CN102140132A - 一种花药发育控制基因及其在拟南芥雄性不育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种花药发育控制基因及其在拟南芥雄性不育中的应用。从T-DNA插入突变体库中筛选到拟南芥雄性不育突变体arf17，克隆并鉴定了控制拟南芥育性的基因ARF17，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，遗传互补实验证明野生型中的ARF17基因可以恢复突变体的雄性不育表型。氨基酸序列分析实验表明ARF17是一个ARF(AUXIN RESPONSE FACTOR)家族的转录因子，定位于细胞核中。拟南芥中，该基因的突变导致雄性完全败育。该基因在阐述控制胼胝质合成和外壁形成关键基因的转录来调控植物育性方面，以及杂交制种提高作物产量方面具有非常重要的应用价值。

Description

一种花药发育控制基因及其在拟南芥雄性不育中的应用

技术领域

本发明属植物生物技术领域，特别是涉及一种调控植物花药发育从而调节育性的基因、编码蛋白及其应用。

背景技术

植物的有性生殖不仅是植物繁殖的主要途径，也是植物进化及对环境适应的基础之一。花药是植物的雄性生殖器官，是花粉发育的场所。花药及花粉的发育是植物基因功能研究的一个重要研究方向。花药及花粉发育异常会引起花药不能产生正常功能的雄配子从而导致雄性不育，雄性不育是生产上杂交制种的基础。因此对花药及花粉发育的深入研究既有理论研究意义，又有实际应用的价值。

在大多数植物中，成熟的花粉粒有两层细胞壁：花粉内壁和花粉外壁；花粉外壁在保护花粉抵抗环境压迫，细菌侵染以及细胞间识别中有重要作用。外壁的主要成分是孢粉素类物质(sporopollenin)，有较强的抗腐蚀及抗酸碱性能。花粉外壁比其他植物细胞壁都要复杂，分为两层：有蜂窝状的外壁外层(sexine)以及平坦的外壁内层(nexine)，分别有不同的组成模式。花粉外壁的成分主要由绒毡层细胞合成并分泌在药室中，沉着在小孢子表面后形成高度复杂的网状结构。

花粉外壁的形成可以追述到减数分裂期间，此时小孢子母细胞会在细胞膜外分泌由β-1，3-葡聚糖组成的胼胝质层以取代原有的细胞壁。胼胝质具有将小孢子与花药孢子体细胞隔离、防止细胞融合以及防止小孢子过早发育等作用。此外，胼胝质层作为初生外壁形成的模板在随后的花粉壁发育中有极其关键的作用。初生外壁(primexine)由单倍体小孢子在细胞膜表面形成由多糖类物质组成。其结构决定了随后花粉外壁的结构图案，相当于花粉外壁建设的蓝图。当胼胝质或者初生外壁的合成出现缺陷时，随后的花粉壁形成就会受到影响，从而导致花粉发育缺陷乃至降解。拟南芥胼胝质合成酶基因Callose Synthase 5(CalS5)在小孢子母细胞中高效表达，对四分体胼胝质层的合成起主要作用。在该基因的敲除突变体中，小孢子周围的胼胝质合成量急剧降低，导致初生外壁合成缺陷，随后的花粉外壁沉积也受到严重影响，这些研究表明了胼胝质层对小孢子外壁发育非常重要。

生长素在植物的花药发育过程中有着重要的作用。在生长素合成缺陷的yuc2 yuc6双突变中，雄蕊可以正常形成，但其发育终止，花药中只形成极少花粉并且花丝不能伸长。另外，最近的研究表明花药自身合成的生长素可以调节花药开裂和花粉成熟的过程，而生长素的运输则可以调控了花丝的伸长。生长素响应元件DR5-GUS的染色结果显示，生长素在这一时期的花药中有特异的积累，提示其在绒毡层发育和花粉形成早期起重要作用。绒毡层中的内源生长素在花粉单核期累积，在烟草绒毡层中特异表达iaaL基因后，内源生长素水平降低，引起花粉育性的降低，说明绒毡层中内源生长素对花粉发育有重要作用。因此，生长素在花药发育过程中花药开裂、花丝伸长、绒毡层发育和花粉形成等方面都起重要的作用。

生长素响应因子(ARFs)、生长素/吲哚乙酸蛋白(Aux/IAAs)和SCF复合体(泛素介导的蛋白降解途径组分)是三类主要的早期生长素响应蛋白，这些蛋白在生长素的信号转导中起着关键性的作用。当细胞中没有生长素信号进入时，ARF蛋白与Aux/IAA蛋白结合形成异源二聚体，ARF蛋白不具有转录活性。当细胞中有生长素信号转入时，Aux/IAA蛋白被泛素介导的蛋白降解途径降解，ARF蛋白形成同源二聚体，结合在生长素调控基因启动子的生长素响应元件(AuxREs)上，从而调节一系列基因的表达，进而引导植物的正常生长和发育。因此ARF蛋白在生长素调控植物生长发育的信号传导中有着重要的作用。ARF17蛋白缺少二聚化的结构域III和IV，其中间结构域富含Ser，其可能是一个抑制型转录因子。ARF17受miR160调控，且过量表达以后会产生子叶增生，真叶卷曲，根长及侧根数目异常、花期前死亡和不育等表型。虽然在拟南芥中ARF17过量表达会产生多种表型，但由于缺少ARF17的突变体，ARF17本身在植物中的功能不是很清楚。

