CN116286856A - 一种编码della6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 - Google Patents
一种编码della6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116286856A CN116286856A CN202310033199.7A CN202310033199A CN116286856A CN 116286856 A CN116286856 A CN 116286856A CN 202310033199 A CN202310033199 A CN 202310033199A CN 116286856 A CN116286856 A CN 116286856A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- della6
- gene
- protein
- mango
- judging
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 title claims abstract description 24
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 title claims abstract description 24
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 title claims abstract description 24
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 title claims abstract 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 241001093152 Mangifera Species 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 101150092780 GSP1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150035751 GSP2 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 235000005976 Citrus sinensis Nutrition 0.000 description 3
- 240000002319 Citrus sinensis Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000931515 Acer palmatum Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- AEDDIBAIWPIIBD-ZJKJAXBQSA-N mangiferin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=C(O)C=C(OC=2C(=CC(O)=C(O)C=2)C2=O)C2=C1O AEDDIBAIWPIIBD-ZJKJAXBQSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241001672694 Citrus reticulata Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 240000001008 Dimocarpus longan Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 235000000235 Euphoria longan Nutrition 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- YWQSXCGKJDUYTL-UHFFFAOYSA-N Mangiferin Natural products CC(CCC=C(C)C)C1CC(C)C2C3CCC4C(C)(C)CCCC45CC35CCC12C YWQSXCGKJDUYTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000183278 Nephelium litchi Species 0.000 description 1
- 240000005859 Orthosiphon aristatus Species 0.000 description 1
- 240000006711 Pistacia vera Species 0.000 description 1
- 235000003447 Pistacia vera Nutrition 0.000 description 1
- 108090000638 Ribonuclease R Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical class C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 229940043357 mangiferin Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020233 pistachio Nutrition 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码DELLA6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用。一种编码DELLA6蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明编码DELLA6蛋白的基因可以为早期预判供试材料是否具有矮化特性提供支持。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码DELLA6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用。
背景技术
矮化栽培是多年生木本果树集约化生产不变的发展趋势。植物矮化主要分为遗传性矮化和生理性矮化。单一基因突变属于遗传性矮化，其矮化机理多为基因合成蛋白，蛋白影响激素，激素影响表型；受环境因素影响，导致植株表型发生变化，属于生理性矮化，其矮化作用机理多为环境变化影响植物激素分泌，最终导致变化。但不论哪种矮化模式，都要通过激素来影响表型，植株生长过程中的激素多与赤霉素(gibberellins，GAs)有关。
