CN111996197A

CN111996197A - 一种杜梨耐盐基因、蛋白及重组载体和应用

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Publication number: CN111996197A
Application number: CN202010783793.4A
Authority: CN
Inventors: 黄小三; 董慧珍; 王春孟; 乔清海; 张绍铃; 陈启明; 马明; 陈紫龄; 谢智华; 吴巨友; 齐开杰; 陶书田
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN111996197B

Abstract

本发明公开了一种杜梨耐盐基因、蛋白及重组载体和应用，涉及基因工程技术领域。本发明所述耐盐基因PbbHLH67的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明将该基因构建超表达载体和沉默载体，通过农杆菌介导的遗传转化分别使其在拟南芥中稳定遗传和在杜梨中瞬时转化表达，对获得的阳性植株苗进行耐盐功能验证。结果显示，PbbHLH67基因能够有效的增加植株的耐盐性。该基因的发现，为植物抗逆分子育种提供了新的基因资源，为我国乃至世界盐碱地植物培育提供参考，有利于提高我国盐碱地利用率。

Description

一种杜梨耐盐基因、蛋白及重组载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种杜梨耐盐基因、蛋白及重组载体和应用。

背景技术

梨作为世界主栽果树之一，在中国其种植面积和产量仅次于苹果和柑橘，出口量占世界第一，是我国重要的果树经济作物。我国梨的栽培品种丰富，主要涉及白梨、西洋梨、砂梨、秋子梨，多分布在中国华北、东北、西北及长江流域地区，其中白梨、砂梨、秋子梨都原产于中国，我国是梨属植物中心发源地之一。因其拥有广泛的栽培地域，导致梨在生长发育的过程中经常遭受环境因素的影响，如干旱、低温和盐碱等。因此，是否能培育出优良的抗逆新品种便成为了梨产业发展最至关重要的因素。梨属于蔷薇科多年生木本果树，其生长周期长且具有自交不亲和的特点，因此用传统的育种方法不能高效的获得优良品种。所以，如何快速获得抗逆梨品种并快速应用于生产，成为当前育种学家们的又一重要难题。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，挖掘抗性基因从而快速培育梨抗逆新品种成为一种必不可少的技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种杜梨耐盐基因、蛋白及重组载体和应用，所述PbbHLH67基因具有增强植物抵御盐害的功能，将PbbHLH67 在植物中超表达，能有效提高植物的抗盐性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种杜梨耐盐基因PbbHLH67，所述耐盐基因PbbHLH67 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述耐盐基因PbbHLH67的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种扩增上述耐盐基因PbbHLH67的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种包括上述耐盐基因PbbHLH67的重组载体，所述重组载体以PCMBIA1300为基础载体，所述耐盐基因PbbHLH67位于所述基础载体的XbaI和BamHI多克隆位点之间。

本发明还提供了上述耐盐基因PbbHLH67或上述引物对或上述重组载体在调节植物耐盐性中的应用。

优选的，所述调节包括提高。

本发明还提供了上述耐盐基因PbbHLH67或上述引物对或上述重组载体在培育耐盐植物株系中的应用。

优选的，所述植物包括拟南芥或杜梨。

本发明提供了一种杜梨耐盐基因PbbHLH67，将杜梨实生苗置于盐胁迫环境中，随着盐胁迫时间的延长，所述耐盐基因PbbHLH67的表达量相应升高，表明所述耐盐基因PbbHLH67响应盐胁迫处理，具有调控抗盐功能。

本发明分别构建了所述耐盐基因PbbHLH67的超表达载体和敲除载体，并稳定转化拟南芥和瞬时转化杜梨，并对获得拟南芥超表达株系和杜梨基因沉默株系进行了盐处理。结果发现：超表达株系的电导率和丙二醛含量较野生型(WT)显著降低，叶绿素含量较野生型显著升高。与野生型相比，超表达株系含有更高的钠离子，更低的钾离子和钠钾比，且抗坏血酸的含量增加。与此同时，超表达株系中的过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O₂ ^-)的含量活性均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。而 VIGS介导的PbbHLH67沉默杜梨株系中测定的过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O₂ ^-)的含量均比野生型要高，其他生理生化结果均与超表达拟南芥株系相反。这些结果表明，超表达的PbbHLH67基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的耐盐性。

附图说明

图1为本发明的技术流程示意图；

图2为PbbHLH67基因在盐、ABA、低温和干旱胁迫下的时间表达模式图；其中，A为PbbHLH67盐胁迫下的时间表达谱；B为PbbHLH67在ABA处理下的时间表达模式；C为PbbHLH67在低温处理下的时间表达模式；D为 PbbHLH67在干旱处理下的时间表达模式；

图3为PbbHLH67基因亚细胞定位图；

图4为转PbbHLH67拟南芥鉴定及半定量分析示意图，其中A为阳性苗鉴定结果，B为转基因拟南芥株系PbbHLH67表达量；

图5为VIGS材料半定量RT-PCR鉴定分析示意图；

图6为PbbHLH67超表达株系与野生型(WT)在氯化钠处理前后的表型和生理指标测定，其中A是100mM氯化钠处理14天前和处理14天后的表型； B是100mM氯化钠处理14天前和处理14天后的荧光叶绿素表型；C是100mM 氯化钠处理14天后的荧光叶绿素测定结果；D～E是100mM氯化钠处理14天后的叶绿素测定(D)及叶绿素提取(E)；F是100mM氯化钠处理14天后的电导率测定结果；G是100mM氯化钠处理14天后的丙二醛测定；

