CN113583100A

CN113583100A - 一种苹果离子转运体MdCCX2及其转基因植株和应用

Info

Publication number: CN113583100A
Application number: CN202111056012.2A
Authority: CN
Inventors: 马锋旺; 杨洁; 毛柯; 陈沛宏; 李超; 刘长海; 龚小庆
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-09-09
Filing date: 2021-09-09
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-09-09
Also published as: CN113583100B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种苹果离子转运体MdCCX2，所述MdCCX2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用MdCCX2进行转基因获得高耐盐性的转基因植株，MdCCX2的过表达能降低盐胁迫下转基因植株的钠含量，提高转基因植株的抗氧化酶活性，从而提高植物耐盐性。

Description

一种苹果离子转运体MdCCX2及其转基因植株和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种苹果离子转运体MdCCX2及其转基因植株和应用。

背景技术

全世界超过20％的耕地受盐渍化影响，且这种趋势正随着全球气候变暖和灌溉用水的过度使用而加剧。土壤盐渍化问题对于在经济上很大程度上依赖农业的国家来说尤其令人关注。土壤高盐是造成全世界各种农作物大量减产的主要环境因素之一，主要是由于高盐导致的渗透胁迫和离子过量积累对植物造成的毒害作用。这会进一步导致植物的种子萌发和幼苗活力降低，阻碍植物生长，并影响光合作用和干物质分配等。因此探索适宜的抗逆育种技术并培育耐盐植物一直是植物科学家的重要任务。植物对盐胁迫的响应包括一系列分子、生化和生理水平的变化，植物对盐胁迫的调控也是多种多样的，并受多种因素的影响。近几十年来，许多学者对植物的耐盐机制进行了研究，并从离子稳态、渗透因子生物合成、自由基清除、水转运和长距离响应协调等调控机制中得到了一定程度的解释。

大多数植物都进化出了应对极端环境的响应调控机制。但是，引起这些反应的信号转导途径，甚至是植物感知这些环境胁迫的方式，还不是很清楚。盐胁迫影响植物生长发育的相关研究涵盖了植物形态、生理和分子水平上的响应变化。土壤中的钠离子过量是导致盐胁的主要因素。钠离子在进入植物后，会通过蒸腾流在多个组织中积累，并进一步造成离子失衡和ROS积累导致细胞损伤甚至死亡。为了提高作物对盐胁迫的适应能力，人们采用了多种方法如培育转基因植物、改良育种方法、改良现有作物基因等。不同盐生植物的耐盐机制可能不同，但一般的耐盐机制包括对内部Na⁺、K⁺和Cl^-含量的精细调控。基本原理是通过控制基因的表达，参与调节植物钠的流入、流出、贮存、循环利用和高钠引发的抗氧化胁迫及细胞死亡。Ren et al.报道了Na⁺选择性转运体SKC1在抗性品种(Nona Bokro)的耐盐性调控中发挥功能，并提出了它从茎到根中回收Na⁺的重要作用。从细胞水平来说，SOS途径为植物耐盐性调控途径提供了精细的模板。首先，外界高浓度的钠离子会触发细胞膜上的钙离子通道，钙离子进入细胞质基质会激活SOS3,激活的SOS3能与细胞质游离的SOS2互作并将SOS2锚定到细胞膜上。随后SOS2发挥激酶的作用，将细胞膜上的Na⁺/H⁺转运体SOS1磷酸化并激活，将胞质中过量的Na⁺排出细胞，从而减少Na⁺积累。另外，位于液泡的Na⁺/H⁺转运体能将胞质的钠离子转运进入液泡从而隔离钠离子。这两个过程直接降低了胞质中的钠离子浓度。从整株植物体来讲，耐盐可以从以下几个方面解释：1，植物根尖从外界吸收更少的Na⁺，这样可以从源头上降低植株的Na⁺含量；2，根部的一些基因如SOS1会控制钠离子向木质部卸载的效率，从而降低植物地上部各组织的Na⁺浓度；3，HKT1控制着Na⁺的在韧皮部的装载和在木质部的卸载，通过控制该过程可降低向植物地上部转运的Na⁺；4，一些基因如HAK5，KAT1，AKT1等通过影响K⁺含量，降低Na⁺/K⁺比从而提高耐盐性。在提高植物耐盐性方面具有潜在作用的基因通常抑制氧化应激，从而提高植物的盐胁迫耐受性。过表达囊泡转运蛋白Rab7和一些抗氧化调节因子如脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、抗坏血酸氧化酶(AAO)等均能够提高植株耐盐性。

