CN110218248B - 花花柴质膜Na+ /H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因与应用。所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白KcSOS1为序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸残基序列；编码其的基因序列如SEQ ID No.1所示。实验证明：花花柴KcSOS1基因导入至烟草中，能够显著增强转基因烟草的抗盐性。本发明提供的花花柴KcSOS1基因可用于提高作物的抗盐胁迫性能，在作物和优良牧草的耐盐遗传改良领域具有广阔的应用前景。

Description

花花柴质膜Na+/H+ 逆向转运蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种花花柴质膜 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白KcSOS1及其编码基因与应用。

背景技术

干旱和土壤盐渍化是限制植物生长、发育的主要环境因素。全球约有10亿公顷盐碱地，其中我国盐碱地约占全球总面积的10％(王遵亲等,1993；Rozema和Flowers,2008)；特别是近年来频繁的旱涝气候变化导致我国土壤盐碱化现象日益加重，严重制约着我国农牧业生产和生态环境建设(Guo等,2013,2015)。因此，在盐碱地面积不断扩大和愈趋频繁的背景之下，如何行之有效的控制和减轻土壤盐碱化已成为目前亟待解决的问题。

植物细胞抵御盐害的主要策略有Na⁺外排和Na⁺区域化(Guo等, 2013)。其中，在Na⁺外排过程中，质膜H⁺-ATPase利用水解ATP的能量把H⁺从细胞质中泵出细胞，产生跨膜H⁺电化学势梯度，驱动质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SOS1将Na⁺外排出胞外，降低胞质内Na⁺浓度，从而减轻了Na⁺对细胞质的毒害(Niu等,1995；Shi等,2000；Zhu 等,2003)。Shi等(2000)从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定出第一个高等植物质膜上的质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因AtSOS1；将其在拟南芥中过表达，显著降低Na⁺在细胞中的积累，增强了植株的抗盐性(Shi等,2003)。同样，Feki等(2014)也发现，在拟南芥atsos1突变体中过量表达硬粒小麦(Triticum durum)TdSOS1，与对照相比，盐处理后转基因植株积累了更少的Na⁺和更多的K⁺，显著增强了其的抗盐性。另外，当质膜Na⁺/H⁺逆向转运活性受到抑制时，拟南芥突变体atsos1根部H⁺内流降低，细胞质发生碱化，pH升高(Shabala等,2005；Guo等,2009)；与此同时，根部细胞质膜和液泡膜上与pH调节相关的基因如AHA1、AHA2、AVA-P4和AVP1的表达丰度均显著下降，但atsos1突变体和野生型植株根中Na⁺浓度并无显著差异，表明SOS1 在Na⁺大量进入细胞造成离子毒害之前通过调控根细胞中与pH调节相关的基因表达来维持细胞正常的PH(Oh等,2010)。可见，质膜 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SOS1介导的Na⁺外排在调节胞内离子稳态及其提高植物耐盐性中起着非常重要的作用(Guo等,2012；Britto和 Kronzucker,2015)。

花花柴(Karelinia caspica(Pall.)Less.)是一种菊科花花柴属多年生草本盐生植物，主要分布在我国西北干旱荒漠区盐碱生境中，在漫长的进化过程中，逐渐形成了一系列特殊的耐盐适应性机制，其蕴涵着丰富的耐盐基因资源。挖掘和鉴定与之相关的耐盐功能基因，将能克服栽培作物抗性育种中抗逆基因匮乏的问题。然而，目前有关SOS1 介导的Na⁺外排在花花柴耐盐中的作用仍不清楚。鉴于此，我们从花花柴中克隆得到质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因KcSOS1，并将其导入到至烟草中，显著增强了转基因烟草的抗盐性。本发明不仅对盐碱荒地植被恢复和生态环境治理具有重要的理论意义和实践价值，同时对农作物、优良牧草、草坪草以及能源草的抗盐遗传改良方面也具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，其氨基酸序列为：

(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能使得植物具有调节开花时间的功能蛋白。

为了使(a)中的花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白便于纯化和检测，可在由SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的KCSOS1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的KCSOS1蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明提供了编码所述KCSOS1蛋白的基因(KCSOS1基因)。

其核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％ SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

上述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的cDNA基因具体可为如下任一所述的基因：

1)其编码基因序列是序列表中SEQ ID NO.1的自5’末端第1-3411

bp核苷酸；

2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1的基因；

3)在不改变氨基酸残基序列的前提下，考虑到密码子的简并性，对上述SEQ IDNO.1所示的编码基因核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明提供了含有所述KCSOS1基因的生物材料。所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。

可用现有的植物表达载体构建含有KCSOS1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用KCSOS1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用KCSOS1 基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以开花时间为表型筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pBI121的多克隆位点插入上述任一所述编码基因得到的重组表达载体。

所述含有KcSOS1基因的其它植物表达载体构建的重组表达载体。例如pCAMBIA1301/1302/2301/3301、pGreen0029、pBin19或其它衍生植物表达载体。

从转基因植物安全考虑，可用6-磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因、或甜菜碱醛脱氢酶基因替换抗生素选择标记或抗除草剂标记，以获得不含抗生素标记物或抗化学试剂标记基因的转化植株。