尽管对生长素极性运输和作用机理已有比较深入的了解，但是在花药发育中生长素的信号通路及调控花药开裂、花丝伸长、绒毡层发育和花粉形成等方面分子机制尚不清楚。拟南芥的arf17突变体，是单基因隐性突变，符合孟德尔方式遗传规律。该突变体呈不育的表型，突变体中小孢子从四分体中释放后很快破裂降解。因此，ARF17在植物生命周期中，从双倍孢子体向单倍雄配子体转换过程中起关键作用，通过生物技术手段实现对拟南芥育性的调控将有助于在模式植物上创建一个全新的雄性不育育种应用途径。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种花药发育控制基因，以补充现有雄性不育基因序列的特异性的分子标记的不足，而此标记具备鉴定拟南芥或其他植物的雄性不育植物的基因型的潜力；在此基因的应用方面，提供一种新的雄不育植株获得方法，即利用本发明克隆的基因进行分子水平的转基因育种，以克服常规的杂交和回交育种方法育种的时间长、育种效果不确定的缺陷。

技术方案

本发明的技术方案之一是提供一种分离的花药发育控制蛋白多肽，所述的多肽选自下组：

a)SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽；或

b)在SEQ ID No.2的氨基酸序列中经过取代、缺失或插入1-10个氨基酸所衍生的，且具有花药发育控制功能的蛋白。

上述的花药发育控制蛋白多肽的一种优选方式为具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。

本发明的技术方案之二是提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列选自下组：

a)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸；或

b)SEQ ID No.1中包含SEQ ID No.1中355-660位和820-1068位的多核苷酸序列。

在一种优选方式中，所述的多核苷酸编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽。

在另一种优选方式中，所述的多核苷酸如SEQ ID No.1所示、或者包含SEQ ID No.1中355-660位和820-1068位的多核苷酸序列。

本发明的技术方案之三是提供一种载体，该载体含有上述的技术方案之二所述的多核苷酸。

本发明的技术方案之四是提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述的技术方案之三所述的载体。

本发明的技术方案之五是提供一种花药发育控制蛋白的制备方法，包含以下步骤：

a)在适合表达花药发育控制蛋白的条件下，培养上述的技术方案之四所述的宿主细胞；和

b)从培养物中分离出所述的花药发育控制蛋白。

本发明的技术方案之六是提供一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：

a)将上述的技术方案之二所述的多核苷酸转入植物细胞；和

b)将步骤a)中的植物细胞再生植株。

本发明的技术方案之七是提供一种上述的技术方案之一所述的花药发育控制蛋白多肽、以及上述的技术方案之二所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于控制植物花药的发育。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对于本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对理解本发明做进一步详细描述，但并非对本发明做限定。

图1显示了突变体背景下ARF17基因的的突变位点。黑色长方形代表外显子，基因内黑线代表内含子。

图2显示了拟南芥雄性不育突变体arf17的不育表型。A.野生型植株果荚饱满，可育；B.突变体植株果荚短小，完全不育；C.转基因互补植株恢复育性。

图3显示了野生型与突变体的花药发育组织学观察。(A)，(B)，(C)，(G)，(H)，(I)为野生型花药；(D)，(E)，(F)，(J)，(K)，(L)为arf17花药。(A)野生型第五期(B)野生型花药第六期。(C)野生型第七期内为四分体。(D)第五期arf17花药基本正常。(E)第六期arf17花药。(F)第七期arf17花药中绒毡层空泡化，四分体形态较为异常。(G)第八期早期的野生型花药，小孢子已从四分体中分离。(H)野生型第九期花药。小孢子进入空泡化过程，外壁已形成。(I)第十期野生型。(J)第8期arf17突变体的小孢子也能从四分体中分离。(K)第九期突变体。小孢子以及绒毡层都开始降解，孢粉素积累异常。(L)第十期突变体中小孢子已经降解。dMp，降解的小孢子；E，花药外壁；En，花药内壁；MI，中层细胞；Ms，小孢子母细胞；Mp，小孢子；Pg，花粉；Sp，孢粉素；T，绒毡层；Tds，四分体.标尺＝10μm.