细胞内的离子转运对离子浓度的调控至关重要。离子平衡的调控依赖于离子偶联的转运体，例如Na⁺/Ca²⁺转运体(NCX)，Na⁺/Ca²⁺,K⁺转运体(NCKX)，阳离子/Ca²⁺转运体(CCX)，H⁺/阳离子转运体(CAX)。以上转运体均属于CaCA超家族。其中，CCX蛋白参与多种离子的跨膜转运，例如Na⁺,K⁺,Ca²⁺,Cu²⁺,Mn²⁺,Cd²⁺等。水稻的CCX2定位于细胞膜，其能外排Cd²⁺从而降低Cd²⁺积累造成的毒性。CCX3和CCX4表现出H⁺/K⁺交换能力。CCX5表现出对K⁺的高亲和吸收和对Na⁺的转运能力，Yadav et al.发现OsCCX2基因显著响应干旱、盐和ABA，表明OsCCX2在多种逆境胁迫的响应过程中起重要作用。

苹果是世界上的主栽果树之一。作为一种重要的经济果树，它的生产受到各种环境胁迫的影响，包括干旱、低温、盐碱等。虽然CCX蛋白在调节植物耐盐性方面发挥着重要作用，但苹果中尚未见关于CCX家族蛋白调节耐盐性的详细功能研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种苹果离子转运体MdCCX2及其转基因植株和应用，所述的转运体MdCCX2过表达能降低盐胁迫下转基因植物的钠含量，提高转基因植物的抗氧化酶活性，从而提高转基因植物的耐盐性。

本发明提供了一种苹果离子转运体MdCCX2，所述MdCCX2的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种包含所述的苹果离子转运体MdCCX2的重组过表达载体pBI121-MdCCX2。

进一步地，所述载体pBI121-MdCCX2用于拟南芥遗传转化。

本发明还提供了一种由上述重组过表达载体pBI121-MdCCX2构建的转基因植株。

进一步地，所述转基因植株通过转化拟南芥植株获得。

本发明还提供了一种包含所述的苹果离子转运体MdCCX2的过表达载体pCambia2300-MdCCX2-GFP。

进一步地，所述载体pCambia2300-MdCCX2-GFP用于转化苹果愈伤或苹果根系。

本发明还提供了一种由上述过表达载体pCambia2300-MdCCX2-GFP构建的转基因植株。

进一步地，所述转基因植株通过转化苹果愈伤组织或苹果根系获得。

本发明还提供了一种包含所述的苹果离子转运体MdCCX2的RNAi干扰表达载体pK7GWIWG2D-MdCCX2。

进一步地，所述载体pK7GWIWG2D-MdCCX2用于转化苹果根系。

本发明还提供了一种由上述RNAi干扰表达载体pK7GWIWG2D-MdCCX2构建的转基因植株。

进一步地，所述转基因植株由苹果植株根系转化获得。

本发明还提供了所述的苹果离子转运体MdCCX2在转基因中的应用。

进一步地，所述MdCCX2能够用于提高转基因酵母耐盐性并降低钠含量。

进一步地，所述MdCCX2能够用于提高转基因植物耐盐性并降低钠含量。

与现有技术相比，本发明提供的一种苹果离子转运体MdCCX2，具有以下有益效果：

1、本发明从苹果中克隆了一个CCX家族基因MdCCX2，并利用转基因及盐胁迫处理下的表型比较和生理参数测定，详细鉴定了其正调控植物耐盐性的生物学功能，获得的研究成果对于开展苹果耐盐分子定向育种具有重要的理论意义和实际应用价值。

2、本发明克隆的MdCCX2编码的蛋白定位于细胞膜，其过表达能降低盐胁迫下转基因植物的钠含量，提高转基因植物的抗氧化酶活性，从而提高转基因植物的耐盐性，在提高植株耐盐的基因工程育种方面有重要的参考价值。

3、本发明利用农杆菌介导的浸染方式获得的转基因苹果愈伤和苹果植株的耐盐性显著增强，在苹果耐盐分子定向育种方面有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中苹果阳离子/Ca²⁺转运体MdCCX2的保守结构域及聚类分析；

