CN102277360A - 一种对樱della蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于农业野生植物基因资源保护利用技术领域的一种对樱DELLA蛋白及其编码基因与应用。本发明第一次从樱桃中克隆得到赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白及其编码基因，将其命名为PpGAI，将PpGAI转化大肠杆菌BL21证明其具有生物活性，能够编码预期分子量大小的蛋白，将PpGAI基因转化野生型拟南芥，证明该基因编码的DELLA蛋白可导致拟南芥出现明显的矮化性状。本发明为果树转基因工程提供了一个优良的矮化基因，并为樱桃矮化密植开辟一条新的途径。

Description

一种对樱DELLA蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于农业野生植物基因资源保护利用技术领域，具体涉及对樱DELLA蛋白PpGAI及其编码基因与应用。

背景技术

赤霉素(Gibberellins，GAs)作为一类较大的四环双萜类植物激素，在植物的生长发育过程中起着极其重要的作用，并作用于植物整个生命周期，例如种子萌发，茎的伸长，叶片延展，花与果实的发育(Fleet C M，SUN T P.A DELLAcate balance：the role of gibberellin inplant morphogenesis.Current Opinion Plant Biology，2005，8：77～85)。目前，GAs的合成与代谢途径已研究得较为清楚，而且代谢关键酶和相应的基因也相继得以克隆，因而现在研究重点集中于对赤霉素信号转导途径的分子机制的探讨(Harberd N P，Belfield E，Yasumura Y.The angiosperm gibberellin-GID 1-DELLA growth regulatory mechanism：how an“inhibitor of aninhibitor”enables flexible response to fluctuating environments.Plant Cell，2009，21：1328～1339)。在已发现的植物GA信号传递组分中，有一类蛋白的N端极其保守，具有共同的DELLA结构域，称之为DELLA家族蛋白，其作为一个关键调控因子，在GA信号传导过程中起负调节作用(Peng J，Carol P，Richards D，et al.Arabidopsis GAI gene defines asignaling pathway that negatively regulates gibberellin responses.Genes & Development，1997，11：3194～3205)。在没有GA的情况下，DELLA蛋白阻遏植物的生长发育过程；当有GA信号时，DELLA蛋白通过泛素化途径降解，从而解除其阻遏作用。如果GA的信号转导途径受阻，将使植物产生矮化等异常的生理现象(Sun T P.Gibberellin-GID1-DELLA：A PivotalRegulatory Module for Plant Growth and Development.Plant Physiology，2010，154：567～570)。20世纪90年代，有研究发现“绿色革命”中导致小麦产生矮化性状的基因rht1即为DELLA蛋白的编码基因。该基因突变后导致小麦无法正常响应赤霉素信号，因而形成一个新的矮化品种。由于其早结实、抗倒伏、耐风沙，从而极大地促进了世界粮食作物的增产(Peng J，Richards D E，Hartley N M，et al.‘Green revolution’genes encode mutant gibberellin responsemodulators.Nature，1999，400：256～261)。目前，已从拟南芥、水稻、葡萄等物种中克隆得到DELLA蛋白基因，其功能也得以进一步研究。Foster等将苹果DELLA蛋白基因MdRGL2a转入拟南芥中进行过表达，转基因植株表现出叶片紧缩、茎杆变短、花期延长、对外源GA3敏感度降低等现象，类似于拟南芥gai矮化突变体的表型特征(Foster T，Kirk C，Jones W T，etal.Characterization of the DELLA subfamily in apple(Malus×domestica Borkh.).Tree GenetGenomes，2007，3：187～197)。在酿酒葡萄11突变体中，DELLA区域突变成了DELHA，使葡萄蔓藤上本应生长蔓须的部位形成花序，导致植株矮化(Paul K B，Mark R T.Association ofdwarfism and floral induction with a grape‘green revolution’mutation.Nature，2002，416：847～850)。以上研究结果暗示了DELLA蛋白在不同物种之间的功能较为保守，通过干扰GA的信号转导过程可达到使植株矮化的目的。

