CN102586278A

CN102586278A - 水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15、重组表达载体和应用

Info

Publication number: CN102586278A
Application number: CN2012100634258A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 黄远新; 吕俊; 杨昆; 赵勇; 王忠伟; 武丽娜; 管玉圣
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-03-12
Also published as: CN102586278B

Abstract

本发明公开了水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15，该基因编码如SEQIDNO.1所示氨基酸序列，或者SEQIDNO.1所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且具有与水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积蛋白OsABCG15功能相同的蛋白质，还公开了OsABCG15基因的重组表达载体，本发明公开的OsABCG15基因编码的蛋白具有转运脂质以形成花药、花粉壁特定纹饰的功能，是小孢子发育成可育花粉的必须基因，该基因功能的缺失会导致花药和花粉外壁的保护层不能形成，产生水稻雄性不育。

Description

水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15、重组表达载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15，还涉及水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15的重组表达载体和应用。

背景技术

水稻（Oryza sativa）是主要粮食作物之一，全世界约有一半人口以稻米为主食。在我国，水稻播种面积为全国粮食作物播种面积的30%，而总产量却占粮食作物产量的42%以上，其重要原因就是水稻杂种优势的成功应用。

Jones早在1926年就发现了水稻杂种优势现象。但水稻为自交结实作物，难以获得大量的、纯度高的杂交种，阻碍了水稻杂种优势利用的进程，直到1970年我国李必湖发现野败不育株。1973年“杂交水稻之父”袁隆平的研究团队，经过刻苦专研，实现了三系配套，并于1976年开始大面积推广杂交水稻，使水稻杂种优势成为现实。直到现在，不育系仍是水稻杂种优势利用的主要途径。

目前，人们主要通过质核互作不育系（三系法）和温光敏不育系（两系法）来实现水稻的杂种优势。然而，由于质核互作不育系配组不自由，可利用的亲本有限，种子生产比两系法复杂，温光敏不育系的育性受自然温光条件影响，大面积制种风险大等原因，使得水稻的杂种优势无法通过这两种不育系得到充分体现。

正常可育水稻的花药和花粉外壁具有特定纹饰，主要由脂类等物质形成，在抵御生物和非生物逆境，提高授粉效率，花粉与柱头的相互识别和信号交流，生殖隔离等方面有重要作用。普通核雄性不育具有如下特点：由一对隐性基因控制，任何品系都能够转育成不育系,任何品系都能够作为其恢复系，败育彻底，不受环境影响等。这些特点有利于充分发挥水稻杂种优势。因此，大力发掘普通核不育基因和研究其调控机理，对于进一步提供水稻产量和品质具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15，具有转运脂质以形成花药、花粉壁特定纹饰的功能，是小孢子发育成可育花粉的必须基因，该基因功能缺失会导致雄性不育，产生新的水稻雄性不育系，在农业生产上有重要作用，技术方案为：

所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，或者SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且具有与水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积蛋白OsABCG15功能相同的蛋白质。

进一步，所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的之二在于提供水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15的重组表达载体，其技术方案为：

含有所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体是在pCAMBIA1301载体多克隆酶切位点处连入SEQ ID NO.31所示核苷酸序列。

本发明的目的之三在于提供水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15的应用，技术方案为：

所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15在水稻育种中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15，该基因主要通过影响水稻花粉发育中的脂类运输，对花粉及其外壁发育、育性方面具有重要作用，OsABCG15基因突变、基因敲除或抑制表达等使其丧失功能后，导致花药和花粉壁的纹饰形成和脂类沉积无法进行，从而导致小孢子降解，获得新的水稻雄性不育系，可以用来生产杂交种子，在农业生产上具有十分重要的应用；本发明还公开了OsABCG15基因的重组表达载体，该重组表达载体能够将水稻雄性不育系恢复为可育系，具有广泛的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图l为本发明osabcg15突变体和正常的近等基因系II-32B花药和花粉形态学观察图（（Sp表示染色花粉，Ac表示花药残渣））。

图2为本发明 OsABCG15座位定位和突变位点示意图。

图3为本发明OsABCG15互补植株的花药形态和花粉碘染图。

图4为本发明 osabcg15突变体和近等基因系II-32B花药组织切片和扫描电镜图(图A、B、C和D花药组织切片图，A和B为野生型，C和D为osabcg15突变体；E、F、G和H为扫描电镜图，E和F为花药电镜扫描图，E为野生型，F为osabcg15突变体，G和H为绒绒毡层电镜扫描图；G为野生型，H为osabcg15突变体；DC:二分体，T:绒毡层，C:花药空腔)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

术语“花药表皮和花粉壁脂类沉积的基因”指编码具有运输脂类到花药表皮和花粉壁的ABC-2型转运蛋白的核酸序列，碱基序列如SEQ ID NO.2中第1-2067位所示的核苷酸序列及其简并序列。简并序列是指，位于SEQ ID NO. 2序列的编码框第1-2067位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.2中第1-2067位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.1所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.2中从核苷酸第1一2067位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.2中从核苷酸第1一2067位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的调控花药和花粉壁脂类积累的相同功能的蛋白的SEQ ID NO.2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个（通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

