CN105906697B

CN105906697B - 水稻OsMTOPVIB蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用

Info

Publication number: CN105906697B
Application number: CN201610471129.XA
Authority: CN
Inventors: 程祝宽; 薛治慧; 李亚非; 唐丁; 沈懿; 杜桂杰
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2036-06-24
Also published as: CN105906697A

Abstract

本发明公开了一种水稻OsMTOPVIB蛋白及其编码基因在调控水稻花粉育性中的应用。本发明提供的OsMTOPVIB蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由序列1衍生的蛋白质。编码所述OsMTOPVIB蛋白的基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育雄性不育植物的方法，为抑制目的植物中所述基因的表达，得到雄性不育植物。本发明可以用于水稻杂交种子生产和育性控制，在水稻育种上具有重要意义，可以为增加水稻产量、提高水稻品质提供重要的生物资源。

Description

水稻OsMTOPVIB蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用

技术领域

本发明涉及一种水稻OsMTOPVIB蛋白及其编码基因在调控花粉育性中的应用。

背景技术

水稻是人类最重要的粮食作物之一，占全球谷类作物种植面积的1/3，为人类提供40％的热能。水稻是世界一半人口的食物来源。东亚和东南亚的绝大部分人口均以稻米为食。水稻是中国第一大粮食作物，同时，中国也是世界上最大的稻米生产国。因此，水稻的稳产和增产将直接关系到中国乃至世界的粮食安全。探索提高水稻产量的手段成为农业生产上面临的关键问题。在耕地面积逐步减少的趋势下，单纯靠提高水稻种植面积来满足对水稻产量的需求已经基本上成为不可能。解决粮食安全问题，需要实现水稻育种上的新突破。我国的水稻育种技术经历了三次革命。第一次绿色革命发生在二十世纪50年代末到60年代初，半矮品种的推广，使得水稻平均产量从不足1500kg/hm²达到近4500kg/hm²。第二次绿色革命发生二十世纪70年代，袁隆平培育出的三系杂交水稻，使得水稻单产量在矮化育种基础上再次提升了近20％，水稻平均产量升至6000kg/hm²。缓解了我国人口迅速增长与粮食短缺的矛盾。水稻育种的第三次飞跃实现于“超级稻育成”，水稻产量达到12000kg/hm²。纵观水稻育种历史，水稻单产的飞跃实现于杂种优势的广泛应用。杂种优势是生物界的一种普遍现象，其指两个遗传性不同的亲本杂交，杂种一代比双亲具有更强的生活力、生长势、抗性、适应性和丰产性。杂交水稻较普通水稻表现了营养、生殖、抗性和品质等众多优势。其推广应用为中国乃至世界的粮食生产作出了巨大贡献。三系杂交水稻中的三系是指：(1)雄性不育系。该不育系植株的雌蕊发育正常，但雄蕊的发育退化，表现无花粉或者花粉败育，不能自交结实。(2)保持系。该系水稻植株的雌雄蕊均发育正常，将其花粉授给雄性不育系，仍可获得雄性不育的植株。(3)恢复系。将其花粉授给雄性不育系植株，产生杂交种，杂交种后代雄蕊正常，可恢复育性，可进行自交结实，有目的的选取具有增产优势的杂交种用于大田生产。水稻雄性不育系是杂交水稻制种的关键。水稻雄性不育资源的获得是实现强优组合选育的重要基础。利用雄性不育系能大幅度提高杂种种子的产量和质量。然而，自然突变导致的雄性不育株少儿又少。极其罕见。加之对雄性不育株鉴定费工费时。因此，利用基因工程方法获得雄性不育系成为育种家的选择。

生物的生活周期包括二倍体孢子体世代到单倍体配子体世代的交替转换。有性生殖是自然界中普遍存在的生殖类型。有性生殖是指通过雌雄配子体融合形成受精卵，由受精卵发育为完整植株的生殖方式。减数分裂在雌雄配子体发生过程中起到关键作用，是有性生殖生物的关键细胞学事件。减数分裂在真核生物生活史中具有极其重要的意义：一方面，减数分裂产生染色体数目减半配子，通过受精形成合子，发育为新个体，维持亲代与子代体细胞染色体数目的恒定，保证物种的相对稳定性；另一方面，减数分裂过程中，同源染色体非姊妹染色单体间交叉互换以及非同源染色体的自由组合，促使配子的遗传物质在双亲的染色体间进行交融和组合，促使配子的遗传多样化，增加了后代对环境的适应性，同时也增强了群体的遗传多样性，为自然选择提供了良好的原材料。

