CN103421812B - 利用花花柴KcNHX1基因培育耐高温拟南芥的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种从花花柴(Karelinia caspia)植物中鉴定的基因KcNHX1的分离克隆、功能验证和应用。本发明获得的编码基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；其编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了基因KcNHX1在拟南芥转基因中的应用，本发明克隆的基因可提高拟南芥对高温的耐受性及在高温条件下的产量，验证其具有提高拟南芥花器官中生长素含量的功能。

Description

利用花花柴KcNHX1基因培育耐高温拟南芥的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种从花花柴(Karelinia caspica)分离克隆的NHX类基因(简称KcNHX1基因)及其编码基因与应用。本发明编码基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。功能验证表明该基因能提高拟南芥对高温的耐受性及在高温条件下的产量，具有提高拟南芥花器官中生长素含量的功能。利用本发明克隆的基因KcNHX1，通过遗传转化可应用于增强植物对高温耐受性的培育。

背景技术

非生物胁迫是导致作物减产甚至植株死亡的重要因素。在非生物胁迫因子中，高温导致植物激活一些特异细胞或组织的细胞程序性死亡，该过程会导致叶片脱落，幼苗迅速失绿直至死亡，导致花期的花器官变小、花药不开裂、花粉活性降低、花粉生长素含量显著降低等，严重时会导致花或果实的不能形成，甚至整株植株死亡(Tadashi Sakata，Takeshi Oshino，等.Auxins reverse plant male sterility caused by hightemperatures.PNAS，2010，107(19)：8569-8574)。然而，有关植物对高温胁迫响应的研究报道相对盐碱、干旱、低温等逆境胁迫是最少的一种逆境。但随着全球气温的不断升高，高温对植物造成的胁迫正日益加剧，人们也越来越多的关注高温对植物产生的影响。

高温主要会引起氧化胁迫。自然界中高温和干旱常伴随发生，高温胁迫不同程度地影响着细胞中各种蛋白、膜系统、RNA的种类、细胞骨架结构、酶促反应效率的稳定性，从而影响代谢平衡的状态。因为许多细胞内的反应是相偶联的，代谢稳态的打破可能导致毒素如活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累。许多有机体中氧化胁迫和高温胁迫响应之间存在着密切关系(Ron Mittler，Andriia Finka and PierreGoloubinoff.How do plants feel the heat？.Trends in Biochemical Sciences March.2012，37(3)：118-125)。在细胞代谢、植物或其他组织中通过重新调整其转录组、蛋白组、代谢组和脂质来对环境温度的改变做出响应进而应对高温对其产生的胁迫(田小海，等.水稻花期高温胁迫研究进展与展望.应用生态学报2007，18：2632-2636)。这种改变旨在重建新的代谢平衡，这可使有机体发挥正常功能、继续存活、甚至在高温下保持产量。(Iba K.Acclimative response to temperature stress in higher plants：approaches of gene engineering fortemperature tolerance.Annu Rev Plant Biol.2002，53：225-245.)。高温胁迫和植物对高温的耐热响应是一个复杂的生物学过程，研究植物对高温胁迫响应的机理，发掘并利用耐高温的植物资源及基因资源将是未来缓解由高温导致的植物生长发育受阻及产量下降的研究方向。我国是一个地域辽阔、气候环境复杂的国家，可以充分利用荒漠植物等耐热的植物资源，探索耐热植物对高温响应的生物学机理，应用现代分子生物学和基因组学的方法，克隆耐高温相关的基因并加以功能验证，再应用于有经济价值的作物等。这不仅为植物对高温响应的分子机理研究提供理论基础，也为耐高温育种提供新的种质资源和育种材料。