图4显示了野生型与arf17突变体小孢子发育的透射电镜图像：

(A)-(D)野生型小孢子第六期(A)，第七期(B)，第九期(C)第十期(D).

(E)-(H)(A)-(D)中黑框所划出区域的放大图片。(I)-(L)arf17小孢子第六期(I)，第七期(J)，第九期(K)第十期(L).(M)-(P)(I)-(L)中黑框所划出区域的放大图片。(M)，(N)第六期及第七期花药切片，显示突变体小孢子母细胞及四分体的胼胝质沉积较少。(K)，(O)第九期及第十期花药切片，显示野生型中小孢子外壁骨架及顶盖结构发育正常，(L)，(P)arf17突变体中积累异常，小孢子败育。dMsp，降解的小孢子；dPg，降解的花粉；Ex，花粉外壁；Ms，小孢子母细胞；Msp，小孢子；Pg，花粉；Tds，四分体.标尺＝4μm。

图5显示了胼胝质染色及CALS5基因的表达。(A)野生型的四分体中正常的胼胝质。(B)野生型四分体的胼胝质荧光及泪滴型的形状。(C)arf17突变体在明场下胼胝质层几乎观察不到。(D)紫外激发荧光显示突变体的四分体上胼胝质信号较浅。(E)半定量RT-PCR(F)定量PCR检测CALS5在野生型及突变体花苞中的表达。Tubulin作为对照基因。

图6显示了ARF17基因的表达模式。(A).ARF17在不同组织中的定量RT-PCR结果。Rt：根；St：茎；Lf：叶；Inf：花序；Sdl：幼苗。B-H以ARF17为探针的原位杂交结果，杂交探针为anti-sense。(B).野生型花药发育第C期；D.花药发育第6期早期。E.花药发育第6期晚期。F.花药发育第7期。G.花药发育第8期。H.花药发育第10期。I.花药发育第6期，杂交探针为sense。Sp：造孢细胞；Msp：小孢子；T：绒毡层；：小孢子母细胞；Tds：四分体；Pg：花粉。

图7显示了生长素响应报告基因DR5::GUS在野生型和arf17中的表达分析。(A)-(E)DR5::GUS在野生型不同组织中的表达。(A)DR5::GUS在野生型花药发育的第四到第十期表达。(B)DR5::GUS在野生型花序中的表达。(C)DR5::GUS在野生型叶尖生长点表达(星号所示)。(D)IAA处理后，DR5::GUS除在野生型花药中表达外，还在花瓣、花萼等部位表达。(E)IAA处理后，DR5::GUS在野生型叶子里的表达明显升高。(F)-(I)DR5::GUS在arf17突变体不同组织中的表达情况。(F)DR5::GUS在arf17突变体各时期的花序中都没有表达。(G)DR5::GUS在arf17突变体叶子的尖部正常表达(星号所示)。(H)IAA处理后，DR5::GUSarf17在突变体各时期的花药中仍然没有表达，但在、花萼等部位表达。(I)IAA处理后，DR5::GUS在在arf17突变体叶子的尖部表达大量增加。

发明人实现本发明的具体技术包括如下步骤：

步骤一，拟南芥雄性不育突变体arf17的分离和遗传分析：通过外源T-DNA插入诱变野生型拟南芥Col生态型植株，通过大量筛选得到表型稳定的突变体arf17。该突变体的营养生长与野生型无明显差异，表型为果荚短小，内不含有种子，如图2所示。将arf17作为母本与野生型Col-0父本杂交后可形成正常果荚，说明突变体雌蕊发育正常。通过杂交F2代表型分离比分析，本发明确定arf17是一个符合单基因控制遗传规律的隐型突变体。

步骤二，分离控制拟南芥育性的ARF17基因：为了分离造成该突变体不育表型的基因，本发明采用TAIL-PCR的方法，通过对侧翼序列的测序表明，突变体中生长素响应因子AUXINRESPONSE FACTOR 17(ARF17，AT1G77850)的第一个外显子上有T-DNA插入(图

1)。进一步的连锁分析发现，所有不育植株在该位点上都是纯合插入。

步骤三，ARF17基因的功能分析：为证明突变体雄性不育的表型是ARF17的缺失所导致的，本发明进行了互补实验验证。首先从野生型植株中克隆出AT1G77850基因组(包含上游1.5kb启动子和下游300bp在内5.0Kb片段)以及编码区cDNA片段，分别构建到不同的双元表达载体中，利用农杆菌介导法转化入arf17突变体F1代，待果荚成熟后收取种子，在平板上用T-DNA片段所含抗性进行筛选，从而得到转基因植物。经过对转基因T2代植株的背景分析，证明了该基因的突变导致了该突变体的不育表型。本发明正确的克隆了ARF17基因(SEQ ID No.1)，氨基酸序列分析表明ARF17基因包含三个外显子和两个内含子，编码一个由585个氨基酸残基构成的蛋白，属于生长素响应因子ARF转录因子家族(SEQ IDNo2)；其中，所述SEQ ID No.1中的355-660位为转录因子B3DNA结合区序列；所述SEQID No.1中的820-1068位为AUXIN响应因子结构域序列。

