CN115819530B - 青蒿bHLH类转录因子AabHLH113及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青蒿bHLH类转录因子AabHLH113及其应用，所述AabHLH113的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述青蒿bHLH类转录因子AabHLH113的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；该转录因子对青蒿素生物合成关酶基因DBR2和ALDH1的启动子有显著的激活效果，能明显提高植株中的青蒿素含量；本发明还通过构建植物过表达载体在青蒿中过表达转录因子AabHLH113的编码基因，从而获得了青蒿素含量提高的青蒿新品种。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种青蒿bHLH类转录因子AabHLH113，还涉及AabHLH113在培育高青蒿素含量的青蒿新品种中的应用。
背景技术
青蒿素(Arteannuin)不仅作为抗疟疾的特效药，而且也在治疗红斑狼疮和糖尿病等其他疾病方面显示出巨大的药用潜力，因此其具有巨大的市场需求。然而，非洲和东南亚等国家和地区不仅人口众多，而且经济也相对落后，导致人们长期处于青蒿素资源短缺的困境。此外，通过化学工艺和其他生物合成获得青蒿素不仅效率低，而且生产成本高，无法量产青蒿素，这对于上述国家和地区是不切实际的。因此，如何提高青蒿中青蒿素的含量仍然是今后乃至很长一段时间内的重大问题。转录因子不仅直接或间接地调控单个基因表达，而且也可以协同调控多个基因的表达，进而影响植物的次生代谢。青蒿素的生物合成与青蒿中JA和ABA介导的信号通路显著相关。然而，同时受到这两类植物激素信号诱导直接调控青蒿素的转录因子尚未被鉴定。因此鉴定能同时受到JA和ABA双激素诱导的关键转录因子的生物学功能，不仅能应用该转录因子整合JA和ABA信号直接调控青蒿素的生物合成，而且为培育青蒿素高含量的新品种和规模化生产具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种青蒿bHLH类转录因子AabHLH113；本发明的目的之二在于提供一种青蒿bHLH类转录因子AabHLH113的编码基因；本发明的目的之三在于提供含有所述转录因子AabHLH113编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌株；本发明的目的之四在于提供所述转录因子AabHLH113的编码基因在培育高青蒿素含量的青蒿新品种中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种青蒿bHLH类转录因子，命名为AabHLH113，所述AabHLH113的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2、所述青蒿bHLH类转录因子AabHLH113的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3、含有所述转录因子AabHLH113编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌株。
4、所述转录因子AabHLH113的编码基因在培育高青蒿素含量的青蒿新品种中的应用，通过在青蒿中过表达所述转录因子AabHLH113的编码基因，从而激活青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子来实现。
本发明优选的，具体包括以下步骤：
步骤一、将所述转录因子AabHLH113的编码基因序列插入到植物表达载体pHB-FLAG，构建植物过表达载体pHB-FLAG-AabHLH113；
步骤二、将如上步骤一中所述的植物过表达载体pHB-FLAG-AabHLH113转入宿主菌株农杆菌EHA105中，获得含有植物过表达载体的工程菌株，通过农杆菌介导转化后获得再生青蒿植株；
步骤三、筛选步骤二中所述的再生青蒿植株，得到青蒿素含量显著提高的过表达转基因植株。
本发明优选的，步骤一中，转录因子AabHLH113的编码基因序列通过PstI和XbaI限制性内切酶位点插入到植物表达载体pHB-FLAG上。
本发明优选的，步骤二中，所述转入宿主菌株农杆菌的方法为冻融法。
本发明优选的，步骤三中，所述筛选为采用抗生素筛选，所述抗生素选用潮霉素。