甜樱桃(Prunus avium L.)果实色泽艳丽，晶莹美观，味美多汁，营养丰富，深受消费者喜爱，被誉为果中珍品，是经济效益最好的栽培果树之一；而甜樱桃的矮密栽培更具有提早结果、方便采摘、提高土地和光能利用效率等优点，成为樱桃产业高效发展的一种良好的栽培模式。传统的密植方式多采用矮化砧木来控制树体大小和高度，然而目前国内成功选育出的甜樱桃矮化砧木品种屈指可数，且应用范围小，生产上大多利用从国外引进的砧木资源，如Gisela系列、Colt。但由于地理环境的差异，这些砧木在我国的实际生产应用上尚存在一定的局限性，例如Gisela系列砧木对土壤肥力要求高，且嫁接接穗品种后普通存在砧木“小脚”现象，而Colt砧木的耐盐碱性较差，易感根癌病。中国樱桃‘对樱’(Prunuspseudocerasus L.)是分布于北京地区的一个半野生小乔木，其抗逆性及抗病虫害能力强，与甜樱桃品种的嫁接亲和力好，但将其作为甜樱桃的砧木品种，嫁接树生长健壮，树冠较高大，矮化效果不明显。鉴于此，如果通过基因工程的手段，将赤霉素信号转导负向调节因子DELLA蛋白基因导入中国樱桃砧木品种‘对樱’，培育出性状优良并适于樱桃矮化密植的砧木新品种，将为甜樱桃矮化育种开辟新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对樱DELLA蛋白及其编码基因。

本发明的目的还在于提供包含对樱DELLA蛋白编码基因的载体及其工程菌。

本发明的目的还在于提供对樱DELLA蛋白编码基因的获得方法。

本发明的目的还在于提供对樱DELLA蛋白编码基因及其表达的DELLA蛋白在果树矮化密植方面的用途。

一种DELLA蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述DELLA蛋白的编码基因来源于对樱(Prunus pseudocerasus L.)。

包含权利要求1所述DELLA蛋白的编码基因的表达载体。

包含权利要求3所述表达载体的工程菌。

一种DELLA蛋白，所述DELLA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述DELLA蛋白来源于对樱(Prunus pseudocerasus L.)。

一种DELLA蛋白的编码基因的获得方法，按照如下步骤进行：

(1)CTAB法提取对樱叶片总RNA，将其反转录为cDNA；

(2)根据权利要求1所述的DELLA蛋白的编码基因设计引物PpGAI-L和PpGAI-R，以步骤(1)得到的cDNA为模板，利用RT-PCR方法扩增全长PpGAI基因；所述PpGAI-L的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；PpGAI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。

上述DELLA蛋白的编码基因，发明人将其命名为PpGAI，蛋白命名为PpGAI。

上述任一DELLA蛋白的编码基因或DELLA蛋白在果树矮化密植方面的用途。

本发明的有益效果：本发明第一次从樱桃中克隆得到赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白及其编码基因PpGAI，将PpGAI转化大肠杆菌BL21证明其具有生物活性，能够编码预期分子量大小的蛋白，将PpGAI基因转化野生型拟南芥，证明该基因编码的DELLA蛋白可导致拟南芥出现明显的矮化性状。从而为果树转基因工程提供了一个优良的矮化基因，并为樱桃矮化密植开辟一条新的途径。