其中，图A和图B表示MdCCX2与拟南芥AtCCX2的蛋白序列进行保守结构的比对；

图C表示MdCCX2与拟南芥的CaCA超家族的系统发育分析图；

图2为本发明实施例1中苹果MdCCX2基因在不同组织和盐胁迫处理下的表达量分析及其编码蛋白的亚细胞定位鉴定；

其中，图A表示MdCCX2基因分别在苹果根、茎、叶、花、果实中的表达量差异；

图B表示盐胁迫下根系中的MdCCX2基因在不同处理时间下的表达量差异；

图C表示MdCCX2编码蛋白定位于烟草下表皮细胞的细胞膜；

图D表示MdCCX2编码蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞质膜；

图3为本发明克隆的苹果MdCCX2在钠离子敏感酵母突变体中的功能鉴定；

其中，图A表示不同浓度的CaCl₂对表达MdCCX2的K667阳性菌株生长影响的直观图；

图B表示不同浓度的CaCl₂对表达MdCCX2的K667阳性菌株生长速率影响的折线统计图；

图C表示不同浓度的NaCl对表达MdCCX2的钠敏感突变体阳性菌株生长影响的直观图；

图D表示不同浓度的NaCl对表达MdCCX2的钠敏感突变体阳性菌株生长速率影响的折线统计图；

图E表示不同浓度的NaCl处理下对酵母钠离子含量的影响；

图4为本发明MdCCX2转基因拟南芥的鉴定和MdCCX2过表达对拟南芥耐盐能力及抗氧化酶活性的影响；

图A表示MdCCX2转基因拟南芥抗性苗DNA的PCR鉴定结果；

图B表示MdCCX2转基因拟南芥中MdCCX2的表达量鉴定结果；

图C表示MdCCX2转基因拟南芥和野生型拟南芥受盐胁迫伤害的表现；

图D表示盐胁迫对各拟南芥株系的相对电导率(REL)的影响；

图E表示盐胁迫对各拟南芥株系的MDA含量的影响；

图F表示盐胁迫对各拟南芥株系的脯氨酸含量的影响；

图G表示盐胁迫对各拟南芥株系积累的钠离子含量的影响；

图H表示盐胁迫对各拟南芥株系的抗氧化酶(CAT，POD，SOD)活性的影响；

图I表示盐胁迫对各拟南芥株系的抗氧化酶编码基因的表达量的影响；

图5为本发明MdCCX2转基因苹果愈伤的鉴定及MdCCX2过表达对苹果愈伤耐盐能力及抗氧化酶活性的影响；

图A表示MdCCX2转基因苹果愈伤DNA的PCR鉴定结果图；

图B表示MdCCX2转基因苹果愈伤中的MdCCX2表达量统计图；

图C表示不同浓度氯化钠对于苹果愈伤组织生长量影响的直观图；

图D表示不同浓度氯化钠对于苹果愈伤组织鲜重的影响；

图E表示不同浓度氯化钠对不同愈伤组织中的钠离子含量的影响；

图F表示不同浓度氯化钠对不同愈伤组织中的抗氧化酶(CAT，POD，SOD)活性的影响；

图6为本发明MdCCX2转基因苹果根系的鉴定及MdCCX2在根中的表达量对苹果植株耐盐能力的影响；

图A表示MdCCX2转基因苹果根系的绿色荧光鉴定；

图B表示MdCCX2转基因苹果根系的MdCCX2表达量测定；

图C表示盐胁迫对MdCCX2的不同转基因株系表型的影响；

图D表示盐胁迫对MdCCX2转基因株系的叶片相对电导率(REL)的影响；

图E表示盐胁迫对MdCCX2转基因株系的叶片MDA含量的影响；

图F表示盐胁迫对MdCCX2转基因株系的叶片叶绿素荧光的影响直观图；

图G表示盐胁迫对MdCCX2转基因苹果植株叶片的的叶绿素荧光Fv/Fm的影响；

图H表示盐胁迫对MdCCX2转基因苹果植株叶片的净光合速率Pn的影响；

图7为本发明MdCCX2在根中的表达量对盐胁迫下苹果植株根系活力和钠含量的影响；

图A表示盐胁迫对MdCCX2转基因根系的根系活力的影响；

图B表示盐胁迫对MdCCX2转基因根系的钠含量的影响；

图C表示盐胁迫对MdCCX2转基因植株的叶片钠含量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1

一、苹果阳离子/Ca²⁺转运体基因MdCCX2的克隆与基本信息介绍

在蔷薇科基因组数据库(https://www.rosaceae.org/)下载苹果基因组(版本GDDH13 v1.1)序列，并以拟南芥AtCCX2(At5g17850)蛋白序列为依据对苹果基因组进行blastp比对，筛选获得与其同源性最高的序列MD12G1011800，并命名为MdCCX2。通过与拟南芥AtCCX2的蛋白序列进行保守结构的比对(图1，图A，图B)，发现两者具有相同的离子转运保守结构域(Na_Ca_ex)。与拟南芥CaCA超级族成员蛋白序列进行聚类分析，发现MdCCX2与拟南芥的AtCCX2聚类在同一分支(图1，图C)，说明MdCCX2为AtCCX2在苹果中的同源蛋白。根据MdCCX2基因预测序列设计基因扩增引物(MdCCX2-PMD-F和MdCCX2-PMD-R)，所述MdCCX2-PMD-F基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述MdCCX2-PMD-R如SEQ ID NO.4所示，以‘金冠’(本研究团队的资源圃)为模板克隆得到了MdCCX2的编码序列。该基因的完整开放阅读框长度1716bp，编码571个氨基酸，预测蛋白分子量为64.43kDa，等电点为8.43，所述MdCCX2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.3：ATGGGCACCTTAGTTTTCTT