本发明优选的，步骤三中，所述筛选还包括PCR检测，PCR检测的引物为SEQ IDNO.1所示的正向检测引物和SEQ ID NO.12所示的反向检测引物。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明克隆了转录因子AabHLH113的编码基因的序列，该转录因子对青蒿素生物合成关酶基因DBR2和ALDH1的启动子有显著的激活效果，能明显提高植株中的青蒿素含量；
(2)本发明构建了青蒿转录因子AabHLH113的植物调控表达载体，实现对青蒿素含量的提高的调控；
(3)本发明提供了含有转录因子AabHLH113的植物过表达载体的青蒿素含量提高的转基因青蒿植株，为培育青蒿素高含量的新品种和规模化生产具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为AabHLH113转基因青蒿植株的基因表达量检测图和青蒿素含量图(A:AabHLH113基因在过表达AabHLH113转基因青蒿和野生型青蒿中的相对表达量；B:AabHLH113基因在过表达AabHLH113转基因青蒿和野生型青蒿中的青蒿素含量)；
图2为烟草瞬时转化AabHLH113显著增强DBR2基因启动子和ALDH1基因启动子的双荧光素酶活性示意图(A：AabHLH113激活DBR2基因启动子的双荧光素酶活性；B：AabHLH113激活ALDH1基因启动子的双荧光素酶活性)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、青蒿中编码转录因子AabHLH113的基因的克隆
提取青蒿RNA，反转为cDNA，根据青蒿基因组设计PCR扩增引物：
上游引物为：5’-ATGCACCAACCAAACAGTCAA-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物为：5’-TTACAAGCATCTGCCTCCATAACC-3’(SEQ ID NO.2)；
PCR扩增条件为：98℃预变性1分钟；98℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸60秒，共32个循环；最后72℃延伸2分钟，获得编码转录因子AabHLH113的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO.4所示。
实施例2、含AabHLH113基因的植物表达载体的构建
一、植物调控表达载体pHB-YFP-AabHLH113的构建
根据获得的AabHLH113基因序列，分析其编码区和pHB-YFP载体上的酶切位点，并选择XhoI和XbaI作为载体构建的限制性内切酶位点，在全长AabHLH113的上游引入XhoI酶切位点，在全长AabHLH113的下游引入XbaI酶切位点，引物序列如下：
AabHLH113-F-XhoI：5’-gcctcgagATGCACCAACCAAACAGTCAA-3’(SEQ ID NO.5)
AabHLH113-R-XbaI：5’-gctctagaTTACAAGCATCTGCCTCCATAACC-3’(SEQ ID NO.6)
二、植物过表达载体pHB-Flag-AabHLH113的构建
根据获得的AabHLH113基因序列，分析其编码区和pHB-FLAG载体(pHB-FLAG载体由pHB-AaTCP14-Flag通过酶切去AaTCP14基因而得，pHB-AaTCP14-Flag见文献：YA-NANMA.Jasmonate promotes artemisinin biosynthesis by activating the TCP14-ORAcomplex in Artemisia annua.PLANT SCIENCES.2018)上的酶切位点，并选择PstI和XbaI作为载体构建的限制性内切酶位点，在全长AabHLH113的上游引入PstI酶切位点，在全长AabHLH113的下游引入XbaI酶切位点，引物序列如下：
AabHLH113-F-PstI：5’-gcctgcagATGCACCAACCAAACAGTCAA-3’(SEQ ID NO.7)
AabHLH113-R-XbaI：5’-gctctagaTTACAAGCATCTGCCTCCATAACC-3’(SEQ ID NO.6)
实施例3、青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1启动子双荧光素酶报告载体的构建
PCR扩增青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1启动子根据NCBI数据库中青蒿的DBR2启动子(GeneBank:KC118523)的序列信息和ALDH1启动子(GeneBank:KU214890)的序列信息，分别设计DBR2和ALDH1基因启动子扩增特异性引物。
正反DBR2启动子特异性引物分别含有KpnI和XhoI酶切位点，引物序列如下：