定位于植物液泡膜上的Na⁺/H⁺逆向运输蛋白(NHX)能够将细胞质中的Na⁺你浓度梯度运输至液泡中隔离起来，同时将液泡中的H⁺有液泡中运至细胞质，该过程起到了降低细胞质中Na⁺浓度从而减少由高Na⁺对细胞产生毒害的作用。Apse等人于1999年克隆了拟南芥的NHX1基因，并将其在拟南芥中超表达，发现转基因植株能耐200mM NaCl(Apse MP，等.Salt Tolerance Conferred by Overexpression of a VacuolarNa⁺/H⁺Antiport in Arabidopsis.Science，1999，285：1255-1258.)。Zhao等人(Zhao F，等.Analysis of thephysiological mechanism of salt-tolerant transgenic rice carrying a vacuolar Na⁺/H⁺antiporter gene from Suaedasalsa.Journal of Plant Research.2006，119：95-104.)从盐生植物盐地碱蓬中克隆了SsNHX1基因并在水稻中超表达，发现转基因水稻的耐盐性和耐旱性明显增强，而且转基因植株中K⁺、Ca²⁺和Mg²⁺的含量也明显高于非转基因植株。Elias Bassil等人(Bassil E，等.The Arabidopsis Na⁺/H⁺antiporters NHX1and NHX2control vacuolar pH and K⁺homeostasis to regulate growth，flower development，and reproduction.The Plant Cell.2011，23：3482-3497.)利用反向遗传学将拟南芥的NHX1和NHX2同时敲除，发现突变植株出现生长减慢、细胞变小、子叶下胚轴变短、雄蕊异常、花丝变短、花粉活性低等现象，说明NHX1和NHX2具有介导调节液泡中K⁺浓度和pH的作用。Liu等人从花花柴中克隆了KcNHX1的cDNA全长，构建了这两个基因的干涉载体并转化入花花柴。生理学结果显示花花柴的KcNHX1沉默导致耐盐性降低，说明KcNHX1可能在花花柴耐盐胁迫响应中起重要作用(Liu L，等.Isolation，molecular characterization，and functional analysisof the vacuolar Na(+)/H(+)antiporter genes from the halophyte Karelinia caspica.Mol Biol Rep.2012，39(6)：7193-7202.)。大量关于NHX基因的研究表明该基因通过离子转运和区隔化来增强转基因植株的耐盐性、耐旱性及对低温的耐受性，还可以通过K+的转运来调节生殖器官的发育，这些都说明NHX在植物生长发育及抵御非生物胁迫方面有着重要的作用。

花花柴(Karelinia caspica)是一种典型的具有广谱抗逆性的菊科荒漠植物(中国植物志，第七十五卷。科学出版社，1979年9月，第一版，P54-55)。Liu等人克隆了花花柴的KcNHX1基因(为了与本发明区别，将已经提交的KcNHX1基因用Kc1表示)，报道了该基因的耐盐性功能。本发明克隆的花花柴KcNHX1基因在核苷酸水平上与已经提交的Kc1基因有12个碱基的差异，在蛋白质水平有1个氨基酸的差异，表明本发明所克隆的基因和已经提交的Kc1基因不是同一个基因。本发明所涉及的基因的功能验证主要在模式植物拟南芥中完成。通过该基因在拟南芥中超量表达验证表明KcNHX1基因与高温胁迫反应相关。申请人认为利用本发明的基因可提高植物对高温的耐受性，增强植物中在高温条件下的结实率，对气候变暖条件下维持植物的产量具有极其重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明的目的是从野生花花柴(Karelinia caspia)植物中分离克隆一个包含该功能蛋白同源基因完整编码区段的cDNA片段(在本发明中所述的“cDNA片段”与“核苷酸序列”以及“cDNA分子”同义)，这个基因参与植物液泡膜的Na⁺/H⁺转运功能。对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明它与拟南芥AtNHX1类基因具有较高的同源性，因此被命名为KcNHX1基因，利用这个基因可以提高植物对高温的耐受性，在高温条件下使转基因拟南芥产量比对照提高2倍左右。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明涉及分离和应用一种包含KcNHX1基因的DNA片段，该片段具有提高植物对高温的耐受能力。其中，所述的KcNHX1基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ NO：1中第1-1620位所示的cDNA序列；或