步骤四，ARF17基因调控小孢子胼胝质的合成以及花粉外壁的发育：通过细胞学光镜切片观察比较了arf17突变体与野生型的整个花药发育过程，发现在花药发育第六期，突变体中小孢子母细胞不如野生型致密，中层细胞退化程度要比野生型严重。减数分裂完成后中，突变体四分体外的胼胝质虽然能够形成，但其形状并不是滴漏形结构并且彼此间隙不如野生型明显，说明突变体的胼胝质形成有问题。到花药发育第九期，突变体中大多数小孢子已经降解，而且其外壁的沉积也出现异常。透射电镜观察表明，在四分体时期，突变体小孢子和胼胝质正常形成，但孢粉素沉积异常，比野生型多且大，而且小孢子周围没有初生外壁形成(图4)。小孢子从四分体释放以后，突变体小孢子未形成任何外壁结构，只有异常的孢粉素沉积。此外，通过RT-PCR的方法，发现在arf17突变体背景下，在花药中特异性表达的与胼胝质合成相关的基因CALS5的表达有强烈下调。综上所述，arf17的小孢子由于缺乏外壁结构，导致降解，从而引起花粉败育(图5)。

步骤五，ARF17基因在花药中高表达：ARF17在所有检测的组织中均有表达，包括根、茎、叶、小的花苞和幼苗，但是在小的花苞中的表达较其它组织比明显较高。为更详细的了解ARF17在花药中的时空表达，我们进行了原位杂交试验。我们设计了5’端的原位探针进行检测。原位杂交实验表明ARF17在花药发育的第六期前期开始高表达，杂交信号特异性地在绒毡层和小孢子母细胞中，而到了第六期的后期，表达有所减弱，但仍然在绒毡层，小孢子母细胞中表达，而正义链探针在花药发育的第六期没有杂交信号。到了四分体时期和第八期，ARF17只在绒毡层有微弱表达(图6)。ARF17在花药中的表达谱与其功能较一致，在花药发育的第六期控制了花药发育所需关键基因的表达。其突变后也导致第六期花药结构异常。

步骤六，ARF17参与花药生长素信号转导：ARF家族转录因子能和结合在有生长素诱导元件基因的启动子上，启动基因表达，在生长素信号传导过程中有着重要作用。为研究ARF17在花药生长素信号途径中的作用，我们用杂交的方法将DR5:GUS导入突变体中。含有DR5:GUS的野生型花药和叶的尖部都能观察到GUS基因的活性，突变体的叶尖部位DR5:GUS基因表达正常，说明突变体中成功导入了DR5::GUS基因(图7)。但在arf17突变体花药中未能检测到GUS表达，说明arf17花药中生长素信号途径受到影响。我们进一步对野生型和突变体进行外源生长素处理，结果显示施加外源生长素以后野生型和突变体的叶，花萼和花瓣等部位的DR5:GUS基因表达明显上升，而突变体花药中仍未检测到DR5::GUS基因的表达，说明arf17突变体除花药外，其它组织的生长素信号正常。总结这些数据，突变体花药中DR5:GUS基因的异常表达可能是因为生长素信号转导过程受到影响，而ARF17则可能是生长素控制花药生长信号途径中的关键因子。

粮食供给是人类生存与发展的根本。植物的生殖器官为动物和人类提供了食物的主要来源。由于雄性不育品种为农业生产上异花授粉提供了极大的便利，所以控制作物的雄性生殖发育对作物育种和农业生产至关重要。随着基因工程技术的发展使得应用ARF17基因调控植物育性成为可能。

有益效果

在本发明提供的ARF17基因为一种拟南芥雄性不育的调控基因，与先前报道的其他雄性不育调控基因不同，为新发现的特异性的雄性不育分子标记，以此标记可鉴定拟南芥或其他植物的雄性不育植物的基因型。

在此基因的应用方面，本发明提供的新的雄不育植株获得方法，即利用本发明克隆的基因进行分子水平的转基因育种，克服了常规的杂交和回交育种方法育种的时间长、育种效果不确定的缺陷。

利用本发明的ARF17基因，通过反义敲除的手段还能提供一种新的雄性不育植株获得方法。

在本发明对ARF17基因的研究过程中还揭示，它是一个生长素响应因子ARF转录因子，该基因通过调节CALS5基因的表达调控了胼胝质的合成过程以及后续的花粉发育过程，突变体发育后期花粉完全败育。ARF17是在花药发育6-9期非常重要的一个基因，也是目前报道的第一个与生长素转导途径相关的参与小孢子外壁发育形成的转录因子。利用该发育生物学的调控因子，可以进一步为控制胼胝质形成和花粉壁发育过程提供可供选择的手段。