SEQ ID NO.4：TTAAAATTTTACAGACCCAA；

二、苹果MdCCX2在不同组织及高盐处理下的表达模式分析及其编码蛋白的亚细胞定位鉴定

采取‘嘎啦-3’(‘GL-3’，本研究团队的资源圃)的根、茎、叶、花和果实样品，提取RNA并反转录，用于组织特异性表达分析。挑取生长一致的野生型‘嘎啦-3’生根苗，对其进行200mM NaCl处理，并于不同时间点取样。提取样品RNA，设计特异性qRT-PCR定量引物，检测在NaCl处理下MdCCX2的表达模式。MdCCX2定量引物序列为MdCCX2-qF(核苷酸序列如SEQID NO.5)和MdCCX2-qR(核苷酸序列如SEQ ID NO.6)：

SEQ ID NO.5：GAGGAAGGAGCTGCACAAGGC；

SEQ ID NO.6：GTCACTGAAGCAACTGCATATGGC。

定量结果显示，MdCCX2在苹果不同组织中均有表达，在叶片中表达量最高，在果实中表达量最低，在根和茎中的表达没有显著差异(图2，图A)。盐处理下，根系中MdCCX2的表达量上升显著，在处理1h后其表达量已显著高于对照。最大上调倍数出现在处理6h时，约为0h的5.4倍(图2，图B)，表明MdCCX2表达显著响应盐胁迫。

亚细胞定位对离子转运体的生物学功能至关重要，因此我们将MdCCX2的编码序列插入到带有GFP荧光蛋白标签的pCambia2300载体中。随后通过农杆菌介导的方法在烟草叶片和拟南芥原生质体中进行MdCCX2-GFP融合蛋白的瞬时表达。荧光显微镜观察结果显示，MdCCX2蛋白定位于烟草叶片和拟南芥原生质体细胞的细胞质膜上(图2，图C，图D)。

三、苹果MdCCX2在酵母突变体中的功能鉴定

酵母表达载体采用pDR196，载体构建选择EcoR1、Sal1酶切位点，通过双酶切及连接方法进行。载体基因表达由PMA启动子驱动，在酵母中的营养筛选缺陷为-Ura。融合载体pDR196-MdCCX2和pDR196空载体通过LiAc/ss carrier DNA/PEG方法转化进入钙敏感突变体K667和钠离子敏感突变体(双突-ena,-nha)，以W303-1B作为阳性对照酵母菌株。

结果表明，在含有不同浓度CaCl₂的培养基中进行培养时，过表达MdCCX2的阳性菌株的生长速率与空载体对照没有差异(图3，图A,图B)，表明MdCCX2蛋白并不具有钙转运能力。在钠离子敏感酵母突变体中，我们发现MdCCX2过表达能显著降低双突变体(-ena,-nha)对钠离子的敏感性(图3，图C)，并且能显著提高转基因菌株在200mM NaCl处理下的生长速度(图3,图D)。另外，MdCCX2过表达还显著降低了NaCl处理下酵母中钠离子的含量(图3，图E)。以上结果说明MdCCX2能通过抑制钠离子积累从而提高酵母的耐盐能力。

四、苹果MdCCX2植物表达载体构建和转基因植株的获得

1、载体构建

用于拟南芥遗传转化的过表达载体为pBI121，用于转化苹果愈伤和苹果根系的过表达载体是pCambia2300-GFP(购于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)，用于转化苹果根系的RNAi干扰表达载体是pK7GWIWG2D(从ThermoFisher公司购买)。pBI121和pCambia2300-GFP载体构建分别选择BamH I、Sac I和BamH1、Sal1酶切位点，基因表达由CaMV 35S启动子驱动，在植物中的抗性标记为卡那霉素。以上载体构建的方法使用无缝克隆技术，具体步骤参照诺唯赞一步法克隆试剂盒说明书(ClonExpress II One StepCloning Kit,C112,Vazyme Biotech Co.,Ltd)。对于RNAi干扰表达载体的构建，利用PCR克隆基因开放阅读框的前300bp并插入到pK7GWIWG2D载体中，构建过程使用BP和LR酶进行两步法连接，具体方法参照gateway系统载体(Gateway BP/LR Clonase II Enzyme mix,ThermoFisher)的构建说明书。最终构建获得了过表达载体pBI121-MdCCX2和pCambia2300-MdCCX2-GFP，RNAi干扰表达载体pK7GWIWG2D-MdCCX2。

2、遗传转化

(1)拟南芥的遗传转化：将构建好的MdCCX2过表达载体(pBI121-MdCCX2)通过热击法转化农杆菌GV3101，随后利用农杆菌介导的蘸花法侵染拟南芥获得转基因植株，具体方法参考文献(Clough and Bent 1998)。