2)序列表SEQ NO：1中第1-1620位所示的DNA序列同源性超过90％的DNA类似物；或

3)具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO：2序列相同活性且同源性超过90％的蛋白质。

申请制备了一种分离的基因的cDNA，其核苷酸序列含有表达载体p35s-KcNHX1。

所述的表达载体为植物表达载体pK2GW7.0。

一种分离的基因cDNA在提高拟南芥对高温的耐受性中应用，其应用过程是：

以已克隆的其他物种的NHX1基因为模板设计简并引物，从花花柴的cDNA中用PCR(PolymeraseChain Reaction)技术以及RACE技术克隆到本发明的KcNHX1基因。将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中过量表达的载体连接后转化植物。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子、特异启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。

携带有本发明KcNHX1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

本发明的优点有：

本发明克隆的KcNHX1基因提高植物特别是拟南芥对高温的耐受性，增强拟南芥在高温条件下的结实率。本发明有助于研究拟南芥对高温响应的分子机制，同时能够利用基因工程技术有目的提高植物耐高温的能力。

本发明能够利用基因工程技术有目的提高拟南芥的耐高温能力，有利于增强拟南芥在高温条件下的结实性。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的花花柴KcNHX1基因的核苷酸序列，序列长度为1620bp。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的花花柴KcNHX1基因编码的蛋白质的序列，编码539个蛋白质的氨基酸序列。

图1：利用ClustalW软件(公开使用软件)对KcNHX1编码序列与花花柴的Kc1编码序列进行比对结果示意图。图1A显示本发明所克隆的KcNHX1基因和已经公布的Kc1在核苷酸水平的比对结果，它们的同源性为99.3％；图1B是本发明所克隆的KcNHX1与已公布的Kc1在氨基酸上水平的系列比对，它们之间具有99.8％的同源性；图1C是本发明所克隆的KcNHX1基因与拟南芥中的AtNHX基因家族系统发育树，KcNHX1编码序列与拟南芥NHX基因家族中AtNHX3同源性最近；

图2：本发明克隆基因使用的超量表达载体p35S::KcNHX1的构建示意图。图中：图2A是pDONR^TM221质粒图谱；图2B是pK2GW7.0质粒图谱；图2C是含有KcNHX1基因的p35s-KcNHX1重组质粒图。

图3：一种KcNHX1超量表达转基因拟南芥T2植株KcNHX1基因表达量检测示意图。图中各泳道情况：

第1-15泳道为转基因拟南芥的15个不同株系，第16泳道为野生型拟南芥对照。结果表明，不同转基因株系中基因的表达量有所差异。Actin1是拟南芥的肌动蛋白基因，作为内参基因以参考各样品的上样量是否一致。

图4：一种KcNHX1超量表达转基因拟南芥高温处理下地上部表型分析示意图。图4A是幼苗期高温处理(30-38℃处理6天后的表型)下转基因拟南芥KcNHX1-2和KcNHX1-4及野生型(WT)拟南芥的表型在高温胁迫处理下，野生型拟南芥会表现出叶片失绿的现象。图4B是幼苗期高温处理(30-38℃处理6天后)下转基因拟南芥KcNHX1-2和KcNHX1-4及野生型(WT)拟南芥的存活率统计，两个转基因系植株在高温下的存活率是野生型拟南芥的4倍；图4C是高温处理不同时间点转基因拟南芥KcNHX1-2和KcNHX1-4及野生型(WT)拟南芥幼苗叶片中可溶性糖含量的测定，看出从高温处理12h后，转基因植株叶片中的可溶性糖大量积累，明显高于野生型拟南芥。

图5：一种KcNHX1超量表达转基因拟南芥和野生型拟南芥在高温处理下用不同浓度IAA浸泡花器官后角果长度和籽粒数统计示意图。图5A为正常条件下转基因拟南芥KcNHX1-2和KcNHX1-4及野生型(WT)拟南芥角果长度及结实性的测定结果。图5B是高温处理(33℃处理6天)下在喷施不同浓度吲哚乙酸(IAA)后转基因拟南芥KcNHX1-2和KcNHX1-4及野生型(WT)拟南芥角果长度及结实性(种子数)的统计