减数分裂和粮食生产的关系非常密切，农作物的收获产品大部分是减数分裂的直接产物(包括果实和种子)。农作物品种的选育过程是遗传物质重组、优化和选择的过程。现在农作物品种的改良主要依赖有性杂交技术。该技术实现了杂交亲本的遗传物质的广泛交换和重组，给农作物新品种的遗传改良和选育带来生机。优良性状组合的实现依赖于减数分裂的同源染色体重组事件。对水稻进行减数分裂重组相关研究，取得的成果可以通过进一步探索应用到生产实践中。目前“Science”杂志上发表了拟南芥减数分裂基因在育种应用上的研究工作，为更好地结合研究和应用开辟了先河。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻OsMTOPVIB蛋白及其编码基因在调控水稻花粉育性中的应用。

本发明提供的蛋白质，获自水稻，命名为OsMTOPVIB蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由序列1衍生的蛋白质。花粉育性又称为雄性育性。

为了使(a)中的OsMTOPVIB蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的OsMTOPVIB蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsMTOPVIB蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述OsMTOPVIB蛋白的基因(OsMTOPVIB基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：

(1)编码区如序列表中序列2自5′末端第197至1660位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与植物花粉育性相关蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物花粉育性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有所述OsMTOPVIB基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护所述OsMTOPVIB蛋白或其编码基因在调控植物雄性育性中的应用。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如盐稻8号水稻。

本发明还保护一种特异DNA分子，包括如下元件：区段A、区段B和区段C；所述区段C(间隔序列)位于区段A和区段B之间；所述区段A与所述区段B反向互补；所述区段A如序列表中序列3自5′末端第528-827位核苷酸所示。所述特异DNA分子具体可如序列表的序列3所示。

所述特异DNA分子转录得到的RNA分子也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中所述OsMTOPVIB基因的表达，得到雄性不育植物。

所述“抑制目的植物中所述OsMTOPVIB基因的表达”是通过导入所述特异DNA分子实现的。

所述“抑制目的植物中所述OsMTOPVIB基因的表达”是通过导入干扰载体实现的；所述干扰载体含有特异DNA片段(发夹结构DNA)；所述特异DNA片段包括如下元件：区段A、区段B和区段C；所述区段C(间隔序列)位于区段A和区段B之间；所述区段A与所述区段B反向互补；所述区段A如序列表中序列3自5′末端第528-827位核苷酸所示。所述干扰载体具体可为在pCAMBIA2300-Actin载体的多克隆位点(具体可为PstI位点)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒。，

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中所述OsMTOPVIB基因的表达，得到花粉母细胞的同源染色体不能配对的转基因植物。

本发明还保护一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中所述OsMTOPVIB蛋白的活性，得到雄性不育植物。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如盐稻8号水稻。

本发明还保护OsMTOPVIB蛋白、OsMTOPVIB基因、所述特异DNA分子、所述RNA分子或以上任一所述方法在植物育种中的应用。

所述育种的目的为选育雄性不育性的植物。

以上任一所述雄性不育性具体体现为不结实和/或花粉呈现败育的表型和/或花粉母细胞的同源染色体不能配对和/或花粉母细胞的减数分裂终变期有24个单价体。

本发明提供了OsMTOPVIB蛋白及其编码基因，在水稻的发育过程中，通过RNA干扰技术抑制水稻中OsMTOPVIB蛋白的表达，可导致水稻花粉败育。结合采用组织特异性抑制基因表达的方法，OsMTOPVIB基因可以用于水稻杂交种子生产和育性控制，本发明在水稻育种上具有重要意义，可以为增加水稻产量、提高水稻品质提供重要的生物资源。

附图说明

图1为盐稻8号与水稻不育突变体OsmtopVIB的植株和花粉观察图。

图2为OsMTOPVIB基因的组织特异性表达分析图。

图3为盐稻8号和水稻不育突变体OsmtopVIB花粉母细胞中的染色体行为观察图。

图4为OsMTOPVIB^RNAi干扰植株和水稻不育突变体OsmtopVIB植株染色体行为观察图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