图7为杜梨干涉PbbHLH67基因株系抗盐分析示意图，其中A是生长正常生长的盆栽植株(处理前)和500mM氯化钠浇15天的表型，B是生长正常生长的盆栽植株(处理前)和500mM氯化钠浇15天的荧光叶绿素表型，C是500 mM氯化钠浇15天荧光叶绿素测定结果，D～E是500mM氯化钠浇15天叶绿素测定(D)及叶绿素提取(E)；F是500mM氯化钠浇15天电导率测定结果， G是500mM氯化钠浇15天丙二醛测定；

图8为PbbHLH67超表达拟南芥株系和干涉杜梨幼苗中Na⁺和K⁺含量，其中A是100mM氯化钠处理14d后Na⁺测定结果，B是100mM氯化钠处理14d后 K⁺测定结果，C是100mM氯化钠处理14d后Na⁺/K⁺测定结果，D是干涉杜梨植株在500mM氯化钠处理14d后Na⁺测定结果，E是干涉杜梨植株在500mM 氯化钠处理14d后K⁺测定结果，F是基因沉默的杜梨植株在500mM氯化钠处理14d后Na⁺/K⁺测定结果；

图9为PbbHLH67超表达拟南芥株系和干涉杜梨幼苗的组织化学染色，其中A和B是30天大的拟南芥植株在100mM氯化钠处理14d前后野生型和超表达株系采用二氨基联苯胺(DAB)和硝基四氮唑(NBT)分别对H₂O₂(A) 和O₂ ^-(B)进行染色，C和D是拟南芥植株在100mM氯化钠处理14d后野生型和超表达株系过氧化氢(C)和超氧阴离子(D)的测定，E和F是干涉的杜梨植株在500mM氯化钠处理15d前后未沉默基因植株和三个沉默基因株系活性氧组织化学染色，G和H是VIGS介导的杜梨植株在500mM氯化钠处理15d 前后未沉默基因植株和三个沉默基因株系过氧化氢(G)和超氧阴离子(H) 的测定；

图10为PbbHLH67超表达拟南芥株系和干涉杜梨幼苗中抗坏血酸含量，其中A是100mM氯化钠处理14d后AsA的测定结果，B是100mM氯化钠处理 14d后DHA测定结果，C是100mM氯化钠处理14d后总AsA测定结果，D是 100mM氯化钠处理14d后AsA/DHA测定结果，E是基因沉默的杜梨植株在 500mM氯化钠处理14d后AsA的测定结果，F是基因沉默的杜梨植株在500 mM氯化钠处理14d后DHA测定结果，G是基因沉默的杜梨植株在500mM氯化钠处理14d后总AsA测定结果，H是基因沉默的杜梨植株在500mM氯化钠处理14d后AsA/DHA测定结果。

具体实施方式

本发明提供了一种杜梨耐盐基因PbbHLH67，所述耐盐基因PbbHLH67 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述耐盐基因为来源于杜梨的碱性螺旋-环-螺旋转录因子，能够增加抗坏血酸的含量，同时能够提高植物体清除ROS的能力，从而说明这个基因具有抗盐的功能。

本发明还提供了上述耐盐基因PbbHLH67的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述耐盐基因PbbHLH67共编码 569个氨基酸，蛋白大小为61.84KDa，等电位点为7.14。

本发明还提供了一种扩增上述耐盐基因PbbHLH67的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ATGGAGAATGATTTTTTCCTAAATGC，所述下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示：GAGCTCAATTTTCATGTGCGATAC。本发明对利用所述引物对扩增所述耐盐基因PbbHLH67的方法并没有特殊限定，优选通过 PCR扩增，所述PCR扩增的程序优选包括94℃预变性3min；94℃变性30s， 58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。

本发明还提供了一种包括上述耐盐基因PbbHLH67的重组载体，所述重组载体以PCMBIA1300为基础载体，所述耐盐基因PbbHLH67位于所述基础载体的XbaI和BamHI多克隆位点之间。本发明对所述重组载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规构建方法即可。

本发明所述调节优选为上调或提高，本发明将所述的耐盐基因 PbbHLH67在植物中过表达，得到的超表达植株具有耐盐能力，将所述 PbbHLH67基因通过VIGS介导使之在杜梨中沉默，所得干涉植物耐盐减弱，表明所述耐盐基因PbbHLH67在可提高植物的耐盐性。本发明所述植物优选包括拟南芥或杜梨。

本发明还提供了上述耐盐基因PbbHLH67或上述引物对或上述重组载体在提高植物耐盐性中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了上述耐盐基因PbbHLH67或上述引物对或上述重组载体在培育耐盐植物株系中的应用。本发明所述耐盐植物株系的耐盐浓度优选不高于500mmol/L，且耐盐的盐离子优选包括Na⁺或K⁺。本发明所述植物包括优选拟南芥或杜梨。

