CN113881689B - 一种苹果离子转运体MdCAX2L-1的转基因植株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种苹果离子转运体MdCAX2L‑1的转基因植株及其应用。本发明利用MdCAX2L‑1转基因获得了耐高浓度钡离子特性的转基因植株，MdCAX2L‑1的过表达能提高植株对钡离子的耐受性并且能限制钡离子往地上部的运输，降低植株地上部的钡含量。

Description

一种苹果离子转运体MdCAX2L-1的转基因植株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种苹果离子转运体MdCAX2L-1 的转基因植株及其应用。

背景技术

农田金属污染已成为一个日益严重的全球性问题，影响农作物产量和品质，并对人体产生间接危害。镉、铅、锌、铜等重金属离子因其在低浓度下具有较高的毒性而受到广泛的研究。钡不是重金属，相关研究相对较少，但是钡作为一种碱土金属却自然存在于土壤中。钡对动植物并不是一种必需的营养物质，但是高浓度的钡离子对大多数生物体都会造成有害影响，已经有一些研究报道钡离子对生物的影响。在黄瓜(Cucumis sativus L.)中，钡影响萌发和植物生长。钡对大豆的毒害作用主要表现为影响大豆植株对K⁺的吸收、气孔的开放和光合作用。不同Ba浓度下，向日葵中的叶绿素、类胡萝卜素、可溶性糖和蛋白质含量均显著降低。与其他重金属一样，高浓度的Ba也会导致植物产生大量的ROS，从而影响植物的抗氧化能力。大豆(Glycine max)暴露于Ba中，可导致的脂质过氧化(MDA)，这表明大豆ROS的产生和氧化应激的增加。SOD、 CAT和GR的变化表明Ba影响了抗氧化酶系统。在高浓度Ba处理下，向日葵的CAT、POD等抗氧化酶活性显著提高。Ba刺激黄瓜不同组织，过氧化氢酶、愈创木酚、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶的活性的变化，表明Ba处理导致了黄瓜氧化损伤的发生以及植物抗氧化防御系统的参与。综上所述，钡除了影响植物的正常生长发育外，还可引起氧化应激反应，破坏细胞膜和膜脂，产生脯氨酸、MDA和ROS，从而调动抗氧化物质和抗氧化酶系统。

虽然植物尚未进化出特异吸收Ba的机制，但由于Ba与Ca、Mg等化学元素周期表中同属于碱土金属族的元素相似，所以Ba仍可被植物吸收。据报道，栽培植物在高钡土壤中吸收Ba。Ba在气生植物组织中可积累到有显著差异的浓度。在营养培养条件下，坦桑尼亚麦草(Panicum maximum)的临界Ba浓度为156～383mg/kg。同样，巴氏干果(Bertholletiaexcelsia)地上部Ba积累也非常显著。超积累植物可能是恢复土地的好方法，金属可以通过土壤-植物-动物食物链转移，并在动植物组织中积累，这一过程称为生物积累。在全球50多个维管植物科中已知的约582种金属超富集物中，约25％属于十字花科，这一科包含许多食用作物物种。可食用器官的积累仍然对人体有害。如果不加以治疗，接触大量的钡可能导致低钾血症、急性高血压、呕吐、腹泻、心律失常甚至死亡。因此，迫切需要研究通过液泡的隔离来实现金属离子的超富集和降低转运到食源性器官的速率的机制。这种解毒机制在Cd²⁺转运研究中有报道。来自低积累Cd²⁺品种的OsHMA3通过选择性地将Cd²⁺隔离到根液泡中，限制了Cd²⁺从根向地上组织的转运。所有突变体的锌和镉的转运率均明显低于野生型，表明OsHMA2是锌和镉从根向茎的主要转运载体。