(2)苹果愈伤组织的遗传转化：将pCambia2300-MdCCX2-GFP融合表达载体转化农杆菌EHA105，随后利用农杆菌侵染方法进行苹果愈伤的遗传转化。

具体转化方法如下：液体培养基中培养的苹果愈伤组织每隔15天继代一次以保证愈伤细胞的活性；将液体愈伤在无菌的纱布上过滤，并将过滤后的愈伤细胞与农杆菌悬浮液(OD₆₀₀＝0.6)混合，轻轻摇晃10分钟；将此混合物再经无菌的纱布过滤，并在无菌滤纸上吸除过量的农杆菌，然后将愈伤组织平铺于预培养基上避光生长2天；2天后，用含有250mg/L头孢的无菌水清洗愈伤组织3次，过滤吸去多于水分后平铺于筛选培养基上，暗培养至抗性愈伤细胞团出现；将抗性细胞团在筛选培养基中连续继代筛选3次，随后进行PCR鉴定和MdCCX2表达量鉴定。以上实验过程均在超净台中进行。农杆菌重悬液使用无菌水，侵染过程中使用的培养基配方如下：

预培养基：4.43g/L MS+30g/L蔗糖+1.5mg/L 2,4-D+0.4mg/L 6-BA+7.5g/L agar,pH5.8。

筛选培养基：4.43g/L MS+30g/L蔗糖+1.5mg/L 2,4-D+0.4mg/L 6-BA+30mg/L卡那霉素+7.5g/L Agar,pH5.8。

(3)苹果植株根系的遗传转化：将构建好的过表达载体pCambia2300-MdCCX2和RNAi干扰表达载体pK7GWIWG2D-MdCCX2以及相应的空载体分别转化发根农杆菌K599。发根农杆菌介导的根系转基因方法参考(Xiang et al.2005；Hernandez-Piedra et al.2020)，有部分改动，具体如下：挑取阳性克隆在添加50mg/L硫酸链霉素和50mg/L的卡那霉素或30mg/L的壮观霉素素的YEP培养基中进行培养直到OD₆₀₀＝0.6，菌液离心并用无菌水重悬待用。取培养一个月左右的‘GL-3’组培苗，在距顶端约1.5厘米处的茎段上用刀片切断，切口为平整的斜口。取上部茎段浸泡于农杆菌重悬液中，并在真空泵中用0.08Mpa抽真空15分钟。将茎段捞出并放于无菌滤纸上吸去多余的菌液，随后插入到带有培养基的组培瓶中培养生根。大约1-1.5个月之后，对长出来的根系进行活体GFP荧光观察，筛选阳性转基因株系。培养基配方如下：4.43g/LMS+15g/L蔗糖+250mg/L头孢+7.5g/L Agar,pH5.8。

五、苹果MdCCX2过表达对拟南芥耐盐性和盐胁迫下抗氧化酶活性影响的功能鉴定

1、MdCCX2过表达拟南芥的筛选鉴定

将获得的拟南芥T₀代种子播种于带有卡那霉素(50mg/L)的MS培养基中进行抗性苗筛选。筛选出的抗性苗移栽，提取DNA进行PCR鉴定(图4，图A)，并提取RNA进行MdCCX2基因表达量鉴定(图4，图B)。选择表达量较高的三个株系单株收种纯合，并取T₃代纯合种子进行后续盐胁迫处理实验。

2、MdCCX2过表达提高转基因拟南芥耐盐性并降低盐胁迫下植株的钠含量

将T₃代转基因种子和野生型种子4℃低温春化3天，随后播种于含有机基质/蛭石/珍珠岩混合物(1：1：1，v：v：v)的营养钵中，培养温度设置为白天23度/晚上22度，光周期为8h光照/16h黑暗。挑选生长状态一致的幼苗移栽入新的营养钵，用含200mM NaCl的水溶液进行处理，每隔5天浇灌一次，持续处理15天。对照植株用蒸馏水浇灌。处理后野生型拟南芥受到显著的盐胁迫伤害，表现为叶片干枯发黄，而过表达株系仅少数叶片表现出失绿或干枯表型(图4，图C)。取样测定拟南芥叶片的相对电导率(REL)，MDA含量，脯氨酸含量，结果表明盐胁迫下过表达株系的REL及MDA含量更低，脯氨酸含量较高，说明受到的盐胁迫伤害更小(图4，图D-F)。另外，钠离子含量测定结果表明过表达株系在盐胁迫下积累的钠离子含量更低(图4，图G)。

