CN105705643A

CN105705643A - 非生物胁迫抗性

Info

Publication number: CN105705643A
Application number: CN201480038836.9A
Authority: CN
Inventors: N·巴萨卡; V·R·曼古
Original assignee: Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College
Current assignee: Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College
Priority date: 2013-07-08
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2016-06-22
Also published as: AU2014287556A2; AU2014287556A1; US10465202B2; US20160145637A1; WO2015006185A1; EA201690177A1

Abstract

公开了对于非生物胁迫例如盐胁迫、水分胁迫或温度胁迫具有增强的抗性的转化植物。还公开了可用于制造这样的转化植物的载体，以及转化植物以增强对非生物胁迫例如盐胁迫、水分胁迫或温度胁迫的抗性的方法。例如，互花米草ADF基因SaADF2当转化到稻Oryza sativa中时增强抗性。表达更高水平的米草属ADF的转基因稻植物对盐、干旱和寒冷更具抗性。相较于野生型(WT)稻，存在改善的生长、更高的光合作用和增加的谷物产率。

Description

非生物胁迫抗性

根据35U.S.C.§119(e)要求2013年7月8日提交的美国临时专利申请系列号61/843,511在美国的优先权；根据适用的条约和公约要求在所有其它国家的优先权。优先权申请的完整公开内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

来自盐生草互花米草(Spartinaalterniflora)的肌动蛋白解聚因子赋予对多种非生物胁迫的耐受性，并且可用于转化其它植物(单子叶和双子叶植物)以改善对胁迫的抗性。

背景技术

干旱、盐度和极端温度是最常见的不利地影响植物生长和发育的环境胁迫。这些胁迫限制了世界范围内种植面积的植物生产力。在目前的不断改变的气候条件下，胁迫耐受性和胁迫下的作物产率必须改善以给不断增长的世界人口提供食物和纤维。

植物通过各种途径响应非生物胁迫。对于改善作物的胁迫耐受性存在未满足的需求。大田作物，例如稻(水稻(OryzasativaL.))或棉(陆地棉(GossypiumhirsutumL.))，在相似条件下通常比在同一区域生长的原生植物(例如原生盐生植物或原生变水植物(“复苏植物“))经历更多的胁迫。例如，稻植物对盐、干旱和寒冷的温度敏感。当暴露于干旱或盐胁迫时，稻遭受生长和生产力的中等至严重的下降。如果盐浓度在～50mMNaCl以上，大多数稻植物生长不良或根本不生长，而盐生植物互花米草(Loisel)(也被称为互花米草(smoothcordgrass))可在高达500mMNaCl的盐度下完成其整个生命周期。虽然棉通常比稻更耐旱，但在干旱期补充灌溉可更好地实现高且一致的棉产率。在关键的繁殖阶段期间避免胁迫是特别重要的，并且是超过三分之一的美国棉种植面积处于某种形式的灌溉下的原因之一。外部灌溉是昂贵的。此外，用于灌溉的有效水的质量已在许多地方下降，并且有效水常常有较高的溶解盐，这对植物施加额外的胁迫。当植物遭受干旱或盐胁迫时，棉纤维质量可能会下降。

与淡土植物(不耐盐的植物，例如稻或棉)相反，盐生植物(耐盐植物)在生理、细胞和分子水平上具有帮助植物应对较高盐浓度的适应。这些机制包括离子平衡、渗透调节、离子排出和分室化。互花米草是多年生落叶草，其是原生于沿北美和南美的大西洋海岸以及墨西哥湾的潮间盐水沼泽的盐生植物。互花米草是积累Na⁺(将其隔离在液泡中)的兼性盐生植物，并通过专门的盐腺排出过量的NaCl。互花米草还合成相容性溶质，例如脯氨酸、甘氨酸甜菜碱；并且它不排斥离子被其根吸收。见Baisakh等人，PlantScience170:1141-1149(2006)。鉴定在植物例如互花米草中负责胁迫耐受性的基因并将那些基因转化至作物植物例如稻或棉中具有产生对非生物胁迫的耐受性改善的遗传修饰作物的潜力。

改善棉(或其它作物)在干旱和高盐度下的产率的一种方法是将胞质钠隔离至液泡中，从而避免钠离子在胞质中累积至毒性水平，并实现更好的保水性和更高的盐耐受性。液泡钠隔离由活性Na+/H+“反向转运体”膜蛋白介导。离子交换通过V-ATP酶在液泡处由原发性主动H⁺运输驱动(V-ATP酶是ATP依赖性蛋白泵)。H⁺-ATP酶用作将质子泵出细胞质的主要转运蛋白，从而在液泡膜上产生pH和电势梯度，由此激活次级转运蛋白用于离子和代谢产物的吸收。Baisakh等人，PlantBiotechnologyJournal10:453-464(2012)报道，液泡H⁺-ATP酶基因c1亚基的互花米草基因(SaVHAc1)的组成型过表达对转基因稻植物赋予盐耐受性。

改善大田作物的胁迫耐受性的另一方法是操纵调节性基因，例如参与信号传导途径的那些，或调节胁迫响应基因的下游表达的转录因子。Park等人，BMCPlantBiology12:90(2012)最近在受到水分胁迫的棉植物中鉴定了许多差异表达的mRNA转录物。这些转录物中的一些与热休克和活性氧物质相关。其它研究人员已鉴定了脱水响应元件结合基因，包括DREB1和DREB2。这些基因在与顺式作用DRE(脱水响应元件)相互作用的脱落酸非依赖性胁迫耐受途径中是重要的。DREB1的天然形式和DREB2的组成型活性形式的过表达增加了转基因拟南芥(Arabidopsis)植物对干旱、盐度和寒冷的耐受性。Kasuga等人，NatureBiotechnology17：287-291(1999)。DREB基因的过表达还增加稻植物对盐度和干旱的耐受性。见Datta等人，PlantBiotechnologyJournal10:579-586(2012)。