术语“花药表皮和花粉壁脂类沉积的蛋白”指具有运输脂类到花药表皮和花粉壁的ABC-2型转运蛋白活性的、具有SEQ ID NO.1序列的多肽。该术语还包括具有与天然影响花药表皮和花粉壁脂类沉积的ABC-2型转运蛋白SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能；在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

实施例中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本实施例的水稻花药表皮和花粉壁脂类转运相关多肽时，可以将该蛋白的编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成调控水稻花药表皮和花粉壁脂类转运相关蛋白的表达载体。

相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

除了用重组法产生之外，实施例中蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。可以分别化学合成本实施例蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

实施例1、 osabcg15 突变体植株的获得和形态学的观察

籼稻缙恢1号突变体，命名为osabcg15突变体，由本实验室保存，用II-32B作轮回亲本，与osabcg15突变体杂交和隔代回交，最终将突变体保存下来，该不育材料同II-32B为一对近等基因系。osabcg15突变体与II-32B杂交，Fl代全部为可育，自交F2代中出现分离，其中正常植株为567，突变株为187，比例符合3:1(χ2 = 0.0071<χ0.05 = 3.84)，表明该雄性不育突变体表型由一个单核基因突变造成。对osabcg15突变体植株的形态学观察：II-32B稻穗结实后下垂(图1A左)，而osabcg15突变体小穗不结实呈直立状(图1A右)；II-32B花药包含成熟花粉呈现为黄色(图1B上)，osabcg15突变体花药为白色(图1B下)；II-32B花粉碘染为黑色(图1C上)，osabcg15突变花药中无花粉，在碘液中捣碎后只有花药残渣(图1C下)。

实施例2、OsABCG15基因的定位和克隆

一、定位群体

将osabcg15突变体与粳稻日本晴杂交，自交获得F2代，选择雄性不育植株为定位群体。

二、提取水稻DNA

亲本采用改进的CTAB法进行提取，包括如下步骤：取叶片0.1-0.2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2m1离心管，加入700μL 100℃预热的 1.5×CTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入65℃水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混匀，13000rpm离心10分钟，取上清于新管中，加入900μL无水乙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的DNA离心，14000rpm离心10分钟。去掉上清，将沉淀用1mL 体积分数为70%乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200μL TE溶液中，4℃冰箱保存。定位群体的单株DNA采用改进的碱煮法提取，包括如下步骤：剪碎嫩叶片1-2cm²放入0.5m1离心管，加入100μL浓度为0.125M的 NaOH溶液，沸水浴30秒，然后加入50μL浓度为1.0M 的Tris-HCl（pH8.0），最后加入100μL浓度为0.125M的HCl，沸水浴2分钟后4℃冰箱保存备用。

三、群体分离分析初定位

设计137对多态性标记，其中包括42对SSR引物和95对InDel分子标记引物。其中SSR引物根据已发表的序列合成(具体参见http://www.gramene.org.microsat/ssr.html)，其他InDel分子标记设计是根据比较粳稻日本晴和籼稻9311两品系的已公布的核酸序列，对差异的部分设计引物，验证2个亲本粳稻日本晴和籼稻osabcg15突变体之间的多态性。将设计的137对引物分别扩增水稻雄性不育植株和水稻亲本基因组DNA，PCR扩增程序为:10μL体系中，lμL模板，lμL 10pmol/μL 上游引物，lμL10pmol/μL下游引物，lμL 10×Buffer (Mg^2十)，lμL 2mM dNTP，0. lμL Taq，3.9μL水；PCR产物用质量体积分数为10%的PAGE胶电泳，银染方法检测。结果显示，137对标记进行扩增反应，Chr6Ind（-37-1）引物（如表1所示）对亲本与F2代选择雄性不育植株存在差异，表明6号染色体上的标记Chr6Ind（-37-1）与OsABCG15基因座位有明显的连锁关系。

四、精细定位

用不育单株对6号染色体上的标记Chr6Ind（-37-1）附近有差异SSR标记进行验证，发现RM3628引物对（如表1所示）和RM5371引物对（如表1所示）分别有6个和38个的重组子而且重组子不相互包含，这说明OsABCG15基因座位应位于RM3628和RM5371两个分子标记之间。为了对OsABCG15基因进一步精细定位，将用于定位的突变株扩大到近2157株，又在RM3628和RM5371间设计了20对SSR引物，6对InDel引物和23对STS引物，20对SSR引物中RM20356、RM20361、RM20366 、RM275和RM275引物对存在差异，6对InDel引物中Chr6Ind(-30)、Chr6Ind(-7)和Chr6Ind(4)引物对存在差异，23对STS引物中Chr6STS20、Chr6STS13和Chr6STS15引物对存在差异。用有差异的引物对定位群体进行分析，最终将OsABCG15基因定位在Chr6Ind（-30）和Chr6STS13之间，如图2A所示。经分析表明，该区域只包含1个编码基因，该基因编码ABC-2型转运蛋白，编码该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，与拟南芥雄性不育基因WBC27同源，通过对该基因的两次测序，发现osabcg15突变体在该基因的第4个外显子处发生一个碱基的替换(A变为C)，如图2B所示。基因定位所用标记的序列如表1所示。