在图5中：在正常培养情况下，转基因和野生型拟南芥的角果长度和籽粒数一致。在高温情况下，不用IAA处理的转基因拟南芥的角果长度和野生型没有差异，但转基因拟南芥的结实性是野生型拟南芥的2倍，明显高于野生型。当用0.1μM的IAA浸泡花器官后，转基因和野生型拟南芥的角果长度和籽粒数相对没有IAA处理的植株有明显增加，且使用IAA的转基因植株在角果长度和结实性方面明显高于野生型。用0.5μM的IAA浸泡花器官后，转基因和野生型拟南芥的角果长度和籽粒数相对没有IAA处理的植株明显增加，但在转基因植株和野生型之间相比没有显著差异。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有KcNHX1基因完整编码区段的DNA片段，以及验证KcNHX1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1KcNHX1基因的分离克隆

本申请人从花花柴(Karelinia caspica)植物中克隆得到了一段EST序列，所用简并引物为：KcNHX1：(5′-GTTTGCACHTTGCAGGT-3′)，KcNHX2：(5′-CATNARMCCWGCCCACCA-3′)。对这条序列在NCBI基因库中进行tBLASTx比对，发现这个序列可能是Na⁺/H⁺逆向运输蛋白(NHX)基因。这条EST序列没有包含完整地开放读码框，我们采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)法通过PCR进行cDNA末端快速克隆技术以得到这个基因完整的编码序列。

1.花花柴叶片的总RNA提取及cDNA的获得：

从花花柴植物(2009年10月采自中国新疆阿拉尔市)叶片中提取总RNA(提取方法根据Zhu等Animproved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA libraryconstruction.Acta Agronomica Sinica.2005，31.1657-1659.)，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃5min，50℃60min，70℃10min。

2.花花柴KcNHX1基因全长序列的获得：

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)(Frohman等，Rapid production of full-length cDNAs fromrare transcripts：amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer.PNAS1988，85，8998-9002.)分别扩增出KcNHX1的5’和3’端，采用的引物序列分别为KcNHX5r-1(5′-TTCACCCCAAAAGAAGAGATGGAAGC-3′)和KcNHX5r-2(5′-CTGTACAGTAGTGGTGTTTCATCCT-3′)；KcNHX3r-1(5′-TACTGTTTGGGCTGATTATGGCTGG-3′)和KcNHX3r-2(5′-GGTGGTGCTTGGGATAATGCCAAG-3′)。将序列拼接后得到KcNHX1的cDNA序列。根据上述所得的拼接序列设计ORF引物，上下游引物分别为：KcNHX1-F(5′-ATGGATTTCCTTTTGGGCCCGCTATTAG-3′)，KcNHX1-R(5′-TCAATGGATCACATCCATGTCACGGGTG-3′)，以花花柴的cDNA为模板利用PCR技术扩增KcNHX1的ORF。PCR条件为94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，30个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，筛选阳性克隆并测序。其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。再通过ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析；确定包含一个完整的ORF，其表达的蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定ORF所对应的539个氨基酸的蛋白质序列(SEQ ID NO.2)与拟南芥AtNHX1(AF056190.1)相似性较高，因此被命名为KcNHX1基因(图1)。

实施例2：花花柴KcNHX1基因植物超量表达载体的构建

根据得到的SEQ ID No.1设计引物用于构建表达载体，在引物两端分别加上BP-LR反应的接头碱基，引物序列分别为KcNHX1BP-F(5’-GGGG ACA AGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGATGGATTTCCTTTTGGGCCCGCTATTAG-3’)和KcNHX1BP-R(5’-GGGG ACC ACT TTG TAC AAG AAAGCT GGG TC TCAATGGATCACATCCATGTCACGGGTG-3’)以T-KcNHX1质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1.5min，32个循环；72℃延伸10min，经PCR扩增得到包含完整ORF的PCR产物。PCR产物经BP反应连接至pDONR^TM221载体上(BP酶和pDONR^TM221载体购自Invitrogen公司，美国，室温4小时)后转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α感受态细胞，以KcNHX1的特异引物(KcNHX1-F和KcNHX1-R)进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，30个循环；72℃延伸10min。再用LR酶反应将KcNHX1基因连接至植物表达载体pK2GW7.0(比利时国立根特大学惠赠，LR酶购自Invitrogen公司，美国，室温反应4小时)，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α(购自天根生化科技(北京)有限公司)。以KcNHX1的特异引物进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，30个循环；72℃延伸10min。确定为阳性的克隆即为获得了用于转化的超量表达质粒p35s-KcNHX1(图2)。