GAs是植物生长过程中的中央调节器，通过降解DELLA蛋白来实现其功能。当GAs缺失时，DELLA蛋白可与调控植物生长发育的相关转录因子结合，抑制下游基因表达，进而抑制植物生长；当GAs存在时，DELLA蛋白被降解，其抑制作用被解除，促进下游基因表达，植物正常生长。DELLA蛋白在GAs信号转导途径中具有承上启下的重要作用。上世纪50年代，在小麦中利用DELLA蛋白的有益突变，实现了半矮化育种，提高了粮食产量，解决了温饱问题。现在，在多种农作物及经济作物中已经可以通过转基因技术调控DELLA蛋白的表达水平，使植株矮化，降低了管理成本。
通过对比具有乔化特性和矮化特性植物材料DELLA6基因的表达量，可以预判植物其是否具有矮化特性，既省时又省力。目前还未见利用DELLA6基因预判芒果品种是否具有矮化特性的相关报道。
发明内容
本发明提供了一种编码DELLA6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用，其可以预判芒果品种是否具有矮化特性，既省时又省力。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明的第一个目的在于提供一种编码DELLA6蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
更为具体的，所述基因的开放阅读框为1671bp。
本发明的第二个目的在于提供所述的编码DELLA6蛋白的基因的应用，所述编码DELLA6蛋白的基因用于预判芒果品种是否具有矮化特性。
本发明的第三个目的在于提供一种DELLA6蛋白，所述DELLA6蛋白是由所述的基因编码。
更为具体的，所述DELLA6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
更为具体的，所述DELLA6蛋白由556个氨基酸组成，分子重量为61.55KD，理论等电点为5.42。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明从供试材料中获取DELLA6蛋白基因序列，分析该基因理化活性，把该基因作为调控矮化性状的指标。
(2)本发明涉及到DELLA6蛋白基因克隆、与之相对应的氨基酸序列分析，通过半荧光定量方法测定DELLA6蛋白基因表达量，可以为早期预判供试材料是否具有矮化性状提供支持。
附图说明
图1为DELLA6基因中间片段PCR扩增结果图；
图2为DELLA6基因3'端PCR扩增结果图；
图3为DELLA6基因5'端PCR扩增结果图；
图4为芒果DELLA6与其它植物DELLA6同源性比对结果示意图；
图5为芒果DELLA6蛋白的氨基酸组分图；
图6为芒果DELLA6蛋白的信号肽及跨膜结构域分析图；
图7为芒果DELLA6蛋白二级结构预测图；
图8为芒果DELLA6蛋白三级结构预测图；
图9为芒果DELLA6蛋白亲水性和疏水性预测图；
图10为芒果DELLA6蛋白系统进化树；
图11为不同物候期金煌芒(乔化特性)和桂七芒(矮化特性)中DELLA6基因表达量图。
具体实施方式
下面结合对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域所属的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在实施例1中，主要仪器和试剂为：PCR仪：Takara；电泳仪：Bio-Rad；
2000分光光度计：Thermo；恒温摇床；/>
超保真DNA聚合酶：NEB；FirstChoice RLM-RACEKit：Thermo；2×Taq Master Mix(Dye Plus)：Vazyme。
在实施例2中，主要仪器和试剂为：ABI 7900-Fast Real-Time PCR DetectionSystem：ABI；
2000分光光度计：Thermo；普通PCR仪：Takara；All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia(Cat.No.AORT-0050)；All-in-OneTMqPCR Mix：GeneCopoeia(Cat.No.AOPR-0200)；EpcentreTM RNase R。
实施例1：芒果DELLA6基因的克隆与序列分析
一、RNA提取与纯化
1.总RNA提取(Trizol法)
(1)样品处理：取80-100mg芒果叶片至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至装有1mL Trizol的2.0mL离心管中，振荡混匀后室温静置约5min。
(2)水相分离：每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振荡混匀15s后室温静置约3min，4℃，12000rpm，离心15min。
(3)沉淀：转移水相至新的2.0mL离心管中，每1mL Trizol加入0.5mL异丙醇，混匀后室温静置20min，4℃，12000rpm，离心10min。
(4)洗涤：弃上清，加入1.5mL 80％(质量分数)的乙醇，混匀后4℃，8000rpm，离心5min。
(5)溶解：弃上清，空气干燥RNA沉淀约5min(注意不要完全干燥，只需沉淀泛白即可)，加入DEPC处理水溶解RNA沉淀。
2.纯化提取的RNA
(1)在微量离心管中配制下列反应液，50ul体系：
(2)在37℃下反应30min后，使Recombinant DNase I失活。
(3)加入10ul 3M醋酸钠和250ul冷乙醇，-80℃静置20min。
(4)在4℃下，12000rpm离心10min，弃上清。
(5)加入80％(质量分数)冷乙醇洗净，4℃，12000rpm离心5min，弃上清，干燥沉淀即可。
二、克隆目的基因中间片段
2.1根据GenBank中公布的植物的DELLA6基因cDNA序列，经过DNAMAN软件比对后，根据保守区域设计一对简并引物。
DELLA6-F：AAYGGYGATRTBGGHTGGRTYAGATA
DELLA6-R：TGCYTYACRCTYATAATTYCTYCCATTWCTGA
2.2反转录中间片段
(1)解冻First-Strand cDNA Synthesis Kit的试剂，上下轻柔颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
(2)冰上配制RNA-Primer Mix，在预冷的RNase-free反应管内加入以下试剂至总体积13μL；
(3)混匀RNA-Primer Mix，进行短暂离心，65℃变性10min后立即放于冰上；
(4)在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL；
(5)混匀反应Mix，短暂离心后37℃孵育1h；
(6)反应结束后，85℃灭活处理5min，-20℃保存反转录产物待用。
2.3中间片段分析和分离
中间片段PCR反应体系：