3、MdCCX2过表达提高转基因拟南芥在盐胁迫下的抗氧化酶活性

盐胁迫会导致植物体内积累过氧化物(ROS)，而抗氧化酶能够降低ROS积累，进而减少ROS过量积累导致的氧化损伤。我们测定了各拟南芥株系的抗氧化酶(CAT，POD，SOD)活性(图4，图H)，结果表明盐胁迫下转基因拟南芥植株的抗氧化酶活性显著高于野生型，且抗氧化酶编码基因的表达量也显著高于对照植株(图4，图I)。

六、MdCCX2过表达对苹果愈伤耐盐性影响的功能鉴定

我们将在不同的培养皿中或同一培养皿不同的位置分化出来的抗性愈伤团定为不同的株系。在对不同株系分别继代培养的基础上，提取各株系愈伤组织DNA和RNA，并进行MdCCX2转基因(图5，图A)及表达量(图5，图B)鉴定，随后选取三个表达量较高的株系进行MS培养基中的盐胁迫处理。挑选生长一致的苹果愈伤组织，取0.1g平铺在含有不同浓度氯化钠的MS培养基上(图5，图C)，每个株系铺4块，此为1个重复，共设置9个生物学重复。黑暗处理15天之后，称取各处理下愈伤的鲜重。结果表明，转基因愈伤在含NaCl的MS培养基中生长的更快，鲜重显著高于对照(图5，图C,图D)。另外，钠离子含量测定结果表明，转基因愈伤在NaCl处理下积累的钠离子浓度更低(图5，图E)。我们还测定了愈伤组织的抗氧化酶(CAT,POD和SOD)活性，结果表明盐胁迫处理下转基因愈伤的酶活显著高于对照(图5，图F)。这些结果说明，MdCCX2过表达能够通过抑制钠离子积累和提高抗氧化酶活性来增强苹果愈伤对盐胁迫的耐受性。

七、根系中过表达MdCCX2对苹果植株耐盐性影响的功能鉴定

1、转化MdCCX2过表达及RNAi干扰表达载体的苹果转基因根系的鉴定

将发根农杆菌侵染后发出新根的‘GL-3’苹果植株的根系置于激光共聚焦显微镜下，并选择GFP通道进行转基因材料的绿色荧光鉴定(图6，图A)。另外，对各转基因株系的根取样提取RNA通过定量PCR测定MdCCX2表达量(图6，图B)。通过以上两种方式，保证每一种转基因载体获得至少20棵植株(每一棵都是一个株系)以用于后续盐处理。

2、根系中过表达MdCCX2增强了转基因苹果植株的耐盐性

苹果植株的盐胁迫处理方式与拟南芥的处理相似，对移栽于营养钵中的苹果苗进行200mM NaCl浇灌，每隔5天浇一次，处理周期共10天。表型比较发现，处理后MdCCX2过表达株系受到的盐胁迫损伤明显较轻，叶片仍保持鲜绿色，而干扰株系的叶片上则出现较多的黄色斑点，并且多数叶片有干枯萎蔫情况(图6，图C)。随后，对叶片的相对电导率，MDA含量进行测定，发现过表达株系的数值显著低于对照，干扰株系则相反(图6，图D,图E)。胁迫损伤会显著影响植物光合作用，通过对苹果植株的叶绿素荧光Fv/Fm(图6，图F，图G)和叶片的净光合速率Pn(图6，图H)进行测定，发现过表达株系的Fv/Fm和Pn均显著高于对照和干扰株系，说明光合作用单位受损较小。以上结果说明MdCCX2过表达能够增强苹果植株的耐盐性，干扰MdCCX2表达则会降低苹果植株耐盐性。

3、根系中过表达MdCCX2提高了盐胁迫下苹果植株的根系活力并降低了植株的Na⁺积累水平

我们测定了盐胁迫下各转基因株系的根系活力，结果表明MdCCX2过表达根系的根系活力显著高于对照，干扰表达的根系则呈现相反趋势(图7，图A)。

我们还测定了不同条件下各转基因株系的根系和叶片中的Na⁺积累水平。结果显示，盐胁迫下MdCCX2过表达根系中的钠含量显著低于对照，并且其叶片中的钠含量也显著低于对照，而RNAi植株中的结果则相反(图7，图B，图C)。这说明，MdCCX2过表达通过降低转基因植株中的钠含量，从而减轻盐胁迫下由钠离子过量积累导致的胁迫损伤。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种苹果离子转运体MdCCX2及其转基因植株和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1716

