CN112522289B - 陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了所述基因GhDGK7b在培育耐盐耐旱性植物或提高植物耐盐耐旱性中的应用。实验证实过表达GhDGK7b基因可提高拟南芥对盐、干旱胁迫的耐受性，预示GhDGK7b基因在应用于培育耐盐耐旱植物中具有重要作用。

Description

陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b及其应用

技术领域

本发明涉及一种陆地棉基因及其应用，尤其涉及一种陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b及其在提高植物耐盐耐旱性中的应用。属于植物基因工程领域。

背景技术

由于自然界中存在着多种非生物胁迫影响着作物的生产能力，盐碱、干旱是自然界普遍存在的两种非生物胁迫，对作物的生长和产品的生产能力产生不利影响。为了降低盐碱干旱胁迫对粮食生产安全的影响，人类需要发展耐逆作物品种，以适应盐碱、干旱等环境实现在盐碱地高产丰产，以满足人类对农产品的需求。

二酰基甘油激酶(Diacylglycerol kinase，DGK)是一种在植物脂质信号转导中起关键作用的酶，它催化二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)磷酸化成磷脂酸(phosphatidicacid，PA)，而磷脂酸是一个植物代谢网络中的重要化学分子，PA作为植物信号转导过程中的第二信使，在信号转导途径中有重要作用(Wang et al,2014)。内质网，线粒体和质体等是产生PA的主要细胞器，PA主要来自质膜中各种磷脂酶代谢网络，并且是植物中磷脂和糖脂的主要前体(Testerink et al，2011)。PA作为信号转导级联途径的重要信使，在植物中响应盐、脱落酸、渗透压、干旱等多种非生物胁迫(Kue et al，2020)。有证据表明DGKs参与了非生物胁迫反应，DGKs在植物应对干旱胁迫耐受性方面具有一定作用。迄今为止只有少数DGK基因的生理功能和信号作用被阐明且多限于拟南芥的研究。近年来于苹果(Li etal，2015)、玉米(Gu et al,2018)和大豆(Carther et al,2019)等物种中进行了DGK基因家族的全基因组筛选和表达分析，但对于陆地棉中DGK基因家族的相关信息尚不清楚。为了更好地了解植物DGK的功能，在棉花中探讨DGK并研究其功能也很有必要，且经文献检索，有关陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b及其在提高植物耐盐耐旱中的应用尚未见报道。

参考文献：

Wang X,Su Y,Liu Y,et al.Phosphatidic acid as lipid messenger andgrowth regulators in plants[M]//Phospholipases in Plant Signaling.Springer,Berlin,Heidelberg,2014:69-92.

Testerink,C.；Munnik,T.Molecular,cellular,and physiological responsesto phosphatidic acid formation in plants t[J].Journal of Experimental Botany,2011,62,2349-2361.

Kue Foka I C,Ketehouli T,Zhou Y,et al.The Emerging Roles ofDiacylglycerol Kinase(DGK)in Plant Stress Tolerance,Growth,and Development[J].Agronomy,2020,10(9):1375.https://doi.org/10.3390/agronomy10091375.

Li Y,Tan Y,Shao Y,et al.Comprehensive genomic analysis and expressionprofiling of diacylglycerol kinase gene family in Malus prunifolia(Willd.)Borkh[J].Gene,2015,561(2):225-234.

Gu Y,Zhao C,He L,et al.Genome-wide identification and abiotic stressresponses of DGK gene family in maize[J].Journal of Plant Biochemistry andBiotechnology,2018,27(2):156-166.

Carther K F I,Ketehouli T,Ye N,et al.Comprehensive Genomic Analysisand Expression Profiling of Diacylglycerol Kinase(DGK)Gene Family in Soybean(Glycine max)under Abiotic Stresses[J].International Journal of MolecularSciences,2019,20(6):1361.