中籼3037：参考文献：Wang，K.，Tang，D.，Hong，L.，Xu，W.，Huang，J.，Li，M.，Gu，M.，Xue，Y.and Cheng，Z.(2010)DEP and AFO Regulate Reproductive Habit in Rice.PlosGenetics 6.中籼3037为文中的“Zhongxian 3037”，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

大肠杆菌BL21(DE3)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，产品目录号：CMC0014-4X40UL。

pUCRNAi载体：参考文献：Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang et al.OsSPO11-1isessential for both homologous chromosome pairing and crossover formation inrice.Chromosoma.2010(119)：625-636.；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

pCAMBIA2300-Actin载体：参考文献：Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang etal.OsSPO11-1 is essential for both homologous chromosome pairing andcrossover formation in rice.Chromosoma.2010(119)：625-636.；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

根癌农杆菌EH105：北京天恩泽生物技术有限公司，产品目录号：140383。

水稻品种盐稻8号：江苏省盐城市明天种业科技有限公司。

愈伤诱导及继代培养基(N6D2培养基)：(NH4)₂SO₄ 463mg，KNO₃ 2830mg，CaCl₂·2H₂O 166mg，MgSO₄·7H₂O 185mg，KH₂PO₄ 400mg，KI 0.8mg，H₃BO₃ 1.6mg，MnSO₄·4H₂O4.4mg，ZnSO₄·7H₂O 1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，蔗糖30g，植物胶2.5g，2，4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。

农杆菌扩大培养培养基(AB液体培养基)：葡萄糖5g，K₂HPO₄ 3g，FeSO₄·7H₂O2.5mg，NaH₂PO₄ 1g，NH₄Cl 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，KCl 0.15g，CaCl₂ 0.01g，去离子水加至1L，pH为7.0。

农杆菌侵染培养基(AAM液体培养基)：CaCl₂·2H₂O 440mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄ 170mg，KCl 2940mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 6.2mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，ZnSO₄·7H₂O8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，谷氨酰胺0.877g，水解酪蛋白0.5g，天冬氨酸0.266g，精氨酸0.228g，甘氨酸0.075g，去离子水加至1L，pH为5.2。

共培养培养基(N6D2C培养基)：(NH4)₂SO₄ 463mg，KNO₃ 2830mg，CaCl₂·2H₂O166mg，MgSO₄·7H₂O 185mg，KH₂PO₄ 400mg，KI 0.8mg，H₃BO₃ 1.6mg，MnSO₄·4H₂O 4.4mg，ZnSO₄·7H₂O 1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，蔗糖30g，葡萄糖10g，植物胶2.5g，2，4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.2。倒平板之前加入乙酰丁香酮(AS)并使其浓度为100μM。

筛选培养基CCD2S1：NH₄NO₃ 640mg，KNO₃ 1212mg，CaCl₂·2H₂O 588mg，MgSO₄·7H₂O247mg，KH₂PO₄ 136mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 3.1mg，MnSO₄·4H₂O 11.2mg，ZnSO₄·7H₂O 5.76mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2，4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为100mg/l。

筛选培养基CCD2S2：NH₄NO₃ 640mg，KNO₃ 1212mg，CaCl₂·2H₂O 588mg，MgSO₄·7H₂O247mg，KH₂PO₄ 136mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 3.1mg，MnSO₄·4H₂O 11.2mg，ZnSO₄·7H₂O 5.76mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2，4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。

预分化培养基(CCA培养基)：NH₄NO₃ 640mg，KNO₃ 1212mg，CaCl₂·2H₂O 588mg，MgSO₄·7H₂O 247mg，KH₂PO₄ 136mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 3.1mg，MnSO₄·4H₂O 11.2mg，ZnSO₄·7H₂O 5.76mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，麦芽糖20g，脱落酸(ABA)5mg，植物胶3g，2，4-D 2mg，6-BA 2mg，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。

分化培养基(MSR培养基)：NH₄NO₃ 1650mg，KNO₃ 1900mg，CaCl₂·2H₂O 440mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄ 170mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 6.2mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，蔗糖30g，植物胶4g，6-BA 2mg，激动素(KT)0.5mg，水解酪蛋白0.3g，萘乙酸(NAA)0.2mg，玉米素(ZT)0.2mg，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。