下面结合实施例对本发明提供的一种杜梨耐盐基因、蛋白及重组载体和应用，进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

杜梨PbbHLH67基因全长cDNA的克隆

采用高效的酵母表达体系，从杜梨中筛选到一个碱性螺旋-环-螺旋转录因子PbbHLH67，根据PbbHLH67基因的序列设计引物(SEQ ID NO.3：ATGGAGAATGATTTTTTCCTAAATGC，SEQ ID NO.4： GAGCTCAATTTTCATGTGCGATAC)，用RT-PCR方法从杜梨上扩出其全长。详细步骤如下：取杜梨RNA 1μg经1U的DNaseI 37℃处理30min后立即放入冰上，加入1μL 50mM EDTA 65℃处理10min后立即置于冰上。 cDNA第一链的合成参照全是金反转录试剂盒的操作手册进行。所得的第一链cDNA用于PbbHLH67基因的扩增。PCR按以下程序完成：94℃预变性3 min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸 10min。扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒按照使用说明提取步骤，回收特异目的条带。

回收纯化的溶液与Peasy-Blut载体进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为4:1连接。反应总体积是5μL，其中4μL的PCR纯化的产物，1μL 载体。25℃连接30min，采用热击法转化到大肠杆菌感受态DH5α中，以目的基因序列引物进行PCR验证并测序(由上海英潍捷基公司完成)。

生物信息学分析cDNA序列显示，PbbHLH67基因全长(SEQ ID NO.1) 1710bp，包括编码阅读框编码569个氨基酸(SEQ ID NO.2)，等电点为7.14，预测的分子量为61.84KDa。

实施例2

不同逆境条件处理下PbbHLH67基因的qRT-PCR分析

为了分析杜梨中PbbHLH67基因对低温、ABA、高盐和干旱的响应模式，使用Real-time PCR技术对PbbHLH67基因的表达模式进行分析。采用CTAB 法提取RNA，DNA第一链的合成参照TOYOBO反转录试剂盒的操作手册进行。在20μL的反应体系中有：10μL 2×Mix，0.1μL cDNA，5μL引物(以 Tubulin为内参引物(SEQ ID NO.7：TGGGCTTTGCTCCTCTTAC，SEQ IDNO.8：CCTTCGTGCTCATCTTACC)，长度为208，4.9μL水)。其中针对 PbbHLH67基因设计的引物包括：

SEQ ID NO.5：CCCCTTGGATAATACCTCACC；

SEQ ID NO.6：TTCACCAAATGCTGGAAACTG。

定量PCR的程序为：95℃预变性3min；95℃变性3s，60℃退火10s， 72℃延伸30s，45个循环；72℃延伸5min。

结果如图2所示，随着盐处理时间的延长，PbbHLH67基因在12h内的表达量呈现递增的趋势。同时在ABA、低温和干旱处理后该基因的表达量也随时间延长出现先升高后降低的变化趋势。这表明所述编码基因受盐胁迫的响应，使杜梨实现耐盐功能。

实施例3

PbbHLH67的编码基因的亚细胞定位

根据PbbHLH67核苷酸序列和pJIT166-GFP载体图，在基因序列前后分别加入XbaI和BamHI酶切位点。将测序结果正确的目的基因提取质粒作为模板，用加入酶切位点的引物(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)扩增，所用 PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火60s，72℃延伸 90s，35个循环；72℃延伸10min。基因3′去除了终止密码子TAG，目的是让基因与GFP融合表达。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条带。用XbaI和BamHI限制性内切酶对pJIT166-GFP载体质粒进行酶切，37℃酶切4小时后纯化回收。酶切过后的pJIT166-GFP载体与凝胶回收PbbHLH67片段经重组连接酶连接，37℃连接30min，转化至大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈阳性的菌液送至公司测序，提取测序结果正确菌液的质粒，将得到的重组载体命名为PbbHLH67-GFP。重组的PbbHLH67-GFP载体质粒转化至含农杆菌感受态 GV3101中。

农杆菌介导瞬时转化烟草：分别挑取农杆菌PbbHLH67-GFP、GFP和 P19单克隆于LB培养基中活化培养，28℃，220rpm培养过夜。取10μL的过夜培养物转接到5mL LB-MES培养基中，并加入2μL 100mM乙酰丁香酮，28℃，220rpm过夜培养16h。收集菌液，用10mMMgCl₂重悬目的基因菌液(PbbHLH67-GFP和GFP)和P19，OD₆₀₀值分别为1和0.7时，分别将目的基因菌液和P19菌液等体积混合。按照1:500比列将乙酰丁香酮加入混好的菌液中，室温避光放置3h。选择生长状态好，叶面平整的叶片进行注射，注射后避光处理12h，转化正常环境下生长，2～3天后观察验证结果，期间保证水分供应。

