CN112961229A

CN112961229A - 橡胶树转录因子HbICE4及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN112961229A
Application number: CN202110232198.6A
Authority: CN
Inventors: 李言; 田维敏; 全彩虹; 杨署光; 吴绍华
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2041-03-02
Also published as: CN112961229B

Abstract

本发明提供了一种橡胶树转录因子HbICE4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了橡胶树转录因子HbICE4的编码基因及应用。本发明基因表达分析显示HbICE4基因在响应低温胁迫上调表达，且在耐寒性强的橡胶树品种中表达量显著高于耐寒性弱的品种，通过转基因验证了HbICE4能够增强转基因植株的耐寒性、耐旱性和耐盐性等，这对于认识植物在非休眠条件下对低温胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等的抗性机制以及通过转基因技术定向改良高产品种的低温胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等具有重要的理论意义和实际应用价值，该基因可作为重要的基因资源，在橡胶树和其他植物抗逆基因工程中得到应用。

Description

橡胶树转录因子HbICE4及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及橡胶树转录因子HbICE4及其编码基因与应用。

背景技术

ICE(inducer of CBF expression)是CBF诱导表达的转录激活因子。植物中ICE的结构，除含典型bHLH结构域外，还存在S富集区、NLS区和转膜区，且bHLH结构域均含有19个保守的KMDRASILGDAI(D/E)YLKELL氨基酸。其基因分别在西红柿、黄瓜、烟草、香蕉等不同植物中发现，可提高植物的抗寒性。研究表明，AtICE属于组成型表达基因，编码含bHLH的MYC类(MYC-like transcription factors)转录激活因子MYC(Myelocytomatosis)家族成员可以应答多种植物激素，在介导的植物环境胁迫反应中起着非常重要的转录调控作用。

橡胶树(Hevea brasiliensisMuell.Arg.)原产南美洲亚马逊河流域，是典型的热带雨林树种。我国的植胶区位于热带北缘，属于非传统植胶区，经常性遭遇的寒流。因此，生产上需要高产又抗寒的新品种，但是高产耐寒品种极其匮乏。这是由于橡胶树常规育种周期长，杂交次代少，高产和耐寒性状难于聚合；橡胶树耐寒性选育种依赖大田及前哨苗圃鉴定，不仅鉴定周期长、效率低，而且耗费大量的人力、物力和土地资源。本项目采取正向遗传学研究策略，利用建立的橡胶树抗寒性室内鉴定实验系统和已知抗寒性强弱的橡胶树无性系为材料，从分子生物学和遗传转化层面，揭示了橡胶树低温胁迫抗性的分子机制，鉴定了ICE4基因的功能，对于认识植物在非休眠条件下对低温胁迫等的抗性机制以及通过转基因技术定向改良高产品种的低温胁迫抗性具有重要的理论意义和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种橡胶树转录因子HbICE4及其编码基因与应用。

本发明的第一个方面是提供一种橡胶树转录因子HbICE4，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种橡胶树转录因子HbICE4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个方面是提供一种重组载体，其包含原始载体和本发明第二个方面所述的橡胶树转录因子HbICE4基因。

其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pCAMBIA1302载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为pCAMBIA1302载体质粒，SEQ ID NO:2所示核苷酸序列位于pCAMBIA1302载体质粒的Spe I和BstEⅡ两限制性内切酶位点之间。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树转录因子HbICE4、或者本发明第二个方面所述的橡胶树转录因子HbICE4基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体在提高植物耐寒性、和/或耐盐性、和/或耐旱性中的应用。

其中，所述盐为氯化钠。

本发明的第五个方面是提供一种提高植物耐寒性、和/或耐盐性、和/或耐旱性的方法，其特征在于，将本发明第二个方面所述的橡胶树转录因子HbICE4基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体转染至植物。

本发明的第六个方面是一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

本发明的第七个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示。

本发明的第八个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示。

本发明从分子生物学和遗传转化层面，揭示了橡胶树低温胁迫抗性的分子机制，鉴定了橡胶树HbICE4基因的功能，基因表达分析显示HbICE4基因响应低温胁迫上调表达，且在耐寒性强的橡胶树品种中表达量显著高于耐寒性弱的品种，通过转基因验证了HbICE4能够增强转基因植株的耐寒性、耐旱性和耐盐性等，这对于认识植物在非休眠条件下对低温胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等的抗性机制以及通过转基因技术定向改良高产品种的低温胁迫、盐胁迫、干旱胁迫等具有重要的理论意义和实际应用价值，该基因可作为重要的基因资源，在橡胶树和其他植物抗逆基因工程中得到应用。