表1 基因定位分子标记及其引物序列

引物名称	上游引物(5’→3’)	下游引物(5’→3’)
			RM3628	5’-aatcatgcctagagcatcgg-3’（SEQ ID NO.3）	5’-gttcaacatgggtgcagatg-3’（SEQ ID NO.4）
RM20356	5’-ttaccaggcttcctctcttgacc-3’（SEQ ID NO.5）	5’-ccacgtcacccagaaactaatcc-3’（SEQ ID NO.6）
			RM20361	5’-cttgaaatttgtgcggaggttgc-3’（SEQ ID NO.7）	5’-gatgtcaccatcacggagaattagg-3’（SEQ ID NO.8）
Chr6Ind(-30)	5’-gcttccataactacaaggc-3’（SEQ ID NO.9）	5’-atctcgtataacaaactcacaa-3’（SEQ ID NO.10）
			Chr6Ind(4)	5’-cgatattactaccaggattt-3’（SEQ ID NO.11）	5’-attgccaaccaactaact-3’（SEQ ID NO.12）
Chr6STS20	5’-aaaatggtgggtcatacgg-3’（SEQ ID NO.13）	5’-gggtcctgggtagcgaaa-3’（SEQ ID NO.14）
			Chr6STS15	5’-gctccgtgaccaagtatgt-3’（SEQ ID NO.15）	5’-gaggaagaagaagagggtgt-3’（SEQ ID NO.16）
Chr6STS13	5’-cgatgagatggttgggagc-3’（SEQ ID NO.17）	5’-tgcgggcaggagatttgg-3’（SEQ ID NO.18）
			Chr6Ind(-7)	5’-acacgaggcttctagtgat-3’（SEQ ID NO.19）	5’-attgattgttcctaaccaa-3’（SEQ ID NO.20）
RM20366	5’-caggtaaagcgatgagcaattcg-3’（SEQ ID NO.21）	5’-aaggagttggcaacagcgaagg-3’（SEQ ID NO.22）
			RM275	5’-cctcaacatcctcacacacaagc-3’（SEQ ID NO.23）	5’-gccaatcggatgtgatttatgc-3’（SEQ ID NO.24）
Chr6Ind(-37-1)	5’-atgtcctaagggtctgt-3’（SEQ ID NO.25）	5’-agtggctacatttagtttg-3’（SEQ ID NO.26）
			RM5957	5’-actgctgcactgcacaagac-3’（SEQ ID NO.27）	5’-agctagctaggcgtgagctg-3’（SEQ ID NO.28）
RM5371	5’-ggctagctttagctgcgttg-3’（SEQ ID NO.29）	5’-acccagatcgaaacaactgc-3’（SEQ ID NO.30）

实施例3、OsABCG15基因的功能分析

为了进一步确定OsABCG15基因是引起本雄性不育突变体表型的基因，从含有OsABCG15基因的水稻BAC（细菌人工染色体）AP005446中克隆出OsABCG15基因及表达调控区（包含5887bp的外显子和内含子，1596bp上游启动子和1060 bp下游终止子)，核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，用EcoR I和 Sbf I酶切，连接入经同样酶切的pCAMBIA1301载体，获得一个8.5kb的pCAMBIA1301-OsABCG15重组表达载体，将所得重组表达载体采用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404，得含重组表达载体pCAMBIA1301- OsABCG15的根癌农杆菌LBA4404，命名为LBA4404- OsABCG15。

将所得LBA4404-OsABCG15转化水稻osabcg15突变体，以观察其花粉育性是否得到恢复。结果如图3所示，结果显示T₀代获得互补植株，T₀代互补植株花粉育性恢复，花药中含成熟花粉而变成正常黄色，碘染花粉成黑色，T_l代出现可育:不育植株的分离比为3:1 (221株可育:79株不育)，可育性状和GUS染色共分离。由此可见所克隆的OsABCG15基因是引起本突变体雄性不育表型的基因。通过对花药不育突变体osabcg15花药发育各时期进行组织切片观察，结果如图4所示，结果显示OsABCG15基因的突变会导致水稻小孢子从四分体中释放出来不久就开始降解，最后在突变体花药中无完整花粉，甚至药室成了空腔。扫描电镜表明，突变体花药表面光滑，缺少固有的纹饰，绒毡层光滑无乌氏体。结果表明OsABCG15基因是调控水稻雄性不育的基因，对花药表皮和花粉表面脂类沉积具有调控作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15，其特征在于：所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，或者SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且具有与水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积蛋白OsABCG15功能相同的蛋白质。

2.根据权利要求1所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15，其特征在于：所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1或2所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCAMBIA1301载体多克隆酶切位点处连入SEQ ID NO.31所示核苷酸序列。

5.权利要求1或2所述水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15在水稻育种中的应用。