<212> DNA

<213> 苹果

<400> 1

atgggcacct tagttttctt accaaagtac aaaaattaca taattttctt gaacatctcg 60

tttctgctag tgggatgtgc tttcttgatt gtacattttg aagcttcaga ttttccggtt 120

ctaagcactt ctgggatttc cagattttct ggttcactag attgcaaggg ttttcttagt 180

ttagatgact acaaagcaaa gtgctttcac cttaaatcca aaaacccatg tgtctcccaa 240

ggctatataa actatcttaa cattttctac tgcaagtttg gaacttttcc tcaattgggt 300

tattgctgta tgtttctttg gcttctggtt ttgttctatt tgatgggaaa cacagcttct 360

gagtactttt gttcttcact tgatagttta tctaggctgt taaaattgtc ccctacaatt 420

gctggggtaa ctctgctttc tcttggcaat ggagccaatg atgttttttc cagtcttgtt 480

tcgtttatgg gtggcgggac gggcgaaatc ggtcttaata caattttggg tggtgcttct 540

tttgtgtcgt gtgttgtggt tggaatctta agcatttcga tgcgcaaaag gcgcattcga 600

gttaacaaat cggactttgt gagagatatt tgcttctacc tattggtcat tgtatgtttg 660

ggtgttatct tgattcgcaa ggaaatagat gtgtgggctg caatggcttt ctcttcactc 720

tatattgtct atgtgattgt ggtttacgtc tcacacactc gtcggaagaa atgctttgaa 780

ttgagctgta attcgagcaa tgagagtgac ttgactgtgc caattcttag cagcattgaa 840

gaggaagatc tcagtgctgc agaggaagga gctgcacaag gcagttctga agtagtacaa 900

gtcaagaaat gctgctctaa tcttatatca tcagcttttt ttcgcacgct aattttcata 960

cttgagctgc cgctttatct gcccaggaga ttgactattc ctgtagtttg tgaagaaaga 1020

tggtgtaagc catatgcagt tgcttcagtg acactagcac cagtgctttt gtcaacactt 1080

tggaaccatc aatttggaaa tgttagcttc aagacgaagc ttgcaatcta tattattgga 1140

ttggtttttg gaatcacttt tgggattgtt gcttttttta caactgagaa gtcaagccca 1200

cccaaaaagt gcttagttcc ttggcttact gcagggtttg taatgagtat tacttggagt 1260

tatcttacag ctcaagaatt ggtagggttg ttagtttcat tagggtacat attaggtgtg 1320

agtccttcaa ttttagggct aacagtcctt gcttggggca actcacttgg agatttgata 1380

accaatttga caatggcttt gaatggtgga acaaagggag ctcagattgc attttcagca 1440

tgttatgctg gccctatctt caacactctg tttggattag ggttatcgct tgttggctca 1500

gcttggtcta aatttccatc acccgtcttg ttccagagcg atccatacct cttggagacg 1560

gtgtgtttct tggcagtcgg cttgctttgg gcactcgtgg ttttaccgag aagaagtatg 1620

atgcttgatg gggtgttggg agctgggctt ttggttgtgt acatcagttc catgtctttg 1680

aggttgattc gaacacttgg gtctgtaaaa ttttaa 1716

<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<213> 苹果

<400> 2

Met Gly Thr Leu Val Phe Leu Pro Lys Tyr Lys Asn Tyr Ile Ile Phe

1 5 10 15

Leu Asn Ile Ser Phe Leu Leu Val Gly Cys Ala Phe Leu Ile Val His

20 25 30

Phe Glu Ala Ser Asp Phe Pro Val Leu Ser Thr Ser Gly Ile Ser Arg

35 40 45

Phe Ser Gly Ser Leu Asp Cys Lys Gly Phe Leu Ser Leu Asp Asp Tyr

50 55 60

Lys Ala Lys Cys Phe His Leu Lys Ser Lys Asn Pro Cys Val Ser Gln

65 70 75 80

Gly Tyr Ile Asn Tyr Leu Asn Ile Phe Tyr Cys Lys Phe Gly Thr Phe

85 90 95

Pro Gln Leu Gly Tyr Cys Cys Met Phe Leu Trp Leu Leu Val Leu Phe

100 105 110

Tyr Leu Met Gly Asn Thr Ala Ser Glu Tyr Phe Cys Ser Ser Leu Asp

115 120 125

Ser Leu Ser Arg Leu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Ile Ala Gly Val Thr