结果如图3所示，GFP对照绿色荧光分布在整个细胞，PbbHLH67绿色荧光只分布在细胞核中，表明该蛋白亚细胞定位在细胞核。

实施例4

拟南芥的遗传转化

1.植物转化载体构建

根据PCMBIA1300载体的多克隆位点和PbbHLH67基因的编码区序列，加入酶切位点XbaI和BamHI设计基因的上、下游PCR引物(SEQ ID NO.9： gagaacacgggggactctagaATGGAGAATGATTTTTTCCTAAATGC；SEQ ID NO.10：gcccttgctcaccatggatccGAGCTCAATTTTCATGTGCGATAC)。以 PbbHLH67基因的质粒为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为58℃， PCR反应体系及扩增程序与PbbHLH67基因克隆相同。在扩增过后进行胶纯化回收。PCMBIA1300载体双酶切反应体积为40μL，其中：有PCMBIA1300 的载体质粒10μL，10×M缓冲液4μL，XbaI及BamHI各1μL，加双蒸水 24μL。放置于37℃酶切3～4h后纯化回收。在连接反应体系中加入PbbHLH67基因与载体PCMBIA1300的摩尔比为2:1，反应总体积为10μL。其中含有：10×buffer 1μL，DNA重组酶1μL，双酶切回收的PbbHLH67基因4μL，双酶切回收的PCMBIA1300载体产物2μL，双蒸水2μL，在37℃ 反应30min得到连接产物。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L 的卡那霉素的LB固体平板中培养16h。将筛选出的阳性克隆挑点后摇菌，抽提质粒进行PCR鉴定，测序确定没有编码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名P1300-PbbHLH67。

2.农杆菌介导的拟南芥遗传转化步骤如下：

(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB的平板上划线，置于28℃培养箱培养36～48h，刮取划线菌斑，加入液体MS(2.37g/L MS+50g/L蔗糖+0.1 mg/L IBA，pH＝5.8)培养基中，28℃转30min振荡培养，菌液浓度达到 OD₆₀₀＝0.8～1.0时加入表面活性剂sweet 77 200μl/L作浸染。

(2)浸染：选取30d左右苗龄，主花序结荚，次花序约2～10cm长，有少量花开，生长健壮的野生型拟南芥植株进行遗传转化。转化前将已开花序剪掉，然后倒置于含有制备好的根癌农杆菌菌液的玻璃瓶中，抽真空，维持0.05Mpa压力5min，避光侧放24小时。

(3)培养：按常规方法培育植株至结实，收获成熟种子(T0代)。

3.转基因阳性苗的的筛选

按照上述方法得到转PbbHLH67基因拟南芥T0代种子，将T0代种子表面灭菌，均匀的散布于含50mg/L潮霉素和50mg/L特美汀的MS选择培养基上，置于22℃光照培养，生长一周后挑选生长快根长较长的植株，移栽至灭菌的营养土中，生长一段时间。

3.1转基因拟南芥DNA提取

按照上述方法得到转PbbHLH6基因拟南芥，每株拟南芥提取DNA，设计基因引物进行PCR扩增鉴定阳性苗，其中基因引物为SEQ ID NO.11： CTGCATACTCGTCTGAGATCCGAGTGCC；

SEQ ID NO.12：CGTCGTCCTTGAAGAAGATG。

(1)取拟南芥叶片0.1g放入2mL离心管液氮中充分研磨后加入500μL CTAB溶液(65℃预热)。

(2)65℃恒温水浴30min，每隔10min上下颠倒一次。

(3)水浴结束后冷却至室温，在通风橱中加入500μL三氯甲烷，上下颠倒混匀，12000rpm室温离心10min。

(4)离心后上清液转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇溶液，上下颠倒混匀，12000rpm室温离心10min。

(5)离心后管底有白色絮状沉淀出现，小心倒掉上清，加入1mL75％无水乙醇清洗2次，重悬沉淀，12000rpm离心1min。

(6)小心弃上清，待酒精挥发完全后加入50μL ddH₂O，65℃恒温烘箱放置30min，待沉淀完全溶解。

3.2阳性转基因植株检测

采用基因特异性引物进行PCR扩增。采用基因上游引物和载体下游引物(SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12)进行PCR：

PCR反应体系：模板DNA 1μL，PCR Buffer2μL，dNTD Mix(2.5 mmol/L)1.6μL，引物各1μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.2μL，无核酶水 13.2μL；

PCR程序：94℃预变性3min；94℃变性3s，58℃退火30s，72℃延伸 30s，35个循环；72℃延伸5min。

在选取的转基因株系中能扩增出预期大小的片段的，表明它们为阳性转基因株系，通过农杆菌介导方法在拟南芥中表达PbbHLH67。通过分子遗传分析，鉴定得到了单拷贝纯合插入、从T1-T2代均稳定表达PbbHLH67的转基因拟南芥，因此表型性状能够稳定遗传。插入位点分析证明分别PbbHLH67 转基因材料的表型变化不是由转基因操作影响其他基因而引起的。因此该转基因材料为本项目的研究提供了材料保障。利用PCR鉴定T0代转基因植物如图4中A所示，得到转基因拟南芥株系7株；利用RT-PCR鉴定T1代转基因植物如图4中B所示，最终得到三个超表达系OE1、OE5和OE6是三个超表达系。