将构建的p35s-KcNHX1载体转化农杆菌菌株GV3101(Roger等，A guide to Agrobacterium binary Tivectors.Trends in plant science.2000.5，1360-1385.)，挑取单菌落接于含25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm，26℃摇48h，按菌液和甘油体积比为1∶1加入1.5mL离心管混匀，-70℃保存。再通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥。

以上及以后所述的LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；用5mM NaOH调pH＝7.2；用蒸馏水定容至1L；在高温121-125℃高压灭菌15-20min。LB固体培养基为每升加入8g琼脂。

实施例3KcNHX1基因的遗传转化及筛选鉴定

1、拟南芥的准备

供试材料为野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.Columbia ecotype)。野生型拟南芥种子经过春化(4℃处理3天)处理后点播拟南芥种植专用营养土(购自江苏省镇江培蕾有机肥有限公司商品肥料)并放入人工培养室(16小时光照，22±2℃)等拟南芥长到4叶左右进行定苗，以控制拟南芥的生长密度。待拟南芥生长6周左右开始开花时即可进行转化，转化前一天给拟南芥浇足水；

2、农杆菌的活化

从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因(即本发明克隆的KcNHX1基因，其序列见SEQ ID NO：1所示)的GV3101菌株(购自天根生化科技(北京)有限公司)的甘油管在冰上融化，后于含25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，26.5℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在加25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养(26.5℃，100rpm)，其OD600＝0.8-1.0时即可用于转化；

将菌液转移到离心管中5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入100ml浓度为5％(W/V)的蔗糖溶液，重悬农杆菌GV3101，在28℃摇床中复苏1-2小时。加入表面活性剂(Silwet L-77)0.05％(V/V)，震荡摇混匀。

3、农杆菌介导的花序法转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选

农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照参考(Zhang等，Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature Protocols，2006.1：641-646)。具体步骤如下：

(1)将拟南芥花器浸入农杆菌悬液，并轻轻搅动约30秒钟，用纸巾吸掉过多的菌液，并用黑色塑料袋将拟南芥植株包裹起来，保湿避光处理24小时；

(2)24小时之后将塑料袋逐渐揭开透气，正常培养；

(3)一个星期之后重复上述(1)的操作；

(4)待种子成熟可以停止浇水并收获种子，即T₁代种子。

(5)将收获的种子消毒：先用70％(V/V)乙醇浸泡1分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次；

(6)处理后的种子用Top agar(0.1％(W/V)琼脂水溶液)均匀涂布在含卡那霉素的拟南芥生长培养基固体筛选培养基(即含有100mg/L卡那霉素的MS培养基)表面；

(7)4℃春化3天，移入培养室培养10天后，共选取具有卡那霉素抗性植株35株；

(8)将35株转基因T₁代拟南芥植株移栽到土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T₂代种子。

(9)将收取的T₂代种子按操作步骤(5)-(6)进行操作1次；

(10)4℃春化3天，正常培养10天后计算具有卡那霉素抗性植株与非抗性植株的分离比，并进行统计分析；

(11)符合抗性与非抗性植株的分离比为3∶1的株系认为是单拷贝株系，移栽土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即为T₃代种子。

4、转基因拟南芥植株的纯系检测

将收取的T₃代种子按实施例3中农杆菌介导的花序法转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选的操作步骤(5)-(6)进行操作1次；然后4℃春化3天，移入培养室培养10天后查看转基因植株在含卡那霉素的拟南芥生长培养基固体筛选培养基(含有100mg/L卡那霉素的MS培养基)上是否发生抗性分离，不发生抗性分离的株系即认为是转基因纯系T₄代种子，用作下一步表型分析和功能鉴定。