肌动蛋白细胞骨架对于许多细胞过程(包括对于植物发育必不可少的几个)是至关重要的。这些过程需要肌动蛋白丝(F-肌动蛋白)网络的不断重组和重塑。F-肌动蛋白周转包括聚合、解聚、切断、核化以及大规模易位事件。肌动蛋白结合蛋白调节肌动蛋白阵列的空间结构和动态细胞骨架重排。肌动蛋白结合蛋白感测环境改变并影响肌动蛋白丝聚合、解聚、分支和捆聚。

肌动蛋白解聚因子(ADF)/丝切蛋白是在真核细胞中发现的普遍存在的低分子量(15至20kDa)肌动蛋白调节性蛋白质。作为肌动蛋白阵列动力学的关键调节因子，这些蛋白在生长和发育中起重要作用。ADF在植物、动物和真菌中是系统发育保守的。ADF特异性结合单体(G-)和丝状(F-)肌动蛋白的肌动蛋白捆聚形式。ADF通过切断肌动蛋白丝、减少纤丝长度和增加带刺末端来增加肌动蛋白周转。ADF还通过改变肌动蛋白丝的螺旋扭转来增加F-肌动蛋白单体从尖端的解离，从而加速肌动蛋白亚基的解离。可逆磷酸化、特定的磷酸肌醇、钙刺激蛋白激酶、RopGTP酶和pH均影响植物的ADF活性。ADF还在花粉管生长、根形成以及冷驯化中起作用。

Yan等人，Proteomics5:235-244(2005)报道了稻中盐胁迫响应蛋白质的系统性蛋白质组学研究。在盐胁迫后上调的蛋白之一被鉴定为推定的肌动蛋白结合蛋白，作者认为其可能是在稻中以前未报告过的ADF。

研究植物ADF的调控由于许多异形体在高等植物中的存在而充满挑战。ADF2的RNAi介导的敲低已被报道在拟南芥中干扰细胞生长和分化。质谱分析表明在稻叶中ADF蛋白在水分胁迫23天之后上调。见Salekdeh等人，Proteomics2:1131-1145(2002)。

Ali和Komatsu,JournalofProteomicsResearch5:396-403(2006)报道，在稻叶鞘中ADF在干旱胁迫2至6天之后上调。也参见www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/EH277804。

Baisakh等人，Functional&IntegrativeGenomics8:287-300(2008)报道，在互花米草中ADF样蛋白在盐胁迫下上调。

Ouellet等人，PlantPhysiology125:360-368(2001)报道，在小麦(Triticumaestivum)中ADF在冷胁迫过程中上调。

Baisakh和Subudhi，PlantBiotechJ.47:232-235(2009)报道，在互花米草中在热胁迫下ADF在叶中下调并在根中小幅上调。

Huang等人，TheRiceJ.5:33:1-35(2012)报道，在稻中ADF3在干旱胁迫下上调。据报道，稻ADF3的过表达赋予拟南芥干旱耐受性。

据报道，拟南芥液泡焦磷酸酶基因AVP1的表达增加增强转基因棉的干旱和盐耐受性。(Zhang等人，PlantSignaling&Behavior6:861-863(2011))。AVP1介导的干旱耐受性可能的分子机制被描述为液泡焦磷酸酶的增加的质子泵活性，这增加在液泡膜上的质子电化学梯度。这种梯度导致在植物液泡中的低水势和更高的次级转运蛋白活性，从而抑制细胞质中毒性离子的积累。AVP1的过表达似乎刺激根发育，较大的根系统允许AVP1过表达的植物在干旱和盐条件下更有效地吸收水分，从而提高胁迫耐受性和增加产率。较大的根系统或根冠比的变化可以提高水分胁迫条件下的棉产率。

Bedre等人(“Genome-widetranscriptomeanalysisofthehalophytegrassSpartinaalterniflorarevealsmolecularbasisofitssaltadaptationresponses”，摘要和海报，PlantandAnimalGenomeXXII会议上第P795号的展示(2014年11月14日，SanDiego,CA))描述了关于经受500mMNaCl的互花米草的叶和根转录组分析的研究结果。

气候变化可能导致不可预知的天气模式、海平面上升和海水入侵(盐胁迫)、不稳定的降雨(水分胁迫)以及温度波动(冷和热胁迫)。这些环境胁迫可不利地影响作物生长和生产力。存在对于改善可更好地耐受这样的非生物胁迫的大田作物的未满足的需要。

发明公开内容

我们已发现了对于非生物胁迫例如水分胁迫、盐胁迫或温度胁迫具有增强的抗性的转化植物。我们还发现了可用于制造这样的转化植物的载体，和转化植物以增强对非生物胁迫例如水分胁迫、盐胁迫或温度胁迫的抗性的方法。例如，互花米草ADF基因SaADF2当转化到稻(Oryzasativa)中时增强抗性。表达更高水平的ADF的转基因稻植物对干旱、盐和寒冷更具抗性。相较于野生型(WT)稻，存在改善的生长、更高的光合作用和增加的谷物产率。

在一个实施方案中，从盐生植物互花米草(其已知耐受多种非生物胁迫)克隆编码ADF的DNA序列。当来自互花米草的直向同源基因在稻中表达时，在我们的实验中没有观察到“基因沉默”。外源基因在稻植物的后代中持续表达并持续提供胁迫抗性。(到目前为止，已通过T₄代证实遗传力。)

我们从互花米草分离和鉴定了与来自其它植物的ADF基因显示显著同源性的cDNA。我们发现，该基因“SaADF2”在互花米草中在盐或干旱胁迫下强烈上调。该cDNA包含438个碱基的开放阅读框，我们预测其编码具有145个氨基酸残基(三个α-螺旋和6个β链)的膜蛋白。氨基酸残基19至145是ADF/丝切蛋白结构域。

盐生植物SaADF2基因当被转化至稻(单子叶植物)和拟南芥(双子叶植物)中时赋予对干旱、盐度和温度胁迫的增加的耐受性。

我们成功地将SaADF2DNA引入粳稻基因型日本晴(Nipponbare)中，处于35S花椰菜花叶病毒组成型启动子的控制下。按照另外的在Rao等人，PlantCellTissueandOrganCulture99:277-285(2009)中描述的方案，通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化稻植物。相反地，过表达相应的稻直向同源物OsADF2没有导致胁迫的可比较的改善。