实施例5

杜梨幼苗的瞬时转化

1.病毒诱导基因沉默载体构建

按照实施例4的方法构建病毒沉默载体。病毒沉默载体载体pTRV2双酶切位点为XbaI和SacI，按照引物设计原则设计上、下游引物(SEQ ID NO.13：aaggttaccgaattctctagaATGGAGAATGATTTTTTCCTAAA；SEQ ID NO.14：ggcctcgagacgcgtgagctcTTCTTTCTTCAAATGGTGATCC)将 PbbHLH67基因扩增并插入至该载体上的两个酶切位点中间，得到重组载体pTRV2-PbbHLH67，并转入农杆菌GV3101感受态中。

2.病毒诱导杜梨幼苗基因沉默

(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB液体培养基中28℃，220rpm振荡培养12h。将培养后的菌液6000g离心10min收集菌体，用侵染液(10mM MgCl₂、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH5.6)重悬沉淀，至浓度达到 OD₆₀₀＝0.8～1.0；

(2)菌液诱导：将调好OD值的菌液放在黑暗条件下，100rpm常温诱导4h；

(3)梨苗注射：pTRV1和pTRV2菌液按照1:1比例混合作为对照组， pTRV1和pTRV2-PbbHLH67菌液按照1:1比例混合作为实验组，分别注射苗龄45天，生长状况一致且健康状况良好的杜梨实生苗幼苗。

3.VIGS材料鉴定

将注射完成后的梨苗在常温下黑暗处理12h，然后恢复正常培养3天，每个株系独立取样，提取对照组和实验组梨苗样品RNA，通过凝胶电泳检测其结构完整，利用Nanodrop测定其浓度后(浓度均在200～1000ng/μl)，将 RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA，再用梨的Tubulin作为内参进行扩增。Tubulin引物核苷酸序列为：

Tubulin正向引物：5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’(SEQ ID NO.7)

Tubulin反向引物：5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’(SEQ ID NO.8)

用Tubulin扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，然后用PbbHLH67特异引物和梨内参引物Tubulin进行RT-PCR检测，分析待检测株系的表达量，PbbHLH67特异引物核苷酸序列为：

正向引物：5’-ATGGAGAATGATTTTTTCCTAAA-3’(SEQ ID NO.15)

反向引物：5’-TTCTTTCTTCAAATGGTGATCC-3’(SEQ ID NO.16)。

根据PbbHLH67基因的表达量，选择表达量较低的三个植株作为病毒沉默阳性株系，命名为TRV1、TRV2和TRV3。

利用基因特异引物进行半定量RT-PCR检测基因沉默阳性植株的基因表达量，结果如图5所示，沉默阳性植株的条带要弱于野生型植株的条带，结果表明沉默杜梨幼苗的表达量明显低于对照。说明了病毒沉默杜梨幼苗阳性株系的PbbHLH67基因被沉默。

实施例6

PbbHLH67转基因植株抗盐分析

为了鉴定PbbHLH67转基因拟南芥是否和盐胁迫有关，将对照系和转基因系(T3代)进行盐胁迫处理。同一批次收到的PbbHLH67转基因系(OE1、 OE5和OE5)拟南芥种子和野生型(WT)种子灭菌处理后分别播于MS筛选培养基和常用的MS无抗培养基上，等发芽后约5天将其移栽到土里进行培养。取不同苗龄的转基因植株进行盐处理，观察其处理后的表型，测定叶绿素含量、电导率和丙二醛含量等。结果如图6所示，表明转基因株系较野生型生长状态好，三个转基因系OE1、OE5和OE5叶绿素含量分别为 4.53mg/g、5.74mg/g和3.48mg/g，电导率分别为26.07％、45.97％和32.68％，丙二醛含量为20.36nmol/g、19.45nmol/g和19.68nmol/g，而野生型的叶绿素含量、电导率和丙二醛含量为1.73mg/g、76.87％、和23.46nmol/g。结果表明转基因株系中叶绿素含量高，电导率和丙二醛含量低，能够证明PbbHLH67这个基因增强了转基因植株的抗盐性。

实施例7

pTRV-PbbHLH67转基因植株抗盐分析

为了进一步验证PbbHLH67基因对植物耐盐性的功能，将野生型和沉默株系进行一定时间盐处理。将苗龄一致生长状况良好野生型和病毒沉默阳性杜梨幼苗(TRV1，TRV2和TRV3)在相同培养条件下用500mM的氯化钠溶液浇灌15天，观察其处理后的表型，测定电导率、叶绿素和丙二醛等。结果如图7所示，基因沉默株系较对照株系生长状态弱，三个沉默株系TRV1， TRV2和TRV3叶绿素含量分别为1.58mg/g、1.63mg/g和1.25mg/g，电导率分别为65.62％、73.10％和60.35％，丙二醛含量分别为65.04nmol/g、73.62 nmol/g和59.07nmol/g，而野生型的叶绿素含量、电导率和丙二醛含量为0.88 mg/g、18.08％和43.21nmol/g。结果表明杜梨沉默株系叶绿素含量更低，电导率和丙二醛含量更高，能够证明沉默PbbHLH67这个基因降低了植物的耐盐性。