PCR反应程序为：95℃5min；95℃50s，58℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃10min；结束后将PCR反应产物在质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1，并进行切胶回收目的片段。
从图1中可以看出，从芒果叶片中克隆出的DELLA6基因中间片段大小约为1100bp。
2.4目的片段回收
(1)将50μL的反应体系全部加入到1％琼脂糖凝胶的点样孔中，在样品的一侧点入DNA Marker DM 2000。
(2)恒压120V，根据条带移动的位置，判断何时终止跑胶时间。
(3)在紫外灯下，根据Marker的位置，对目的条带进行切割回收，利用DNA琼脂糖胶回收试剂盒纯化目的基因中间片段。
(4)将切割的凝胶快速放入离心管中，根据凝胶的重量，评估其体积。
(5)向凝胶中加入同体积的Binding Buffer，65℃水浴，至凝胶全部融化。
(6)将融化液吸入到HiBind DNA Mini柱子里，然后把柱子放入到离心管中，12000g，室温，离心1min。弃废液，留柱子，直至所有的融化液完成此步骤。
(7)向柱子中加入300μL的XP2，12000g，室温，离心1min。弃废液，留柱子。
(8)加入700μL的SPW Wash buffer于柱子中，12000g，室温，离心1min，弃废液。重复此步骤一次。
(9)室温，13000g，空转2min，去除残余废液。
(10)把柱子放入新的离心管中，将30μL的Elution Buffer滴入到膜中央，室温，2min，然后13000g，离心2min，洗脱DNA。
2.5T载体连接及转化
I、连接
PCR产物4μL，PEASY-T1克隆载体1μL，轻轻混合，室温下反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上。
II、转化
(1)自-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5a，放入冰中直至完全溶解，轻轻混匀。
(2)吸50μL感受态细胞放入灭过菌的离心管中，并向离心管中加入5μL重组质粒，轻轻混匀，冰上静置30min。
(3)将冰浴后的离心管置于42℃水浴中热激90s，迅速移入装有冰的冰盒中2min，加入600ul LB培养液，放到37℃恒温摇床上进行220rpm培养1h。
(4)取50ul培养液涂于含有Amp的固体LB培养基上，待其干燥后放于37℃的培养箱中倒置培养。12h-16h后检查培养皿中是否出现菌落。
(5)挑取单克隆划线培养，用基因上下游引物做菌落PCR扩增检测。
(6)挑取阳性单克隆进行摇菌并测序。
三、克隆目的基因3'端
3.1根据已经获得的目的基因中间片段设计一对3'RACE引物。
DELLA6 3'GSP-1:CCGGCATGTGGCCTAATTCA
DELLA6 3'GSP-2:ATGGTTCAACACAAGGCCCT
3.2获得3'cDNA
(1)在无RNA酶的离心管中加入以下成分，于冰上操作：
(2)轻轻混匀，于42℃孵育1h，-20℃保存。
3.3Outer 3'PCR反应体系
PCR反应程序为：95℃5min；95℃50s，60℃50s，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃10min。
3.4Inner 3'PCR反应体系
PCR反应程序为：95℃5min；95℃50s，60℃50s，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃10min；结束后将PCR反应产物在质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2，并进行切胶回收目的片段连接到PEASY-T1克隆载体上转化感受态细胞，鉴定出阳性菌落后测序。
从图2可以看出，根据已获得的DELLA6基因中间片段的序列信息设计特异引物DELLA6 3'GSP-1、DELLA6 3'GSP-2与各自的通用引物进行PCR扩增，得到约300bp大小的DNA片段。
四、克隆目的基因5'端
4.1.根据已经获得的目的基因中间片段设计一对5'RACE引物。
DELLA6 5'GSP-1:GCACGTCCAAATTCAACCTGC；
DELLA6 5'GSP-2:GCTTGGCAACTGGCTTAAGC。
4.2Outer 5'PCR反应体系
PCR反应程序为：95℃5min；95℃50s，60℃50s，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃10min；
4.3Inner 5'PCR反应体系
PCR反应程序为：95℃5min；95℃50s，60℃50s，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃10min；结束后将PCR反应产物在质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图3，并进行切胶回收目的片段连接到PEASY-T1克隆载体上转化感受态细胞，鉴定出阳性菌落后测序。
从图3可以看出，根据已获得的DELLA6基因中间片段的序列信息设计特异引物DELLA6 5'GSP-1、DELLA6 5'GSP-2与各自的通用引物进行PCR扩增，得到约300bp大小的DNA片段。
五、基因序列拼接与分析
5.1利用DNAMAN对5'端、3'端及中间片段进行拼接，得到DELLA6基因的全长序列，见SEQ ID No.1，并将其翻译成蛋白质序列，见SEQ ID No.2；根据NCBI上登录的黑麦草、棉花、砂仁等植物的DELLA蛋白序列进行比较，结果见图4。
由图4可知，获得的基因为芒果DELLA6基因。
5.2氨基酸序列理化性质分析
5.2.1用protparam分析，DELLA6基因的开放阅读框为1671bp。DELLA6基因编码556个氨基酸，分子重量为61.55KD，理论等电点为5.42。
DELLA6蛋白的氨基酸组成见图5。
由图5可知，DELLA6蛋白氨基酸的组成主要是丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、谷氨酸和缬氨酸等氨基酸组成。其中，酸性氨基酸(Asp+Glu)70个，碱性氨基酸(Arg+Lys)49个
5.2.2用Phobius(http://phobius.sbc.su.se/)在线分析，分析结果见图6。
由图6可知，DELLA6蛋白为胞浆蛋白，DELLA6编码的蛋白质均没有信号肽。对DELLA5蛋白序列的跨膜结构域进行预测结果显示，DELLA6跨膜区域不明显。
5.2.3利用DNAMAN对DELLA6蛋白二级结构预测，预测结果见图7。
由图7可知，在DELLA6编码蛋白中，螺旋结构占42.09％，折叠占10.79％，无规则卷曲占47.12％。