干旱实验证明，对于SaADF2纯合的转基因稻对于低水分条件是高度耐受的。SaADF2转基因稻植物没有表现出萎蔫的迹象直到干旱胁迫的11至14天，相比之下，WT植物在没有水的情况下仅4至5天后即显示叶卷曲和干燥。相较于WT稻，转基因稻显示改善的枝和根生长，保持较高的相对含水量(RWC)，并具有较高的脯氨酸和气孔光合产率。在干旱条件下在营养和生殖阶段中均观察到这些现象。在收获时，转基因谷物产率为WT稻的3至4倍。

在盐度实验中，引入的基因赋予在水培条件下对盐胁迫(150mMNaCl)的增加的耐受性。转基因植物显示出较少的叶尖灼烧、较少的黄化以及对光系统II的损伤较小。相较于WT植物，它们还具有更高的叶绿素含量和更高的含水量。

在使用冷胁迫的实验中，SaADF2转基因稻在4℃下耐受一周，而WT植物具有卷曲和干燥的叶并最终在一周后死亡。

SaADF2基因可以用于转化植物并增强单子叶植物(稻，玉米，甘蔗，小麦等)和双子叶植物(棉，大豆，油菜(canola)等)的胁迫抗性。转化植物将更好地耐受非生物胁迫，包括水、盐和温度胁迫。

附图简述

图1描绘了SaADF2的核苷酸序列(SEQIDNO：7)和推测的氨基酸(SEQIDNO：8)序列。

图2描绘了显示来自互花米草、稻(O.sativa)和拟南芥的不同ADF蛋白之间的推断关系的系统树。

图3描绘了用于稻转化的p35S::SaADF2载体的T-DNA结构。

图4描绘了实验植物在3天和7天后测得的土壤含水量。

图5描绘了在3天和7天的干旱条件之后在植物叶中的相对含水量。

图6描绘了对照植物和干旱胁迫植物的气孔导度，其是蒸腾损失的量度。

图7描绘了对照植物和干旱胁迫植物的光合产率。

图8A和8B分别描绘了转基因和野生型稻中在干旱胁迫后的谷物产率和生物量产率。

本发明的具体实施方式

方法

表1.缩写

ADF	肌动蛋白解聚因子
		EST	表达序列标签
RWC	相对含水量
		WT	野生型

实施例1.RNA分离和cDNA合成

使用另外描述于Baisakh等人，FunctionalandIntegrativeGenomics,8:287-300(2008)中的程序，将5％(w/v)的合成海盐(InstantOcean,AquariumSystems,Mentor,OH)用来对温室中的互花米草植物施加胁迫。总RNA从胁迫和未胁迫的互花米草在24小时、48小时、72小时、96小时和1周后新鲜收获的叶中分离。按照制造商的说明，使用RNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen，USA)。使用1.2％的甲酰胺变性琼脂糖凝胶电泳和ND-1000分光光度计(NanodropTechnologies,Wilmington,DE)就质量控制目的测量总RNA。使用iScript^TMcDNA合成试剂盒(Bio-Rad,USA)，按照另外描述于Baisakh等人，PlantBiotechnologyJournal10:453-464(2012)中的程序，从1μgRNA合成cDNA。

实施例2.克隆、序列分析和二元载体构建

进行全基因组转录组分析以从互花米草鉴定推定的非生物胁迫响应基因，使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST软件：BLASTP将氨基酸查询序列针对蛋白质序列数据库进行比较。BLASTN将核苷酸查询序列针对核苷酸序列数据库进行比较。BLASTX将在所有阅读框中翻译的核苷酸查询序列针对蛋白质序列数据库进行比较。

根据当与非冗余核苷酸数据库(BLASTN)和与蛋白质数据库(BLASTP)进行比较时显示与植物ADF序列的相似性的表达序列标签来设计聚合酶链式反应(PCR)引物。通过使用引物SaADF2Fwd:5’-GGAAGATCTATGGCCTTCATGCGCAC-3’(SEQIDNO:1)和SaADF2Rev:5’-GGGTAACCTCAGTGAGCCCGCTC-3’(SEQIDNO:2)的PCR来从互花米草的第一链cDNA扩增SaADF2的完整开放阅读框，所述引物分别包含BglII和BglII限制性位点。

将p35S::SaADF2构建在pCAMBIA1305.1植物表达载体中及其随后掺入到根癌农杆菌LBA4404细胞中根据另外描述于Baisakh等人PlantBiotechnologyJournal10:453-464(2012)中的方法进行。p35S:SaADF2的身份和方向通过限制性消化和测序证实。图1描绘了SaADF2的观察到的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。核苷酸1-3(ATG)是起始密码子，核苷酸436-438(TGA)是终止密码子。图1中的矩形框表示肌动蛋白解聚因子的ADF-H结构域(如通过与其它植物ADF的序列同源性推断的)。

与SaADF2相似的核苷酸和蛋白序列从NCBI和UniprotKB数据库检索。SaADF2及其来自各种生物的直向同源物通过使用ClustalOmega软件进行比对。使用邻接法，在www.phylogeny.fr/version2_cgi/index.cgi上的Phylogeny.fr和TreeDyn中进行系统发生分析。

实施例3.稻转化

用含SaADF2的根癌农杆菌转化胚胎发生的稻愈伤组织，栽培品种“日本晴”。使用SaADF2特异性引物和潮霉素磷酸转移酶(hpt，选择性标记)特异性引物，通过PCR筛选原代转化(T₀)系。将转基因系通过自花授粉发展至T₂代以获得纯合系。

实施例4.表达SaADF2的植物的分子分析

使用改良CTAB法从稻叶组织中分离出总基因组DNA，并利用NanoDrop分光光度计(ND1000,Wilmington,USA)进行定量。通过PCR就选择性标记基因(hpt)和靶基因(SaADF2)分析100ng的DNA，使用以下基因特异性引物(5'-3')：HPTFwd:tacttctacacagccatc(SEQIDNO:3),HPTRev:tatgtcctgcgggtaaat(SEQIDNO:4)；SaADF2Fwd:ATCGAGGAAAAGCAAAAGCA(SEQIDNO:5),SaADF2Rev:CGATCCTTGGAGGTGGAGTA(SEQIDNO:6)。

