质粒载体和含有PrsS1的pMD19质粒分别进行双酶切，并回收酶切片段，再利用T4 DNA酶进行连接（4℃连接过夜），进一步热激法转化Trans-T1感受态细胞，涂布在含有卡那抗性的LB培养基平板上，37℃培养过夜筛选，挑取阳性克隆进行验证，以确保重组构建正确。
重组过程中，以PrsS1代替中间质粒载体Ghstp-pBI121中的GUS基因，从而构建获得柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121（鉴定结果如图1所示）。对含有构建正确的重组表达载体的菌落进行扩增后，提取质粒备用。
相同方法获得花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS1-pBI121，并提取质粒备用。
进一步地，将柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121、花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS1-pBI121分别转化农杆菌以备后续侵染备用。
上述操作过程中，具体酶切时，25μL酶切体系参考设计如下：
待酶切质粒，10μL；
内切酶1，1μL（50000U）；
内切酶2，1μL（50000U）；（内切酶1、内切酶2即双酶切时所对应内切酶）
Cut Smart Buffer，2.5μL；
ddH2O补至25μL；
37℃酶切4h。
实施例3
在实施例2基础上，发明人利用农杆菌介导转化技术，进一步将实施例2的棉花柱头特异表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121和花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121，采用农杆菌介导转化技术导入受体棉花Z24，通过目的基因PCR检测和自交后代分离情况检测，筛选获得两组稳定纯合的自交不亲和柱头决定基因与花粉决定基因转基因株系Gh-PrpS和Gh-PrsS。具体实验过程简介如下。
（一）制备转基因幼苗
参考现有技术（具体流程如图2所示），将棉花种子（Z24）萌发后培养无菌苗，再将下胚轴切成小段后分别用转化有花柱头特异表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121和花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121的农杆菌菌液侵染，并进行共培养，诱导愈伤组织直至产生分化芽，继续培养获得再生苗。相关操作可参考如下。
（1）无菌苗培养：
发苗培养基：15 g葡萄糖，2.5 g植物凝胶，2.215g MS无机盐，加ddH2O定容至1L，pH调至5.9，121℃高温灭菌30 min备用；
中24棉籽浓硫酸脱绒后先用无菌水清洗2-3遍去除杂质，再用6%双氧水浸泡24 h，再用无菌水清洗3-4遍，接种于萌发培养基（同发苗培养基），每瓶约接种3-4粒，暗培养3天，光培养4-7天出苗，即为无菌苗。
（2）农杆菌侵染下胚轴
共培养培养基：称取30 g葡萄糖，2.5 g植物凝胶，4.43g MS无机盐，0.1 mg激动素（KT），0.1 mg二氯苯氧乙酸（2,4-D），50 mg乙酰丁香酮（AS），量取B5有机物母液2 mL，加ddH2O定容至1L，pH调至5.9，121℃高温灭菌30 min；
下胚轴切断及侵染：取步骤（1）中的无菌苗，去除子叶和根后，用手术刀在湿润的滤纸上将下胚轴切成0.5 cm左右长度的小段；
将切段置于OD600为0.5的农杆菌中侵染5-20 min，期间不断摇晃以确保侵染均匀；将侵染完的下胚轴挑出，置于灭菌滤纸上，吸干切段表面多余菌液，风干；
将切段整齐排放在隔有一层滤纸的共培养培养基上，做好标记，培养箱暗培养48h。
（3）诱导愈伤组织
选择培养基：30 g葡萄糖，3 g植物凝胶，4.43g MS无机盐，0.1 mg KT，0.1 mg 2,4-D，量取B5有机物母液2 mL，加ddH2O定容至1L，pH调至5.9，121℃高温灭菌30 min，冷却后加入卡那霉素（Kana）50 mg/L和头孢霉素400 mg/L）；