附图说明

图1为从对樱叶片中提取的总RNA电泳图。

图2为通过简并引物LT、RT扩增樱桃DELLA蛋白基因的中间片断的电泳检测图；

图中，M为DNA Marker II，1为PpGAI基因中间片断的PCR产物。

图3为PpGAI基因的3′末端PCR产物电泳检测图；

图中，M为100bp plus DNA Ladder，1为PpGAI基因的3′末端PCR产物。

图4为PpGAI基因的5′末端PCR产物电泳检测图；

图中，M为DNA Marker II，1为PpGAI的5′末端PCR产物。

图5为PpGAI基因全长电泳检测图；

图中，M为500bp DNA Ladder，1为PpGAI的开放阅读框全长。

图6为利用MEGA软件进行的系统进化树分析。

图7为BamH I和sal I双酶切重组质粒鉴定PpGAI基因阳性克隆电泳图；

图中，M为DNAMarker III，1、2均为重组质粒的酶切结果。

图8为PpGAI蛋白的考马斯亮蓝染色图；

图中，M为蛋白Ladder(10-250kD)，1为未经诱导的转化子表达的总蛋白，2～6为分别诱导2、4、6、8、10h转化子表达的总蛋白，7为未经诱导的pGEX-4T-1空载体表达的总蛋白，8～12为分别诱导2、4、6、8、10h pGEX-4T-1空载体表达的总蛋白。

图9为Nco I和Bgl II双酶切重组质粒鉴定PpGAI基因阳性克隆电泳图；

图中，M为DNA Marker III，1、2均为重组质粒的酶切结果。

图10为PCR检测转PpGAI基因阳性拟南芥植株；

图中，M为Marker V，1～9为转基因拟南芥苗，10为野生型拟南芥对照。

图11为野生型和转PpGAI基因拟南芥植株表型比较；

图左侧为野生型拟南芥植株，图右为PpGAI基因拟南芥植株。

图12为野生型和转PpGAI基因拟南芥植株叶片比较；

图上一行为野生型拟南芥植株叶片，图下一行为转PpGAI基因拟南芥植株叶片。

具体实施方式

下面以附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例试验所用材料为中国樱桃‘对樱’(Prunus pseudocerasus L.)，采自北京市海淀区植物组织培养技术实验室。2009年6月下旬采取嫩叶后，置于冰盒中立即带回实验室，液氮速冻后，存于-80℃冰箱备用。

原核表达载体pGEX-4T-1、植物表达载体pCAMBIA1301、大肠杆菌DH5a感受态细胞、根癌农杆菌EHA105菌株、大肠杆菌BL21感受态细胞购自北京天根生化公司。

Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RNase-Free DNase I、限制性内切酶BamH I、sal I、Nco I和Bgl II、T4 DNA连接酶，购自TAKARA公司。Clotech Smarter^TMRACE cDNA Amplication Kit购自Clotech公司，M-MLV反转录酶购自Promega公司；DNAMarker购自中科瑞泰北京生物技术有限公司，蛋白Ladder 10-250KD购自中科瑞泰NEB公司；氨苄青霉素、硫酸卡钠酶素、利福平购自北京新经科生物技术有限公司，潮霉素购自Sigma公司；离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京汇天东方科技有限公司，离心柱型质粒小量提取试剂盒购自北京博大泰恒生物技术有限公司，SDS-PAGE试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

实施例1、对樱DELLA蛋白PpGAI及其编码基因的获得

一、PpGAI基因中间片断的获得

以中国樱桃‘对樱’(Prunus pseudocerasus L.)为试验材料(采自北京市海淀区植物组织培养技术实验室)，CTAB法提取其叶片总RNA。用30μl超滤水(RNA free)溶解所提取的RNA沉淀。取1～2μl溶解的RNA，加入1μl 6×电泳上样缓冲液后混匀，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA。在凝胶成像系统下观察，电泳结果如图1所示，从图中可以清晰地看到28S rRNA和18S rRNA两条带，且28S rRNA和18S rRNA含量之比大约为1∶1-2∶1，无拖尾及弥散现象。紫外分光度测量OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.95，OD₂₆₀/OD₂₃₀＝2.00，浓度为1131ng/μl，说明RNA纯度较好，完整性好且浓度较高，达到后续实验要求。