从SaADF2和WT稻在干旱胁迫0小时、12小时、24小时、36小时和48小时之后新鲜收集的100mg叶和根组织提取总RNA。采用单步RT-PCR试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)，通过SaADF2基因的半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增来分析两微克的总RNA。将产物在1.0％TAE琼脂糖凝胶上进行解析，并在Kodak200geldoc装置(CarestreamHealth,Inc.,Rochester,NY)中在UV投射仪下进行可视化。稻肌动蛋白1基因用作模板验证的内部对照。

实施例5.在稻中的盐度和干旱耐受性测定

将八个独立的转基因稻品系SaADF2#2、SaADF2#13和SaADF2#23、SaADF2#31、SaADF2#35、SaADF2#38、SaADF2#41和SaADF2#42(即，来自八个独立的转化事件的品系)用于盐和干旱胁迫。将SaADF2#2和SaADF2#31用于冷胁迫实验。(数据未示出)。

注：在一些附图中所见的命名例如31-4-8-12-7描述谱系。在此实例中，“31”是指31^stT₀转基因植物，“4”是指T₁代中的4^th植物；“8”是指T₂代中的8^th植物，等等。

使三周龄的纯合SaADF2和WT稻幼苗(在Yoshida营养溶液中水培生长)经受一周的盐胁迫(150mMNaCl)。将漂浮叶盘测定法用于测定叶绿素漂白作为盐耐受性的量度。

将干旱胁迫施加至45日龄的SaADF2稻品系和WT稻。将两者在温室内的深塑料盆中生长14天(不灌溉)，维持在29℃(日间)和21℃(夜间)，其中每天白昼14小时及黑暗10小时。每盆具有单个植物。施加胁迫处理(植物未浇水)，并且每两天记录土壤含水量。

实施例6.生理分析

体积土壤含水量是存在的水的体积与样品的总体积的比率。土壤湿度传感器响应土壤介电常数ε，其很大程度上取决于含水量。体积土壤含水量(θ_V,m³m^-3)使用Theta探针ML2x以便携式HH2湿度计(Delta-TDevicesLtd.,England,U.K.)在室温下进行测量。

气孔导度是二氧化碳(CO₂)或水蒸气通过叶的气孔的速率的量度。气孔导度(mmolm^-2s^-1)使用叶气孔计(DecagonDevicesInc.,Pullman,WA)来测量。

使用另外描述于Baisakh等人，PlantBiotechnologyJournal10:453-464(2012)中的方法测定叶的相对含水量(RWC)(作为完全水合的含水量的一部分的实际含水量)。

叶绿素荧光使用便携式荧光计(PAM-2100；Walz,Germany)在室温下测量。通过在足够低的水平下测量调制光来测定最小荧光水平(Fo)，其中所有的光系统II反应中心打开。使用0.8秒饱和脉冲在暗适应叶中测定最大荧光水平(Fm)，其中所有的光系统II反应中心关闭。光合产率被测定为：光合产率＝1.0-Fo/Fm。

结果

实施例7.SaADF2的序列分析

鉴定了来自互花米草的含有438bp开放阅读框的表达序列标签(EST)。针对NCBI蛋白质和核苷酸数据库及UniprotKB数据库的同源性检索(利用BLASTx和BLASTn)显示该cDNA类似于来自其它植物的ADF。我们将该基因命名为SaADF2，并预测它是含有145个氨基酸残基的膜蛋白(图1)。

SaADF2相对于来自其它物种的直向同源物的比较序列分析表明，SaADF2开放阅读框与来自几种禾本科植物的ADF(稻ADF2(OsADF2)、玉米(Zeamays)ADF6(ZmADF6)和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)ADF2(BdADF2))具有超过90％的相似性。其ADF与SaADF2具有显著相似性的其它单子叶植物和双子叶植物物种包括：拟南芥(Arabidopsisthaliana)(AtADF6)，陆地棉(GhADF4)，大豆(Glycinemax)(GmADF)，葡萄(Vitisvinifera)(VvADF)，高粱(Sorghumbicolor)(SbADF)，蓖麻(Ricinuscommunis)(RcADF)，马铃薯(Solanumtuberosum)(StADF6)，和毛果杨(Populustrichocarpa)(PtADFI)。类似地，将SaADF2与来自稻和拟南芥的ADF家族的几个成员进行比较的蛋白质序列分析表明SaADF2与来自稻的OsADF2最相似。

图2描述了来自互花米草、稻和拟南芥的ADF家族的几个成员之间的预测关系的进化树。径向树使用邻接算法构建，并经受1000次重复的自展检验。稻(OS)和拟南芥(At)ADF蛋白的UniprotKB登录号是OsADF1:Q6EUH7；OsADF2:Q9AY76；OsADF3:Q84TB6；OsADF4:Q84TB3；OsADF5:Q10P87；OsADF6:Q7XSN9；OsADF7:Q0DLA3；OsADF8:Q0D744；OsADF9:Q8H2P8；OsADF10:Q337A5；OsADF11:Q2QLT8；AtADF1:Q39250；AtADF2:Q39251；AtADF3:Q9ZSK4；AtADF4:Q9ZSK3；AtADF5:Q9ZNT3；AtADF6:Q9ZSK2；AtADF7:Q67ZM4；AtADF8:Q570Y6；AtADF9:O49606；AtADF10:Q9LQ81；AtADF11:Q9LZT3；和AtADF12:Q8LFH6。

SaADF2的145个氨基酸的序列的结构域分析预测了从氨基酸19至145的丝切蛋白/ADF(ADF-H结构域)，其是在植物物种间高度保守的结构域。可能的三级和二级结构的基于同源模型的分析表明，SaADF2包含三个α-螺旋和六个β-链。