壮苗培养基：NH₄NO₃ 825mg，KNO₃ 950mg，CaCl₂·2H₂O 220mg，MgSO₄·7H₂O 185mg，KH₂PO₄ 85mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 6.2mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，蔗糖30g，多效唑(MET)6mg，植物胶2g，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。

实施例1、OsMTOPVIB蛋白及其编码基因的获得

一、水稻不育突变体OsmtopVIB的获得及其表型分析和遗传分析

以盐稻8号为出发植株，构建水稻突变体库。通过筛选水稻突变体库，获得一个完全不育突变体，命名为水稻不育突变体OsmtopVIB。

水稻不育突变体OsmtopVIB营养生长正常，和盐稻8号的营养生长没有任何差别(图1A)，抽穗后，突变体表现不结实。对花粉进行1％I2-KI染色分析，相比于盐稻8号中饱满圆形的花粉，水稻不育突变体OsmtopVIB的花粉呈现完全败育的表型(图1B)。

水稻不育突变体OsmtopVIB和中籼3037进行杂交得F1代，F1代种植产生F2代，在分离出不育突变体的株系中，按单株收获可育植株的种子，并将这些种子按单株进行种植。对再次分离出不育突变体的株系中的可育植株与不育植株的数目进行统计后发现，不育株和可育株的比例为3∶1(不育株数目，117；可育株数目，43)，表明该不育表型由单隐性基因所控制(χ²＝0.15；P＞0.05)。

二、OsMTOPVIB基因的图位克隆

在有不育株分离的株系中，选择多株可育的植株与中籼3037进行杂交，分单株分别进行编号收取种子，将不同编号种子对应种下，并且将杂种F1进行播种，根据不同单株种子是否有分离来判定上一代植株的基因型是Aa还是AA，将Aa和中籼3037的杂种F1单株收种，每一株所收取的种子分别种成独立的F2小区，在有分离的F2代小区中选取不育株，进行基因定位。同时，在F3代或者F4代中选取不育株进行精细定位。通过对F2代200多株不育株系进行连锁分析，将该基因初步定位在6号染色体S3和S4两个标记之间，大概230kb的区域内。通过对F3和F4代共700多株不育株进行连锁分析，将该基因精确定位在一个BAC上，大概39kb范围内。并将该区域的所有候选基因全部进行PCR扩增并测序分析，结果发现只一个基因内发生了突变。在水稻不育突变体OsmtopVIB的第10个外显子处，存在G到A的点突变，最终形成终止密码子，导致翻译提前终止。

三、OsMTOPVIB蛋白及其编码基因的获得

提取盐稻8号的总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，分别进行ORF扩增、5’RACE和3’RACE，拼接后得到全长序列。全长序列编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为OsMTOPVIB蛋白，由487个氨基酸残基组成。将编码OsMTOPVIB蛋白的基因命名为OsMTOPVIB基因，OsMTOPVIB基因包含12个外显子和11个内含子，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第197-1660位核苷酸所示。

实施例2、OsMTOPVIB基因表达分析

待测样本为：盐稻8号的根、茎、叶片、幼穗。

1、提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA。

2、以步骤1的到的cDNA为模板，进行Real-time PCR反应，采用引物RT-F和引物RT-R检测OsMTOPVIB基因的表达水平，采用引物Ubi-F和引物Ubi-R检测内参基因(Ubiquitin基因)的表达水平。

RT-F：5’-GCATTGTTTGGATTGAAAGCA-3’；

RT-R：5’-CTAGAAATCGAAAATCATATCCT-3’；

Ubi-F：5’-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3’；

Ubi-R：5’-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3’。

Real-time PCR采用SYBR Green I(Invitrogen)嵌合荧光法进行，PCR反应用Bio-Rad CFX96-real-time RCR仪完成，得到的结果用Bio-Rad CFX Manager软件分析。扩增反应所用酶为Hot Start Taq聚合酶(TAKARA)。