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种二酰基甘油激酶基因GhDGK7b及其在提高植物耐盐耐旱中的应用。

本发明所述的陆地棉二酰基甘油激酶基因，其特征在于：该基因命名为陆地棉二酰基甘油激酶基因基因GhDGK7b，该基因含有12个外显子和11个内含子，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，为1461bp。

上述陆地棉二酰基甘油激酶基因编码的氨基酸，其特征在于：所述氨基酸的序列如SEQ ID No.2所示，含有氨基酸数486个，理论等电点8.55，分子量为54.57KDa。

本发明还提供了一种含有上述陆地棉二酰基甘油激酶基因的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是pX-bar-GhDGK7b-YFP。所述表达载体为重组原核表达载体或重组植物表达载体。

事实上，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，诸如：pCAMBIA1300-GFP、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pX-YFP、pBI121等载体，本发明优选的是pX-YFP载体。

上述pCAMBIA1302等载体可从BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心等机构(公司)获取。本发明涉及的pX-YFP载体构建及其应用见文献(Tian Y,Fan M,Qin Z,etal.Hydrogen peroxide positively regulates brassinosteroid signaling throughoxidation of the BRASSINAZOLE-RESISTANT1 transcription factor[J].NatureCommunications,2018,9(1):1063.)。

本发明所述陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b在提高植物耐盐耐旱性中的应用。

本发明所述陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b在培育耐盐耐旱性植物中的应用。

本发明所述植物表达载体pX-bar-GhDGK7b-YFP在提高植物耐盐耐旱性中的应用。

本发明所述植物表达载体pX-bar-GhDGK7b-YFP在培育耐盐耐旱性植物中的应用。

上述的应用中：所述植物优选是指拟南芥或棉花。

其中：所述拟南芥优选是Col-0野生型，所述棉花品种优选是陆地棉中9807。

本发明中首先在陆地棉中9807植株中克隆到二酰基甘油激酶基因GhDGK7b；实验发现在200mM NaCl盐胁迫下GhDGK7b表达水平上调，在盐胁迫2h表达水平最高，为处理前的3.66倍。干旱胁迫后GhDGK7b表达水平上调，在干旱胁迫3h表达水平最高，为处理前的2.71倍。ABA处理后GhDGK7b表达水平下调，ABA处理至12h的表达水平为处理前的16.67％。低温胁迫GhDGK7b表达水平在2h时最高，为处理前的1.26倍，其它处理时间点表达水平下调(图1)。

利用T4连接酶将GhDGK7b基因连接到pEntry-T载体上(Thermo FisherScientific，货号12536017)，通过转化的方法该质粒在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆。进行LR反应把GhDGK7b基因连接到表达载体pX-YFP中获得植物表达载体pX-bar-GhDGK7b-YFP，其在大肠杆菌DH5α中表达后提取质粒，将质粒转入农杆菌菌株GV3101中，利用农杆菌介导法将GhDGK7b基因导入拟南芥(Col-0)中，对GhDGK7b基因的抗逆功能进行验证。

结果显示：本发明所述陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b的表达受盐、干旱胁迫诱导。通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过研究发现转基因植株对高盐、干旱胁迫的耐受性提高，预示GhDGK7b基因应用于培育耐盐耐旱植物或在提高植物耐盐耐旱中具有重要作用。基于此，可通过过表达陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b，通过分子检测和植株抗逆性测定选出抗性明显提高的转基因植株。再进一步通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，即可筛选出耐盐耐旱显著提高的转基因材料。

本发明的有益效果是：本发明利用现有的植物基因工程技术首次在棉花9807植株中克隆到二酰基甘油激酶基因GhDGK7b，并通过实验证明过表达GhDGK7b基因的拟南芥对盐、旱胁迫的耐受性提高，预示本发明提供的GhDGK7b基因在应用于培育耐盐耐旱植物在提高植物耐盐耐旱中具有重要作用。

附图说明

图1盐、旱、ABA、低温处理下棉花GhDGK7b基因在叶片中的表达模式。

其中GhDGK7b基因表达水平的计算使用2^-ΔΔCt的方法，Actin(Gh_A01G147400)作为内参。*表示根据t检验与0h数据有显著性差异，*,0.01<P<0.05；**,P<0.01。

图2pEntry-GhDGKs菌落PCR电泳图。

其中M为

PlusⅡDNA Marker；13～16为GhDGK7b菌落PCR电泳图。

图3植物表达载体pX-bar-GhDGK7b-YFP的T-DNA区。

图4转GhDGK7b拟南芥T1代植株的PCR鉴定。

其中M为

Plus DNA Marker；L19～L24为GhDGK7b植株；H：野生型对照；P4为质粒pX-bar-GhDGK7b-YFP。

图5转GhDGK7b基因拟南芥的免疫印迹分析。

其中WT为野生型拟南芥，dgk7(SALK_059060)为dgk突变体，OE1、OE2为过表达GhDGK7b拟南芥株系；GhDGK7b-YFP为融合蛋白；β-actin为内参蛋白。