诱导愈伤组织：将步骤（2）中共培养后侵染茎段转移至选择培养基，5-7段/瓶，20-30 d继代一次，直至长出愈伤组织。
（4）诱导形成胚状体及培育成再生苗
分化培养基：30 g葡萄糖，2.2 g植物凝胶，4.43g MS无机盐，0.01 mg KT，0.04 mg吲哚乙酸（IAA），量取B5有机物母液2 mL，加ddH2O定容至1 L，pH调至5.9，121℃高温灭菌30min，冷却后加入卡那霉素（Kana）50 mg/L和头孢霉素400 mg/L；
胚状体诱导培养基：30 g蔗糖，2.5 g植物凝胶，4.43g MS无机盐，0.02 mg KT，0.02 mg IAA，量取B5有机物母液2 mL，加ddH2O定容至1L，pH调至5.9，121℃高温灭菌30min；冷却后加入卡那霉素（Kana）50 mg/L；
再生苗诱导培养基：30 g蔗糖，2.5 g植物凝胶，4.43g MS无机盐，0.02 mg IAA，量取B5有机物母液2 mL，加ddH2O定容至1L，pH调至5.9，121℃高温灭菌30 min；
成苗培养基：15 g蔗糖，2.5 g植物凝胶，2.215g MS无机盐，量取B5有机物母液2mL，加ddH2O定容至1 L，pH调至5.9，121℃高温灭菌30 min；
首先将步骤（3）中生长良好的愈伤组织转移至分化培养基上，培养直至分化；再将分化部分转移到胚状体诱导培养基上，继续培养直至长出胚状体；将生长较大的胚状体转移转移至再生苗诱导培养基培养直至出苗，最后再将小苗移植入成苗培养基培养使其长成植株（整个培养期间，根据需要每20~30天左右更换一次对应培养基）。
（二）阳性植株鉴定及纯合系获得
利用PCR鉴定方法（再生苗现蕾后取存活植株嫩叶，CTAB法提取基因组DNA，利用PrpS1引物对PrpSF/R、或者PrsS1引物对PrsSF/R进行PCR反应，鉴定扩增产物与目的片段PrpS1、PrsS1是否符合），对步骤（一）中所获得再生苗进行鉴定。
实验过程中，步骤（一）中共获得PrpS1转基因棉花T2代5株，分别编号Gh-PrpS-a1-6，鉴定结果表明，这5株转基因棉中均含有目的基因片段（结果如图3所示）。步骤（一）中共PrsS1转基因棉花T2代37株，分别编号Gh-PrsS1-37，结果显示Gh-PrsS-4、5、6、7、9、10、11、13、14、15、17、18、19、20、21、23、24、27、28、30、32、34、35、37含有目的片段PrsS1（结果如图4所示），部分植株不含目的片段。
（三）获得转基因纯合株系并鉴定
对步骤（二）中所获得转基因棉花，为明确目的片段是否能在后代中稳定遗传（也即，为确定所获得转基因植株是否为纯合株系），将各转基因植株后代进一步进行培育，以子叶为样品提取基因组DNA进行PCR检测，结果表明，后代均含有目的基因片段PrpS1或PrsS1（部分结果如图5、图6所示），也即，步骤（二）所获植株均为纯合株系。
实施例4
在实施例3基础上，发明人进一步进行了遗传杂交实验，以对转基因株系的遗传发育情况（自交不亲和表型）进行评价。具体实验情况简介如下。
（一）棉花种植过程
幼苗培育：流水下浸泡棉种（转基因株系Gh-PrpS、Gh-PrsS及对照TM-1陆地棉）48h左右，待大部分种子露出胚根时播植于营养钵内，待幼苗长至两叶一心时进行移栽；
温室种植：对移栽棉苗及时除虫、除草、浇水、施肥，温度25~30℃，湿度65%左右，培养直至收获自交子一代，随后将此自交子一代进行大田杂交实验；
大田杂交实验：四月中旬在大田（河南大学金明校区东操场试验田）种植上述子一代种植，按需除虫、除草、浇水、施肥，六月下旬开始进行杂交实验。
（二）具体杂交实验操作方法
自交方法：开花前一日下午6点左右，用小夹子夹住花苞顶端使其花瓣不能展开，挂牌记录开花日期；
杂交方法：开花前一日下午6点左右将杂交材料人工去雄，剥去萼片、花瓣和雄蕊，放入牛皮纸袋中并做好标记，柱头套上弯头吸管避免其他花粉污染；开花当天上午8点左右，人工授上相应的花粉，授粉完成后再次套上弯头吸管，挂牌记录亲本信息及开花日期。
（三）具体杂交实验设计
正反交实验
正交：以Gh-PrpS为母本，Gh-PrsS为父本进行杂交，30天后统计成铃率；
反交：以Gh-PrsS为母本，Gh-PrpS为父本进行杂交，30天后统计成铃率；
对照实验