实施例8

植物细胞中Na⁺和K⁺含量测定

将处理过后的野生型植株和转基因植株去除地下部分，地上部分将样品置于烘箱中105℃杀青30min，使各个组织部位的酶失活，防止离子移动。杀青结束后将样品置于65℃烘箱中烘干至恒重，一般烘3～4天即可。烘干后的样品研磨至粉末状，称取0.05g样品于15ml离心管，加入2ml 0.5mol/l 的HCl浸提3天，然后吸出1ml HCl再加入5ml去离子水浸提一昼夜，浸提结束后吸取1ml浸提液加入去离子水定容至10ml待用。配制Na⁺、K⁺标样制作标准曲线，所用试剂为NaCl和KCl，标样浓度按需求在0～100μg/ml 之间配制。将上述浸提液和Na⁺、K⁺标样用火焰光度计进行测定。样品中 Na⁺或K⁺含量(μg/g)＝ρ*稀释倍数*总体积/测量所取的样品干重。

结果如图8所示，转基因拟南芥中OE1、OE5和OE6钠离子含量分别为1920.24mg/g、1469.16mg/g和1799.28mg/g，钾离子含量分别为451.92 mg/g、644.28mg/g和493.08mg/g，钠钾比分别为4.21、2.21和3.61，而野生型的钠离子、钾离子和钠钾比分别为2201.95mg/g、264.6mg/g和8.42。沉默株系TRV1，TRV2和TRV3中钠离子含量分别为118.96mg/g、96.48mg/g 和160.70mg/g，钾离子含量为24.787mg/g、20.921mg/g和27.29mg/g，钠钾比分别为4.81、4.62和5.89，野生型的钠离子、钾离子和钠钾比分别为68.24 mg/g、34.49mg/g和1.98。结果表明转基因株系中含有更低的Na⁺，更高的 K⁺和Na⁺/K⁺，基因沉默植株的结果正好相反，以上结果证明过表达 PbbHLH67能够更好维持细胞离子稳定，从而提高了植株的耐盐能力。

实施例9

植物中过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O₂ ^-)的测定

用DAB和NBT组织化学染色法对植株叶片进行染色并进行定量测定，检测过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O₂ ^-)的含量。

结果如图9所示，三个转基因株系OE1、OE5和OE6中过氧化氢的含量分别为850.06mmol/g、282.74mmol/g和869.97mmol/g，超氧阴离子的含量分别为500.95U/mg、762.90U/mg和538.2790U/mg，野生型株系过氧化氢和超氧阴离子的含量分别为4715.24mmol/g和417.9290U/mg。基因沉默株系 TRV1、TRV2和TRV3中过氧化氢的含量分别为429.96mmol/g、529.20 mmol/g和566.37mmol/g，超氧阴离子的含量分别为110.7190U/mg、89.4190 U/mg和70.2590U/mg，野生型株系中过氧化氢和超氧阴离子的含量分别为218.11mmol/g和124.7090U/mg。结果表明转基因株系在盐胁迫下较野生型有更低的ROS(H₂O₂和O₂ ^-)积累。基因沉默的株系结果正好相反。

实施例10

植物中抗坏血酸含量的测定

采用苏州科铭生物有限公司AsA和DHA试剂盒进行测定，实验方法如下：

AsA测定操作方法：称取约0.1g样品，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。

1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到420nm，蒸馏水调零。

2.在EP管中加入表1中所示试剂

表1试剂名称(μL)

25℃静置20min，吸取200μL加入微量石英比色皿/96孔板中，420nm 下测定各管吸光值。ΔA＝A测定-A空白。按样本质量计算AsA(μg/g鲜重) ＝(ΔA+0.018)÷0.0044×V样÷(W×V样÷V样总)＝227.27×(ΔA+0.018)÷W

DHA测定操作方法：称取约0.1g样品，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。

1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。

2.试剂二在25℃水浴锅中预热30min。

3.标准管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL标准液、160μL 预热的试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于265nm比色，记录10s和 130s的吸光值A1和A2，△A空白管＝A2-A1。

4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL上清液、160μL 预热的试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于265nm比色，记录10s和 130s的吸光值A3和A4，△A测定管＝A4-A3。按样本质量计算 DHA(nmol/g鲜重)＝[C标准液×△A测定管÷△A标准管×V标准]÷(W×V 样÷V样总)＝100×△A测定管÷△A标准管÷W。

结果如图10所示，三个转基因系OE1、OE5和OE6中AsA的含量为 39.87nmol/g、40.76nmol/g和45.64nmol/g，DHA的含量为1.44nmol/g、1.20 nmol/g和0.84nmol/g，AsA/DHA分别为27.78、34.17和56.17，野生型的 AsA的含量、DHA含量和AsA/DHA分别为29.53nmol/g、2.43nmol/g和 12.16。沉默株系TRV1、TRV2和TRV3中AsA的含量分为22.54nmol/g、 18.92nmol/g和24.64nmol/g，DHA的含量分为3.10nmol/g、4.03nmol/g和2.88nmol/g，AsA/DHA分别为7.27、4.69和8.55，野生型的AsA、DHA和 AsA/DHA含量为32.65nmol/g、2.52nmol/g和12.98。结果表明转基因拟南芥中含有更高的AsA、AsA/DHA和总AsA(AsA+DHA)，更低的DHA，基因沉默植株的结果正好相反。以上结果证明过表达PbbHLH67能够提高植物中抗坏血酸的含量，从而提高植物的耐盐性。