图6、盐和甘露醇胁迫下拟南芥种子的萌发率。

其中A：不同水平NaCl胁迫下拟南芥种子的萌发表型(播种后7d)；B：不同水平甘露醇下拟南芥种子萌发表型(播种后7d)；C：不同水平NaCl处理下拟南芥种子的萌发率；D：不同水平甘露醇胁迫后拟南芥萌发率。三次生物学重复，“*”表示根据t检验与野生型有显著差异，p<0.05。

图7盐和甘露醇胁迫下拟南芥主根长度。

其中A：不同水平NaCl条件下生长5d的拟南芥的表型；B：不同水平甘露醇条件下生长5d的拟南芥表型；C：不同水平NaCl条件下拟南芥主根的长度；D：不同水平甘露醇胁迫后拟南芥主根长度。三次生物学重复，“*”表示根据t检验与野生型有显著差异，p<0.05。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1:高保真PCR扩增GhDGK7b基因

取陆地棉中9807四叶期幼嫩的叶片和根，参照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)说明书提取植物总RNA，用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒反转录得到cDNA。以特异引物进行高保真PCR扩增。

扩增GhDGK7b特异引物序列如下，GhDGK7b-F：AAGTACTCCCACCTTCACTCC；GhDGK7b-R：CTACAAGCCCTTTTGGGGGA。GhDGK7b基因扩增预期大小为1585bp。

PCR反应总体积为25μL，反应体系为：稀释十倍的cDNA模板1μL；Forward Primer(10μM)0.5μL；Reverse Primer(10μM)0.5μL；10×EasyPfu Buffer 2.5μL；2.5mM dNTPs2.5μL；EasyPfu DNA Polymerase 0.5μL；ddH₂O 17.5μL。PCR扩增条件，预变性94℃5min，35个循环：94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，3min，最后72℃延伸10min。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切割目的片段大小位置处的胶块至1.5mL EP管内。参照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN，DP209)说明操作进行PCR产物回收。按照克隆载体pEASY-Blunt(TRANSGEN，CB101-01)试剂盒说明书进行连接反应，PCR产物连到克隆载体中而后转化DH5α。培养转化后的DH5α，使用质粒提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP103)提取质粒pEASY-Blunt-GhDGK7b后进行PCR检测，片段大小正确的质粒送至公司测序。

鉴定质粒pEASY-Blunt-GhDGK7b的PCR引物是：

上游引物：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；

下游引物：5'-CTACAAGCCCTTTTGGGGGA-3'。

扩增片段大小为1572bp。PCR反应体积：25μL，反应体系为：模板1μL；ForwardPrimer(10μM)0.5μL；Reverse Primer(10μM)0.5μL；10×EasyPfu Buffer 2.5μL；2.5mMdNTPs 2.5μL；EasyPfu DNA Polymerase 0.5μL；ddH2O 17.5μL。PCR扩增程序：预变性94℃5min，35个循环：94℃，30sec；54℃，30sec；72℃，3min，最后72℃延伸10min。

通过上述步骤，获得了陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b的cDNA的核苷酸序列。

具体是：通过高保真酶扩增获得陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，为1461bp。所述陆地棉二酰基甘油激酶基因基因编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，编码486个氨基酸。

实施例2：GhDGK7b基因在盐和旱胁迫下的表达模式分析

陆地棉中9807(Gossypiumhirsutum L.Var.Zhong9807)种子经消毒后种植在温室中，生长条件为：30℃/25℃，相对湿度为60～70％，光照14h，黑暗10h，光子通量密度为800μmol m^-2s^-1。于霍格兰营养液长到四叶期后分为3组，一组棉花幼苗正常在霍格兰营养液中生长，另二组分别转移至含有200mM NaCl或20％PEG 6000霍格兰营养液中，分别在0、1、2、3、6、12h取材，所取棉花材料立即冷冻在液氮中，并储存在-80℃用于RNA的提取。提取总RNA并反转为cDNA，稀释10倍后用于实时荧光定量PCR分析。

陆地棉GhActin基因(GenBank accession number Gh_A01G147400)为内标。荧光定量PCR反应试剂盒为TAKARA的SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒，反应在

96System荧光定量仪中进行，3次生物学重复，实验结果用相对定量2^-ΔΔCt法计算GhDGK7b基因的表达量。

其中涉及引物序列为：

GhDGK7b-qRT-F：TTTGGAGATTGATGGGGGCAT；

GhDGK7b-qRT-R：GCCCTGAGTGCAACTGTAAC；

GhActin-qRT-F：ATCCTCCGTCTTGACCTTG；

GhActin-qRT-R：TGTCCGTCAGGCAACTCAT

所设PCR程序为预变性95℃30s，40个循环：95℃，5sec；60℃，30sec。

结果表明，在200mM NaCl盐胁迫下GhDGK7b表达水平上调，在盐胁迫2h表达水平最高，为处理前的3.66倍。干旱胁迫后GhDGK7b表达水平上调，在干旱胁迫3h表达水平最高，为处理前的2.71倍。ABA处理后GhDGK7b表达水平下调，ABA处理至12h的表达水平为处理前的16.67％。低温胁迫GhDGK7b表达水平在2h时最高，为处理前的1.26倍，其它时间点表达水平下调。因此确定，GhDGK7b基因的表达受盐、旱胁迫的诱导。

实施例3：GhDGK7b基因功能的验证

1、拟南芥表达载体pX-bar-GhDGK7b-YFP的构建

(1)GhDGK7b基因连入入门载体

①GhDGK7b的PCR片段加A

设计GhDGK7b特异性引物，上游引物从目的基因的起始密码子序列开始，下游引物从终止密码子之前的序列开始，引物是LR7b-F：ATGAATTCGCCGACGAC；LR7b-R：TTCTCTATTGATCATTAGAGACTG。

使用测序正确的pEASY-Blunt-GhDGK7b质粒进行PCR扩增及回收PCR扩增片段，PCRPCR反应体积：25μL，反应体系为：模板1μL；Forward Primer(10μM)0.5μL；ReversePrimer(10μM)0.5μL；10×EasyPfu Buffer 2.5μL；2.5mM dNTPs 2.5μL；EasyPfu DNAPolymerase0.5μL；ddH2O 17.5μL。PCR扩增程序：预变性94℃5min，35个循环：94℃，30sec；51℃，30sec；72℃，3min，最后72℃延伸10min。，预期片段大小为1461bp。参照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)使用说明操作回收PCR产物。

由于使用EasyPfu DNA Polymerase扩增产物是平末端，和酶切的入门载体pEntry-T连接必须在PCR回收片段两端加A，使用普通Taq酶进行加A反应。加A过程是：10×Easy Taq buffer 1μL、dNTP 0.8μL、Taq酶0.2μL、回收产物8μL，72℃反应40min。琼脂糖凝胶电泳并回收PCR加A产物。

②入门载体pEntry-T酶切：

pEntry-T质粒(200ng/μL)5μL、10×NE buffer 5μL、ddH₂O 38μL、XcmⅠ酶2μL，于37℃水浴1h，65℃20min失活。琼脂糖凝胶电泳回收酶切大小约2.6kb的片段。

③加A后产物与酶切产物连接获得pEntry-GhDGK7b

加A后回收的产物6μL、酶切后的pEntry-T 1μL、5×T4 buffer 2μL、T4 ligase 1μL，22℃反应1h，产物转入DH5α，挑取单菌落，进行菌落PCR，鉴定所用GhDGK7b引物序列是：上游引物为5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；下游引物为TTCTCTATTGATCATTAGAGACTG，菌落PCR预期大小为1553bp，琼脂糖凝胶电泳鉴定参见图2。

目的片段的位置和实验预期相符合，大小正确。阳性菌液送测序。测序正确菌液提取质粒pEntry-GhDGK7b备用。

(2)pX-bar-GhDGK7b-YFP植物表达载体构建

含GhDGK7b基因片段的入门载体(pEntry-GhDGK7b)1μL(70ng/μL)、载体pX-YFP1μL(70ng/μL)、LR酶(invitrogen，#1993359)0.5μL，25℃反应1h，获得用于拟南芥转化的植物表达载体：pX-bar-GhDGK7b-YFP。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，提取质粒后测序，将测序正确的pX-bar-GhDGK7b-YFP质粒转化农杆菌备用。大小正确的菌株提取质粒转化农杆菌GV3101后用于浸染野生型拟南芥Col-0植株。植物表达载体T-DNA区如图3所示。