如本文所用，术语“雄性不育”是指植物雄性生殖器官不能产生正常功能的雄配子(花粉)。

如本文所用，术语“单基因隐型突变体”是指突变体受到单个基因的控制，其遗传分离比符合孟德尔遗传规律。

如本文所用，术语“生长素响应因子ARF转录因子”是指一系列编码在核内调控基因表达并能结合在生长素诱导元件启动子上的调控基因

如本文所用，术语“T-DNA插入突变”是指利用转基因的方法把外源DNA片段插入目的植物从而使其基因突变的方法。

如本文所用，术语“TAIL-PCR”是指利用依照目标序列旁的已知序列的3个较高退火温度的嵌套特异性引物和一系列较短且Tm值较低的随机简并引物组合，通过3轮热不对称的温度循环分级反应来进行PCR扩增，获得已知序列的侧翼序列。

具体实施方式

本发明经过深入而广泛的研究，从拟南芥分离出控制花药发育的调控蛋白ARF17，其调控了雄性小孢子的发育过程。本发明已经证实，通过调节ARF17的活性可以产生花粉败育的植物，所以开发和利用此基因进行人工创制不育系等农业应用方面具有很大的经济效益。

如本文所用，ARF17蛋白多肽是用标准的蛋白纯化技术纯化的ARF17蛋白，纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽，合成多肽，优选重组多肽。该多肽可以是糖基化的，或是非糖基化的。本发明还包括ARF17蛋白的片段，衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”，“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然ARF17蛋白相同生物学功能和活性的多肽。本发明中，术语“ARF17多肽”指具有ARF17蛋白相同功能的SEQ ID No.2的多肽或其他变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个氨基酸的缺失，插入或取代，以及在C末端或N末端添加数个氨基酸。该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然变异体、诱导变异体，在高或低的严紧度条件下能与ARF17杂交的DNA所编码的蛋白，以及利用抗ARF17的抗血清获得的多肽或蛋白。发明还提供ARF17蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然ARF17蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰差异，或者兼而有之。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。常规无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，限制性内切酶购自上海皓嘉生物公司，引物由上海生工公司合成。原位探针制备试剂盒购自美国Roche公司，MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶等其余分子生物学试剂均购自美国Promega公司。Eppendorf梯度式PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司，荧光PCR仪为美国ABI公司产品。

实施例1

1.拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体arf17，原始野生型为Columbia(Col)生态型(上海师范大学植物分子生物学实验室保存)。

2.拟南芥材料栽培条件：拟南芥在0.1％的琼脂糖中4℃春化2-4天后培养在黑土；蛭石；珍珠岩(1∶6∶0.25)的混合土中。培养时在其上层罩一层塑料膜以保持湿度，当拟南芥萌发出子叶后去掉塑料层。光照时间为16小时光照，8小时黑暗，湿度保持在60-70％，温度控制在22-25℃，光照强度为50μEm^-2s^-1，营养液为PNS(表1)。

表1.PNS母液成分和1升1×PNS配方

a：将Na₂-EDTA 7.45g及FeSO45.57g分别溶于400mL水中加热至沸，然后混合，并继续煮沸30min，冷却并定容至1L即可。

b：将硼酸0.434g；硫酸锰1.7626g；硫酸铜0.0798g；硫酸锌0.172g；钼酸钠0.432g；氯化钠0.585g；氯化锰0.00129g定容于1L即可。

c：将磷酸二氢钾130.4g和磷酸氢二钾9.12g混合溶于1L水中即可。

3.TAIL-PCR分离突变基因：TAIL-PCR实验体系根据Liu等的原始方法优化(Liu et al.，1995Plant Journal 8：457-463)。使用新鲜提取的突变体基因组DNA作为模板，使用T-DNA左边界端特异性引物与随机简并引物分别扩增8管。程序如下：

TAIL-PCR第一轮：Step 1＝4.0℃2分钟；Step 2＝93.0℃1分钟；Step 3＝95.0℃1分钟；Step 4＝94.0℃30秒；Step 5＝62.0℃1分钟；Step 6＝72.0℃2分钟30秒；Step 7＝回到step 4再循环4次；Step 8＝94.0℃30秒；Step 9＝25.0℃3分钟；Step 10＝每秒升温0.2℃到72.0℃；Step 11＝72.0℃2分钟30秒；Step 12＝94.0℃10秒；Step 13＝68.0℃1分钟；Step 14＝72.0℃2分钟30秒；Step 15＝94.0℃10秒；Step 16＝68.0℃1分钟；Step17＝72.0℃2分钟30秒；Step 18＝94.0℃10秒；.Step 19＝44.0℃1分钟；Step 20＝72.0℃2分钟30秒；Step 21＝回到step 12再循环14次；Step 22＝72.0℃5分钟；Step 23＝4.0℃保温；Step 24＝结束