综合分析表明，将该基因转入拟南芥中后鉴定其功能，发现超表达株系与对照野生型相比抗盐能力有了很大提升。超表达株系中的抗坏血酸含量增加，过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O₂ ^-)的含量要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。这些结果表明，过表达的PbbHLH67 基因能够有效的增强植物体内抗坏血酸的含量以增强活性氧的清除能力，从而提高了植株的耐盐性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种杜梨耐盐基因、蛋白及重组载体和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1710

<212> DNA

<213> Pyrus betulifolia Bunge

<400> 1

atggagaatg attttttcct aaatgccgga atcccatcac cgcttctctt agaacaagca 60

tcctcaatgc cggcatggcg gtcttcattc tcgaccgccg tggacatcca ggccgctgcc 120

gtggaccaaa attgctcttt ggagcagtcc ccggactgct tctacaatcc caactgggac 180

aacaagtcaa ccgaccagaa catccacttc aaatcagccc tgagttcaat ggtgtcatct 240

ccggcggcgt ccaactccaa catctccaac gagagcttcg tgatcaggga actgatcgga 300

aagctcggaa gcatcggaaa ctccaacgat ctctcgtcac attcccagtt gttgctggga 360

attcaaaatt cttacatggg tagaaatgga aatgcaagtg ccaacacttc atgctacagc 420

accccgttga actcgccgcc caagttaaac ctgcccgttc cggatcacca tttgaagaaa 480

gaaaagcaac ccaatttagc aaactccatg gccttgaatt ccagcatggc ggatttctct 540

gccgaccctg gattcgccga gagggcggcg aagttttcat gtttcggaag caggagcttc 600

aatggcagaa catcacagct gggaacgaat aataacaaca gtactgaaca accgccgttt 660

agatcccatc ccgcagcggg aaatggcggc aagcttcctc gggtttcgag cagttcgtcg 720

attaaggcac tcggatctca gacgagtatg caggaaaaga tgcgtgctct gctgcaggat 780

cggagtgaac tccccaattc cctagaggaa tcgacgattt ctgagcagaa accaaacggg 840

gagaccaatt ccatggatat gaattctagg aaaagaaaat cagcttccaa aggaaaagca 900

aaggaccata atcctcctcc aatatcccca tctccaactt ccacaaaggg ggctgaagtt 960

aacgaaaatt ctaatgcaaa gagaagcaag ccaagtgaaa acaatgggaa tgaccaaaat 1020

gggtctgtga aagctgagga ggatgcaaag ggaagcacca gttctgatga gaagcaaacc 1080

aagactggtc caaagccacc tgagcctccc aaggattata ttcatgtaag agcaagaagg 1140

ggccaagcca ctgacagcca cagccttgct gaaagggtaa gaagagagaa gattagtgaa 1200

aggatgaagc ttcttcaaga tcttgtgcct gggtgcaaca aggtgactgg aaaagcactt 1260

atgcttgatg agattataaa ttacgtgcag tcattacaac gccaagtcga gtttctctcc 1320

atgaagttgt cttctgtgaa caccagactg gatttcaaca tggaaaccct aatgtcaaaa 1380

gagatatttc aacaaaacaa tggcttgcca cagcatccaa tattcccatc agattcctcg 1440

gcacaagcca tttatggaca ccaacgccag caaaatccag cactttctaa tggggcagtg 1500

gaccccttgg ataatacctc accgtgccaa agccttggga tgcaattacc tcctctcagt 1560

ggttttagta gtgaaggcat tcctcagttt ccagcatttg gtgaagatga tctgcatacc 1620

attgttcaga tgggttttgg ccaaaatcca accagagaat cagaattgct tggttcaaat 1680

caagtatcgc acatgaaaat tgagctctga 1710

<210> 2

<211> 569

<212> PRT

<213> Pyrus betulifolia Bunge

<400> 2

Met Glu Asn Asp Phe Phe Leu Asn Ala Gly Ile Pro Ser Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Glu Gln Ala Ser Ser Met Pro Ala Trp Arg Ser Ser Phe Ser Thr

20 25 30

Ala Val Asp Ile Gln Ala Ala Ala Val Asp Gln Asn Cys Ser Leu Glu

35 40 45

Gln Ser Pro Asp Cys Phe Tyr Asn Pro Asn Trp Asp Asn Lys Ser Thr

50 55 60

Asp Gln Asn Ile His Phe Lys Ser Ala Leu Ser Ser Met Val Ser Ser

65 70 75 80

Pro Ala Ala Ser Asn Ser Asn Ile Ser Asn Glu Ser Phe Val Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Ile Gly Lys Leu Gly Ser Ile Gly Asn Ser Asn Asp Leu Ser