2、农杆菌介导的拟南芥遗传转化

1).挑取含pX-bar-GhDGK7b-YFP重组质粒的阳性农杆菌(菌株名称：GV3101)单菌落到3mL含有50mg/L壮观霉素(Spe)和50mg/L利福平(Rif)的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。第二天按2％转接到25mL含有50mg/L Spec和50mg/L Rif的YEP液体培养基中培养至OD＝0.8～1.2，进行第二次活化。

2).室温下5000rpm离心5min后收集农杆菌菌体。离心的同时配制40mL拟南芥侵染液(12μL 0.03％SilwetL-77，2g蔗糖，0.02g MES，0.0948g MS，定容至40mL)。

3).倒掉离心后的上清液，加入等体积的侵染液重悬农杆菌，准备侵染。

4).准备生长4～6周的拟南芥，侵染前一天剪掉已经生长的果荚，将拟南芥花序浸没在上步中的侵染液中，保持30s，期间不停晃动离心管。

5).将侵染后的植株平放入托盘中，表面包裹上一层保鲜膜，避光放置24小时，第二天打开，拟南芥正常生长于培养间。

6).一周后重新侵染一次。

7).2～4周，待种子成熟后将其收获得T1代种子。

3、拟南芥的PCR鉴定

根据35S启动子和目的基因序列设计特异性引物进行PCR鉴定，PCR引物是：

上游引物为35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC；

下游引物为LR7b-R：TTCTCTATTGATCATTAGAGACTG。

PCR反应体系为251μL，具体是Template为1μL；Forward Primer(10μM)为0.5μL；Reverse Primer(10μM)为0.5μL；10×EasyPfu Buffer为2.5μL；2.5mM dNTPs为2.5μL；EasyPfu DNA Polymerase为0.5μL；Nuclease-free Water为17.5μL。

PCR反应程序如下：94℃，2～5min；94℃，30sec；53℃30sec；72℃，3min，35cycles；72℃10min。对收获的转GhDGK7b拟南芥T1代株系进行PCR鉴定，结果如图4所示，PCR扩增片段大小为1557bp，与预期一致。

4、转GhDGK7b基因拟南芥植株的Western blot检测

1).取拟南芥叶片50mg，液氮研磨后，加入150μL 2×SDS Loading，95℃5min，涡旋振荡，重复一次，12000rpm 2min离心，获得蛋白质样品，准备上样。

2).加满新鲜的电泳液于内槽，外槽中加电泳液至电泳槽中间位置，上样。

3).电泳仪设置一般为80V、30min，待蛋白跑至分离胶处改为120V、1～2h。

4).转膜：预估需要转膜的PAGE胶大小，裁剪PVDF膜，4张滤纸，根据实验切胶。

5).将切好的2张滤纸，放在盛有转膜液的方皿中静置5s，拿出放入半干转印仪中间位置，注意不要有气泡。

6).将切好的PVDF膜，放在甲醇中浸泡30s后放入盛有转膜液的方皿中静置5s，拿出放在刚才的两张滤纸上。

7).将切好的PAGE胶，放在盛有转膜液的方皿中静置5s，拿出放在刚才的两张PVDF膜上。

8).将切好的剩余2张滤纸，放在盛有转膜液的方皿中静置5s，拿出放在刚才的PAGE胶上。

9).将圆筒状50mL离心管在滤纸上，轻压滚动驱赶气泡。盖上黑色盖板和乳白色盖板。

10).转膜仪设置：一般小于100KD的蛋白设置为15V，15min。

11).取出PVDF膜直接放入10mL含有5％脱脂奶粉的TBST中，后放在摇床上摇动封闭1h。

12).倒掉封闭液，将一抗(

Anti-GFP Mouse Monoclonal Antibody，TransGen，HT801和

Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody，TransGen，HC201)分别用10mL含有5％脱脂奶粉的TBST稀释5000倍后倒入两个方皿中，室温下孵育1～2h或过夜(4℃)