目前对Ba的特异性吸收转运体报道较少。CaCA蛋白是一个超家族，由 5个不同亚家族的交换蛋白组成:YRBG，Na⁺/Ca²⁺转运体(NCX)，Na⁺/Ca²⁺， K⁺转运体(NCKX)，阳离子/Ca²⁺转运体(CCX)和H⁺/阳离子转运体(CAX)。然而，陆生植物还进化出了另外两组CaCA蛋白：Mg^{2 +}/H⁺交换蛋白(MHX)和NCX类蛋白(NCL)。它们因具有保守的功能域(Na_Ca域)而被聚在一起，但因功能和结构的差异而被分为不同亚族。CCX和CAX亚家族蛋白研究最多，离子底物丰富。例如，AtCCX2可以运输Ca²⁺，AtCCX3,5控制K⁺吸收或Na⁺运输。OsCCX2控制Cd²⁺运输。对于CAX亚家族，AtCAX1,3具有Ca²⁺转运的特性，而SaCAX2增强Ca²⁺和Mn²⁺的积累。相比之下，截掉N末端的AtsCAX2 不积累Mn²⁺，但全长AtCAX2可以转运Ca²⁺、Cd²⁺和Mn²⁺。

关于CAX2甚至CaCA超家族蛋白涉及钡离子转运的研究较少。AtCAX4 在提高酵母对Na⁺、Ca²⁺和Ba²⁺的耐受性方面发挥了重要作用。星星草(Puccinellia tenuiflora)中的PutCAX1和PutCAX2影响酵母对Ca²⁺和Ba²⁺耐受性。

苹果是我国重要的经济树种之一，提高产量和品质是育种的重要目标，特别是在逆境胁迫下保持最大效益以获得较高的经济效益。苹果中CAX2L-1蛋白的功能尚不清楚，对钡离子胁迫的研究更是未见报道。通过基因操作控制钡吸收为钡污染土壤上的苹果栽培提供了可能。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种苹果离子转运体MdCAX2L-1的转基因植株及其应用，所述的转运体MdCAX2L-1过表达，一方面能将钡离子进行液泡的区隔化，从而降低胞质中的钡离子含量，并控制着钡离子由根向地上部的运输，另一反面，提高转基因植物的抗氧化系统活性。两方面共同作用来提高转基因植物对钡离子的耐受性。

本发明提供了一种苹果离子转运体MdCAX2L-1在转基因中的应用，所述苹果离子转运体MdCAX2L-1的表达可以提高转基因对象对钙、钡的耐受性。

进一步地，所述MdCAX2L-1能够在转基因酵母菌株中转运钙离子。

进一步地，所述MdCAX2L-1的过表达能提高转基因酵母对钡的耐受性。

进一步地，所述MdCAX2L-1能够用于提高转基因植物对钡离子的耐受性。

本发明还提供了一种苹果离子转运体MdCAX2L-1的转基因植株。

进一步地，所述转基因植株为苹果转基因植株。

本发明还提供了上述的苹果离子转运体MdCAX2L-1的转基因植株在耐高浓度钡中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明获得了苹果离子转运体MdCAX2L-1的转基因植株，并利用钡胁迫处理下的表型比较和生理参数测定，详细鉴定了其正调控植物耐高钡的生物学功能，获得的研究成果对于开展苹果分子定向育种具有重要的理论意义和实际应用价值；

2、本发明明确了MdCAX2L-1编码的蛋白定位于液泡膜，MdCAX2L-1过表达，一方面能够将外界高浓度的钡离子隔离到液泡中，降低胞质钡含量并控制钡离子的向上运输；另一方面提高转基因植物的抗氧化酶活性，两方面共同作用提高转基因植物的耐钡性，在提高植株耐钡的基因工程育种方面有重要的参考价值；

3、本发明利用农杆菌介导的浸染方式获得的转基因苹果愈伤和苹果植株对高浓度钡的耐受性显著增强，在苹果耐钡的分子定向育种及缩小栽培环境限制方面有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中苹果离子转运体MdCAX2L-1与拟南芥AtCAX2 的基因结构比较及保守功能域分析；