5.2.4对DELLA6蛋白三级结构预测，预测结果见图8。
由图8可知，DELLA6蛋白由若干不同个α-螺旋、β-转角和随机卷曲构成蛋白肽链，预测结果与二级结构分析结果高度一致。
5.2.4利用DNAMAN预测DELLA6的亲水性和疏水性，预测结果见图9。
由图9可知，DELLA6多肽链第159位的天冬氨酸具有最低值-3.43，亲水性最强，而第1位的甲硫氨酸具有最高值3.02，疏水性最强。
5.2.5为了研究Mango DELLA6蛋白的进化情况，构建了DELLA6蛋白氨基酸序列的系统进化树，如图10所示。
由图10可知，芒果DELLA6与开心果(XP_031271042.1)亲缘关系较近；其次为复叶槭(KAI9170197.1)、漾濞槭(TXG57155.1)、龙眼(AUF71968.1)、荔枝(QAT94458.1)、克莱门柚(XP_006448223.1)、甜橙(KAH9794669.1)、甜橙(KDO64603.1)、甜橙(XP_006469195.1)和蜜柑(GAY58951.1)等植物的亲缘关系较近。
实施例2：基因相对量PCR检测
利用Beacon Designer设计引物，探究DELLA6基因在“金煌芒”(乔化特性)和“桂七芒”(矮化特性)不同时期中的表达情况。
以芒果actin内参基因设计actin-F和actin-R引物。根据已克隆得到的DELLA6序列设计特异引物DELLA6-YGF和DELLA6-YGR，cDNA的获得同实施例1。
PCR定量反应步骤如下：
(1)将All-in-OneTM qPCR Mix在室温下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。
(2)冰上配制PCR Reaction Mix，包括2×All-in OneTM qPCR Mix 10μL、qPCRPrimer(1μmol/L)2μL、cDNA Template 2μL，加入ddH2O使终体积至20μL。在试验中设计了NTC(no template control)为阴性对照，即用水代替模板cDNA，其他试剂不变，从而确保体系无污染。
(3)将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应管底部。
PCR反应程序为95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃15s，40个循环；72℃10min。PCR反应结束后，进行溶解曲线分析，即温度控制在72-95℃，每间隔10s升高0.5℃，最后25℃保持30s。试验设置3次重复。
采用7300System软件和2-ΔΔCt方法进行数据分析，结果见图11。
由图11可知，在5个物候期时间段，具有矮化特性供试材料的DELLA6基因表达量远高于具有乔化特性种质，说明DELLA6基因具有调控植物矮化表型的作用。
综上所述，本发明通过半荧光定量分析法测定DELLA6基因表达量可以为早期预判供试材料是否具有矮化性状提供支持。
Claims (6)
1.一种编码DELLA6蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的编码DELLA6蛋白的基因的应用，其特征在于，所述基因的开放阅读框为1671bp。
3.一种权利要求1所述的编码DELLA6蛋白的基因的应用，其特征在于，所述编码DELLA6蛋白的基因用于预判芒果品种是否具有矮化特性。
4.一种DELLA6蛋白，其特征在于，所述DELLA6蛋白是由权利要求1所述的基因编码。
5.根据权利要求4所述的DELLA6蛋白，其特征在于，所述DELLA6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
6.根据权利要求4所述的DELLA6蛋白，其特征在于，所述DELLA6蛋白由556个氨基酸组成，分子重量为61.55KD，理论等电点为5.42。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310033199.7A CN116286856A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 一种编码della6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310033199.7A CN116286856A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 一种编码della6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116286856A true CN116286856A (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=86824758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310033199.7A Pending CN116286856A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 一种编码della6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116286856A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942453A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-01-12 | 中国农业大学 | 一种GAI mRNA分子在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法 |
| CN102277360A (zh) * | 2011-08-05 | 2011-12-14 | 中国农业大学 | 一种对樱della蛋白及其编码基因与应用 |
| US20210062202A1 (en) * | 2017-09-18 | 2021-03-04 | Futuragene Israel Ltd. | Tissue-specific expression control of della polypeptides |
| CN114591976A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-06-07 | 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） | 一种编码GA2ox-氧化酶的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 |
-
2023