实施例8.SaADF2在转基因稻中的稳定整合和遗传

使用基因特异性引物通过PCR分析确认32个转化体就整合SaADF2表达盒而言是阳性的。这些植物在温室中生长至成熟。T1后代分析显示了具有单拷贝基因整合的8个独立的转基因系(SaADF2#2，SaADF2#13和SaADF2#23，SaADF2#31，SaADF2#35，SaADF2#38，SaADF2#41，和SaADF2#42)，分离比率为3:1。(即，存在8个独立的转化事件；并且32个品系来源于这8个事件。)图3描绘了用于稻转化的p35S::SaADF2载体的T-DNA(农杆菌转移的DNA)结构。下表指明了图3的组成成分。

表2.p35S::SaADF2的组成成分

LB	左侧边框
		35S 3′	35S终止子序列
hpt	潮霉素磷酸转移酶选择性标记
		P35S	CaMV 35S启动子
MCS	多克隆位点
		LACZa	lac操纵子
SaADF2	来自互花米草的肌动蛋白解聚因子2基因
		RB	右侧边框

实施例9.SaADF2表达赋予盐耐受性

转基因和WT稻植物的漂浮叶盘测定法显示了在盐胁迫(150mMNaCl)下叶绿素损失的明显差异。在盐胁迫下，WT植物经受高漂白，以及比转基因植物更多的叶卷曲、枯萎、尖灼烧和染回(dye-back)症状。此外，WT植物生长受到的抑制比转基因稻植物多得多，如通过一周的盐条件后的枝和根长度所证实的。

在非胁迫(对照)条件下，转基因和WT稻幼苗的生长和发育是基本上没有区别的。然而，转基因植物中的ADF2表达比WT植物中的表达更高，即使在对照条件下亦如此(如通过RT-PCR测定的)，这是符合预期的，因为该SaADF2基因在组成型启动子(CaMV35S)的控制下。此外，在48小时的盐胁迫中，转基因植物在其叶和根中维持更高的ADF2表达，而ADF2累积在WT植物中显著减少。在12小时的盐胁迫后在转基因植物和野生型植物中均存在短暂的ADF2上调。

实施例10.SaADF2过表达改善干旱耐受性

当稻植物在营养-生殖过渡阶段期间经受干旱条件时，SaADF2转基因植物比WT植物更耐受水分胁迫。到第4天WT植物显示叶卷曲，并且到第14天完全干燥和枯萎。生长也受到了严重抑制。这些植物由于叶绿素的严重损失而显示早衰。与此相反，转基因植物没有表现出叶卷曲和生长抑制的发生直至第11天。转基因植物保持绿色更久，并且延迟衰老的发生。

干旱条件后的植物恢复通过首先不给植物提供水进行11天或14天，随后重新进行4天的正常浇水来测量。在14天水分胁迫之后，WT植物无法恢复，尽管转基因植物在大约一周之内恢复到正常的生长。在11天水分胁迫之后，转基因和WT植物均恢复；然而，此后转基因稻的生长比WT稻显著更高，所述WT稻开花较晚并且结实较差。地面生物量和根生长在干旱胁迫之后进行测量并且转基因稻同样比WT稻表现得更好。(参见图8A和8B)。

还观察到在具有转基因品系的盆中土壤含水量(平均0.15m³/m³)通常比WT稻的那些(0.113m³/m³)更高(图4)。这些观察结果表明，转基因植物更有效地使用水，从而导致持续干旱胁迫下的生存时间延长。

实施例11.气孔导度和相对含水量

转基因植物在水分胁迫下具有比WT植物更好的渗透调节，如通过它们高得多的相对含水量(RWC)显示的。WT植物在干旱一周后失去了叶中84％的RWC。转基因系在相同时间上失去叶中平均28％的RWC。图5描绘了在3天和7天的干旱之后在转基因和WT叶中的RWC。由于转基因植物保持比WT更高的RWC，故它们在干旱条件下组织损伤较少。

转基因植物在非胁迫对照条件下具有比WT植物通常更高的气孔导度。随着缺水增加对植物的胁迫，存在蒸腾速率的普遍下降。虽然所有植物的气孔导度被实质性降低，但转基因系表现出比WT植物更少的降低。图6显示了WT和转基因植物在0天和7天干旱之后的气孔导度，作为干旱胁迫下蒸腾损失的量度。

实施例12.光合产率

在干旱胁迫条件下，转基因稻植物保持比WT植物实质更高水平的光合作用。转基因植物保持更高的光系统II效率，其提高叶绿素“a”水平。图7描绘了在干旱胁迫下转基因系中比WT高得多的光合产率。我们还观察到叶绿素荧光的降低较少，这表明SaADF2过表达导致了在水分胁迫条件下保护转基因稻的光系统II。

在对照和水分胁迫条件下ADF2mRNA转录物的累积在SaADF2转基因稻植物中高得多，如由半定量RT-PCR测定的。有趣的是，转基因植物中的转录物水平在7天胁迫后非常高(相较于仅1天或3天的水分胁迫后的水平)。稻延伸因子1a(OsEF1a)用作内部对照。(数据未示出)

实施例13.谷物生产

转基因稻品系在胁迫条件下具有比WT植物更高的光合作用水平。转基因稻品系保持绿色更久，具有较高的RWC，并且经受较低的胁迫引起的光合抑制。这些特征促成干旱胁迫的转基因植物相较于WT植物具有显著更高的谷物产率和生物量产率。在胁迫下，WT谷物产率下降了85％，而转基因稻的谷物产率下降仅平均24％(范围：21％至27％)。类似地，WT生物量产率下降69％的损失，而转基因生物量下降平均37％(范围：23％至42％)。

图8A和8B分别描绘了转基因和WT稻在有和没有干旱胁迫情况下的谷物和生物量产率/植物。转基因和WT稻的谷物产率在胁迫不存在的情况下是相当的。

转基因稻品系比WT植物更加耐受冷胁迫，如通过在暴露于4℃下3天和7天后的生长和发育所测量的。在盐或冷胁迫下转基因胁迫响应相较于WT胁迫响应的生理分析给出了与干旱胁迫所见的类似的结果(数据未显示)。