实施例4：转基因拟南芥的表达分析

收集T₄代种子生长的拟南芥植株叶片以提取RNA，RNA的抽提方法采用Trizol试剂盒(购自Sigma公司，美国)。RNA完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)。RNA浓度的测定在BeckmanDU800spectrophotometer(BECKMAN公司，美国)上进行。RNA260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与1μl500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，1μl10mM dNTP，DEPC-water混合，总体积为12μl；然后65℃变性5min冰上骤冷；再加入8μl含有4μl RT buffer，2μl0.1M dithiothreitol，40units ofRibonucleaseInhibitor(购自Promega公司，美国)，和200units of SuperscriptIII反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50℃温浴1h合成第一链；反应结束后75℃处理15min使SuperscriptIII反转录酶失活。每份cDNA稀释到300μl后-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物KcNHXlin-f(KcNHXlin-f：5′-ACCTCTTTCATTTTTATCCAACT-3′)和KcNHXlin-r(KcNHXlin-r：5′-GCAATCCAAATACCACTGTACTG-3′)对KcNHX1基因进行特异的PCR扩增(扩增产物大小为250bp)。同时用拟南芥Atactin2(GenBank登陆号：NM_179953)基因作为内对照基因，引物分别为Actin-f(Actin-f：-5′CACTGTGCCAATCTACGAGGGT-3′)和Actin-r(Actin-r：5′-CACAAACGAGGG CTGGAACAAG3′)做特异扩增(扩增产物大小为250bp)。PCR反应体系的总体积为20μl，DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂1.2ul、2mM dNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶，加ddH₂O至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃30s、72℃30s30个循环，72℃延伸5min。获得的PCR产物取10μl以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

电泳检测结果如图3。结果表明：本发明克隆的KcNHX1基因在拟南芥中能够表达，并且在不同转基因系中的表达量有差异，后续的功能验证研究中选取表达量相对较高的2和4号两个系进行分析。

实施例5：利用转基因拟南芥对KcNHX1基因进行功能验证

1.KcNHX1超量表达和野生型拟南芥苗期高温处理下存活率统计

将转基因拟南芥KcNHX1-2和KcNHX1-4及野生型拟南芥点播于拟南芥专用营养土(购自江苏省镇江培蕾有机肥有限公司商品肥料)，并放入人工培养室(16小时光照，22±2℃)等拟南芥生长4周时于38℃/30℃(白天/夜间)处理4天(见图4A)，统计存活率(见图4B)。

2.KcNHX1超量表达和野生型拟南芥苗期高温处理下可溶性糖含量的测定

在高温处理0h，6h，24h，48h和96h的时间点取样测可溶性糖的含量，测定方法参照《植物生理生化实验原理和技术》(王学奎.植物生理生化实验原理和技术.第2版.北京：高等教育出版社，2008)的方法(结果见图4C)。

3.KcNHX1超量表达和野生型拟南芥花期高温处理下不同浓度IAA处理下的结实性统计

设计0、0.1、0.5μM的3种IAA浓度梯度浸泡两个转基因系和野生型拟南芥植株的花器官5min，再于33℃下处理6天后于室温培养14天，然后剪下高温处理期产生的角果，分别测量其长度，并统计每个角果中的种子数，并以正常条件下同时期结的角果为对照，每个系测试45个角果，结果见图5A和图5B。

以上结果说明花花柴KcNHX1基因具有提高植物耐高温的能力，利用本发明克隆的基因可用于植物，其中包括棉花、拟南芥、油菜、水稻、小麦、大豆、玉米等耐高温品系的培育。

附录：上述培养基及溶液的配方：

拟南芥正常生长培养基：

5mM KNO₃，2mM MgSO₄，2mM Ca(NO₃)₂，1mM KH₂PO₄，1.5mM KCI，70μM H₃BO₃，14μM MnCl₂，1μM ZnSO₄，0.5μM CuSO₄，10μM NaCI，0.2μM Na₂MoO₄，40μM Fe-EDTA，10g/L蔗糖，pH5.7，8g/LAgar。

序列表

 

Claims (1)

1.一种分离自花花柴(Karelinia caspica)的KcNHX1基因在提高拟南芥耐高温中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。