本发明提供了所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、该蛋白的编码基因、或含有其编码基因生物材料在在降低植物体内Na⁺浓度，增加K⁺浓度中的应用。

本发明提供了所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、该蛋白的编码基因、或含有其编码基因生物材料在制备抗逆性高的植物、或提高植物抗逆性中的应用。

本发明提供了所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、该蛋白的编码基因、或含有其编码基因生物材料在植物种质资源改良、育种中的应用。

本发明提供了所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、该蛋白的编码基因、或含有其编码基因生物材料在促进植物生长速率提高中的应用。

本发明提供了所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、该蛋白的编码基因、或含有其编码基因生物材料在制备生长速率快的转基因植物中的应用。

本发明所述的植物包括小麦、水稻、玉米、谷子、高粱、大麦、早熟禾、黑麦草、燕麦、猫尾草、芒草、柳枝稷、拟南芥、烟草、大豆、番茄、油菜、棉花、苜蓿、百脉根、红豆草、白三叶、菊苣。

所述的抗逆性为抗盐性或抗高盐胁迫性、或抗高渗透胁迫性。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法，是将上述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白编码基因KcSOS1导入目的植物中，得到抗逆性显著增强的转基因植物。

所述抗逆性为抗盐性、或抗高渗透胁迫性。

携带与本发明有关的含有KcSOS1基因的植物表达重组载体，可通过Ti质粒、Ri质粒、DNA转化、植物病毒载体、电导、显微注射、农杆菌介导等常规转化方法导入到目的植株。被转化的植物可为单子叶植物或双子叶植物，其中，单子叶植物包括小麦、水稻、玉米、谷子、高粱、大麦、早熟禾、黑麦草、燕麦、猫尾草、芒草、柳枝稷等，所述双子叶植物包括拟南芥、烟草、大豆、番茄、油菜、棉花、苜蓿、百脉根、红豆草、白三叶、菊苣等。

实验证明：KcSOS1在花花柴根、茎、叶中的表达显著受到盐胁迫或渗透胁迫诱导，并不受低温或ABA(脱落酸)处理的诱导，表明盐胁迫或渗透胁迫能显著诱导与调节KcSOS1的表达；在烟草中过量表达KcSOS1，与野生型相比，转基因烟草植株相对生长速率较高，特别是其体内Na⁺浓度显著降低，而K⁺浓度大幅增加，从而其抗盐性显著提高。可见，本发明基因具有极强的抗盐功能。因此，本发明具有重要意义，在盐碱荒地植被恢复以及农作物、优良牧草、草坪草以及能源草的抗盐遗传改良领域具有十分广阔的应用前景。

附图说明

图1为花花柴KcSOS1各片段及其开放阅读框PCR产物检测， M1:DNA MarkerDL2000；M2:DNA Marker DL5000。A图为利用 RT-PCR方法获得花花柴KcSOS1基因核心片段电泳图，B、C图分别为利用RT-PCR方法分别获得花花柴SOS1基因5’-RACE和3’-RACE 片段的电泳图，D图为将三个片段拼接得到其SOS1基因开放阅读框(ORF)的电泳图。

图2A为花花柴KcSOS1与冷蒿AcSOS1、菊花CcSOS1和拟南芥AtSOS1氨基酸序列多重比较；图2B为花花柴KcSOS1拓扑结构。

图3为花花柴KcSOS1基因与其它植物SOS1基因的系统进化树分析。其中，AcSOS1(冷蒿,Artemisia chinensis,KP896476),AetSOS1(节节麦,Aegilops tauschii,FN356231),AjSOS1(牡蒿,Artemisia japonica, KP896475),AlSOS1(马绊草,Aeluropuslittoralis,JN936862), AsSOS1(拟斯卑尔脱山羊草,Aegilops speltoides,FN356230),AtSOS1(拟南芥,Arabidopsis thaliana,AF256224),BgSOS1(木榄, Bruguieragymnorhiza,HM054521),BpSOS1(桦树,Betula platyphylla, KT344121),CcSOS1(菊花,Chrysanthemum crissum,AB439132), CmSOS1(大菊,Chrysanthemum×morifolium,KP896477),CnSOS1(海草, Cymodocea nodosa,AJ427294),CsSOS1(黄瓜,Cucumissativus, NM_001305732),CtSOS1(川红花,Carthamus tinctorius,KC755044), DsSOS1(盐草,Distichlis spicata,GU480079),GhSOS1(陆地棉, Gossypium hirsutum,KU994886),GmSOS1(大豆,Glycine max, NM_001258010),HbSOS1(短芒大麦草,Hordeumbrevisubulatum, MF101260),HtSOS1(菊芋,Helianthus tuberosus,KC410809), IsSOS1(中华大节竹,Indosasa sinica,KC113048),LgSOS1(大叶补血草, Limonium gmelinii,EU780458),LpSOS1(黑麦草,Lolium perenne, AY987046),KcSOS1(花花柴,Kareliniacaspica),KvSOS1(海滨锦葵, Kosteletzkya virginica,KJ577576),NtSOS1(白刺,Nitraria tangutorum, KC292267),OsSOS1(水稻,Oryza sativa,AY785147),PeSOS1(胡杨, Populus euphratica,DQ517530),PhaSOS1(芦苇,Phragmites australis,AB244217),PotSOS1(白杨,Populus trichocarpa,XM_002315801), PtSOS1(小花碱茅,Puccinellia tenuiflora,GQ452778),PvSOS1(菜豆, Phaseolus vulgaris,XM_007158764),RtSOS1(长叶红砂,Reaumuria trigyna,KC292265),SjSOS1(碱蓬,Suaedajaponica,AB198179), SlSOS1(番茄,Solanum lycopersicum,AB675690),SpSOS1(海马齿,Sesuvium portulacastrum,JX674067),SsSOS1(盐地碱蓬,Suaeda salsa, KF914414),TaSOS1(小麦,Triticum aestivum,KJ563230),TmSOS1(一粒小麦,Triticum monococcum,FN356229),TtSOS1(硬粒小麦,Triticum turgidum,EU552490),VrSOS1(绿豆,Vignaradiate,KC855193), VvSOS1(葡萄,Vitis vinifera,NM_001281211),ZxSOS1(霸王,Zygophyllum xanthoxylum,GU177864)。