实施例14.双子叶植物转化

为了证实SaADF2基因和蛋白不仅在单子叶植物中有效，而且在双子叶植物也有效，还用农杆菌载体将SaADF2基因转化至拟南芥中。初步结果表明，拟南芥转基因植物(AtOx)过表达SaADF2，并且在营养和生殖阶段相较于WT植物具有增加的对干旱和盐胁迫的耐受性。(数据未显示)。

实施例15.来自互花米草的诱导型启动子

我们还将SaADF2编码序列置于用于脱落酸胁迫成熟蛋白(SaAsr1)的天然互花米草启动子(SEQIDNO:9)的控制之下。该启动子描述于Subudhi和Baisakh,InvitroCellularandDevelopmentalBiology–Plant47:441-457(2011)中。将融合构建体转化到拟南芥中并在其中测试。表达在SaAsr1启动子控制下的SaADF2的转基因拟南芥植物在150mMNaCl的盐胁迫下当与其中SaADF2基因是由CaMV35S组成型启动子控制的那些植物相比时，表现出略微更好的根和枝生长(数据未显示)。

实施例16.其它转化

本文公开的载体可用于将SaADF2基因转化到任何目标作物(单子叶植物或双子叶植物)中以改善胁迫耐受性。SaADF2基因将会转化至其中的代表性作物包括稻、小麦、大豆、玉米、番茄、甘蔗、马铃薯、葡萄、棉等。

保藏信息

含有SaADF2基因的p35S::SaADF2载体的样品于2014年7月1日保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209，并被分配了ATCC登录号PTA-121363。此保藏是按照布达佩斯条约进行的。

克隆至其它绿色植物中。

SaADF2基因可用于将胁迫耐受性状一般性地转化到绿色植物中。可随后将胁迫耐受性引入其它异种或同种植物，例如，通过传统育种、回交和选择；或通过用克隆的核苷酸序列转化栽培品种。栽培品种的直接转化可能允许将抗性特征快速引入品种，而不需要多代育种和回交以获得均匀性。

本领域技术人员将理解列出的核酸序列不是可以用来赋予胁迫耐受性的仅有序列。还考虑了编码相同的但由于遗传密码的简并性而具有不同核苷酸序列的那些核酸序列。例如，本领域公知天冬酰胺的密码子可以是AAT(AAU)或AAC。

本发明还包括编码在不直接参与胁迫耐受性的分子的部分中具有一个或多个沉默氨基酸改变的肽或蛋白质的核苷酸序列。例如，考虑了导致在给定位点上产生化学上等同的氨基酸的核苷酸序列改变；因此，氨基酸丙氨酸(疏水氨基酸)的密码子可以由编码另一个疏水残基例如甘氨酸的密码子取代，或可以用更疏水的残基例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代。类似地，导致一个带负电的残基取代另一个(例如天冬氨酸取代谷氨酸)或一个带正电的残基取代另一个(例如赖氨酸取代精氨酸)的改变也可预期产生生物学等价的产物。

本发明不仅涉及如本说明书中所描述的功能性SaADF2序列，还涉及具有对这样的序列的修饰的蛋白，所述修饰导致具有相同功能(即，赋予胁迫耐受性的功能性ADF)并且与所述的氨基酸序列的序列具有约60-70％，优选90％或更高的同源性，更优选约95％或更高的同源性的氨基酸序列。本文所用的“同源性”是指相同的氨基酸或保守取代(例如，酸性取代酸性，碱性取代碱性，极性取代极性，非极性取代非极性，芳族取代芳族)。同源性程度可以通过基于程序的简单比对来确定，所述程序是本领域中已知的，例如，GCG的GAP和PILEUP或可获自NIH互联网网站的BLAST软件。最优选，某一百分比的“同源性”会是相同氨基酸的百分比。

可通过使用本领域已知的定点诱变方法将特别期望的点突变引入编码序列。本发明的分离的DNA序列可用于转化靶作物植物或观赏植物，从而赋予胁迫耐受性。目前存在许多技术用于实现利用外源DNA对高等植物的直接或间接转化，并且通过其可以将SaADF2序列之一掺入到宿主基因组中并由其后代稳定遗传的任何方法包括在本发明中。

植物细胞的转化可以通过使用载体来介导。用于转化植物的常用方法是使用根癌农杆菌来将外源核苷酸序列导入靶植物细胞中。例如，将SaADF2核苷酸序列插入到含有Ti质粒T-DNA中的侧翼序列的质粒载体中。该质粒随后被转化到大肠杆菌(E.coli)中。在此株系、含有具有实现将含SaADF2的T-DNA序列转移至靶植物染色体中所需的毒性功能的缴械Ti质粒的农杆菌株系以及含有具有使得将SaADF2构建体从大肠杆菌转移至农杆菌所需的序列的质粒的第二大肠杆菌株系之间进行三亲交配。或者如本文所用的，可将简单的冻融法用于使质粒载体进入农杆菌中。含有植物转化所需的序列的重组农杆菌株系被用于感染来源于成熟种子、未成熟胚等的叶盘或愈伤组织。叶盘/愈伤组织在选择性培养基上生长并鉴定成功转化的再生体。

植物病毒也提供了用于转移外源DNA的可能手段。

还可使用植物细胞对DNA的直接摄取。通常地，将靶植物的原生质体在待转移的DNA的存在下连同促进原生质体对DNA的摄取的试剂一起置于培养中。这样的试剂包括，例如，聚乙二醇和磷酸钙。

备选地，DNA摄取可以通过电穿孔刺激。在此方法中，电脉冲用于在原生质体细胞膜中打开临时孔，随后周围溶液中的DNA通过孔吸入到细胞中。类似地，显微注射可以用来将DNA直接递送至细胞中，优选直接递送至细胞的核中。

在许多这些技术中，转化发生在培养的植物细胞中。在转化事件之后，必须将植物细胞再生至整个植物。从愈伤组织或原生质体培养物再生成熟植物的技术对于大量植物物种是已知的。参加，例如，HandbookofPlantCellCulture,Vols.1-5,1983-1989McMillan,N.Y.。

还存在不必须地需要使用分离的细胞和植物再生技术来实现转化的替代方法。这些通常被称为“基因枪”或“粒子加速”方法，其中将DNA包被的金属颗粒通过火药电荷(gunpowdercharge)(见Klein等人,Nature327:70-73,1987)或通过放电(见EPO270356)推进到植物细胞中。在此方式中，可以用目标DNA序列稳定转化培养中的植物细胞或植物生殖器官或细胞，例如花粉。

在某些双子叶植物和单子叶植物中，DNA的直接摄入是优选的转化方法。例如，在玉米或稻中，培养细胞的细胞壁在具有一种或多种细胞壁降解酶例如纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的缓冲液中消化，以分离活原生质体。将原生质体洗涤几次以去除降解酶，并随后与含有目标核苷酸序列的质粒载体混合。所述细胞可用PEG(例如20％的PEG4000)或通过电穿孔来进行转化。原生质体被放置在硝酸纤维素滤膜上并在具有植入的用作饲养培养物的玉米细胞的培养基上培养。2-4周后，将硝酸纤维素滤膜中的培养物保持在培养基中1-2个月。将具有植物细胞的硝酸纤维素滤膜每两周转移至新鲜培养基抚育细胞。

转化植物的其它方法描述于B.Jenes等人中，和S.Ritchie等人中，S.-D.Kung等人(Eds.),TransgenicPlants,vol.1,EngineeringandUtilization,AcademicPress,Inc.,HarcourtBraceJovanovich(1993)中；以及L.Mannonen等人,CriticalReviewsinBiotechnology,vol.14,pp.287-310(1994)中。还参见公开的国际专利申请WO00/26390的第15-17页引用的各种参考文献，其每一个通过引用并入。

可用于转化种子、生殖细胞、整株植物或单子叶植物或双子叶植物的体细胞的载体是在美国专利5,719,055中公开的基于转座子的载体。此载体可通过上述技术之一或者例如经由与植物细胞原生质体的膜融合的脂质体来递送至植物细胞。

本发明可应用于转化几乎任何类型的绿色植物(单子叶植物和双子叶植物)。考虑用于转化的作物植物和其它植物包括(例如)稻，玉米，小麦，粟，黑麦，燕麦，大麦，高粱，向日葵，甘薯，木薯，紫花苜蓿，甘蔗，甜菜，油菜及其它芸苔属种类，葵花，番茄，胡椒，大豆，烟草，甜瓜，莴苣，芹菜，茄子，胡萝卜，南瓜，瓜，黄瓜及其它葫芦科植物，豆类，卷心菜及其它十字花科蔬菜，马铃薯，西红柿，花生，豌豆，其它蔬菜，棉，三叶草，可可，葡萄，柑桔，草莓及其它浆果，果树，树以及坚果树。所述新型序列还可以用于转化草坪草，观赏植物物种，例如矮牵牛和玫瑰，以及木本物种，例如松树和白杨树。

其它方面

通过本领域中已知的常规育种实践，将从成功转化的亲本植物育种后代。在鉴定了被显示具有非生物胁迫耐受性的后代之后，这些后代将用于培育用于商业用途的品种和杂种。通过标准方法将抗性植物与其它种质进行杂交和回交将产生具有良好的生产力和其它农艺学期望性质的胁迫耐受品种和杂种。备选地，可以采用直接转化至具有农艺学期望性质的品种或具有农艺学期望性质的杂种的亲本，因为直接转化可加速总体选育过程。

如在本说明书和权利要求书中所用，除非上下文另外地明确指出，否则术语“植物”旨在涵盖处于任何成熟阶段的植物，以及从这样的植物获取或衍生的任何细胞、组织或器官，包括但不限于任何胚、种子、叶、茎、花、果实、根、块茎、单细胞、配子、花药培养物、愈伤组织培养物、悬浮培养物、其它组织培养物、或原生质体。并且，除非上下文另外地明确指出，否则术语“植物”旨在意指光合生物体或绿色植物，包括藻类、藓类、蕨类植物、裸子植物和被子植物。然而，该术语排除不进行光合作用的原核生物和真核生物例如酵母、其它真菌，以及不进行光合作用的所谓的红色植物和棕色植物。

除非上下文另外地明确指出，否则植物的“基因组”是指植物的整个DNA序列内含物，包括核染色体、线粒体染色体、叶绿体染色体、质粒以及其它核外或染色体外的DNA。

除非上下文另外地明确指出，否则植物的“后代”包括其祖先可追溯至该植物的任何后续世代的植物。

除非上下文另外地明确指出，否则SaADF2转化植物的“衍生物”包括该植物的后代，术语“后代”如上定义；并且还包括该植物的任何突变体、重组体、或遗传改造的衍生物，无论是相同物种还是不同物种的；其中，在任一情况下，原始植物的胁迫耐受特征已被转移至该衍生植物。因此，植物的“衍生物”可以包括(以举例的方式而非限制性)表达胁迫耐受表型的以下任何植物：F₁后代植物，F₂后代植物，F₃₀后代植物，用SaADF2基因转化的转基因玉米植物，以及这样转化的转基因甘薯植物。

应理解以下定义适用于整个说明书和权利要求书，除非上下文另外地明确指出。

“分离的”核酸序列是位于活细胞外的寡核苷酸序列。包含“分离的”核酸序列的细胞是已用曾经位于活细胞外的核酸序列转化的细胞；或作为这样的细胞的后代或衍生物的细胞。

其它实施方案包括：(a)包含SaADF2多核苷酸的转化载体。或(b)包含SaADF2多核苷酸的宿主细胞。或(c)用于产生具有增强的胁迫耐受性的植物的方法，其包括用SaADF2多核苷酸转化植物细胞，其中所述植物细胞能够再生植物。或(d)通过这样的方法产生的植物，其中所述植物的细胞表达所编码的SaADF2。或(e)这样的植物的衍生植物，其中所述衍生植物的细胞表达所编码的SaADF2。或(f)这样的植物或衍生植物的种子，或能够产生这样的衍生植物的种子，其中所述种子的细胞包含SaADF2多核苷酸。