- 2023-01-10 CN CN202310033199.7A patent/CN116286856A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942453A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-01-12 | 中国农业大学 | 一种GAI mRNA分子在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法 |
| CN102277360A (zh) * | 2011-08-05 | 2011-12-14 | 中国农业大学 | 一种对樱della蛋白及其编码基因与应用 |
| US20210062202A1 (en) * | 2017-09-18 | 2021-03-04 | Futuragene Israel Ltd. | Tissue-specific expression control of della polypeptides |
| CN114591976A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-06-07 | 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） | 一种编码GA2ox-氧化酶的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 宋晓波 等: "辽宁2号DELLA蛋白编码基因的克隆及表达分析", 《河北农业大学学报》, vol. 39, no. 1, pages 29 - 34 * |
| 无: "Accession number：XM_044635274.1，PREDICTED: Mangifera indica DELLA protein GAIP-B-like (LOC123215255), mRNA", 《GENBANK》 * |
| 黄先忠 等: "DELLA家族蛋白与植物生长发育的关系", 《植物生理学通讯》, vol. 2004, no. 05, pages 529 - 532 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Owens et al. | CBF1 orthologs in sour cherry and strawberry and the heterologous expression of CBF1 in strawberry | |
| Jun-Wei et al. | Induced expression of DREB transcriptional factor and study on its physiological effects of drought tolerance in transgenic wheat | |
| CN112980854B (zh) | 一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用 | |
| CN113136391B (zh) | 小麦抗病蛋白TaWK6D及其相关生物材料与应用 | |
| CN111778265B (zh) | 玉米赤霉素氧化酶的突变基因、突变体、表达载体和应用 | |
| US20120198587A1 (en) | Soybean transcription factors and other genes and methods of their use | |
| CN113337526B (zh) | 玉米甲硫氨酸亚砜还原酶基因ZmMSRB3及应用 | |
| US20110119792A1 (en) | Genes Controlling Plant Root Growth And Development For Stress Tolerance And Method Of Their Use | |
| Wang et al. | Molecular cloning and localization of a novel cotton annexin gene expressed preferentially during fiber development | |
| CN108728450A (zh) | 狗牙根中一个受低温显著诱导的基因CdERF1及其应用 | |
| CN112961229A (zh) | 橡胶树转录因子HbICE4及其编码基因与应用 | |
| WO2024108862A1 (zh) | 水稻白叶白穗基因wlp3及在水稻抗逆和增产中的应用 | |
| CN114591976A (zh) | 一种编码GA2ox-氧化酶的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 | |
| CN116286856A (zh) | 一种编码della6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 | |
| CN114836441B (zh) | 玉米种子耐贮性相关的ZmRAP2.7基因及其功能标记与应用 | |
| CN116426537A (zh) | 一种编码della5蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用 | |
| CN106432444A (zh) | 一个植物谷蛋白转运储藏相关蛋白gpa4及其编码基因与应用 | |
| Olave-Concha et al. | Accumulation of dehydrin transcripts and proteins in response to abiotic stresses in Deschampsia antarctica | |
| CN115896163A (zh) | 苹果MdPRX37L基因在维持采后苹果果实色泽品质中的用途 | |
| CN112226442B (zh) | 小麦籽粒大小性状相关基因TaSRK、其编码蛋白及应用 | |
| WO2008154650A2 (en) | Drought responsive genes in plants and methods of their use | |
| CN111153980B (zh) | 一种植物粒型相关蛋白OsSDSG及其编码基因与应用 | |
| CN108753794A (zh) | 植物茎杆持汁性调控基因Dry及其编码蛋白 | |
| CN114164291B (zh) | 水稻粒长基因gl10等位基因的应用 | |
| CN114989276B (zh) | 与紫苏耐盐相关蛋白PfWRKY33及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20230623 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |