CN113912687A

CN113912687A - 一种改变植物茎叶及花形态特性的方法及应用

Info

Publication number: CN113912687A
Application number: CN202111219429.6A
Authority: CN
Inventors: 蔡兆明; 程春红; 苏少东; 向美琴; 石家宇; 许芳; 周美谷; 郭海燕; 刘金枝; 黄星诚
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2021-10-20
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-10-20
Also published as: CN113912687B

Abstract

本发明公开了一种改变植物茎叶及花形态特性的方法及应用，涉及植物培育技术领域。本发明方法包括：克隆茎瘤芥中基因BjuB033714，以pTF101为目的载体，采用BamH I和Sma I作为酶切位点构建以CAMV35S作为启动子的过表达载体；以茎瘤芥全基因组cDNA为模板，采用PCR的方法扩增BjuB033714的CDS序列；将扩增出的BjuB033714基因进行电泳，并利用回收BjuB033714基因扩增产物片段；使用100μg/mL壮观霉素的LB液体培养基对PCR扩增呈阳性的单菌落进行扩增培养并提取质粒；使用限制性内切酶Sma I和BamH I对提取的质粒进行双酶切以鉴定载体是否构建成功。本发明公布了一种可改变植物茎和花等形态特征的方法，该方法可用于优质观赏植物品种或作物新品种的培育，包括观赏花卉品种和经济作物，具有显著的经济价值。

Description

一种改变植物茎叶及花形态特性的方法及应用

技术领域

本发明属于植物培育技术领域，特别是涉及一种改变植物茎叶及花形态特性的方法及应用。

背景技术

叶形态和花形态等是观赏植物的重要方面，优质的观赏植物往往具有枝繁叶茂、花瓣形态与众不同等特征，为培育更加具有观赏性的植物往往针对植物的花序形态及花形态等特征进行改良。

目前，在培育观赏植物和作物新品种时，能引起较好性状的基因比较稀缺。针对此问题，我们筛选到了具有在调控植物叶片和花发育过程中发挥作用的新的基因，结合分子生物学等相关操作方法，可为培育优良观赏及作物品种提供资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改变植物茎叶及花形态特性的方法及应用，以解决了现有的问题：在培育观赏植物和作物新品种时，能引起较好性状的基因比较稀缺。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种改变植物茎叶及花形态特性的方法，包括以下步骤：

克隆茎瘤芥中基因BjuB033714，以pTF101为目的载体，采用 BamH I和 Sma I 作为酶切位点构建以CAMV35S作为启动子的过表达载体；

以茎瘤芥全基因组cDNA为模板，采用PCR的方法扩增BjuB033714的CDS序列；

将扩增出的BjuB033714基因进行电泳，并利用回收BjuB033714基因扩增产物片段；

使用100 μg/mL壮观霉素的LB液体培养基对PCR扩增呈阳性的单菌落进行扩增培养并提取质粒；

使用限制性内切酶Sma I和BamH I对提取的质粒进行双酶切以鉴定载体是否构建成功。

进一步优选的，其中，采用PCR的方法扩增BjuB033714的CDS序列，其扩增引物为：

BjuB033714-F：CCAAGCTTATGGAGCCAAGGCAACATA；

BjuB033714-R：CGGGATCCTCAGTTCAGACATAGCTT。

进一步优选的，其中，将扩增出的BjuB033714基因进行电泳，并利用回收BjuB033714基因扩增产物片段，主要包括：

使用限制性内切酶Sma I和BamH I分别对BjuB033714基因扩增产物和pTF101载体进行双酶切，采用1%琼脂糖凝胶电泳对双酶切产物进行检测并回收；

用T4DNA连接酶将酶切后的BjuB033714基因片段连接酶切后的pTF101载体，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；

将转化后培养40分钟的菌液涂布在含有100 μg/mL壮观霉素的LB固体培养基上；

在37℃培养箱中倒置培养16小时以筛选具有抗性的单菌落；

采用2 Taq DNA聚合酶，以培养基上长出的单菌落为模板对单菌落中的BjuB033714基因进行菌落PCR扩增；

通过1%琼脂糖凝胶电泳检测含有BjuB033714基因片段的阳性克隆。

上述的改变植物茎叶及花形态特性的方法的应用，所述方法应用于观赏花卉品种的培育。

上述的改变植物茎叶及花形态特性的方法的应用，所述方法应用于经济作物的培育。

本发明具有以下有益效果：

本发明公布了一种改变植物叶片数目和叶面积，改变花序形态、花瓣形态和增加花瓣数目，以及使植物茎上长出花组织的方法，通过转基因等生物学手段将本发明中的基因导入植物中，可培育出具有新形态的观赏植物和农作物；

本研究公布了一种可改变植物茎和花等形态特征的方法，该方法可用于优质观赏植物品种或作物新品种的培育，包括观赏花卉品种和经济作物，具有显著的经济价值。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明为一种改变植物茎叶及花形态特性的方法。

本发明采用生物领域前沿的生物工程技术将经济作物茎瘤芥中的BjuB033714基因以转基因的形式导入到其它植物中，使植物表现出在子叶上产生了不定芽可发育为完整的植株，植物叶片形态改变、花序发育提前终止，植株茎上产生额外的花组织以及植株花瓣形态改变及花瓣数目增加等性状，其中花瓣数目增多和茎上生花的性状是在培育新颖的花卉品种方面具有巨大潜力和应用价值。

参看图1，本发明克隆了茎瘤芥中的一个基因BjuB033714（蛋白编码序列全长为870 bp），以pTF101为目的载体，采用BamH I和 Sma I 作为酶切位点构建以CAMV35S作为启动子的过表达载体。

具体的，参看图2：

图2为BjuB033714基因构建至pTF101过表达载体过程。A：BjuB033714基因PCR扩增产物电泳检测图。M为DNA Marker D2000,1为BjuB033714扩增产物电泳条带；B：BjuB033714基因连接pTF101载体并转化大肠杆菌后菌落PCR检测结果，M为DNA Marker D2000,1-12为12个单克隆菌落PCR扩增产物电泳条带，N为阴性对照，P为阳性对照；C图为构建完毕的BjuB033714-Ptf101载体酶切鉴定电泳检测图，M为DNA Marker D2000 Plus,1为BjuB033714-pTF101载体酶切鉴定电泳条带。

BjuB033714过表达载体构建流程为：

如图2 A:首先以茎瘤芥全基因组cDNA为模板，采用PCR的方法扩增BjuB033714的CDS序列，扩增引物为：BjuB033714-F：CCAAGCTTATGGAGCCAAGGCAACATA， BjuB033714-R：CGGGATCCTCAGTTCAGACATAGCTT。

如图2 B：将扩增出的BjuB033714基因进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶回收试剂盒回收BjuB033714基因扩增产物片段。使用Thermo公司的限制性内切酶Sma I和BamH I分别对BjuB033714基因扩增产物和pTF101载体进行双酶切，采用1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测并回收，用T4DNA连接酶将酶切后的BjuB033714基因片段连接酶切后的pTF101载体，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并将转化后培养40分钟的菌液涂布在含有100 μg/mL壮观霉素的LB固体培养基上，并在37℃培养箱中倒置培养16小时以筛选具有抗性的单菌落，采用2 Taq DNA聚合酶，以培养基上长出的单菌落为模板对单菌落中的BjuB033714基因进行菌落PCR扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测含有BjuB033714基因片段的阳性克隆。

如图2 C：使用100 μg/mL壮观霉素的LB液体培养基对PCR扩增呈阳性的单菌落进行扩增培养并提取质粒，使用限制性内切酶Sma I和BamH I对提取的质粒进行双酶切以鉴定载体是否构建成功。采用1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测，能够酶切下目的片段的载体即为构建成功的BjuB033714融合GFP的过表达载体。

具体的，为方便进一步理解，我们提供如下具体实施例：

通过转基因技术在拟南芥中超表达BjuB033714。采用蘸花转化法将含有BjuB033714-pTF101载体的GV3101农杆菌侵染拟南芥花顶端分生组织，将BjuB033714导入到拟南芥基因组中并使其表达。

具体参看图3：

图3 为BjuB033714转基因阳性拟南芥植株筛选。A：阳性对照；B：阴性对照；C：转基因拟南芥T1代苗，红色星号标记为转基因阳性植株。

利用pTF101载体上的抗除草剂基因（BAR）对转基因操作后的拟南芥种子进行阳性株系的筛选。将转基因后收取的种子放入硅胶中干燥2周使其休眠，取休眠后的种子经5%次氯酸钠消毒后播种于含有除草剂basta（每100 mL培养基加入5 μL 10%的basta）的0.8%的MS固体培养上，光下培养1周后选择存活的阳性转基因幼苗，将转基因苗阳性移入装有蛭石和营养土（3：1）的花盆中放在光照培养室中继续培养。单株收获不同株系转基因拟南芥植株种子，继续种植并使其自交，直至筛选出纯合的转基因植株。

具体参看图4：

图4 为拟南芥野生型植株（Col-0）和3个纯合转基因株系中BjuB033714基因表达水平检测。上面一行为BjuB033714基因在不同植株中的PCR扩增条带，下面一行为内参基因AtACTIN8在不同植株中的PCR扩增条带。

通过自交的方法对纯合转基因拟南芥株系的筛选，获得3个纯合株系，分别为BjuB033714-OE-1、BjuB033714-OE-2和BjuB033714-OE-3。采用RT-PCR的方法检测拟南芥野生型（Col-0）和2个转基因株系中的BjuB033714基因表达水平，以确定在转基因株系中实现了BjuB033714基因的超表达。分别提取野生型拟南芥植株和3个转基因株系的总RNA，并将其反转录为cDNA。分别以此cDNA为模板，扩增BjuB033714基因在不同样本中的表达水平。BjuB033714基因扩增引物为：RT-BjuB033714-F：CAAGGCAACATAATCACCAAGC，RT-BjuB033714-R：GATCTGTCGTTGGTGTCCATC。内参基因为拟南芥AtACTIN8，扩增引物为RT-AtACTIN8-F：TCAGCACTTTCCAGCAGATG，RT-AtACTIN8-R：ATGCCTGGACCTGCTTCAT。通过扩增拟南芥AtACTIN8调整cDNA模板用量，使其在不同样本中模板用量保持相同，再次对BjuB033714基因进行扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测不同拟南芥植株中BjuB033714基因表达水平。通过基因表达检测可知在拟南芥野生型植株中无法检测到BjuB033714基因的表达，而在3个拟南芥转基因株系中均可检测到BjuB033714基因的表达，说明实现了在3个筛选到的拟南芥纯合转基因株系中对BjuB033714基因的超表达。

具体参看图5：

图5为BjuB033714蛋白定位在细胞质和细胞核中。A-C：BjuB033714蛋白在烟草叶下表皮细胞中的定位观察；D-F：BjuB033714蛋白在拟南芥根细胞中的定位观察。

为检测BjuB033714蛋白发挥功能的部位，分别在‘本氏烟草’和拟南芥中观察BjuB033714融合绿色荧光蛋白（GFP）的亚细胞定位情况。采用荧光显微镜观察绿色荧光信号发现，无论在烟草中还是在拟南芥中，BjuB033714蛋白均定位在细胞质和细胞核中。

具体参看图6：

图6 为BjuB033714过表达拟南芥植株子叶产生不定芽。B、D、F、H分别为A、C、E、G标记的叶柄部位的放大图像。

将通过自交获得的拟南芥转基因株系和拟南芥野生型同时在温室培养10天后，对拟南芥幼苗形态进行观察。结果表明，在三个过表达的BjuB033714转基因株系中发现，与野生型不同，它们在子叶的叶柄基部均产生不定芽，发现BjuB033714基因的超表达可导致植物产生额外的茎端分生组织，后期可发育成新的完整的额外植株。

具体参看图7：

图 7为超表达BjuB033714可改变拟南芥植株花序形态。E、F、G、H分别为A、B、C、D红框标记部位的放大图像。

在拟南芥生长至27天时，对BjuB033714超表达转基因植株和拟南芥野生型Col-0的花序进行观察，结果表明拟南芥转基因植株的花序从无限的总状花序变成有限的类似二歧或多歧聚伞花序，这与野生型拟南芥的无限总状花序不同，并且与野生型拟南芥在花序轴上产生侧生花芽不同的是转基因拟南芥在顶端分生组织末端同一个结点产生了两个甚至多个花芽，利用该基因在调控植物花序形态方面的功能可培育出具有新的花序形态的观赏园艺植物品种。

具体参看图8：

图8为超表达BjuB033714的转基因植株花器官形态改变。A、D、G、J为野生型和转基因植株花器官正面图像；B、E、H、K为侧面图像；C、F、I、L为花瓣解剖图像。

超表达BjuB033714可改变拟南芥花器官形态。图7显示拟南芥野生型Col-0为4个花瓣，而BjuB033714-OE-1和BjuB033714-OE-3转基因拟南芥中产生了5个花瓣的花朵，BjuB033714-OE-2的部分花朵产生了6个花瓣。利用该基因在此方面的功能可改变植物的花瓣数目和形态。

具体参看图9：

图9为超表达BjuB033714的转基因植株茎上产生额外的花。

通过观察发现在过表达BjuB033714的拟南芥植株的成熟茎上可产生额外的花器官。在拟南芥野生型Col-0植株的茎上并不产生花组织，而在BjuB033714-OE-1和BjuB033714-OE-2的转基因拟南芥植株的茎上可观察到额外产生的花组织，利用此方法可培育特异的“茎上生花”的观赏植物品种。

综合上述，本发明公布了一种改变植物叶片数目和叶面积，改变花序形态、花瓣形态和增加花瓣数目，以及使植物茎上长出花组织的方法，通过转基因等生物学手段将本发明中的基因导入植物中，可培育出具有新形态的观赏植物和农作物。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

在此，为进一步方便理解，附上以下基因组序列：

1、BjuB033714基因组序列：

ATGGAGCCAAGGCAACATAATCACCAAGCCGACCAAGAAAGCGGCAACAACAACAAGTCCGGCTCTGGTGGTTACACGTGTCGTCAAACGAGCACAAGATGGACACCAACGACAGATCAAATCAGAATACTCAAAGATCTTTACTACAACAACGGAGTTCGGTCACCAACAGCCGAGCAGATCCAGAAGATCTCTGCAAGGCTGAGACAGTACGGGAAGATCGAGGGAAAAAACGTCTTTTACTGGTTTCAAAACCATAAGGCTCGTGAGCGACAGAAAAAGAGATTCAACAGCACAACCATGGCGACACCAACGTCTTCATCGTCCAACTCGGTTATGATGGCTAGTGATCACTATCATCATCATGGTGTTACAATCCAGAGACCTGCTTTGGTCAACGTTAAGCTCGACCATGAAAATCATATGTTTCATCAGAACAGATCATATCCCAGCTTCAATAACGGTGAATTTTTTTTTGGTTACTAAAAACTAATTTCTTATGTTTTTAATGATTTTTTAGATGACTTTGATGAAAACAAGTTTTAGTATATGAACCATTTGCACCACAACCTATTACATGATAACGCAAAAAAAAATTAAGAAGATTTTTTTTTTTTTTTTGAGATTTACATATGCATGTTGACTAATTTCATATATGTACATATGAGTTTGATAGGTATGTATATATATGTAATGAAGTACACAATATTTATTTTTTTAAAATGTTGTGTTTCAATGAATTTGATAAAAGGGTTTTTTTTTTTCAATTGCTAATTTTAGGTTACCAGGAACCGTTTACACGACTAGCTTTTTACATGTAGGAAAAAAAAAAGAAAAAGTAAAAGTAAACTAAGAAGATTTTGTATATATGATAAAACATGTACATGTAGTGACGTATATGTGAAGTTGTGGATCTTGATTGGGTCAAACCAAATTTGCATATAGAGAACGATTTCTTGGTTGTGTAATGGAAACTAGCCTCACGTGTTGCGATTTGTAACAGAACTAGTGATTTAGATTAGTGAAAAATAGCATAATATTTTGTAGTTCGTTTTTCGCCATTTTCTCTAAATATTAACAATTGTGTGAAACATGTTCATGCATATATGCTCATAAATTCGCATATATCCGTTTGAAGGGAATATAAATCATGCAAGTTCAGGCACTGAATATGGTGTTTTCAATGCTTCTAGTGGCTACATGAGTAGCTATCTCTGTGCATCTATGGTACGTTCGAAACTATAAGCCATTTATTTCAAACAATATCCTGCATGTATGAATATAATAATTCCATTTAATGAAACTGGATTTTTGGGTGAAGGAACAAGACAATTCAATGAGCTACAACAACGTAGGTGGAGGATGGACAAACATGGATCATAATCATCATTACTCTACTCCAGCTTACAACTTCTTCGATAGACCACCGCCTCTGTCTGGACTAGAAGGCCATCAAGAAGAAGGAGAATACGGTGGCGATGCTTATCTGGAACATCGACGTACACTTCCTCTCTTCCCTTTGCACGGTGAGGATCACATCAACGGTGGTGGTGGTTCCATCTTGAAGTACGGACAATTGGACGGTTGTGATCGTTATGGTAGAGGCCCTTGTGCTTCTCTTAAGCTATGTCTGAACTGA

2、BjuB033714蛋白编码序列（CDS）：

ATGGAGCCAAGGCAACATAATCACCAAGCCGACCAAGAAAGCGGCAACAACAACAAGTCCGGCTCTGGTGGTTACACGTGTCGTCAAACGAGCACAAGATGGACACCAACGACAGATCAAATCAGAATACTCAAAGATCTTTACTACAACAACGGAGTTCGGTCACCAACAGCCGAGCAGATCCAGAAGATCTCTGCAAGGCTGAGACAGTACGGGAAGATCGAGGGAAAAAACGTCTTTTACTGGTTTCAAAACCATAAGGCTCGTGAGCGACAGAAAAAGAGATTCAACAGCACAACCATGGCGACACCAACGTCTTCATCGTCCAACTCGGTTATGATGGCTAGTGATCACTATCATCATCATGGTGTTACAATCCAGAGACCTGCTTTGGTCAACGTTAAGCTCGACCATGAAAATCATATGTTTCATCAGAACAGATCATATCCCAGCTTCAATAACGGGAATATAAATCATGCAAGTTCAGGCACTGAATATGGTGTTTTCAATGCTTCTAGTGGCTACATGAGTAGCTATCTCTGTGCATCTATGGAACAAGACAATTCAATGAGCTACAACAACGTAGGTGGAGGATGGACAAACATGGATCATAATCATCATTACTCTACTCCAGCTTACAACTTCTTCGATAGACCACCGCCTCTGTCTGGACTAGAAGGCCATCAAGAAGAAGGAGAATACGGTGGCGATGCTTATCTGGAACATCGACGTACACTTCCTCTCTTCCCTTTGCACGGTGAGGATCACATCAACGGTGGTGGTGGTTCCATCTTGAAGTACGGACAATTGGACGGTTGTGATCGTTATGGTAGAGGCCCTTGTGCTTCTCTTAAGCTATGTCTGAACTGA

3、BjuB033714蛋白序列

MEPRQHNHQADQESGNNNKSGSGGYTCRQTSTRWTPTTDQIRILKDLYYNNGVRSPTAEQIQKISARLRQYGKIEGKNVFYWFQNHKARERQKKRFNSTTMATPTSSSSNSVMMASDHYHHHGVTIQRPALVNVKLDHENHMFHQNRSYPSFNNGNINHASSGTEYGVFNASSGYMSSYLCASMEQDNSMSYNNVGGGWTNMDHNHHYSTPAYNFFDRPPPLSGLEGHQEEGEYGGDAYLEHRRTLPLFPLHGEDHINGGGGSILKYGQLDGCDRYGRGPCASLKLCLN

Claims

1.一种改变植物茎叶及花形态特性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种改变植物茎叶及花形态特性的方法，其特征在于：其中，采用PCR的方法扩增BjuB033714的CDS序列，其扩增引物为：

BjuB033714-F：CCAAGCTTATGGAGCCAAGGCAACATA；

BjuB033714-R：CGGGATCCTCAGTTCAGACATAGCTT。

3.根据权利要求1所述的一种改变植物茎叶及花形态特性的方法，其特征在于：其中，将扩增出的BjuB033714基因进行电泳，并利用回收BjuB033714基因扩增产物片段，主要包括：

用T₄DNA连接酶将酶切后的BjuB033714基因片段连接酶切后的pTF101载体，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；

在37℃培养箱中倒置培养16小时以筛选具有抗性的单菌落；

4.上述权利要求1-3所述的改变植物茎叶及花形态特性的方法的应用，其特征在于，所述方法应用于观赏花卉品种的培育。

5.上述权利要求1-3所述的改变植物茎叶及花形态特性的方法的应用，其特征在于，所述方法应用于经济作物的培育。