附图说明

图1为HbICE4基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。

图2为HbICE4基因的系统进化树分析。

图3为HbICE4和其他植物来源的ICE的氨基酸序列比对。

图4为HbICE4基因在低温条件下橡胶树耐寒品种和不耐寒品种的表达分析结果。

图5为过表达HbICE4基因的拟南芥植株的耐寒性鉴定结果，图中，WT：对照，35::HbICE4：转HbICE4基因拟南芥。

图6为过表达HbICE4基因的拟南芥植株的耐盐性鉴定结果，图中，WT：对照，35::HbICE4：转HbICE4基因拟南芥。

图7为过表达HbICE4基因的拟南芥植株的耐旱性鉴定结果，图中，WT：对照，35::HbICE4：转HbICE4基因拟南芥。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一、基因获得

利用RT-PCR技术从巴西橡胶树品种93-114的树皮中克隆获得转录因子HbICE4基因，具体实施方案如下：

参照天根RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的操作说明提取橡胶树树皮总RNA。根据Ferments公司试剂盒的操作步骤合成cDNA第一链。依据本橡胶树基因组数据库，获得注释为ICE的Unigene，借助NCBI数据库搜索比对，初步鉴定为完整的基因序列。

以cDNA第一链为模板，以HbICE4-F(SEQ ID NO:3)：ATGGAGCTCTCTCAGCATGGTTTC和HbICE4-R(SEQ ID NO:4):CTAAAGACATCTTCCTCCATAACC为引物，通过PCR扩增反应获得转录因子HbICE4基因的cDNA序列，扩增体系:Pyrobest DNA Polymerase(5U·μL^-1)1μL，10×Pyrobest Buffer II 5μL，dNTP Mixture(2.5mmol·L^-1)4μL，HbICE4-F(10μmol·L^-1)1μL，HbICE4-R(10μmol·L^-1)1μL，cDNA模版1μL，灭菌水补足50μL。扩增程序为:95℃预变性3min；95℃30s，60℃30s，72℃2min，共32个循环；72℃延伸10min。

0.2％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收纯化目的条带，克隆到pEASY-Blunt Simple CloningVector载体上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆送Invitrogen公司进行测序。利用BLAST检索GenBank数据库进行同源性分析，结果表明克隆了ICE家族基因中的一个完整的阅读框(图1)。利用MEGA5.10软件进行多重比对分析并构建系统发育树。结果表明所克隆的ICE基因属于ICE家族，是该家族5个成员之一，于是命名该基因为HbICE4(图2)。

将HbICE4基因编码的氨基酸序列与橡胶树的其它ICEs、葡萄VvICE4、毛果杨PtICE1、拟南芥AtICE1、麻风树JcICE1、蓖麻RcICE1所编码的氨基酸序列进行比对，结果如图3所示，HbICE4含有bHLH—ZIP domain和ACT-like domain，其中ACT-like domain参与多种植物的bHLH类转录因子的聚合。这两个结构域是HbICE4蛋白同其它的ICE蛋白都具有高度保守氨基酸序列。

二、基因表达模式分析

在长期的抗寒前哨苗圃和大田实践中，鉴定出耐寒品种橡胶树93-114、橡胶树GT1和橡胶树INA873，不耐寒品种热垦501、海垦1和热垦515。以这六个品种为材料，低温(4℃)处理，分别在处理0h、4h、8h和24h采集样品，5株一个混合样，3个生物学重复。利用荧光定量技术，对橡胶树转录因子HbICE4基因的表达模式进行分析。HbICE4基因荧光定量引物序列如，HbICE4-Q-F(SEQ ID NO:5)：AACTTTGATTCTTTTGATGAGAACG和HbICE4-Q-R(SEQ ID NO:6)：CACTGAAAGGGCAGTCAAAGC，内参基因ACTIN7a(Gene Bank登录号：HQ260674)的引物序列如，ACTIN7a-F:GGCACTTTGGTACTCAAGTC和ACTIN7a-R:GAAGCATCCCAATCACTCTC。使用BioRad公司的CFX-384荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR,反应程序：95℃预变性30s，94℃5s,60℃20s,72℃20s,进行45个循环，扩增结束后绘制熔解曲线，从50℃逐渐升温至95℃，升温速度0.2℃/s，全过程检测荧光信号。分别检测HbICE4在橡胶树耐寒品种和不耐寒品种中的表达情况。