13).用TBST于室温下在摇床上洗膜两次，每次10min。

14).同上步准备二抗稀释液，将二抗(

Goat Anti-Mouse IgG(H+L),HRP Conjugate，TransGen，HS201-01)分别用10mL含有5％脱脂奶粉的TBST稀释5000倍后倒入两个方皿中，室温下孵育1～2h后，用TBST于室温在摇床上洗膜两次，每次10min。

15).参照BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒，P0018S，碧云天)使用说明进行化学发光曝光成像分析。

免疫印迹结果如图5所示，GhDGK7b-YFP融合蛋白的分子量为91kDa。β-actin内参蛋白的分子量为42kDa。结果显示转GhDGK7b基因可以在拟南芥中正常表达。

5、盐和干旱胁迫下拟南芥种子的萌发实验

T4代GhDGK7b拟南芥过表达株系OE1、OE2、野生型及AtDGK7的T-DNA插入突变体dgk7(salk_059060)种子经过70％酒精灭菌消毒，分别播种在甘露醇浓度为0、150、200、300mmol/L；NaCl浓度为0、100、150mmol/L的1/2MS固体培养基上，4℃条件下春化3d打破种子休眠，随后将幼苗转移到16h光照/8h黑暗，温度为22℃(±1℃)的培养箱中培养。培养7d后对各拟南芥株系进行萌发率的统计。

在150mmol/L NaCl处理下，转GhDGK7b基因拟南芥相较野生型(WT)和dgk7突变体具有更高的萌发率。OE1、OE2的萌发率相较于野生型分别提高了37.60％和28.19％，相较于dgk7突变体系分别提高了337.96％和308.03％。

在150mmol/L甘露醇胁迫下，转GhDGK7b拟南芥相较野生型(WT)和dgk7突变体萌发率没有差异。300mmol/L的甘露醇处理下，OE2的萌发率较野生型和dgk7突变体分别提高了4.23％和50.21％，差异显著。

拟南芥种子萌发实验结果表明，转GhDGK7b拟南芥在NaCl或甘露醇胁迫下具有更高的萌发率。

6、盐和干旱胁迫下拟南芥幼苗根长测定

T4代GhDGK7b拟南芥过表达株系OE1、OE2、野生型及AtDGK7的T-DNA插入突变体dgk7(salk_059060)种子经过70％酒精灭菌消毒，分别播种在1/2MS固体培养基上，4℃条件下春化3d打破种子休眠，随后将幼苗转移到16h光照/8h黑暗，温度为22℃(±1℃)的培养箱中竖直生长3d，选取根长一致的幼苗移栽到含有甘露醇浓度分别为0、200、300、350mmol/L；NaCl浓度分别为0、100、150mmol/L的1/2MS固体培养基上竖直生长5d，对各株系的根长进行测定。

主根长度测定结果表明，200mmol/L甘露醇处理下，过表达GhDGK7b拟南芥相较野生型(WT)和dgk7突变体具有更高的主根长度。OE1、OE2的主根长度相较于野生型分别提高了7.27％和22.43％。OE1、OE2的主根长度相较于dgk7突变体分别提高了41.67％和61.69％。在350mmol/L甘露醇处理下，过表达GhDGK7b拟南芥相较野生型(WT)和dgk7突变体具有更高的主根长度。OE1、OE2的主根长度相较于野生型分别提高了26.48％和28.16％。OE1、OE2的主根长度相较于dgk7突变体分别提高了28.03％和29.73％。

在100mmol/L NaCl处理下，OE1、OE2的主根长度较野生型分别提高了48.20％和70.56％；相较于dgk7突变体分别提高了81.34％和108.70％。150mmol/L NaCl处理下，OE1、OE2的主根长度较野生型分别提高了17.27％和28.30％；相较于dgk7突变体分别提高了19.67％和30.92％。