130 135 140

Leu Leu Ser Leu Gly Asn Gly Ala Asn Asp Val Phe Ser Ser Leu Val

145 150 155 160

Ser Phe Met Gly Gly Gly Thr Gly Glu Ile Gly Leu Asn Thr Ile Leu

165 170 175

Gly Gly Ala Ser Phe Val Ser Cys Val Val Val Gly Ile Leu Ser Ile

180 185 190

Ser Met Arg Lys Arg Arg Ile Arg Val Asn Lys Ser Asp Phe Val Arg

195 200 205

Asp Ile Cys Phe Tyr Leu Leu Val Ile Val Cys Leu Gly Val Ile Leu

210 215 220

Ile Arg Lys Glu Ile Asp Val Trp Ala Ala Met Ala Phe Ser Ser Leu

225 230 235 240

Tyr Ile Val Tyr Val Ile Val Val Tyr Val Ser His Thr Arg Arg Lys

245 250 255

Lys Cys Phe Glu Leu Ser Cys Asn Ser Ser Asn Glu Ser Asp Leu Thr

260 265 270

Val Pro Ile Leu Ser Ser Ile Glu Glu Glu Asp Leu Ser Ala Ala Glu

275 280 285

Glu Gly Ala Ala Gln Gly Ser Ser Glu Val Val Gln Val Lys Lys Cys

290 295 300

Cys Ser Asn Leu Ile Ser Ser Ala Phe Phe Arg Thr Leu Ile Phe Ile

305 310 315 320

Leu Glu Leu Pro Leu Tyr Leu Pro Arg Arg Leu Thr Ile Pro Val Val

325 330 335

Cys Glu Glu Arg Trp Cys Lys Pro Tyr Ala Val Ala Ser Val Thr Leu

340 345 350

Ala Pro Val Leu Leu Ser Thr Leu Trp Asn His Gln Phe Gly Asn Val

355 360 365

Ser Phe Lys Thr Lys Leu Ala Ile Tyr Ile Ile Gly Leu Val Phe Gly

370 375 380

Ile Thr Phe Gly Ile Val Ala Phe Phe Thr Thr Glu Lys Ser Ser Pro

385 390 395 400

Pro Lys Lys Cys Leu Val Pro Trp Leu Thr Ala Gly Phe Val Met Ser

405 410 415

Ile Thr Trp Ser Tyr Leu Thr Ala Gln Glu Leu Val Gly Leu Leu Val

420 425 430

Ser Leu Gly Tyr Ile Leu Gly Val Ser Pro Ser Ile Leu Gly Leu Thr

435 440 445

Val Leu Ala Trp Gly Asn Ser Leu Gly Asp Leu Ile Thr Asn Leu Thr

450 455 460

Met Ala Leu Asn Gly Gly Thr Lys Gly Ala Gln Ile Ala Phe Ser Ala

465 470 475 480

Cys Tyr Ala Gly Pro Ile Phe Asn Thr Leu Phe Gly Leu Gly Leu Ser

485 490 495

Leu Val Gly Ser Ala Trp Ser Lys Phe Pro Ser Pro Val Leu Phe Gln

500 505 510

Ser Asp Pro Tyr Leu Leu Glu Thr Val Cys Phe Leu Ala Val Gly Leu

515 520 525

Leu Trp Ala Leu Val Val Leu Pro Arg Arg Ser Met Met Leu Asp Gly

530 535 540

Val Leu Gly Ala Gly Leu Leu Val Val Tyr Ile Ser Ser Met Ser Leu

545 550 555 560

Arg Leu Ile Arg Thr Leu Gly Ser Val Lys Phe

565 570

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgggcacct tagttttctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttaaaatttt acagacccaa 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaggaaggag ctgcacaagg c 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gtcactgaag caactgcata tggc 24

Claims

1.一种苹果离子转运体MdCCX2，其特征在于，所述MdCCX2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种包含权利要求1所述的苹果离子转运体MdCCX2的重组过表达载体pBI121-MdCCX2，其特征在于，所述载体pBI121-MdCCX2用于拟南芥的遗传转化。

3.一种由权利要求2所述的重组过表达载体pBI121-MdCCX2构建的转基因植株，其特征在于，所述转基因植株通过转化拟南芥植株获得。

4.一种包含权利要求1所述的苹果离子转运体MdCCX2的过表达载体pCambia2300-MdCCX2-GFP，其特征在于，该载体用于转化苹果愈伤或苹果根系。

5.一种由权利要求4所述的过表达载体pCambia2300-MdCCX2-GFP构建的转基因植株，其特征在于，所述转基因植株通过转化苹果愈伤组织或苹果根系获得。

6.一种包含权利要求1中的苹果离子转运体MdCCX2的RNAi干扰表达载体pK7GWIWG2D-MdCCX2，其特征在于，该载体用于转化苹果根系。

7.一种由权利要求6所述的RNAi干扰表达载体pK7GWIWG2D-MdCCX2构建的转基因植株，其特征在于，所述转基因植株由苹果植株根系转化获得。

8.一种权利要求1所述的苹果离子转运体MdCCX2在转基因中的应用。

9.如权利要求8所述的苹果离子转运体MdCCX2在转基因中的应用，其特征在于，所述MdCCX2能够用于提高转基因酵母耐盐性并降低钠含量。

10.如权利要求8所述的苹果离子转运体MdCCX2在转基因中的应用，其特征在于，所述MdCCX2能够用于提高转基因植物耐盐性并降低钠含量。