第一轮PCR产物稀释20倍，作为第二轮Tail-PCR的模板，AD引物用量减少1/5，其他体系与第一轮相同。程序如下：

TAIL-PCR第二轮：Step 1＝4.0℃2分钟；Step 2＝94.0℃10秒；Step 3＝64.0℃1分钟；Step 4＝72.0℃2分钟30秒；Step 5＝回到step 2再循环4次；Step 6＝94.0℃10秒；Step 7＝64.0℃1分钟；Step 8＝72.0℃2分钟30秒；Step 9＝94.0℃10秒；Step 10＝64.0℃1分钟；Step 11＝72.0℃2分钟30秒；Step 12＝94.0℃10秒；Step 13＝44.0℃1分钟；Step 14＝72.0℃2分钟30秒；Step 15＝回到step 6再循环14次；Step 16＝94℃10秒；Step 17＝44℃1分钟；Step 18＝72℃3分钟；Step 19＝回到step 16再循环4次；Step 20＝72.0℃5分钟；Step 21＝4.0℃保温；Step 22＝结束.

第二轮PCR产物稀释10倍作为第三轮PCR模板，体系相比，LB3增加5倍，水相应减少。PCR程序如下：

TAIL-PCR第三轮：Step 1＝4.0℃2分钟；Step 2＝94.0℃10秒；Step 3＝44.0℃1分钟；Step 4＝72.0℃2分钟30秒；Step 5＝回到step 2for再循环19次；Step 6＝72.0℃5分钟；Step 7＝4.0℃保温；Step 8＝结束.

将第二轮与第三轮产物进行琼脂糖凝胶电泳，取较第二轮产物偏小的300bp以上第三轮产物切胶回收，送测序公司测序。对获得的侧翼序列进行BLAST比对，分析T-DNA在基因组中的插入位置。

TAIL-PCR所用的引物序列如SEQ No.3-11所示。

实施例2细胞学观察

1、植物花药的光镜树脂切片：取arf17突变体和野生型的新鲜材料投入装有FAA固定液(50％酒精，5.0％冰醋酸，和3.7％甲醛)的青霉素小瓶，抽气并将其封口置于4℃过夜。随后经过梯度酒精脱水(50％×2，60％，70％，80％，90％，95％，and 100％×2)，转移到二甲苯中，最后包埋在树脂中。切片后再经过甲苯胺蓝(toluidine blue)染色，置于显微镜中观察。胼胝质染色则将切片用含0.05％(w/v)苯胺蓝的0.067M磷酸缓冲液染色，放置于UV镜下观察。

2、电镜植物花药材料制作：扫描电镜材料制作：取arf17突变体和野生型的新鲜花药和花粉用导电胶固定在铜台上，将样品表面喷上8nm的金粉，在扫描电镜中观察。

3、透射电镜材料制作：取arf17突变体和野生型的新鲜花药在含2.5％戊二醛(pH7.2)的磷酸缓冲液中前固定，在含有2％锇酸的磷酸缓冲液中后固定，随后酒精脱水，最后将材料包埋在树脂中。将超薄切片在醋酸双氧铀和柠檬酸铅中染色，置于透射电镜中观察。

实施例3植物组织提取RNA及RT-PCR检测下游基因：

将arf17突变体和野生型的新鲜材料在研钵中用液氮将材料研磨充分。将研好的材料放入已经预先加入1mLTRIZOL的EP管中，振荡混匀。15-30℃温育后加入氯仿，静置后，12000g离心，随后将水相移至另一EP管中，加入异丙醇，静置后4℃12000g离心，随后用75％酒精洗涤一次，干燥RNA，将其溶于20-40μL DEPC-H₂O中。随后取适量RNA用AMV reverse transcriptase反转录合成cDNA第一链。将上述合成好的cDNA作为RT-PCR的扩增模板。半定量RT-PCR程序为预变性95℃5分钟；变性95℃30sec，退火56℃30sec，延伸72℃30sec，此三步执行30个循环。实时定量RT-PCR使用DNA荧光染料试剂SYBRGreen I程序为95℃5分钟；变性95℃10sec，退火及延伸62℃1min，此两步执行40个循环。半定量及定量的引物序列见材料与方法的附件。β-tubulin基因作为组成型表达的对照。引物序列如SEQ No.12-15所示，其中，RTF和RTR为RT-PCR引物，q-RTF和q-RTR为实时定量PCR引物。