其中，图A表示MdCAX2L-1与拟南芥AtCAX2的基因结构比较；

图B表示MdCAX2L-1与拟南芥AtCAX2的保守功能域分析；

图2为本发明实施例2中苹果MdCAX2L-1基因在不同组织和钡胁迫处理下的表达量分析，其启动子响应模式及其编码蛋白的亚细胞定位鉴定；

其中，图A表示MdCAX2L-1基因分别在苹果根、茎、叶、花、果实中的表达量差异；

图B表示钡离子胁迫下根系中的MdCAX2L-1基因在不同处理时间下的表达量差异；

图C表示MdCAX2L-1的启动子响应Ba处理差异分析；

图D表示MdCAX2L-1的启动子响应Ba处理在拟南芥各组织中的表达水平差异；

图E表示MdCAX2L-1编码蛋白定位于烟草下表皮细胞的液泡膜；GFP指绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)，AtCBL2为液泡膜定位marker蛋白。

图F表示MdCAX2L-1编码蛋白定位于酵母细胞的液泡膜；

图3为本发明克隆的苹果MdCAX2L-1在钙离子敏感酵母突变体菌株K667 中的功能鉴定；

其中，图A表示不同浓度的CaCl₂对过表达MdCAX2L-1的K667阳性菌株生长影响的直观图；pDR196为酵母表达载体，YPD为Yeast Extract Peptone Dextrose Medium的缩写。

图B表示不同浓度的BaCl₂对过表达MdCAX2L-1的K667阳性菌株生长影响的直观图；

图C表示CaCl₂处理下，阳性菌株细胞吸收钙离子的荧光图；Fluo指荧光(fluorescence)场下观察结果。

图D表示CaCl₂处理下，阳性菌株细胞吸收钙离子量的定性分析；

图E表示BaCl₂处理下，阳性菌株细胞中钡离子的相对含量；

图4为本发明MdCAX2L-1转基因拟南芥对钡离子耐受能力鉴定；

图A表示钡离子处理对各拟南芥株系的伤害程度直观图；Col为拟南芥野生型‘Columbia’，cax2为拟南芥AtCAX2敲除突变体；RL-17和RL-30指 MdCAX2L-1转化cax2突变体获得的两个株系，OE-10和OE-11指MdCAX2L-1 的转化Col野生型获得的两个株系。

图B表示钡离子处理对各拟南芥株系的相对生长量的影响；

图C表示钡离子处理对各拟南芥株系的根系活力的影响；

图D表示钡离子处理对各拟南芥株系的叶绿素含量的影响；

图E表示钡离子处理对各拟南芥株系叶片的相对离子渗漏(REL，Relativeelectrolyte leakage)的影响；

图F表示钡离子处理对各拟南芥株系叶片的MDA(malonaldehyde，丙二醛)含量的影响；

图G表示钡离子处理对各拟南芥株系整株钡离子含量的影响；

图5为本发明MdCAX2L-1过表达对苹果愈伤耐钡能力及抗氧化酶活性的影响；

图A表示各株系苹果愈伤在钡离子胁迫下的表现直观图；EV指转化空载体pCambia2300-GFP的苹果愈伤，WT指未转基因的野生型愈伤，MdCAX2L-1 指过表达MdCAX2L-1的转基因苹果愈伤；

图B表示钡离子处理对各株系苹果愈伤生长量(鲜重)的影响；

图C表示钡离子处理对各株系苹果愈伤的钡离子相对积累量的影响；

图D-F表示钡离子处理对各株系苹果愈伤的抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性的影响；其中CAT(过氧化氢酶)，POD(过氧化物酶),SOD(超氧化物歧化酶)。

图6为本发明MdCAX2L-1转基因苹果根系的鉴定及MdCAX2L-1在根中的表达量对苹果植株损伤程度的影响；

图A表示MdCAX2L-1转基因苹果根系的绿色荧光鉴定；OE(EV)指转化过表达载体pCambia2300-GFP的空载体对照株系，RNAi(EV)指转化RNAi干扰表达载体pK7GWIWG2D的空载体对照株系；MdCAX2L-1-OE指过表达 MdCAX2L-1的转基因苹果株系，MdCAX2L-RNAi指MdCAX2L-1干扰表达的转基因苹果株系；GFP指绿色荧光蛋白(Green fluorescentprotein)；