其它实施方案包括：(a)用于产生具有增强的胁迫耐受性的植物的方法，所述方法包括将这样的植物或衍生植物与其它种质杂交或回交以产生后代植物，其中所述后代植物的细胞表达所编码的SaADF2。或(b)通过这样的杂交或回交产生的植物，其中所述植物的细胞表达所编码的SaADF2。或(c)这样的植物的衍生物，其中所述衍生植物的细胞表达所编码的SaADF2。或(d)这样的植物或衍生植物的种子，其中所述种子的细胞包含SaADF2多核苷酸。

其它实施方案包括这样的植物或衍生植物，其中所述植物是单子叶植物，或者其中所述植物是双子叶植物。

本说明书中引用的所有参考文献的完整公开内容通过引用以其整体并入本文，优先权申请系列号61/843,511的完整公开内容也如此。然而，在另外无法解决的冲突的情况下，以本说明书的公开内容为准。

Claims

1.一种转化载体，其包含编码与SEQIDNO：8具有约95％或更高的序列相似性的肌动蛋白解聚因子(ADF)多肽的多核苷酸。

2.权利要求1的载体，其中所述载体是保藏在ATCC登录号PTA-****下的p35S::SaADF2载体。

3.权利要求2的载体，其中所述多核苷酸编码具有SEQIDNO：8的ADF多肽。

4.一种宿主细胞，其包含编码与SEQIDNO：8具有约95％或更高的序列相似性的ADF多肽的多核苷酸，其中所述宿主细胞是非米草属的某些种(Spartinaspp.)的植物的细胞。

5.一种用于产生相较于同种的野生型植物具有增强的胁迫耐受性的植物的方法，所述方法包括用权利要求1的载体转化植物细胞，其中所述植物细胞能够再生植物。

6.通过权利要求5的方法产生的植物，其中所述植物的细胞表达所编码的ADF多肽。

7.权利要求6的植物的衍生植物，其中所述衍生植物的细胞表达所编码的ADF多肽。

8.权利要求6的植物的种子、或能够产生所述植物的种子，其中所述种子的细胞包含所述多核苷酸。

9.权利要求7的衍生植物的种子、或能够产生所述衍生植物的种子，其中所述种子的细胞包含所述多核苷酸。

10.权利要求6的植物，其中所述植物是稻(Oryzasativa)。

11.权利要求7的植物，其中所述植物是稻(Oryzasativa)。

12.权利要求6的植物，其中所述植物是陆地棉(Gossypiumhirsutum)。

13.权利要求7的植物，其中所述植物是陆地棉(Gossypiumhirsutum)。

14.权利要求6的植物，其中所述植物是单子叶植物。

15.权利要求6的植物，其中所述植物是双子叶植物。

16.权利要求7的植物，其中所述植物是单子叶植物。

17.权利要求7的植物，其中所述植物是双子叶植物。

18.用于产生耐受胁迫的植物的方法，所述方法包括将权利要求6的植物与其它种质杂交或回交以产生后代植物，其中所述后代植物的细胞表达所编码的ADF多肽。

19.通过权利要求18的方法产生的植物，其中所述耐受胁迫的植物的细胞表达所编码的ADF多肽；并且其中相较于野生型同种植物，所述植物具有增强的对来自盐、水或温度的胁迫的耐受性。

20.用于产生耐受胁迫的植物的方法，所述方法包括将权利要求7的植物与其它种质杂交或回交以产生后代植物，其中所述后代植物的细胞表达所编码的ADF多肽。

21.通过权利要求20的方法产生的植物，其中所述耐受胁迫的植物的细胞表达所编码的ADF多肽；并且其中相较于野生型同种植物，所述植物具有增强的对来自盐、水或温度的胁迫的耐受性。

22.权利要求19的植物的种子、或能够产生所述植物的种子，其中所述种子的细胞包含所述多核苷酸。

23.权利要求21的植物的种子、或能够产生所述植物的种子，其中所述种子的细胞包含所述多核苷酸。

24.用于生长植物的方法；所述方法包括播种多个权利要求8的种子；和在胁迫条件下生长所得到的植物；其中所述胁迫条件包括盐胁迫、水分胁迫或温度胁迫的一种或多种；其中所得到的植物的生长或生产量或两者均优于在相同条件下生长的同种野生型植物的生长或生产量或两者。

25.用于生长植物的方法；所述方法包括播种多个权利要求9的种子；和在胁迫条件下生长所得到的植物；其中所述胁迫条件包括盐胁迫、水胁迫或温度胁迫的一种或多种；其中所得到的植物的生长或产量或两者均优于在相同条件下生长的同种野生型植物的生长或产量或两者。

26.用于测定植物的胁迫耐受性状的方法，所述方法包括：

(a)提供来自所述植物的材料；和

(b)检测所述植物材料中胁迫耐受性ADF多肽的存在或不存在，或具有编码胁迫耐受性ADF多肽的核苷酸序列的核酸的存在或不存在，其中所述ADF多肽与SEQIDNO：8具有约95％或更高的序列同一性。

27.权利要求26的方法，其中所述ADF多肽具有SEQIDNO：8。

28.权利要求1的载体，其中所述载体是pSaAsr1::SaADF2载体；其中所述载体包含互花米草脱落酸胁迫成熟蛋白(pSaAsr1)的启动子SEQIDNO：9，其可操作地连接至互花米草肌动蛋白解聚因子2(SaADF2)的编码序列SEQIDNO：8。

29.权利要求1的载体，其中所述编码ADF的多核苷酸可操作地连接至组成型启动子。

30.权利要求1的载体，其中所述编码ADF的多核苷酸可操作地连接至响应于胁迫而诱导的启动子。

31.权利要求30的载体，其中所述诱导型启动子是互花米草肌动蛋白解聚因子2的天然启动子。

32.一种分离的、重组的、经诱变的或合成的多核苷酸，其编码肌动蛋白解聚因子(ADF)多肽；其中所编码的ADF多肽与SEQIDNO：8具有约95％或更高的序列相似性，条件是：所述多核苷酸不与SEQIDNO：7相同；或所编码的ADF多肽不与SEQIDNO：8相同；或两者。