检测结果如图2所示。结果表明，OsMTOPVIB基因在水稻各个组织中均有表达，叶片中表达量最高，其次是幼穗中。

实施例3、OsmtopVIB突变体细胞学表型分析

待测样本为：盐稻8号减数分裂时期的幼穗、水稻不育突变体OsmtopVIB减数分裂时期的幼穗。

依次进行如下步骤：

1、取待测样本，用卡诺氏固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1；体积比)固定24h。

2、用解剖针将花药拨出至载玻片上，加少许醋酸洋红，用解剖针迅速将花药敲碎，使花粉母细胞游离出来，盖上盖玻片。

3、取载玻片，在盖玻片一侧加适量45％醋酸水溶液，在另一侧放置一张大小合适的滤纸条，反复重复此步骤，直到将载玻片上的醋酸洋红清除干净，然后将载玻片放入液氮中浸泡20sec，迅速取出，用刀片揭去盖玻片。

4、取载玻片，依次放入70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液和100％乙醇中浸泡各5min，进行梯度脱水，干燥后滴加4’，6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)，然后用荧光显微镜观察染色体表型。

结果如图3所示。图3A为盐稻8号花粉母细胞的观察结果图，图3B为水稻突变体OsmtopVIB花粉母细胞的观察结果图。由图3A可以看到，盐稻8号花粉母细胞在细线期时，染色体开始浓缩，细线状的染色体出现；偶线期，同源染色体的配对和联会开始进行；联会复合体形成于粗线期；终变期可见12个高度浓缩的二价体；中期I二价体整齐地排布在赤道板上；后期I和末期I同源染色体均等分离；经过减数分裂II，最终形成四分体。由图3B可以看出，水稻突变体OsmtopVIB花粉母细胞在细线期，染色体也呈现细线状，和盐稻8号的细线期没有区别；但是，不同于盐稻8号的是，偶线期和粗线期没有观察到配对和联会的染色体，染色体仍然是单股线状染色体；在终变期，观察到24个单价体，而不是盐稻8号中所观察到的12个二价体；中期I，24个单价体散乱分布在细胞核内；后期I和末期I同源染色体不均等分离，在赤道板位置可见落后染色体；四分体时期观察到微核的存在。观察结果表明该突变体为不配型突变体。

5、使用11号染色体上特异的5S rDNA探针和BAC克隆(a0083M01)探针、端粒特异探针pAtT4进行荧光原位杂交(FISH)实验。

结果如图3C所示。在盐稻8号花粉母细胞的减数分裂粗线期，可以检测到1个5SrDNA和a0083M01探针信号，表明同源染色体配对很好。但是，在水稻突变体OsmtopVIB中，观察到2个分离的探针信号，说明OsmtopVIB的突变导致同源染色体不能配对。减数分裂偶线期，盐稻8号花粉母细胞中，端粒可以很好的聚集在一起。突变体的花束期表现正常，端粒在细胞核内同样呈现聚集状态，结果说明花束期没有受到影响。

实施例4、OsMTOPVIB基因功能分析

一、构建RNAi载体及重组农杆菌

1、选取盐稻8号的8mm幼穗，提取总RNA，并反转录cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用RNAi-F和RNAi-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

RNAi-F：5’-AGTGGATCCGTTCGCGAGTATGTCCCTGA-3’；

RNAi-R：5’-GTGTCGACCTAGAAATCGAAAATCATAT-3’。

RNAi-F和RNAi-R中，下划线分别标注BamHI和SalI酶切位点。

3、用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切pUCRNAi载体，回收约2880bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。

6、用限制性内切酶XholI和BglII双酶切步骤5的重组质粒，然后将载体骨架与步骤3得到的酶切产物连接，得到重组质粒。

7、用限制性内切酶PstI酶切步骤6的重组质粒，回收酶切产物。

8、用限制性内切酶PstI酶切pCAMBIA2300-Actin载体，回收10379bp的载体骨架，将载体骨架去磷酸化。

9、将步骤7的酶切产物和步骤8去磷酸化的载体骨架进行连接，得到得到RNAi载体。根据测序结果，对RNAi载体进行结构描述如下：在pCAMBIA2300-Actin载体的PstI位点间插入了序列表的序列3所示的双链DNA分子。RNAi载体可在植物细胞中转录产生带发夹结构的dsRNA，引发RNAi，从而抑制目的基因OsMTOPVIB基因的表达。

序列3所示的双链DNA分子包括一个正向序列及其反向互补系列，正向序列如序列3自5′末端第528-827位核苷酸所示，反向互补序列如序列3自5′末端第15-314位核苷酸所示。