ProDBR2-F-KpnI：5’-gcggtaccTTCCCCAATGGGTTGGTCTAA-3’(SEQ ID NO.8)
ProDBR2-F-XhoI：5’-gcctcgagTTTGATGTTGACCAGGATCAAGAT-3’(SEQ ID NO.9)
正反ALDH1启动子特异性引物分别含有KpnI和XhoI酶切位点，引物序列如下：
ProALDH1-F-KpnI：5’-gcggtaccAAGGGAAGGAGTATTATACTATTAGATTGAGAT-3’(SEQID NO.10)
ProALDH1-F-XhoI：5’-gcctcgagAGGGTCGAATGATGACTTAAGGCT-3’(SEQ ID NO.11)
以青蒿基因组DNA为模板，PCR扩增上述2个启动子片段，回收纯化。
将启动子片段插入双荧光素酶报告载体。将上述PCR产物和pGreenII 0800-LUC载体分别用KpnI和XhoI双酶切后，回收酶切的PCR产物片段和酶切的载体片段，用T4连接酶构建植物双荧光素酶检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2-LUC和pGreenII0800-ProALDH1-LUC。
实施例4、烟草瞬时转化，检测转录因子AabHLH113对DBR2和ALDH1启动子的激活效果。
一、工程菌株GV3101农杆菌的获得
将pHB-YFP空载体和实施实例2中的植物调控表达载体pHB-YFP-AabHLH113采用冻融法转入工程菌株农杆菌GV3101中，并将实施实例3中的植物双荧光素酶检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2-LUC和pGreenII0800-ProALDH1-LUC采用冻融法转入所述工程菌株为带pSoup19辅助质粒的农杆菌GV3101菌株中，分别获得含有空载体、AabHLH113基因和DBR2、ALDH1基因启动子的工程菌株。
二、瞬时转化烟草
将上述4个工程菌株的阳性菌株分别接种在包含5mg/L利福平(Rif)+20mg/L庆大霉素(Gen)+50mg/L卡那霉素(Kan)的5mlYEP液体培养基中，28℃，220转/分钟，过夜培养；4000转/分钟离心10分钟收集菌体；用MS液体培养基将菌体重悬后，调整菌液OD600值为0.6，加入200mmol/L的乙酰丁香酮(AS)和10mmol/L的MES(PH＝5.8)，将混合后的农杆菌菌液置于28℃静止3h。
将含有植物调控表达载体pHB-YFP-AabHLH113和pHB-YFP空载体的工程菌株分别与含有植物双荧光素酶检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2-LUC和pGreenII0800-ProALDH1-LUC的工程菌株按1：1比例混合后，通过注射侵染的方式注射到生长35天的烟草叶片中。将烟草叶片在黑暗下培养48h。
取烟草叶片后用液氮速冻后研磨成粉。使用Promega公司的Dual-Luciferase检测试剂盒检测荧光强度，按Promega公司说明书的方法操作。
结果如图1所示AabHLH113显著增强DBR2和ALDH1基因启动子的相对荧光素酶活性,其中图1，A为AabHLH113激活DBR2基因启动子的相对荧光素酶活性；图1，B为AabHLH113激活ALDH1基因启动子的相对荧光素酶活性，说明青蒿bHLH类转录因子AabHLH113能正向调控青蒿素的生物合成。
实施例5、过表达AabHLH113基因的转基因青蒿的获得及其青蒿素含量的测定
一、青蒿无菌苗的萌发
用75％的乙醇浸泡青蒿种子1分钟，再用20％的次氯酸钠侵泡20分钟，无菌水冲洗3-4，吸去多余的水将种子平铺于MS固体培养基上，黑暗4℃春化48h，放于25℃、16h/8h(光照/黑暗)培养25天左右，剪取第一对真叶用于转化。
二、青蒿的遗传转化
将实施实例2中植物过表达载体pHB-Flag-AabHLH113采用冻融法转入工程菌株农杆菌EHA105中；在抗性板(Rif+Kan)上进行筛选，挑取单克隆菌斑进行PCR检测获得阳性菌种；在250m三角瓶中加入50mL YEP(Rif+Kan)液，在28℃，200rpm，过夜培养；待工程菌的菌液浓度培养至OD600为0.6左右时，4000rpm，离心5min，收集菌体。菌体沉淀用1/2MS液体培养基重悬至OD600为0.3-0.5，28℃，200rpm培养30min；将培养好的菌液侵染青蒿叶片外植体20min，平铺于MS板(MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L)上。25℃，暗培养2d，2d后将其转至分化板(MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L+Hygr)上。每隔10天更换一次筛选培养基，一个月后，大量的丛生芽从分化培养基板上长起；将丛生芽剪下，依次转到壮苗培养基和生根培养基上，直到形成一颗完整的植株；将生根的青蒿植株移栽到土中生长。