图B表示MdCAX2L-1转基因苹果根系的MdCAX2L-1表达量测定；(2L-1)OE指过表达MdCAX2L-1的转基因苹果株系,RNAi指MdCAX2L-1干扰表达的转基因苹果株系；

图C表示钡离子处理对MdCAX2L-1的不同转基因株系地上组织表型的影响；

图D表示钡离子处理对MdCAX2L-1转基因株系叶片的相对离子渗漏(REL，Relative electrolyte leakage)的影响；

图E表示钡离子处理对MdCAX2L-1转基因株系叶片的MDA (malonaldehyde，丙二醛)含量的影响；

图F表示钡离子处理对MdCAX2L-1转基因植株叶片的叶绿素荧光的影响直观图；

图G表示钡离子处理对MdCAX2L-1转基因植株叶片的的叶绿素荧光 Fv/Fm的影响；

图H表示钡离子处理对MdCAX2L-1转基因植株叶片的净光合速率Pn的影响；

图7为本发明MdCAX2L-1在根中表达对钡离子胁迫下苹果植株根系生理状态的影响；

图A表示钡离子胁迫对MdCAX2L-1各转基因根系生长状态的影响；缩写代表的意义如上。

图B表示钡离子胁迫对MdCAX2L-1各转基因根系的根系活力的影响；

图C表示钡离子胁迫对MdCAX2L-1各转基因根系超氧阴离子积累的影响；

图D表示钡离子胁迫对MdCAX2L-1各转基因根系过氧化氢积累的影响；

图E表示钡离子胁迫对MdCAX2L-1各转基因根系抗氧化酶(CAT、POD、 SOD)活性的影响；缩写代表的意义如上。

图F表示钡离子胁迫对MdCAX2L-1各转基因根系的钡离子相对积累量的影响；

图G表示钡离子胁迫对MdCAX2L-1各转基因株系叶片的钡离子相对积累量的影响；

图H表示钡离子胁迫对MdCAX2L-1各转基因株系整株钡离子相对积累量的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

一、苹果离子转运体MdCAX2L-1基因的基本信息介绍

我们在前期研究中克隆获得了MdCAX2L-1的基因编码序列，并已提交国际公共数据库(NCBI数据库，基因ID:MT820134)。该基因的完整开放阅读框长度1302bp，编码433个氨基酸，预测蛋白分子量为47.86kDa，等电点为 5.0。通过与拟南芥AtCAX2的基因结构进行比较，发现二者具有相似的基因结构，MdCAX2L-1除第一个外子外，其余10个外显子长度与AtCAX2中对应的外显子完全相同(图1，图A)。对蛋白序列进行保守结构域比较表明MdCAX2L-1蛋白含有CaCA家族保守结构域(Na_Ca_ex)，与AtCAX2蛋白相似(图1，图B)。

二、苹果MdCAX2L-1在不同组织及高浓度钡处理下的表达模式分析及其编码蛋白的亚细胞定位鉴定

采取苹果‘嘎啦-3’(本研究团队的资源圃)的根、茎、叶、花和果实样品，提取RNA并反转录，用于组织特异性表达分析。挑取生长一致的野生型‘嘎啦 -3’生根苗，对其进行3mMBaCl₂处理，并于不同时间点取样。提取样品RNA，设计特异性qRT-PCR定量引物，检测在BaCl₂处理下MdCAX2L-1的表达模式。 MdCAX2L-1定量引物序列为MdCAX2L-1-qF(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)和MdCAX2L-1-qR(核苷酸序列如SEQ ID NO.2)：