甘露醇和氯化钠胁迫下拟南芥植株主根长度结果表明，过表达GhDGK7b能够增强拟南芥在干旱和盐胁迫下的耐受性。

序列表

<110>山东大学

<120>陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b及其应用

<141>2020-12-07

<160>2

<210> 1

<211> 1461

<212> cDNA

<213> 棉花

<221> 陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b的核苷酸序列

<222>（1）…（1461）

<400> 1

atgaattcgc cgacgacggc aagggattca tcgtcgccga cacggatcgt ggctcgttct 60

tcgatgacgg actggataag agcttgtggc ttgtcgggat tagccggtat gaagatcgat 120

aaagaagaac tcagacgaag gctttcgatg cctcagtatc tacgccttgc tatgttagat 180

tccatcaaga aaaaagacgt cgacggtggc gatgaacatt tccgttcgcg ttcttccgac 240

tacgatgcta ctgttcctca atctcctatc gttgttttta ttaactctcg cagcggcggt 300

cgccatggtc cggtccttaa agagcgtctc cagcagttaa tcagcgaaga gcaggtgttc 360

gacctcctcg atgtgaaacc tcatgaattt gtaaggtatg gattggcttg ccttgagaag 420

tggggtaaca atggagatat ctgtgcgaaa gagacacgac ggaacattag agttgtagtt 480

gctggaggtg atggtacagt tggttgggtt cttggatgtc tcggagaact tcatcaaaaa 540

ggtcgagatc cggttcctcc agtagctgtg attccacttg gtactggcaa tgacttgtct 600

agaagttatg gttggggagg ttcatttcct tttgcttgga aatcggcaat taaaagaact 660

ttgcaccaag ctactactgg tccaatttgt cgtttagata gttggcatgt tgtactgcaa 720

atgcctggtg gagaagttat tgatcctccc cattctttga aagctactga agattgtcat 780

tttgatcaga ctttggagat tgatgggggc attcctgaca aagtgaactg ctatgaagga 840

gtattctata attactttag cataggaatg gatgcgcaag ttgcttatgg attccatcat 900

ttacgtaatg agaaacctta ccttgcgcaa ggtcctatta caaataagat tatctactcc 960

agttacagtt gcactcaggg ctggtttctc acaccttgtg tgagtgatcc aagtttaagg 1020

ggactcaaga atattttaag gatatatatt aaaaaggcca ggtgctcgga atgggagcaa 1080

attcccgtcc ctagaagtgt gagggcaatt gttgctttaa atcttcataa ttacggaagt 1140

gggcgaaatc catggggtaa gctaaaacca gagtatttgg aaaagagagg ctttgtggag 1200

gcccatgccg atgatggtct cctagaaatt tttggtttaa agcaagggtg gcatgcatca 1260

ttcgtaatgg ttgaactcat atctgcaaaa cacattgcac aggcttcatc gattagactg 1320

gagatacggg gcggagagtg gaaagatgta tttatgcaga tggatgggga accatggaaa 1380

cagcccatga gctcggatca ttcgacattt ctcgaaatta agagggtgcc ttatcagtct 1440

ctaatgatca atagagaatg a 1461

<210> 2

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b编码的氨基酸序列

<222>（1）…（486）

<400> 2

MNSPTTARDS SSPTRIVARS SMTDWIRACG LSGLAGMKID KEELRRRLSM PQYLRLAMLD 60

SIKKKDVDGG DEHFRSRSSD YDATVPQSPI VVFINSRSGG RHGPVLKERL QQLISEEQVF 120

DLLDVKPHEF VRYGLACLEK WGNNGDICAK ETRRNIRVVV AGGDGTVGWV LGCLGELHQK 180

GRDPVPPVAV IPLGTGNDLS RSYGWGGSFP FAWKSAIKRT LHQATTGPIC RLDSWHVVLQ 240

MPGGEVIDPP HSLKATEDCH FDQTLEIDGG IPDKVNCYEG VFYNYFSIGM DAQVAYGFHH 300

LRNEKPYLAQ GPITNKIIYS SYSCTQGWFL TPCVSDPSLR GLKNILRIYI KKARCSEWEQ 360

IPVPRSVRAI VALNLHNYGS GRNPWGKLKP EYLEKRGFVE AHADDGLLEI FGLKQGWHAS 420

FVMVELISAK HIAQASSIRL EIRGGEWKDV FMQMDGEPWK QPMSSDHSTF LEIKRVPYQS 480

LMINRE 486

Claims (2)

1.过表达陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b在培育耐盐耐旱性拟南芥中的应用；其中所述陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b含有12个外显子和11个内含子，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码所述陆地棉二酰基甘油激酶基因GhDGK7b的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述拟南芥是Col-0野生型。

Images