三、转基因青蒿植株PCR检测
根据AabHLH113的基因序列和植物pHB-FLAG载体序列分别设计正向检测引物和反向检测引物，引物序列如下：
AabHLH113-F:5’-ATGCACCAACCAAACAGTCAA-3’(SEQ ID NO.1)
Rbcs-R:5’-TCAGTAGGATTCTGGTGTGTG-3’(SEQ ID NO.12)
根据AabHLH113的基因序列设计荧光定量PCR检测引物检测转基因青蒿植株中AabHLH113基因的表达量，引物序列如下：
AabHLH113-qF:5’-CGATCAATGATAAGTTGTGAAGAGA-3’(SEQ ID NO.13)
AabHLH113-qR:5’-TTAACAATCCATCATCTCCTAAAGC-3’(SEQ ID NO.14)
四、转基因青蒿中青蒿素的提取
将生长时间大约3个月左右的转基因青蒿整株取下放入40℃烘箱中，过夜烘干至恒重。然后将烘干后的青蒿取下所有叶片并磨成粉末。称取干重约0.2g的干粉放置于50ml的离心管中，加入25ml石油醚用80Hz在50℃中超声40分钟；用滤纸过滤收集于50ml小烧杯中；再用25ml石油醚清洗滤渣，再次收集于相同烧杯中。将液体倒入100ml蒸发瓶中，在50℃水浴中减压旋转蒸发至石油醚完全蒸干；用1mlHPLC级甲醇溶解转移至1.5ml离心管中；12000转/分钟离心10分钟；用0.25mm的滤头过滤转移至进样瓶中。
五、青蒿素的含量测定
HPLC仪器为SPD20A系统控制器，蒸发光蒸发光散射检测器(Evaporative Light-Scattering Detector，ELSD)。使用Waters C18色谱柱，流动相：乙腈和水，体积比60％∶40％，流速：1mL/min；ELSD检测系统为water alliance 2420，蒸发光散射检测器漂移管温度为40℃，载气压力5bar；标准样品进样20mL，每个样品进样20mL，重复3次进样。青蒿素标准品的出峰时间为8.345min，样品的保留时间为8.295min，根据标准品的浓度和峰面积计算出样品中的青蒿素的含量，再除以青蒿粉末干重，从而计算出青蒿素占样品干重的含量。
结果如图2所示，过表达AabHLH113基因的转基因青蒿中AabHLH113的基因表达量显著提高，青蒿素的含量也显著提高，且均差异显著。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (6)
1.青蒿bHLH类转录因子在培育高青蒿素含量的青蒿新品种中的应用，其特征在于：通过在青蒿中过表达如SEQ ID NO.3所示的AabHLH113编码基因，从而激活青蒿素生物合成途径关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子来实现。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一、将所述AabHLH113的编码基因序列插入到植物表达载体pHB-FLAG，构建植物过表达载体pHB-FLAG-AabHLH113；
步骤二、将如上步骤一中所述的植物过表达载体pHB-FLAG-AabHLH113转入宿主菌株农杆菌EHA105中，获得含有植物过表达载体的工程菌株，通过农杆菌介导转化后获得再生青蒿植株；
步骤三、筛选步骤二中所述的再生青蒿植株，得到青蒿素含量显著提高的过表达转基因植株。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤一中，AabHLH113的编码基因序列通过PstI和XbaI限制性内切酶位点插入到植物表达载体pHB-FLAG上。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤二中，所述转入宿主菌株农杆菌的方法为冻融法。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤三中，所述筛选为采用抗生素筛选，所述抗生素选用潮霉素。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤三中，所述筛选还包括PCR检测，PCR检测的引物为SEQ ID NO.1所示的正向检测引物和SEQ ID NO.12所示的反向检测引物。
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