以上述提取得到的总RNA为模板，将其反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，通过简并引物LT、RT扩增樱桃DELLA蛋白基因的中间片断。

引物序列如下：

PCR反应体系如下：

在200μl离心管中加入下列组分(25μl体系)：

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果如图2所示，其中，M为DNA Marker II，1为PpGAI基因中间片断的PCR产物。

切下目的条带，纯化回收后按照pMD18-T载体试剂盒(TAKARA公司)说明书将PCR产物连接到pMD18-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后，确定PCR扩增获得的857bp片段即是PpGAI基因的中间片断序列。

二、PpGAI基因3′末端的获得

根据Clotech Smarter^TM RACE cDNA Amplication Kit说明书，以3′-CDS Primer A(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGACTAC(T)₃₀V N-3′，N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C；SEQ ID NO：5)为引物，将步骤一中提取的‘对樱’叶片总RNA反转录合成3′-RACE的cDNA第一条链。根据步骤一中扩增得到的中间片断的测序结果分别设计3′端基因特异性引物3Gsp1、3Gsp2，其中3Gsp2是3Gsp1的巢式PCR内侧引物；另外Smarter^TM RACE cDNAAmplication Kit提供通用引物UPM和NUP，其中NUP是UPM的巢式PCR内侧引物。

引物序列如下：

以反转录得到的3′-RACE的cDNA第一条链为模板，以3Gsp1、UPM为引物进行第一轮PCR反应扩增PpGAI基因的3′末端。

PCR反应体系如下：

在200μl离心管中加入下列组分进行第一轮PCR反应(25μl体系)：

PCR程序为：94℃ 5min；94℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 2min，35Cycles；72℃ 10min。

以第一轮PCR产物稀释50倍作为模板，以3Gsp2、NUP为引物进行第二轮PCR反应：在200μl离心管中加入下列组分(25μl体系)：

PCR程序为：94℃ 5min；94℃ 30sec，59℃ 30sec，72℃ 2min，35Cycles；72℃ 10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，结果如图3所示，M为100bp plus DNA Ladder，1为PpGAI基因的3′末端PCR产物。

切下目的条带，纯化回收后按照pMD18-T载体试剂盒(TAKARA公司)说明书将PCR产物连接到pMD18-T载体上，进行测序。结果显示PCR扩增后得到一条672bp的片断，经同源性比较分析后，确定PCR扩增获得的片段即是PpGAI基因的3′末端序列。它与中间片断的重叠区域为175bp，3′端非编码区为497bp。

三、PpGAI基因5′末端的获得

根据Clotech Smarter^TM RACE cDNA Amplication Kit说明书，以5′-CDS PrimerA(5′-(T)₂₅VN-3′，N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C；SEQ ID NO：10)为引物，将步骤一中提取的‘对樱’叶片总RNA反转录合成5′-RACE的cDNA第一条链。根据步骤一中扩增得到的中间片断的测序结果分别设计5′端基因特异性引物5Gsp1、5Gsp2，其中5Gsp2是5Gsp1的巢式PCR内侧引物；另外Smarter^TM RACE cDNA Amplication Kit提供通用引物UPM和NUP，其中NUP是UPM的巢式PCR内侧引物。

引物序列如下：

以反转录得到的5′-RACE的cDNA第一条链为模板，以5Gsp1、UPM为引物进行第一轮PCR反应扩增PpGAI基因的5′末端。

PCR反应体系如下：

在200μl离心管中加入下列组分，进行第一轮PCR反应(25μl体系)：

PCR程序为：94℃ 5min；94℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 2min，35Cycles；72℃ 10min。

以第一轮PCR产物稀释50倍作为模板，以5Gsp2、NUP为引物进行第二轮PCR反应：在200μl离心管中加入下列组分(25μl体系)：

PCR程序为：94℃ 5min；94℃ 30sec，64℃ 30sec，72℃ 2min，35Cycles；72℃ 10min。

1％琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，结果如图4所示，M为DNA Marker II，1为PpGAI的5′末端PCR产物。

切下目的条带，纯化回收后按照pMD18-T载体试剂盒(TAKARA公司)说明书将PCR产物连接到pMD18-T载体上，进行测序。结果显示PCR扩增后得到一条1182bp的片断，经同源性比较分析后，确定PCR扩增获得的片段即是PpG4I基因的5′末端序列。它与中间片断的重叠区域为103bp，5′端非编码区为200bp。

四、PpGAI基因全长cDNA序列的获得

将上述PCR扩增获得的PpGAI基因的中间片断、3′端序列以及5′端序列进行同源性比较，利用DNAMAN等生物软件进行拼接校正，得到PpGAI基因全长cDNA序列，为2310bp，ORF为1788bp，编码一条含595个氨基酸的多肽链，分子质量为64kD，等电点pI为4.88。该基因的起始密码子为ATG，-3位为A，符合KOZAK规律，终止密码子为TGA，3′末端含有一连串的polyA序列，这些都符合基因全长cDNA高效转录和翻译的特征。

根据电子克隆全长cDNA序列设计引物PpGAI-L和PpGAI-R，以步骤一得到的cDNA为模板，利用RT-PCR方法扩增全长PpGAI基因。

在200μl离心管中加入下列组分(25μl体系)：

PCR程序为：94℃ 5min；94℃ 30sec，62℃ 40sec，72℃ 2min，35Cycles；72℃ 10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图5所示，M为500bp DNA Ladder，1为PpGAI的开放阅读框全长。

切下目的条带，纯化回收后按照pMD18-T载体试剂盒(TAKARA公司)说明书将PCR产物连接到pMD18-T载体上，进行测序。测序结果与基因电子拼接全长一致。

五、PpGAI基因全长的序列分析

将测序结果在NCBI上进行BLASTx比对，结果表明PpGAI基因所编码的氨基酸与其它物种的DELLA蛋白相似度较高。其中，与苹果RGL2b(Malus domestica，AAY56750)相似性最高，达到83％。其次为葡萄(Vitis vinifera，CAN59753)，为76％，与杨树(Popμlustrichocarpa，XP_002302975)、蓖麻(Ricinus communis，XP_002534030)、棉花(Gossypiumhirsutum，ABG26370)、菜豆(Phaseolus vμlgaris，BAF62637)的相似性分别为71％、72％、74％和69％。

通过DNAman和Bioedit软件进行氨基酸同源性比较，PpGAI蛋白与数据库中不同物种的DELLA蛋白具有较高的同源性，具有DELLA蛋白家族所共有的结构域，包含N末端的DELLA和VHYNP，中心区有VHIID、核定位区域(NLS)、两个亮氨酸拉链区(LZ)和丝氨酸、苏氨酸富集区(Poly S/T)，以及C末端的RVER和SAW保守结构域。其中DELLA和VHYNP这两个酸性结构域是GA的信号感知区；VHVID、Saw等结构域作为阻遏区域发挥阻遏作用；NLS区是转录因子的标志之一，含有NLS区的蛋白可以从细胞质定位到细胞核；LZ是形成蛋白二聚体的必须组件；Poly S/T位点是蛋白磷酸化和糖基化的位点。

利用MEGA软件进行系统进化树的构建。分子系统进化树分析(图6)表明，中国樱桃‘对樱’PpGAI与苹果(Malus domestica)、葡萄(Vitis vinifera)、蓖麻(Ricinus communis)和豌豆(Pisumtrichocarpa)聚为一类。其中与苹果的DELLA蛋白亲缘关系最近，其次是葡萄，而与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)的亲缘关系较远。

实施例2、PpGAI基因的原核表达分析

一、原核表达载体pGEX-4T-1/PpGAI的构建

根据PpGAI基因全长的ORF序列设计引物PF1(SEQ ID NO：15)、PR1(SEQ ID NO：16)，并引入pGEX-4T-1原核表达载体的酶切位点BamH I和salI。

以实施例1中反转录得到的cDNA为模板，以PF1、PR1为引物进行PCR反应扩增PpGAI基因全长。在200μl离心管中加入下列组分(50μl体系)：

PCR程序为：94℃ 5min；94℃ 30sec，62℃ 45sec，72℃ 2min，35Cycles；72℃ 10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，回收并纯化目的片断，连接至pGEX-4T-1原核表达载体构建重组质粒，并通过BamH I和sal I双酶切重组质粒鉴定阳性克隆，如图7所示，M为DNA Marker III，1、2均为重组质粒的酶切结果。结果显示重组质粒经双酶切后得到一条1797bp的条带，表明PpGAI基因已成功连接至原核表达载体pGEX-4T-1中。

二、重组质粒pGEX-4T-1/PpGAI在E.coli BL21中的表达分析

将pGEX-4T-1/PpGAI转化E.coli BL21感受态细胞，28℃、220rpm振荡培养，并分别在诱导2h、4h、6h、8h、10h时各取2ml菌液，试验并设置未经IPTG诱导的对照及pGEX-4T-1空载体对照。将收集的菌液4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，往菌体中加入100μl SDS-PAGE loading buffer，充分悬浮菌体，在沸水中煮沸5min，冰浴2min以上，将样品直接进行SDS-PAGE电泳。将凝胶用考马斯亮蓝染色液染色并脱色后，置于凝胶成像系统下观察电泳结果，如图8所示，M为蛋白Ladder(10-250kD)，1为未经诱导的转化子表达的总蛋白，2～6为分别诱导2、4、6、8、10h转化子表达的总蛋白，7为未经诱导的pGEX-4T-1空载体表达的总蛋白，8～12为分别诱导2、4、6、8、10h pGEX-4T-1空载体表达的总蛋白。结果显示将pGEX-4T-1/PpGAI转化E.coli BL21感受态细胞后表达一条91kD的特异性蛋白条带(融合了pGEX-4T-1载体上27kD的GST蛋白标签，且在诱导的2-10h内，随着诱导时间的延长而蛋白表达量增大。在0h取样的未诱导样品无此条带，pGEX-4T-1空载体则诱导后也无此条带而表达出27kD的GST蛋白标签。表明经IPTG诱导后，PpGAI表达出预期分子量大小并具有活性的蛋白。

实施例3、PpGAI基因转化拟南芥的功能验证

一、pCAMBIA1301/PacGAI植物表达载体的构建

根据PpGAI基因全长的ORF序列设计引物PF2(SEQ ID NO：17)、PR2(SEQ ID NO：18)，并引入pGEX-4T-1原核表达载体的酶切位点Nco I和Bgl II。

以实施例1中反转录得到的cDNA为模板，以PF2、PR2为引物进行PCR反应扩增PpGAI基因全长。在200μl离心管中加入下列组分(50μl体系)：

PCR程序为：94℃ 5min；94℃ 30sec，62℃ 45sec，72℃ 2min，35Cycles；72℃ 10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，回收并纯化目的片断，连接至pCAMBIA1301植物表达载体构建重组质粒，并通过Nco I和Bgl II双酶切重组质粒鉴定阳性克隆，如图9所示，M为DNA Marker III，1、2均为重组质粒的酶切结果。结果显示重组质粒经双酶切后得到一条1801bp的条带，表明PpGAI基因已成功连接至植物表达载体pCAMBIA1301中。