自交：Gh-PrpS、Gh-PrsS、TM-1分别自交，30天后统计自交成铃率；
野生种杂交对照：以Gh-PrpS为母本，TM-1为父本进行杂交；以Gh-PrsS为母本，TM-1为父本进行杂交；以TM-1为母本，Gh-PrpS为父本进行杂交；以TM-1为母本，Gh-PrsS为父本进行杂交，分别统计30天后成铃率；
自由交配：
此处理组花朵不做处理，收获单株种子进行纯合植株鉴定，并作为对照。
具体实验设计及具体实验结果如图7、图8（图8为进一步大田实验统计结果）所示，具体如下。
（1）花粉管发育情况
利用两组转基因株系分别与陆地棉标准系TM-1的正反交实验，来观察评价花粉管发育情况。具体观察评价时，利用苯胺蓝染色的方法，在体式显微镜下观察不同杂交组合在授粉6小时后的花粉管发育情况。
具体实验操作参考如下：
在棉花全面现蕾开花后，进行杂交操作（同时自交作为对照）。在授粉后6小时左右（即下午2点左右）用消毒的镊子取下柱头，立即放入预冷的卡诺氏固定液中，使用真空泵抽气5 min保证样品下沉，与固定液充分接触，4℃固定24小时以上。将固定好的柱头用95%乙醇冲洗三到四次，放入70%乙醇中4℃保存。检测前，用2M NaOH溶液软化柱头24小时以上，软化时间以样品状态为准，达到透明状态即可。染色前，用蒸馏水冲洗三到四次，用尖头镊子沿合生雌蕊的心皮间裂缝将其分成三到五条，放入脱色苯胺蓝染液中染色过夜。取样品于载玻片上，滴加适量蒸馏水，小心盖上盖玻片（必要时可轻压）即可。将玻片倒放，置于荧光倒置显微镜（Olympus DP 80）下，打开汞灯和紫外滤光片观察，花粉管呈现荧光蓝色，调节焦距进行拍照，照片放大倍数40倍。
结果显示，TM-1自交、Gh-PrpS自交和Gh-PrsS自交的组合花粉管发育正常（图7中的三个自交组合）；转基因株系Gh-PrsS为父本Gh-PrpS为母本的杂交组合花粉管发育亦为正常（图7中的Gh-PrpS×Gh-PrsS组合）；而转基因株系Gh-PrpS为父本Gh-PrsS为母本的杂交组合，则呈现出花粉管伸长停滞的状态，说明自交不亲和性影响了花粉管的正常发育。（图7中的Gh-PrsS×Gh-PrpS SI组合）
（2）棉铃数量情况
杂交后继续培育，统计不同杂交组合的成铃数。需要说明的是，成铃数统计标准为：自开花之日起，一个月内能够正常膨大、生长即算作成铃，一个月后由于取样、虫害等原因丢失的棉铃不算作成铃（未成铃）。
结果表明：转基因株系与标准系TM-1杂交均可以正常成铃，说明转基因株系的配子体和孢子体发育是完全正常的。以转基因株系Gh-PrsS为母本，以转基因株系Gh-PrpS为父本不能成铃，143个杂交组合均未成铃，反交则结铃正常，说明虞美人的自交不亲和基因对可以在棉花中发挥功能，实现了自交不亲和。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学
<120> 一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2003
<212> DNA
<213> Gossypium spp
<400> 1
ctttatagta cccaaaatta ttctattaaa aatggggtaa attaatctct tacatttatc 60
aaaaaaaaaa attcagtcct ctattaaaat ttttatctat ttttatatca acacgtgttt 120
ttgtttattt attctatcag ctaaattaat tcttaacaac ataaatatct ggaattttta 180
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atggacattc aacttcctcc catgtataaa gttgtttttt attgaaattt acaagcaaca 1020
tgcactttct ttctacactc atcaaaatta atttagttaa aagtactatc attttcgtaa 1080
ttctccgtcc cctccctcgg attgcggaaa aataaggaaa actttttacc aacaaatttt 1140
cattgcgtcc aagtaaatca gatgtaacgt taactctttg gcttggagat atttcacatg 1200
ttagatcact ggaaagcact aaactttatc tgttaggcag aagcaaaaaa taaaggtaat 1260
atgtctacgt tgtaccatta ttgatttatt gttgcatgtt gaagtcaagt ttcttttttc 1320
tgggtttctt agccatatta aaagtgacag aaaaatgtta aaattgcttt aaaattttgc 1380
caaatcgatg gcgtaatttg tgggataaat ggagcactta atggcaatat atgtatctag 1440
ttcccgacat tcatagattc aataatttgt aagacagcct ttaaatttac caacttttat 1500
tgactttaag aacttatgtt caacattttt cagtcatttt tataaacttt ttgtttaaat 1560
gcttgtgatg tacattgaaa cctttctgga tttaaccata tgtttccttt tcgtcataaa 1620
caaacttgtt gacagggttg caaagactat gtgcccccgg ccctttcatc atttaacttt 1680
atcgtaaaac tatttctttc tttatgaatg gagttgtcgg tgaaacaata cacgtatgta 1740
gatactgtag accttttaat tgtgtgcatg catacacaca cgcgaaagtg agaggaaaag 1800
agattggtcc cataaaagaa aaaaaaaatg ctctcaagtt ggtgatgaat ccttacatac 1860
taagttaata tatatataat acaaacaaaa acagagattg gcgcccgaaa gtttagcagt 1920
atatataaag gctaaaagga agatcttatg cattcacgga ctaataaacc tatttgagga 1980
agatgaagtc atcaaccaca a 2001

Claims (4)

1.一种棉花自交不育系构建用重组载体，其特征在于，所述重组载体包括：由棉花柱头特异启动子Ghstp和虞美人自交不亲和柱头决定基因PrsS融合构建的柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121，和由花粉管特异启动子Ghpop和虞美人自交不亲和花粉管决定基因PrpS融合构建的花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121；这两个重组载体以质粒pBI121为骨架载体构建获得；
所述棉花柱头特异启动子Ghstp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示；
所述棉花花粉管特异启动子Ghpop，其碱基序列如SEQ ID No.2所示；
所述重组载体通过如下步骤构建获得：
（一）准备虞美人自交不亲和决定基因对
虞美人自交不亲和决定基因对PrsS和PrpS具体基因序列如下：
柱头决定基因PrsS：
ATGAACATATTTTATGTTATTGTGCTGCTATCGTTCTTCTTGTCCAAGTCAAGCGGTTTCTTTCCTGTTATTGAGGTGCGTATAATGAACAGAAGAGGTAACGGGAGGAGCATTGGCATCCATTGCCGATCCAAAGATAATGATCTTCAAAACCAAACAGTGACATCTGGTCATGACATGAGTTTTTCATTTAGGGAAGATTTTTTCCATACAACTCACTTCTATTGTGACCTACAATGGGATAAAGAAACAAAGTTCGGGTTTTATTCCTATCAGGCAAAGAGGGATGATGACGGTAGGTGCTCTTCCCAGTGCCTCTGGAAGATAATGGATGATGGTTTATACGGTTTTGATCAGGAGCATCAGATCTGGCAGATTTACCATTTGATAAAGAAAGAAAGGAAGGAAGGTCGAACCTGA
花粉管决定基因PrpS：
ATGCCCCGAAGTGGAAGTGTTGTTACTTTATTTCAGTTTGTTGGAGGATTATGTACCCTGTTGGGAGTCTCAGTTGCCATAAAAGCTATTTTTGCTCAAGATTATACATTGAAAGATCTCATTATCCTAATTGTATTAGTTGCACTGTCAATAATACTGGGAGGACCAATCACCCTCACATGTGTCAAACTACTTGGCTTGGTTTTACATCGTCTTAGCTTTTCAGAAGATCAAAAGTGGGTAGTCGCATTTGGGACTGCTGCAATCTGTGATGTTCTTCTGGTACCCAAAAATATGTTACCAATGACCATTTTTTCCTTCTTATCTTCCATAATGATCTGTGTGGTCGCTGTTGGTTGGGATTGCGACCGAAGTGGCATGACCGAAGGATTTTTGGTTGGGTTTGGCAAGCTTCTACTAGTATACTTGATCAAACAAGATTTTACTTTTTCATTGTTGTGTGGATCAGTTCTCTGCCTCGCAGTTGTTGCTAAGTTCACAGAAGGTAAGGCTGAAGCCACTCCAAATCCAAATCTCGCTGGAAAAGCGGATTCCCCTCATCTTATAACTCAAGCTTAA；
（二）分别构建柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121
以Hind III和BamH I作为酶切位点，分别对质粒pBI121和含有Ghstp或Ghpop基因的pMD19质粒进行双酶切，并回收酶切片段，再利用T4 DNA酶进行连接，进一步转化、筛选后提取质粒进行验证，以确保重组构建正确；
重组过程中，以启动子Ghstp或Ghpop替换质粒pBI121中原始35S启动子，从而构建获得Ghstp-pBI121或Ghpop-pBI121这一中间质粒载体；
再以BamH I和Sac I作为酶切位点，对构建正确的Ghstp-pBI121或Ghpop-pBI121这一中间质粒载体和含有PrsS或PrpS的pMD19质粒分别进行双酶切，并回收酶切片段，再利用T4DNA酶进行连接，进一步热激法转化Trans-T1感受态细胞，涂布、筛选，挑取阳性克隆进行验证，以确保重组构建正确；
重组过程中，以PrsS或PrpS代替中间质粒载体Ghstp-pBI121或Ghpop-pBI121中的GUS基因，从而构建获得柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121。
2.如权利要求1所述棉花自交不育系构建用重组载体，其特征在于，PCR扩增制备所述棉花柱头特异启动子Ghstp和所述棉花花粉管特异启动子Ghpop时，引物序列设计为：
Ghstp-F：5’-CTTTATAGTACCCAAAATTATTCTATT-3’，
Ghstp-R：5’-CATTTTTTTTGAAGATGGAAAATGAATGAG-3’；
Ghpop-F：5’-TAATCTAACCCATTAGTGAATGAGGCAA-3’，
Ghpop-R：5’-TTGTGGTTGATGACTTCATCTTCCTCAAAT-3’。
3.利用权利要求1所述重组载体的棉花自交不育系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（一）利用组织培养技术，准备棉花无菌幼苗备用；
（二）以分别含有柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121的农杆菌菌液作为侵染液，分别侵染步骤（一）中无菌幼苗的下胚轴；
（三）将步骤（二）中侵染后下胚轴进一步培育形成愈伤组织，并进一步诱导分化、形成再生苗；
（四）进一步筛选、鉴定获得含有目的基因片段PrpS或PrsS的纯合株系。
4.如权利要求3所述棉花自交不育系的构建方法，其特征在于，步骤（一）中，所采用的棉花品种为棉花Z24。
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