实施例4原位杂交检测ARF17基因在花药中的表达

取材及包埋：用剪刀取野生型及突变体花序固定在FAA中。抽真空使固定液渗透到组织中，更换一次固定液后4℃过夜。将固定的材料分别经过50％，60％及70％乙醇各脱水一小时。以上步骤均在冰上进行，并不时轻摇。第三天在4℃下85％及95％乙醇中各脱水1小时，随后转到室温，100％乙醇脱水2小时，然后在25％二甲苯与75％乙醇混合液，50％二甲苯与50％乙醇混合液，75％二甲苯与25％乙醇混合液(加入番红染色)中各放置半小时。最后将材料放入含有1/4体积固体石蜡的100％二甲苯中过夜。第四天将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积蜡块至完全熔化后移至60℃。几小时后换上新鲜熔好的蜡液。随后在60℃恒温箱中放置3-5天每天换蜡两次。包埋时先在包埋袋中铺入一层液体石蜡，将材料按照方向摆正，然后再添加石蜡，放入冷水中包埋。随后，将赖氨酸包被的载玻片置于预热至42℃烘片机上，加2.5mL DEPC-H2O，用镊子将切出的蜡带漂浮于DEPC-H2O上。待蜡带展平后吸走多余的水。在烤片过程中可快速镜捡，寻找理想的切片，最后保持玻片在42℃烤片机上过夜使切片粘牢。

探针制备：在ARF17基因外显子特异区段设计400bp左右片段探针，从cDNA中克隆出目的片段，并构建到pBluescript-SK载体中。由于T7聚合酶转录效率略高于T3聚合酶，构建探针时注意利用T7转录antisense链。将构建好的质粒进行大抽(博大泰克公司质粒大抽试剂盒)。取适量质粒在200μL体系中酶切过夜使之线性化，注意选择5’突出末端的内切酶，跑胶检测。回收线性条带作为转录模板。转录体系为：Template DNA 2μg；Transcriptionbuffer 2μL；Nucleotides(UTP and dig-UTP mix)2μL；RNASIN(RNAse inhibitor)1μL；RNA polymerase 2μL；加DEPC-H₂O至总体积20μL。37℃保温2小时。转录完后去1μL跑胶检测RNA大小亮度，2小时后一般合成RNA2μg左右。加入80μL DEPC-H₂O及5UnitsDNAse，37℃10min。随后加入100μL 4M NH4OAc及400μL无水乙醇，-20℃放置20min.最高转速离心10min，70％乙醇洗一次，最高转速10min，超净台上吹干。回收后的RNA溶于100μL DEPC-H₂O，加100μL 2X碳酸缓冲液(80mM NaHCO₃，120mM Na₂CO₃)进行探针碱解。60℃保温到适当时间，加入10μL 10％的醋酸停止反应，加1/10体积的3MNaOAc(PH5.2)及两倍体积乙醇-20℃沉淀20min。RNA最后溶于50％去离子甲酰胺中。浓度为1μL/slide。针制备：在ARF17基因外显子特异区段设计400bp左右片段探针，从cDNA中克隆出目

原位杂交：将切片放入不锈钢盒中，经过2次二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，水，2×SSC溶液后，蛋白酶处理以酶解RNA上的蛋白质，暴露需要杂交的RNA；然后经过2mg/mL甘氨酸；1×PBS各2min；4％多聚甲醛10min；1×PBS 5min进行组织再固定；随后在5％乙酸酐三乙醇胺溶液搅拌10min；1×PBS溶液5min浸泡5min；再上行梯度乙醇脱水，随后将玻片平铺在含有无水乙醇的塑料盒中4℃放置3-4小时，使样品脱水完全，取出晾干，待下一步杂交。杂交体系如下：首先准备杂交液A(10张切片的使用量计)，其中含有10×in situsalts 100μL；去离子甲酰胺400μL；tRNA(100mg/mL)10μL；50×Denhardt’s 20μL；50％硫酸葡聚糖(dextran sulfate)200μL；70μL DEPC-H2O，总体积800μL。混匀，55℃预热杂交液A。每张切片中的杂交液B含有1μL探针，9μL DEPC-H₂O，10μL去离子甲酰胺，80℃加热2min，离心一下，置冰上。每张切片加入100μL混合液，密封后52℃杂交过夜。

第二天从杂交盒中取出切片放回不锈钢篮上，在55℃洗涤缓冲液(0.2×SSC)中保温2×1小时，随后在37℃NTE溶液中温育5min，重复一次，接着放入含有20μg/mL RNaseA的NTE溶液中30min.然后再次用NTE溶液温育2次各5min，55℃的0.2×SSC溶液中温育1小时，1×PBS中室温放置5min。随后将玻片取出，加适量的1％Blocking reagent in 100mMTris(PH7.5)，150mM NaCl(新配)，小摇床上室温轻摇45min。换1％BSA in 100mM Tris(PH7.5)，150mM NaCl，0.3％Triton X-100继续轻摇45min.用BSA/Tris/Triton溶液按1∶1000稀释地高辛抗体。每张切片滴加150μL，盖上parafilm，避免产生气泡。玻片平铺于含BSA/Tris/Triton溶液的湿盒中，密封室温2小时。随后在BSA/Tris/Triton溶液中室温轻摇4次，每次15min。换100mM Tris(PH9.5)，100mM NaCl，50mM MgCl2洗一次，10min。最后在新的Tris9.5/NaCl/MgCl2洗一次。用Tris9.5/NaCl/MgCl2溶液按1∶50稀释NBT/BCIP。混匀避免产生气泡，每张切片滴加200μL，小心盖上parafilm，平铺于含有双蒸水的湿盒中，密封避光显色1-3天，36小时后，每隔12小时在显微镜下检测。