二、PpGAI基因转化Col野生型拟南芥

将阳性pCAMBIA1301/PpGAI重组质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞，接种到50mlYEP(含100μg/ml Rif、100μg/ml Kan)液体培养基中，28℃ 180rpm继续培养至OD600＝0.8。4000rpm离心10min，弃培养基，收集菌体。用拟南芥渗入缓冲液将菌体稀释OD600＝0.6，制备成拟南芥侵染液。当拟南芥抽苔4～5cm时即可准备侵染，侵染的前3d去除其顶生花序，以利用腋生花序的生长。待长出腋生花序后，其下部的花开始授粉时即可进行转化。转化前大量浇水，并将已授粉的花蕾及荚果摘除。共配制50ml拟南芥侵染液，倒入培养皿，将拟南芥的花序浸入其中30s，注意莲座叶不要沾染到菌液。取出植株，横放在托盘中，暗处理24h。之后直立放置方盘正常光照培养。待果荚成熟时收获T0代种子。

三、转基因拟南芥纯合体的筛选及鉴定

将T0代种子播种前在4℃冰箱春化3d，0.5％ NaClO表面消毒后，播种于1/2MS固体培养基上(大量元素、微量元素减半，含20mg/L潮霉素)培养。7～14d后挑选转化体，具有潮霉素抗性的转化植株体能在含有潮霉素培养基上生长，根明显伸长，而非转化体渐渐黄化死亡，试验共得到9棵转化体。待植株长出4～5片叶子时，提取叶片DNA进行PCR鉴定，引物及PCR程序同实施例1中的PpGAI基因中间片断的克隆。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图10所示，M为Marker V，1～9为转基因拟南芥苗，10为野生型拟南芥对照。电泳结果表明，1、2、4、6经过PCR扩增能够得到857bp的目的片断，为拟南芥阳性转化体，将其继续培养待果荚成熟收获T1代种子。

将PCR鉴定为阳性的植株所收获的T1代种子继续播种，同样经过潮霉素抗性筛选，统计其性状分离比。在培养10d后统计有288株抗性苗，102株黄化苗，经卡方检验符合孟德尔遗传定律中3∶1分离比。将部分抗性苗移植入土壤中，收获T2代纯合的转基因种子。

将T2代种子继续将播种在潮霉素抗性的1/2MS固体培养基上进行筛选，将存活的抗性苗移植入土壤中，共得到12株独立的T2代转基因植株，在生长过程中观察其表型变化，研究结果发现其表型变化一致。对比野生型拟南芥与转PpGAI拟南芥的表型，如图11所示，左为野生型拟南芥，右为转PpGAI拟南芥。与野生型拟南芥相比，转基因苗茎杆缩短，节间距离缩短，花和荚果量减少，对比两种叶片，见图12，上一行为野生型拟南芥叶片，下一行为转PpGAI拟南芥叶片。可明显发现转基因拟南芥的叶片变小，呈紧缩状。说明将PpGAI基因转入拟南芥后得到表达，对拟南芥的生长发育过程产生了很大的影响，可导致植株明显矮化。

Claims (8)

1.一种DELLA蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述一种DELLA蛋白的编码基因，其特征在于，所述DELLA蛋白的编码基因来源于对樱(Prunus pseudocerasus L.)。

3.包含权利要求1所述DELLA蛋白的编码基因的表达载体。

4.包含权利要求3所述表达载体的工程菌。

5.一种DELLA蛋白，其特征在于，所述DELLA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.根据权利要求1所述一种DELLA蛋白，其特征在于，所述DELLA蛋白来源于对樱(Prunus pseudocerasus L.)。

7.一种如权利要求1所述DELLA蛋白的编码基因的获得方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)CTAB法提取对樱叶片总RNA，将其反转录为cDNA；

(2)根据权利要求1所述的DELLA蛋白的编码基因设计引物PpGAI-L和PpGAI-R，以步骤(1)得到的cDNA为模板，利用RT-PCR方法扩增全长PpGAI基因；所述PpGAI-L的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；PpGAI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。

8.权利要求1、2、5、6所述任一DELLA蛋白的编码基因或DELLA蛋白在果树矮化密植方面的用途。

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