100 105 110

Ser His Ser Gln Leu Leu Leu Gly Ile Gln Asn Ser Tyr Met Gly Arg

115 120 125

Asn Gly Asn Ala Ser Ala Asn Thr Ser Cys Tyr Ser Thr Pro Leu Asn

130 135 140

Ser Pro Pro Lys Leu Asn Leu Pro Val Pro Asp His His Leu Lys Lys

145 150 155 160

Glu Lys Gln Pro Asn Leu Ala Asn Ser Met Ala Leu Asn Ser Ser Met

165 170 175

Ala Asp Phe Ser Ala Asp Pro Gly Phe Ala Glu Arg Ala Ala Lys Phe

180 185 190

Ser Cys Phe Gly Ser Arg Ser Phe Asn Gly Arg Thr Ser Gln Leu Gly

195 200 205

Thr Asn Asn Asn Asn Ser Thr Glu Gln Pro Pro Phe Arg Ser His Pro

210 215 220

Ala Ala Gly Asn Gly Gly Lys Leu Pro Arg Val Ser Ser Ser Ser Ser

225 230 235 240

Ile Lys Ala Leu Gly Ser Gln Thr Ser Met Gln Glu Lys Met Arg Ala

245 250 255

Leu Leu Gln Asp Arg Ser Glu Leu Pro Asn Ser Leu Glu Glu Ser Thr

260 265 270

Ile Ser Glu Gln Lys Pro Asn Gly Glu Thr Asn Ser Met Asp Met Asn

275 280 285

Ser Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Lys Gly Lys Ala Lys Asp His Asn

290 295 300

Pro Pro Pro Ile Ser Pro Ser Pro Thr Ser Thr Lys Gly Ala Glu Val

305 310 315 320

Asn Glu Asn Ser Asn Ala Lys Arg Ser Lys Pro Ser Glu Asn Asn Gly

325 330 335

Asn Asp Gln Asn Gly Ser Val Lys Ala Glu Glu Asp Ala Lys Gly Ser

340 345 350

Thr Ser Ser Asp Glu Lys Gln Thr Lys Thr Gly Pro Lys Pro Pro Glu

355 360 365

Pro Pro Lys Asp Tyr Ile His Val Arg Ala Arg Arg Gly Gln Ala Thr

370 375 380

Asp Ser His Ser Leu Ala Glu Arg Val Arg Arg Glu Lys Ile Ser Glu

385 390 395 400

Arg Met Lys Leu Leu Gln Asp Leu Val Pro Gly Cys Asn Lys Val Thr

405 410 415

Gly Lys Ala Leu Met Leu Asp Glu Ile Ile Asn Tyr Val Gln Ser Leu

420 425 430

Gln Arg Gln Val Glu Phe Leu Ser Met Lys Leu Ser Ser Val Asn Thr

435 440 445

Arg Leu Asp Phe Asn Met Glu Thr Leu Met Ser Lys Glu Ile Phe Gln

450 455 460

Gln Asn Asn Gly Leu Pro Gln His Pro Ile Phe Pro Ser Asp Ser Ser

465 470 475 480

Ala Gln Ala Ile Tyr Gly His Gln Arg Gln Gln Asn Pro Ala Leu Ser

485 490 495

Asn Gly Ala Val Asp Pro Leu Asp Asn Thr Ser Pro Cys Gln Ser Leu

500 505 510

Gly Met Gln Leu Pro Pro Leu Ser Gly Phe Ser Ser Glu Gly Ile Pro

515 520 525

Gln Phe Pro Ala Phe Gly Glu Asp Asp Leu His Thr Ile Val Gln Met

530 535 540

Gly Phe Gly Gln Asn Pro Thr Arg Glu Ser Glu Leu Leu Gly Ser Asn

545 550 555 560

Gln Val Ser His Met Lys Ile Glu Leu

565

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagaatg attttttcct aaatgc 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagctcaatt ttcatgtgcg atac 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccccttggat aatacctcac c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcaccaaat gctggaaact g 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgggctttgc tcctcttac 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccttcgtgct catcttacc 19

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagaacacgg gggactctag aatggagaat gattttttcc taaatgc 47

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcccttgctc accatggatc cgagctcaat tttcatgtgc gatac 45

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctgcatactc gtctgagatc cgagtgcc 28

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgtcgtcctt gaagaagatg 20

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaggttaccg aattctctag aatggagaat gattttttcc taaa 44

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggcctcgaga cgcgtgagct cttctttctt caaatggtga tcc 43

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggagaatg attttttcct aaa 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttctttcttc aaatggtgat cc 22

Claims

1.一种杜梨耐盐基因PbbHLH67，其特征在于，所述耐盐基因PbbHLH67的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述耐盐基因PbbHLH67的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种扩增权利要求1所述耐盐基因PbbHLH67的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种包括权利要求1所述耐盐基因PbbHLH67的重组载体，其特征在于，所述重组载体以PCMBIA1300为基础载体，所述耐盐基因PbbHLH67位于所述基础载体的XbaI和BamHI多克隆位点之间。

5.权利要求1所述耐盐基因PbbHLH67或权利要求3所述引物对或权利要求4所述重组载体在调节植物耐盐性中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述调节包括提高。

7.权利要求1所述耐盐基因PbbHLH67或权利要求3所述引物对或权利要求4所述重组载体在培育耐盐植物株系中的应用。

8.根据权利要求5～7任一项所述应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥或杜梨。