二、农杆菌介导的水稻基因转化

1、取步骤一得到的RNAi载体，导入根癌农杆菌EH105，得到重组菌。

2、农杆菌的培养：取步骤1得到的重组菌的单菌落，接种于3mL含50mg/L卡那霉素和10mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养16-18h。取培养体系，按照1∶100的体积比接种至农杆菌扩大培养培养基中，28℃、150rpm振荡培养3-5小时至对数生长期，离心收集菌体，用含100μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌侵染培养基重悬，得到OD_600nm为0.4-0.6的菌悬液。

3、诱导水稻愈伤组织(幼胚)：取开花后10天左右的盐稻8号的种子，先用75％酒精表面消毒3分钟，再用含2.5％活性氯的次氯酸钠(加入2滴Tween-20)浸泡大约90分钟，每十分钟摇动一次，然后用无菌水冲洗5-6次。将种子置于无菌滤纸上，用解剖刀切取幼胚接种在愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养7天。

4、侵染：将完成步骤3的愈伤组织浸泡于步骤2制备的菌悬液中，侵染20min，每5分钟摇动一次。侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上，28℃暗培养3天。

5、将步骤4共培养的愈伤组织转移至筛选培养基CCD2S1上，28℃、暗培养10天，新长出的抗性愈伤组织转入筛选培养基CCD2S2上，28℃继续暗培养10天。

6、预分化：将步骤5的抗性愈伤组织转入预分化培养基上，28℃暗培养10天。

7、分化：将步骤6预分化的愈伤组织置于分化培养基上，26℃、光照培养至苗高8cm左右。

8、壮苗：完成步骤7后，取再生苗，置于壮苗培养基上生根壮苗，26℃、光照培养条件下培养至生根。

9、完成步骤8后，炼苗移入大田，常规栽培管理。

10、采用pCAMBIA2300-Actin载体替代RNAi载体按照步骤1-9进行操作。

三、转基因植株的PCR鉴定

1、取步骤二的9获得的植株，提取具有G418抗性的植株的基因组DNA，用pCAMBIA2300-Actin的特异引物23A-F和23A-R进行PCR鉴定。

23A-F：5’-CCTTATCTGGGAACTACTCA-3’；

23A-R：5’-ATCTCCTGTCATCTCACCTT-3’。

可以扩出588bp大小条带的植株为转基因植株，命名为OsMTOPVIB^RNAi干扰植株。

2、取步骤二的10获得的植株，提取具有G418抗性的植株的DNA，用pCAMBIA2300-Actin的特异引物23A-F和23A-R进行PCR鉴定。

23A-F：5’-CCTTATCTGGGAACTACTCA-3’；

23A-R：5’-ATCTCCTGTCATCTCACCTT-3’。

可以扩出588bp大小条带的植株为转空载体植株。

四、转基因植株性状分析

待测样本为：10株野生型植株(盐稻8号)、10株转空载体植株、10株OsMTOPVIB^RNAi干扰植株和10株突变体OsmtopVIB植株。

结果如图4所示，结果表明，OsMTOPVIB^RNAi干扰植株和突变体OsmtopVIB植株一致，各个植株均粗线期染色体不配对，染色体呈现单股现状结构(图4A，B)，终变期观察到24个单价体(图4C、D)，野生型植株和转空载体植株粗线期染色体正常配对，终变期可见12个高度浓缩的二价体。

5、观察野生型植株、转空载体植株及OsMTOPVIB^RNAi干扰植株的生长情况，OsMTOPVIB^RNAi干扰植株均营养生长正常，和野生型植株营养生长没有任何差别，抽穗后，OsMTOPVIB^RNAi干扰植株均表现为不结实。对花粉进行1％I2-KI染色分析，相比于野生型中饱满圆形的花粉，OsMTOPVIB^RNAi干扰植株的花粉均呈现完全败育的表型。转空载体植株与野生型植株的表型一致。

Claims

1.一种培育雄性不育水稻的方法，包括如下步骤：抑制目的水稻中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质编码基因的表达，得到雄性不育水稻。

2.一种培育转基因水稻的方法，包括如下步骤：抑制目的水稻中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质基因的表达，得到花粉母细胞的同源染色体不能配对的转基因水稻。

3.一种培育雄性不育水稻的方法，包括如下步骤：抑制目的水稻中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的活性，得到雄性不育水稻。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基因为如下（1）或（2）：

（1）编码区如序列表中序列2自5′末端第197至1660位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表中序列2所示的DNA分子。