结果HbICE4在橡胶树耐寒品种GT1和INA873中的本底表达显著高于不耐寒品种热垦501、海垦1和热垦515。在低温胁迫下，HbICE4不论在耐寒品种还是不耐寒品种中都呈上调表达趋势。在低温处理4h时，HbICE4在耐寒品种93-114和GT1中的表达量显著高于不耐寒品种热垦501、海垦1和热垦515；在低温处理8h时，HbICE4在橡胶树耐寒品种93-114、GT1和INA873中的表达量显著高于不耐寒品种热垦501、海垦1和热垦515(图4)。这表明HbICE4与橡胶树的低温胁迫抗性有关。

三、遗传转化

已测序验证的质粒为模板，以HbICE4-TR-F(SEQ ID NO:7)：GACTAGTATGGAGCTCTCTCAGCATGG(下划线为Spe I酶切位点)和HbICE4-TR-R(SEQ ID NO:8)：GGGTGACCCTAAAGACATCTTCCTCCAT(下划线为BstEⅡ酶切位点)为引物，扩增HbICE4基因的ORF，扩增产物经双酶切后连接到经相同内切酶切后的表达载体pCAMBIA1302中，通过测序鉴定目的基因的完整性和连接顺序的正确性，利用热激将带有HbICE4基因ORF的质粒转化到GV3101菌株。通过农杆菌介导法，侵染拟南芥的花序，将HbICE4基因转化到将要形成的种子中进行过表达，然后对转基因阳性植株进行鉴定，对含有目的基因的T3代阳性植株进行筛选及耐寒性鉴定分析，以没有转基因的正常植株为对照(WT)，结果表明培养4周的转基HbICE4的拟南芥株系在低温-5℃条件下处理15h，然后正常恢复培养2周，过表达HbICE4的拟南芥株系的存活率高于55％，而对照WT的存活率仅为11％(图5)。这说明HbICE4能够提高转基因植物株系抗低温胁迫的能力。可能对橡胶树的低温胁迫抗性有很大的调控作用。

以没有转基因的正常植株为对照(WT)，用300mM的氯化钠溶液给培养4周的转基HbICE4的拟南芥株系和WT植株淋水，5天淋水一次，23℃条件下盐胁迫培养2周，结果显示对照WT植株的叶片失水干枯，部分植株已枯死，存活率为54％；但是转基HbICE4的拟南芥株系个别植株枯死，存活率为89％，未枯死的植株中个别植株已抽苔开花结果荚(图6)。说明HbICE4能够提高转基因植物株系抵抗高盐胁迫的能力。

以没有转基因的正常植株为对照(WT)，在正常条件下培养转基因HbICE4的拟南芥植株4周，然后停止淋水，即干旱处理2周，结果显示WT植株的叶片失水而枯萎，转基因HbICE4的植株还正常生长，并且已抽苔开花结果荚。然后给干旱处理的WT和转基因HbICE4的拟南芥植株淋水，正常培养8天，结果显示WT的存活率为63％，而转基因HbICE4的拟南芥植株没有枯死的现象，并且都已开花结果，存活率为100％(图7)。由此可见HbICE4能够提高转基因植物株系抵抗干旱胁迫的能力。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> 橡胶树转录因子HbICE4及其编码基因与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 338

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Met Glu Leu Ser Gln His Gly Phe Leu Glu Glu Leu Leu Gln Ala Pro

1 5 10 15

Arg Arg Asp Ser Ser Trp Ala Asn Phe Pro Ser Ala Gly Ala Asn Glu

20 25 30

Phe Phe Ser Ser Gly Trp Asn Phe Asp Ser Phe Asp Glu Asn Ala Ala

35 40 45

Asn Pro Ser Phe Ile Gly Phe Ser Thr Thr Pro Thr Glu Pro Thr Cys

50 55 60

Phe Asp Cys Pro Phe Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Phe Val Asp Gly Phe

65 70 75 80

Thr Val Pro Ala Glu Ile Asp Thr Ser Tyr Thr Thr Arg Asn Asn Asp

85 90 95

Thr Pro Pro Phe Pro Thr Gln Asp Gln Asp Tyr Pro Ser Ile Ile Glu

100 105 110

Asp Glu Glu Phe Gly Leu Leu Thr Ser His Cys Ser Tyr Glu Glu Arg

115 120 125

Ser Ser Ser Ala Cys Lys Val Glu Met Glu Gln Pro Ala Ser Asn Asp

130 135 140

Ala Gln Val Phe Ser Met Gly Leu Ser Ala Glu Lys Lys Asn Lys Ser

145 150 155 160

Lys Lys Leu Glu Gly Gln Pro Ser Lys Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg

165 170 175

Arg Arg Lys Arg Leu Asn Asp Arg Leu Ser Met Leu Arg Ser Ile Val

180 185 190

Pro Lys Ile Ser Lys Met Asp Arg Thr Ser Ile Leu Gly Asp Thr Ile

195 200 205

Asp Tyr Met Lys Glu Leu Leu Glu Arg Ile Asn Lys Leu Gln Glu Glu

210 215 220

Glu Gly Glu Glu Gly Thr Asn Glu Met Asn Leu Met Thr Asn Leu Lys

225 230 235 240

Glu Leu Lys Pro Asn Glu Val Leu Val Arg Asn Ser Pro Lys Phe Asn

245 250 255

Val Glu Arg Arg Glu Ile Asp Thr Arg Ile Asp Ile Cys Cys Ser Ala

260 265 270

Lys Pro Gly Leu Leu Leu Ser Thr Val Asn Thr Leu Glu Ala Leu Gly

275 280 285

Leu Glu Ile Gln Gln Cys Val Ile Ser Cys Phe Asn Asp Phe Ser Met

290 295 300

Gln Ala Ser Cys Ser Glu Ala Thr Glu Gln Arg Lys Leu Ile Ser Pro

305 310 315 320

Glu Asp Ile Lys Gln Ala Leu Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Gly Gly Arg

325 330 335

Cys Leu

<210> 2

<211> 1017

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

atggagctct ctcagcatgg tttcttggag gagttgcttc aagctccaag aagggacagt 60

agttgggcaa acttcccttc tgctggggct aatgagttct tctctagtgg atggaacttt 120

gattcttttg atgagaacgc agcaaatcct tcatttatag gattctccac cactccaaca 180

gaacctacct gctttgactg ccctttcagt gaccaaactt acccttttgt tgatggtttc 240

actgtacctg ctgagattga cacatcttat actaccagga ataatgatac acctccattt 300

ccaacccaag atcaagatta cccttcaatt attgaagatg aagagtttgg tcttcttaca 360

agtcactgta gttatgaaga aagatcaagt agtgcctgca aagttgagat ggaacaacca 420

gctagcaatg atgctcaggt tttcagtatg ggtttgagtg cagagaaaaa gaacaagtcc 480

aagaagttag aagggcagcc ttcaaagaat ctaatggcag aaagacggag aagaaagcgc 540

ttgaacgatc gcctttccat gctaagatca atagtcccta agatcagcaa gatggacaga 600

acttcaatac ttggagatac catagattac atgaaagaac ttcttgaaag gatcaataag 660

ctgcaagaag aagaaggtga agagggtaca aatgaaatga acttaatgac taacttgaaa 720

gagcttaagc caaatgaagt gcttgtgaga aattccccca agttcaatgt ggagaggaga 780

gagatcgata cccggatcga tatctgctgt tcagcaaagc caggattatt gctatcaaca 840

gtgaacacat tggaagcact aggtcttgag attcaacaat gtgttataag ttgcttcaat 900

gatttttcca tgcaagcatc ttgttcagag gctactgagc agagaaaact aattagtcct 960

gaagacataa agcaagcatt gtttagaact gcgggttatg gaggaagatg tctttag 1017

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

atggagctct ctcagcatgg tttc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

ctaaagacat cttcctccat aacc 24

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

aactttgatt cttttgatga gaacg 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

cactgaaagg gcagtcaaag c 21

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

gactagtatg gagctctctc agcatgg 27

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

gggtgaccct aaagacatct tcctccat 28

Claims

1.一种橡胶树转录因子HbICE4，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种橡胶树转录因子HbICE4基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，其包含原始载体和权利要求2所述的橡胶树转录因子HbICE4基因。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述原始载体为pCAMBIA1302载体质粒，SEQ ID NO:2所示核苷酸序列位于pCAMBIA1302载体质粒的Spe I和BstEⅡ两限制性内切酶位点之间。

5.如权利要求1所述的橡胶树转录因子HbICE4、或者权利要求2所述的橡胶树转录因子HbICE4基因、或者权利要求3或4所述的重组载体在提高植物耐寒性、和/或耐盐性、和/或耐旱性中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述盐为氯化钠。

7.一种提高植物耐寒性、和/或耐盐性、和/或耐旱性的方法，其特征在于，将权利要求2所述的橡胶树转录因子HbICE4基因、或者权利要求3或4所述的重组载体转染至植物。

8.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

9.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

10.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。