图4为低温胁迫(4℃)、渗透胁迫(-1.0MPa山梨醇)、ABA处理(50 μM)以及盐胁迫(200mM NaCl)24h后，KcSOS1在花花柴根、叶片的相对表达水平分析。图中每个点均代表平均值±标准差(n＝3)。

图5A为植物表达载体pBI121-CaMV 35S-KcSOS1-Nos的载体构建示意图；图5B为构建的植物表达载体经BamH I和Sma I酶切检测；图5C为构建的植物表达载体PCR产物检测。

图6A为转基因烟草株系PCR扩增检测图，图中M3：DNA Marker 500，WT：野生型；EM：空载体；图6B为qRT-PCR对转基因烟草各株系相对表达水平检测，图中OX1-32：T2代各转基因烟草株系。

图7A为盐胁迫(0mM和150mM NaCl)21d后对WT、EM与转基因烟草株系OX12、OX21表型，图7B为盐胁迫(0mM和150mM NaCl)21d后对WT、EM与转基因烟草株系OX12、OX21相对生长速率的影响。图中每个点均代表平均值±标准差(n＝6)，柱上不同字母分别表示不同株系间差异显著(P<0.05)。

图8为盐胁迫(0mM和150mM NaCl)胁迫21d后对WT、EM与转基因烟草株系OX12、OX21Na⁺与K⁺浓度的影响。A图为地上部 Na⁺影响示意图，B图为根部Na⁺影响示意图，C图为地上部K⁺影响示意图，D图为根部K⁺影响示意图。图中每个值均代表平均值±标准差(n＝6)，不同字母分别表示不同株系间差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

以下实施案例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的实验材料、试剂及仪器等，若无特殊说明，均可从商业途径得到，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1花花柴Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因KcSOS1的克隆

将长势一致的2周龄花花柴组培苗移至培养盒(20cm×15cm×10 cm)，用Hoagland营养液培养至4周，添加150mM NaCl胁迫处理 24h，剪取叶片经无菌水冲洗，置于消毒滤纸上吸干水分，称取100 mg，于液氮中充分研磨，根据TaKaRa MiniBEST Plant RNAExtraction Kit试剂盒说明书提取总RNA，经Quawell5000核酸蛋白仪测定浓度，并按照TaKaRa PrimeScriptRTase cDNA第一链合成试剂盒说明书进行反转录以合成cDNA。

根据NCBI数据库搜索已克隆出的植物质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SOS1核苷酸序列，通过DNAMAN 8.0软件找出高度保守的区域，并遵循同源性高、简并性低的原则，设计核心简并性引物K1和 K2，利用RT-PCR方法获得花花柴KcSOS1基因核心片段(图1的A 图)，将该片段PCR扩增产物经回收、纯化、克隆测序，序列长度为 723bp。

按照Clontech SMARTer RACE试剂盒说明书5’-RACE和 3’-RACE的方法，分别合成5’-cDNA和3’-cDNA；以花花柴SOS1 基因核心序列为基础，利用DNAMAN 8.0和Primer 5.0软件分别设计5’-RACE外侧引物K3、巣式引物K4和3’-RACE外侧引物K5、巣式引物K6；利用RT-PCR方法分别获得花花柴SOS1基因 5’-RACE(图1的B图)和3’-RACE片段(图1的C图)，经PCR扩增产物经回收、纯化、及测序，5’-RACE片段序列长度为1108bp， 3’-RACE片段序列长度为2148bp；最后将以上三个片段拼接得到其SOS1基因开放阅读框(ORF)，同样利用引物K7和K8经RT-PCR扩增与测序验证该ORF序列长度为3411bp(图1的D图)，编码1136 个氨基酸。通过Compute pI/Mw程序 (http://web.expasy.org/compute_pi/)预测其等电点为5.97，蛋白质分子量为126kDa。其克隆到的SOS1基因与已知植物SOS1基因核苷酸经Blast比对同源性达到70％以上以上，故将其命名为KcSOS1。

引物序列如下：

K1:5’-GCATCAYTTYTGGGARATGGT-3’

K2:5’-ATYCTYCCYTCATCRAGCAT-3’

K3:5’-GATCCAACGACTATGCCCCGTGAGA-3’

K4:5’-TCAGAACACTGTCACCTCCAAGTAT-3’

K5:5’-AGGAATTAGGACCTACTGATTGGC-3’

K6:5’-GACTTGGAGCACATGCATCTTTCTGA-3’

K7:5’-ATGTCATCGGTGGTGGAACC-3’

K8:5’-TTACGGAGCCCGTGGGAAAGAGA-3’

UPM:

Long(0.4μM):

5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAG AGT-3’

Short(2μM):5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’

NUP:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

实施例2质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白KcSOS1结构特征预测分析

将花花柴KcSOS1的氨基酸序列与GenBank中的其他植物的氨基酸序列通过DNAMAN8.0软件和Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) 分析发现，KcSOS1与双子叶植物冷蒿、菊花和拟南芥的SOS1蛋白同源性分别为88％、87％和55％(图2A)。运用TMHMMServer v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)与HMMTOP2.0 (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)对KcSOS1蛋白的跨膜区和拓扑结构进行预测。结果显示，其N-末端含有12个跨膜区， C-末端含有一个长亲水性尾巴、且在738-828aa处含有环核苷酸 (cNMP)结合域(图2B)。因此，花花柴KcSOS1属于质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白。

实施例3质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因KcSOS1进化树分析

为了分析花花柴KcSOS1基因与其它植物SOS1基因的亲缘关系，利用MEGA 6.0软件对其进行系统进化树分析。结果表明：KcSOS1 与双子叶植物冷蒿AjSOS1、菊花CcSOS1等亲缘关系较近，而与单子叶植物小麦TaSOS1、水稻OsSOS1等亲缘关系相对较远(图3)。这暗示着，KcSOS1编码质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白。

实施例4不同处理对花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因KcSOS1 表达水平的影响

通过qRT-PCR方法对不同处理24h后的花花柴幼苗叶片和根中 KcSOS1表达水平进行相对定量分析。按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒说明书的方法提取总RNA，利用 Quawell5000超微量核酸蛋白测定仪测定其浓度，并按照TaKaRaPrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书的方法进行反转录合成cDNA。

利用AlleleID 6.0软件设计KcSOS1基因qRT-PCR引物G1和G2，长度为117bp；花花柴内参Actin基因qRT-PCR引物Q1和Q2，长度为143bp。根据TaKaRa

Premix ExTaq II试剂盒说明书的方法在Bio-Rad CFX96仪器上进行实时荧光定量qRT-PCR反应。采用

方法对花花柴KcSOS1的表达数据进行计算，所有实验均为 3次生物学重复。结果表明，与对照相比，盐胁迫或渗透胁迫下，叶片和根中的KcSOS1表达显著上调，但低温胁迫或ABA处理下，其 KcSOS1转录水平并未发生显著变化(图4)。由此表明，KcSOS1表达受盐胁迫或渗透胁迫的诱导和调节。

引物序列如下：

G1:5’-TGCTGCCTTTCTTCGTGCT-3’

G2:5’-TTTGCTTCCTCTCCCTCTGTCT-3’

Q1:5’-CTTGCGTATGTGGCTCTTGACT-3’

Q2:5’-TGGAACAAAACCTCTGGACAAC-3’

实施例5植物表达载体pBI121-CaMV35S-KcSOS1-Nos的构建

根据Clontech In-Fusion无缝连接原则，首先利用SnapGene 2.3.2 软件并结合KcSOS1基因ORF序列以及植物表达载体pBI121序列特征分别设计含BamH I/Sma I酶切位点引物P1和P2，以KcSOS1-ORF 产物为模板，通过RT-PCR经高保真Gflex DNA Polymerase聚合酶扩增，切胶回收纯化得到该片段KcSOS1-G。再用BamH I/Sma I对 pBI121载体质粒进行双酶切，切胶回收大片段得到线性化载体，命名为pBI121-Q。最后按照In-Fusion试剂盒的相应技术体系(3μL KcSOS1-G，1μL pBI121-Q，2μL 5×In-Fusion HD Enzyme Premix，加水补至10μL，瞬时离心后置于50℃孵育15min)，即可得到重组载体pBI121-CaMV35S-KcSOS1-Nos(图5A)。

取5μL In-Fusion反应液，转化到大肠杆菌DH5α感受态中，用含有50mg L^-1Kan(卡那霉素)的LB固体培养基进行筛选，转化细菌并提取质粒，再经BamH I/Sma I双酶切获得大小3411bp目的基因 KcSOS1的特异条带(图5B)，而后用引物P1和P2，以重组载体质粒为模板PCR验证KcSOS1大小与鉴定结果相符(图5C)，送至上海生工测序。

引物序列如下：

P1:5’-ggactctagaggatccATGTCATCGGTGGTGGAACC-3’

P2:5’-agggactgaccacccgggTTACGGAGCCCGTGGGAAAGAGA-3’

实施例6转基因烟草植株的分子鉴定

采用冻融法分别将空载体pBI121和pBI121-CaMV35S-KcSOS1-Nos转化到根癌农杆菌GV3101感受态中，将转化的菌液均匀涂布于含50mg L^-1Kan和50mg L^-1Rif(利福平)的YEB固体培养基上，28℃避光倒置培养，2-3d后长出单菌落，用接种针挑取单菌落，接种于100mL含50mg L^-1Kan和50mg L^-1Rif 的YEB液体培养基中，200rpm、28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5，而后提取质粒经PCR鉴定确认阳性克隆。然后，按照烟草叶盘侵染遗传转化方法，以及相应的抗性(50mg L^-1Kan)筛选获得的T₀代转基因烟草植株移栽到含有营养土：蛭石(2:1)的花盆中，并放置于温室收获 T₀代转基因烟草植株种子。

将收获的T₀代转基因烟草种子先用5％次氯酸钠消毒，再置于含 50mg L^-1Kan的1/2MS培养基中，大约7d后将发芽一致的转基因烟草按照上述方法收获T₁代转基因烟草植株种子；再重复上述方法获得T₂代转基因烟草植株。按照TaKaRaMiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit试剂盒说明书提取WT和T₂代转基因植株叶片的 DNA，利用Quawell5000核酸蛋白仪测定其DNA浓度，并以此为模板，用引物K9和K10PCR扩增得到片段大小为335bp的植株有32 株(图6A)。随后，将上述获得的T₂代转基因植株扩繁，并按照实施案例1中的方法提取它们叶片总RNA并反转录合成cDNA；通过 qRT-PCR的方法检测转基因烟草植株的转录丰度(目的基因引物Q1 和Q2；烟草内参Actin基因qRT-PCR上游引物Q3和下游引物Q4，长度为109bp)。如图6B所示，各转基因烟草株系的转录丰度均有所不同，其中OX12和OX21转基因烟草株系表达丰度相对最高。因此，选取转基因烟草株系OX12和OX21进行后续的生理生化分析。

引物序列如下：

K9:5’-TATCCACCCTCATACCCAATCA-3’

K10:5’-CAGCAGATATGTAACACGCAGA-3’

Q3:5’-GTGGTCGTACAACTGGTATTGTGTT-3’

Q4:5’-GCAAGGTCCAAACGAAGAATG-3’

实施例7盐处理对转基因烟草植株抗盐性的影响

通过温室盆栽6周龄的野生型(WT)、空载体(EM)和转基因烟草株系(OX12、OX21)在0mM和150mM NaCl处理21d，测定各植株的相对生长速率及通过岛津AA6300C原子吸收分光光度计测试其地上部与根中的Na⁺、K⁺浓度。结果表明：由图7A、图7B所示，在0mM NaCl下，WT、EM和OX2、OX11在表型或相对生长速率方面并没有显著差异；但在150mM NaCl胁迫下，WT和EM植株生长受到严重抑制，出现了明显的叶片萎蔫变黄的症状，反之OX12、OX21植株生长正常并未发生盐害症状。

进一步由图8所示，与对照相比，总体上盐胁迫下所有植株体内 Na⁺浓度显著增加、K⁺浓度大幅下降；然而，与WT和EM相比，OX12 植株地上部Na⁺浓度分别减少了39.95％和47.22％，OX21地上部Na⁺浓度分别减少了40.55％和47.76％；类似的，OX12或OX21植株根中Na⁺浓度分别降低了47.05％和49.25％或46.98％和49.18％。反观，与WT或EM相比，OX12和OX21植株体内积累了更多的K⁺，由此得知其转基因烟草株系体内具有较高的K⁺/Na⁺比。

可见，KcSOS1介导的根系Na⁺外排在降低植株体内Na⁺积累、提高K⁺/Na⁺比以及维持离子稳态平衡方面起着十分重要的作用，从而增强了其的抗盐性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 花花柴质膜Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用

<130> KHP191112742.8

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3411

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcatcgg tggtggaacc cccatggcca aacgtcgtga tcaaggcgga cgaggagcca 60

accgagtctt cgaatccgac agatgcggtg ttgttcgttg ggatttcact ggtgctagga 120

atcgcatcga ggcatgtact cagaggaact cgagttccgt acactgtcgc tctgctcgtt 180

ctcggtatcg ccatgggatc gttagaatat ggaacaagcc atcggttagg aaaggtcggc 240

gatggaattc ggatatgggc aaatattgat cctgatcttc tgttagctgt ttttctccct 300

gctcttcttt ttgaaagttc gttttcaatg gaggtgcacc aaataaagaa atgtttggca 360

caaatggtag tgcttgctgg tcctggggtc ttaatatcca catttcttct tggttcagta 420

ttgaagctaa tctttccata taactgggac tggaaaacat cattactgct tggaggactt 480

ctaagtgcca ctgatcctgt tgctgtggtt gctttgttaa aagaacttgg tgcaagcaaa 540

aagctaagta ctattattga aggagaatct ttaatgaatg atgggacggc aattgttgta 600

tatacacttt ttttccgaat ggtcactgga tcaagcttca gttgggggac tatcatcaag 660

tttttggcaa cagtatctct tggagctgta ggaatgggta ttgcatttgg tttggtgtct 720

tatttatggc taggatatat tttcaacgat acagtgatag aaattacatt gacacttgct 780

gtgagctacc ttgcgtactt cacgtctcaa gaaggtgttg aaatttctgg agtattaaca 840

gtaatgacgt tgggaatgtt ttatgctgct gttgctagaa ctgctttcaa gggtgaaggg 900

caacaaagct tgcatcattt ctgggaaatg gttgcatata ttgctaatac gcttatcttc 960

attttgagtg gagtagtcat agctgaagga atacttggag gtgacagtgt tctgaaacac 1020

gaggaatatt cttggggcta cctgatcctg ctatatgttt ttctccaagt ctcacggggc 1080

atagtcgttg gatcattata tccatttctt cgttattttg gttatggatt ggattggaaa 1140

gaagctattg tacttgtgtg gtctggtttg aggggtgccg tggcattgtc tctttctctc 1200

tccgttaagc aatctagtga ctcttcatac atcagtagtg aaactggaac gctgtttgtg 1260

ttcttcactg gcggaattgt gttcttaaca cttattataa atgggtcaac tactcagttt 1320

gttttacgga tgctagaaat ggataagctg tcagcagcta agaggcgtat tctggagtac 1380

accaagtatg aaatgacaag aaaagcacta gatgcatttg gtgaacttgt tgatgatgag 1440

gaattaggac ctactgattg gcatacagtc aagaaatata tcacatgttt gcatgattca 1500

gaagaacgta tccaccctca tacccaatca gaaaatgata atgacttgga gcacatgcat 1560

ctttctgata tacgtatacg atttttaaat ggtgtgcagg ctgcttattg ggtgatgctg 1620

gaggaaggaa gaatctcaca atttacagca aacattttga tgcaatctgt ggatgaagca 1680

cttgatttgg tgtcacatca tccactatgt gactggaatg ggttgaaagc aaacgttcat 1740

tttcctaatt attacaaatt tctgcaaaca agcacgtttc ctcgtaagct tgtaacctac 1800

ttcacagtcg aaaggttgga atctgcgtgt tacatatctg ctgcctttct tcgtgctcat 1860

aggattgcac gacagcaact acacgagttc attggtgata gtgaaattgc ttcggcaata 1920

attaatgaga gtgagacaga gggagaggaa gcaaaaaagt ttctagaaga tgttcgcgtt 1980

acttttcctg aggttttacg tgttttgaaa acgaggcaag tgacatattc agtgctcagt 2040

catctaattg aatatgttca agatcttgaa aaatctggat tattagagga aaaggaattg 2100

gttcatcttc atgatgctgt cgagactgat ttgaagaaac ttgtacgaaa tcctccattg 2160

gttaagattc ctaaagcaca tgaactgatt agtgcaaatc ctttgttggg agctcttcca 2220

tcagcagtgt gtgagcaaat tgtgggttcc accaaggaaa ccatgaaact acgtggtgtg 2280

gttctctata aggagggatc taagccaaat ggaatatggc tcatttctaa tggtgttgtg 2340

aagtgggcaa gcacgaagat aagaaacaag aactctttgc atccaacatt tgtacatgga 2400

agtactttgg gcctatatga ggtgctgagt ggaaagtctt acttatgtga cattgttgct 2460

gattctgtgg ttcttggatt cttcattgaa gctgaaaaga tactctcggt tcttggaact 2520

actgatcatg cagttgaaga ttttttgtgg caggaaagct caataatact ctccaaacta 2580

ttgcttcctc aaatctttga gaaaatgagc atgcatgacc taaggacact tgttgcagaa 2640

agatcaacta tgaacaccta tataactgga gaaagctttg acctagctcc caatatgatt 2700

ggtctattat tagaaggctt catcaaaacc catactacta tagctgctcc agctgcactt 2760

ttcccttcat atagtgacaa aagtttccga agctctgaaa ttgcaggtgc aagttttact 2820

catcatgcat cctcatacac tgttgagaca cgagcaaggg tgatcatttt tgacattggt 2880

ggatttgaag ccaacagaac ccttcaaaga aggacttctt cattaatacc acatggtgga 2940

gatttacctc caagatcacc aactagagaa catagtggtc taatgagttg gccgcaacat 3000

atgaaatcta gacaaaatct tgaacatcat cctgaagaga ttgatcatca tggaaacaat 3060

ttttctgccc gagccatgca actaagcatg tatggcagca tgatatcaaa tgaaagacac 3120

agtcctcgca cctctccaaa tggagcagtg aaactaccta agacgcagtc tcatagcagg 3180

tcttatccaa gggtcccacc agtagagaat cggcggcttc tttctgtgag atcagaaggg 3240

tctactacag tgggaaaaaa tgtgcatgtt ggaggtgaaa ctcttgtagg cccacatgaa 3300

actgcagata cacgtgaaat ggattactca agtgatgagt ctggtggtga ggatgagcat 3360

attattagaa tcgactcacc aagtaccctc tctttcccac gggctccgta a 3411

<210> 2

<211> 1136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ser Val Val Glu Pro Pro Trp Pro Asn Val Val Ile Lys Ala

1 5 10 15

Asp Glu Glu Pro Thr Glu Ser Ser Asn Pro Thr Asp Ala Val Leu Phe

20 25 30

Val Gly Ile Ser Leu Val Leu Gly Ile Ala Ser Arg His Val Leu Arg

35 40 45

Gly Thr Arg Val Pro Tyr Thr Val Ala Leu Leu Val Leu Gly Ile Ala

50 55 60

Met Gly Ser Leu Glu Tyr Gly Thr Ser His Arg Leu Gly Lys Val Gly

65 70 75 80

Asp Gly Ile Arg Ile Trp Ala Asn Ile Asp Pro Asp Leu Leu Leu Ala

85 90 95

Val Phe Leu Pro Ala Leu Leu Phe Glu Ser Ser Phe Ser Met Glu Val

100 105 110

His Gln Ile Lys Lys Cys Leu Ala Gln Met Val Val Leu Ala Gly Pro

115 120 125

Gly Val Leu Ile Ser Thr Phe Leu Leu Gly Ser Val Leu Lys Leu Ile

130 135 140

Phe Pro Tyr Asn Trp Asp Trp Lys Thr Ser Leu Leu Leu Gly Gly Leu

145 150 155 160

Leu Ser Ala Thr Asp Pro Val Ala Val Val Ala Leu Leu Lys Glu Leu

165 170 175

Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Thr Ile Ile Glu Gly Glu Ser Leu Met

180 185 190

Asn Asp Gly Thr Ala Ile Val Val Tyr Thr Leu Phe Phe Arg Met Val

195 200 205

Thr Gly Ser Ser Phe Ser Trp Gly Thr Ile Ile Lys Phe Leu Ala Thr

210 215 220

Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Met Gly Ile Ala Phe Gly Leu Val Ser

225 230 235 240

Tyr Leu Trp Leu Gly Tyr Ile Phe Asn Asp Thr Val Ile Glu Ile Thr

245 250 255

Leu Thr Leu Ala Val Ser Tyr Leu Ala Tyr Phe Thr Ser Gln Glu Gly

260 265 270

Val Glu Ile Ser Gly Val Leu Thr Val Met Thr Leu Gly Met Phe Tyr

275 280 285

Ala Ala Val Ala Arg Thr Ala Phe Lys Gly Glu Gly Gln Gln Ser Leu

290 295 300

His His Phe Trp Glu Met Val Ala Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Ile Phe

305 310 315 320

Ile Leu Ser Gly Val Val Ile Ala Glu Gly Ile Leu Gly Gly Asp Ser

325 330 335

Val Leu Lys His Glu Glu Tyr Ser Trp Gly Tyr Leu Ile Leu Leu Tyr

340 345 350

Val Phe Leu Gln Val Ser Arg Gly Ile Val Val Gly Ser Leu Tyr Pro

355 360 365

Phe Leu Arg Tyr Phe Gly Tyr Gly Leu Asp Trp Lys Glu Ala Ile Val

370 375 380

Leu Val Trp Ser Gly Leu Arg Gly Ala Val Ala Leu Ser Leu Ser Leu

385 390 395 400

Ser Val Lys Gln Ser Ser Asp Ser Ser Tyr Ile Ser Ser Glu Thr Gly

405 410 415

Thr Leu Phe Val Phe Phe Thr Gly Gly Ile Val Phe Leu Thr Leu Ile

420 425 430

Ile Asn Gly Ser Thr Thr Gln Phe Val Leu Arg Met Leu Glu Met Asp

435 440 445

Lys Leu Ser Ala Ala Lys Arg Arg Ile Leu Glu Tyr Thr Lys Tyr Glu

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ala Leu Asp Ala Phe Gly Glu Leu Val Asp Asp Glu

465 470 475 480

Glu Leu Gly Pro Thr Asp Trp His Thr Val Lys Lys Tyr Ile Thr Cys

485 490 495

Leu His Asp Ser Glu Glu Arg Ile His Pro His Thr Gln Ser Glu Asn

500 505 510

Asp Asn Asp Leu Glu His Met His Leu Ser Asp Ile Arg Ile Arg Phe

515 520 525

Leu Asn Gly Val Gln Ala Ala Tyr Trp Val Met Leu Glu Glu Gly Arg

530 535 540

Ile Ser Gln Phe Thr Ala Asn Ile Leu Met Gln Ser Val Asp Glu Ala

545 550 555 560

Leu Asp Leu Val Ser His His Pro Leu Cys Asp Trp Asn Gly Leu Lys

565 570 575

Ala Asn Val His Phe Pro Asn Tyr Tyr Lys Phe Leu Gln Thr Ser Thr

580 585 590

Phe Pro Arg Lys Leu Val Thr Tyr Phe Thr Val Glu Arg Leu Glu Ser

595 600 605

Ala Cys Tyr Ile Ser Ala Ala Phe Leu Arg Ala His Arg Ile Ala Arg

610 615 620

Gln Gln Leu His Glu Phe Ile Gly Asp Ser Glu Ile Ala Ser Ala Ile

625 630 635 640

Ile Asn Glu Ser Glu Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Lys Phe Leu Glu

645 650 655

Asp Val Arg Val Thr Phe Pro Glu Val Leu Arg Val Leu Lys Thr Arg

660 665 670

Gln Val Thr Tyr Ser Val Leu Ser His Leu Ile Glu Tyr Val Gln Asp

675 680 685

Leu Glu Lys Ser Gly Leu Leu Glu Glu Lys Glu Leu Val His Leu His

690 695 700

Asp Ala Val Glu Thr Asp Leu Lys Lys Leu Val Arg Asn Pro Pro Leu

705 710 715 720

Val Lys Ile Pro Lys Ala His Glu Leu Ile Ser Ala Asn Pro Leu Leu

725 730 735

Gly Ala Leu Pro Ser Ala Val Cys Glu Gln Ile Val Gly Ser Thr Lys

740 745 750

Glu Thr Met Lys Leu Arg Gly Val Val Leu Tyr Lys Glu Gly Ser Lys

755 760 765

Pro Asn Gly Ile Trp Leu Ile Ser Asn Gly Val Val Lys Trp Ala Ser

770 775 780

Thr Lys Ile Arg Asn Lys Asn Ser Leu His Pro Thr Phe Val His Gly

785 790 795 800

Ser Thr Leu Gly Leu Tyr Glu Val Leu Ser Gly Lys Ser Tyr Leu Cys

805 810 815

Asp Ile Val Ala Asp Ser Val Val Leu Gly Phe Phe Ile Glu Ala Glu

820 825 830

Lys Ile Leu Ser Val Leu Gly Thr Thr Asp His Ala Val Glu Asp Phe

835 840 845

Leu Trp Gln Glu Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Leu Leu Leu Pro Gln

850 855 860

Ile Phe Glu Lys Met Ser Met His Asp Leu Arg Thr Leu Val Ala Glu

865 870 875 880

Arg Ser Thr Met Asn Thr Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Phe Asp Leu Ala

885 890 895

Pro Asn Met Ile Gly Leu Leu Leu Glu Gly Phe Ile Lys Thr His Thr

900 905 910

Thr Ile Ala Ala Pro Ala Ala Leu Phe Pro Ser Tyr Ser Asp Lys Ser

915 920 925

Phe Arg Ser Ser Glu Ile Ala Gly Ala Ser Phe Thr His His Ala Ser

930 935 940

Ser Tyr Thr Val Glu Thr Arg Ala Arg Val Ile Ile Phe Asp Ile Gly

945 950 955 960

Gly Phe Glu Ala Asn Arg Thr Leu Gln Arg Arg Thr Ser Ser Leu Ile

965 970 975

Pro His Gly Gly Asp Leu Pro Pro Arg Ser Pro Thr Arg Glu His Ser

980 985 990

Gly Leu Met Ser Trp Pro Gln His Met Lys Ser Arg Gln Asn Leu Glu

995 1000 1005

His His Pro Glu Glu Ile Asp His His Gly Asn Asn Phe Ser Ala Arg

1010 1015 1020

Ala Met Gln Leu Ser Met Tyr Gly Ser Met Ile Ser Asn Glu Arg His

1025 1030 1035 1040

Ser Pro Arg Thr Ser Pro Asn Gly Ala Val Lys Leu Pro Lys Thr Gln

1045 1050 1055

Ser His Ser Arg Ser Tyr Pro Arg Val Pro Pro Val Glu Asn Arg Arg

1060 1065 1070

Leu Leu Ser Val Arg Ser Glu Gly Ser Thr Thr Val Gly Lys Asn Val

1075 1080 1085

His Val Gly Gly Glu Thr Leu Val Gly Pro His Glu Thr Ala Asp Thr

1090 1095 1100

Arg Glu Met Asp Tyr Ser Ser Asp Glu Ser Gly Gly Glu Asp Glu His

1105 1110 1115 1120

Ile Ile Arg Ile Asp Ser Pro Ser Thr Leu Ser Phe Pro Arg Ala Pro

1125 1130 1135

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatcaytty tgggaratgg t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atyctyccyt catcragcat 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatccaacga ctatgccccg tgaga 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcagaacact gtcacctcca agtat 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggaattagg acctactgat tggc 24

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacttggagc acatgcatct ttctga 26

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtcatcgg tggtggaacc 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttacggagcc cgtgggaaag aga 23

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgctgccttt cttcgtgct 19

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttgcttcct ctccctctgt ct 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cttgcgtatg tggctcttga ct 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tggaacaaaa cctctggaca ac 22

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggactctaga ggatccatgt catcggtggt ggaacc 36

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agggactgac cacccgggtt acggagcccg tgggaaagag a 41

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tatccaccct catacccaat ca 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cagcagatat gtaacacgca ga 22

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtggtcgtac aactggtatt gtgtt 25

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcaaggtcca aacgaagaat g 21

Claims (8)

1.花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.含有权利要求2所述编码基因的生物材料，所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌。

4.权利要求1所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、权利要求2所述的编码基因、或权利要求3所述的生物材料在降低植物体内Na⁺浓度，增加K⁺浓度中的应用。

5.权利要求1所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、权利要求2所述的编码基因、或权利要求3所述的生物材料在制备抗逆性高的植物、或提高植物抗逆性中的应用；所述的抗逆性为抗盐胁迫性或抗高渗透胁迫性。

6.权利要求1所述花花柴质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、权利要求2所述的编码基因、或权利要求3所述的生物材料在植物种质资源改良、育种中的应用。

7.权利要求4-6任一所述的应用，其特征在于，所述的植物包括小麦、水稻、玉米、谷子、高粱、大麦、早熟禾、黑麦草、燕麦、猫尾草、芒草、柳枝稷、拟南芥、烟草、大豆、番茄、油菜、棉花、苜蓿、百脉根、红豆草、白三叶、菊苣。

8.一种转基因植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体转化目标植物，筛选转基因植株。

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