实施例5ARF17基因表达载体的构建及拟南芥转化

根据TAIR数据库(www.arabidopsis.org)上拟南芥ARF17基因的genomic及CDS序列设计引物，以野生型材料的总DNA或反转录后的cDNA为模板，用于PCR扩增，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30sec；54℃退火50sec；72℃延伸240sec，40个循环；72℃延伸10min，4℃保存。随后我们将PCR产物直接与pMD18-T载体相连，转化大肠杆菌感受态，长出克隆后，挑取数个克隆置入含有amp抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜后，抽取质粒，酶切鉴定。再将阳性克隆用酶切后与双元表达载体连接，转化大肠杆菌感受态，长出克隆后，挑取数个克隆置入含有kan抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜，抽取质粒，酶切鉴定得到最终载体。最后将其转化入农杆菌。待农杆菌长出克隆后，挑取克隆挑取克隆在液体培养基中28℃培养2天，以菌液为模板进行PCR鉴定结果。

拟南芥转化：将萌发的植物培养至茎高3厘米时，去除其顶生花序。以利于刺激侧枝花序的生长，转化在去顶后3天进行。转化前，将已授粉的花及果荚去除掉，并使土壤吸足水。把已转化了相应质粒的农杆菌菌种接入10mL培养基中过夜培养，转化前一天早上接入大瓶培养至OD600约1.2到1.6之间，室温5000rpm离心10min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养液中，使OD600在0.8左右。将植株浸没在渗透培养液中3sec，避光保存过夜，第二天移入恒温室培养。3-4周后，收种子并放在干燥环境中存放2周。

筛选前用70％酒精浸泡5分钟，最后用无菌水洗四次。处理后的种子均匀涂布在加入筛选抗生素的PNS培养基平板上。低温4℃春化2到3天，移入恒温室培养。根据植物筛选抗性，判断萌发的幼苗是否为转化子，潮霉素抗性的转化子在萌发2周后通过对幼苗的发育来判断。

转化子检测：在三组共约1000粒拟南介种子中，2周后能够在潮霉素PNS培养基上正常萌发的幼苗9株。取上述抗性幼苗的真叶组织进行遗传背景检测，有4株为突变体纯合背景。这4株转基因植株继续培育至开花，能正常结实获得种子，表明外源的ARF17基因能互补arf17的不育表型，使不育植株恢复正常育性。

实施例6ARF17蛋白的重组表达与纯化

为了研究ARF17蛋白的生化功能，将其编码区在原核生物中进行体外表达。将ARF17的ORF区克隆到pGEX-4T-1载体中，构建了ARF17与GST融合蛋白。转化表达宿主菌ROSETTA，用IPTG诱导表达，并用Ni株纯化ARF17融合蛋白。将纯化的ARF17融合蛋白免疫兔，得到了抗ARF17的兔血清。对抗ARF17的兔血清进行了效价测定，在对野生型和突变体植物材料的总蛋白进行Western blot测定时，只有在野生型有阳性信号，而突变体中无表达。此抗血清已成功应用于转基因植株的鉴定。

Claims (10)

1.一种分离的花药发育控制蛋白多肽，其特征在于，所述的多肽选自下组：

a)SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽；或

b)在SEQ ID No.2的氨基酸序列中经过取代、缺失或插入1-10个氨基酸所衍生的，且具有花药发育控制功能的蛋白。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽为SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列选自下组：

a)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸；或

b)包含SEQ ID No.1中355-660位和820-1068位的多核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID No.1所示、或者包含SEQ ID No.1中355-660位和820-1068位的多核苷酸序列。

6.一种载体，其特征在于，含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的载体。

8.一种花药发育控制蛋白的制备方法，包含以下步骤：

a)在适合表达花药发育控制蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；和

b)从培养物中分离出所述的花药发育控制蛋白。

9.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：

a)将权利要求3所述的多核苷酸转入植物细胞；和

b)将步骤a)中的植物细胞再生植株。

10.一种权利要求1所述的花药发育控制蛋白多肽、以及权利要求3所述的多核苷酸的用途，

其特征在于，用于控制植物花药的发育。

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