SEQ ID NO.1：CGGATGTGCCTTCTTCACTGGTG；

SEQ ID NO.2：TGACAGCCATCAACAGCAATCCTG；

定量结果显示，MdCAX2L-1在苹果不同组织中均有表达，在根中表达量最高，在果实中表达量最低，在茎和叶中的表达没有显著差异(图2，图A)。钡处理下，根系中MdCAX2L-1的表达量上升显著，在处理0.5h后其表达量已显著高于对照，最大上调倍数出现在处理3h时(图2，图B)，表明MdCAX2L-1 显著响应钡胁迫。同时，将MdCAX2L-1的启动子驱动的gusA基因(β-葡萄糖苷酶编码基因)转化拟南芥获得的阳性株系进行正常(1/2MS)和钡离子(1/2MS+5 mM BaCl₂)处理。染色结果表明，正常情况下，gusA基因在根、茎和子叶中表达量较高，尤其在这些器官的维管束组织中表达较高，处理之后，整个植株根、茎和子叶的染色显著加深，且在维管束等组织中颜色更深，说明MdCAX2L-1 的启动子主要驱动MdCAX2L-1基因在植物的根、茎和叶片中表达，且该启动子显著响应钡离子胁迫并进一步促进基因表达(图2，图C，图D)。

亚细胞定位对离子转运体的生物学功能至关重要，因此我们将MdCAX2L-1 的编码序列插入到带有GFP荧光蛋白标签的pCambia2300载体中。随后通过农杆菌介导的方法在烟草叶片中进行MdCAX2L-1-GFP融合蛋白的瞬时表达。荧光显微镜观察结果显示，MdCAX2L-1蛋白定位于烟草叶片液泡膜上(图2，图E)。我们又将MdCAX2L-1的编码序列插入到酵母表达载体pDR196-GFP中，转化酵母，培养阳性菌落，显微镜荧光观察发现，MdCAX2L-1蛋白定位于酵母细胞的液泡膜上(图2，图F)。

三、苹果MdCAX2L-1在酵母突变体中的功能鉴定

酵母表达载体采用pDR196，我们将MdCAX2L-1的编码序列通过双酶切及无缝克隆连接方法插入到pDR196载体中，获得基因过表达载体 pDR196-MdCAX2L-1。载体基因表达由PMA启动子驱动，在酵母中的营养筛选缺陷为-Ura。融合载体pDR196-MdCAX2L-1和pDR196空载体通过LiAc/ss carrier DNA/PEG方法转化进入钙离子敏感突变体K667(菌株由东北林业大学卜媛媛老师惠赠)中，以K667及转化pDR196空载体的K667作为阴性对照。结果表明，在含有不同浓度CaCl₂的培养基中进行培养时，MdCAX2L-1阳性菌株的生长速率显著高于两种阴性对照菌株(图3，图A)，这说明MdCAX2L-1 具有钙离子转运能力。随后，我们又用相同的酵母菌株进行了氯化钡实验，我们发现相比于阴性对照株系来说，MdCAX2L-1过表达降低了酵母对钡离子的敏感性(图3，图B)。最后我们测定了各酵母株系的钙含量和钡含量。我们用钙离子荧光探针Fluo 4-AM(5μM)去孵育各酵母菌株，钙离子含量越高，荧光越亮，我们用Image J软件对荧光密度进行定性，发现，MdCAX2L-1阳性菌株的相对荧光密度显著高于对照株系，表明前者积累了更多的钙离子，并且积累的部位是在酵母的液泡内(图3，图C，图D)。我们收集10mM BaCl₂处理下的各株系酵母，通过ICP-OES测定，我们发现MdCAX2L-1阳性菌株也积累了更多的钡离子(图3，图E)。以上结果说明MdCAX2L-1能够转运钙离子，并且能将钡离子隔离进入液泡而降低钡离子毒性。

四、苹果MdCAX2L-1植物表达载体构建和转基因植株的获得

1、载体构建

我们将MdCAX2L-1的编码序列插入pBI121载体中，获得用于拟南芥野生型Col遗传转化的过表达载体pBI121-MdCAX2L-1；将MdCAX2L-1的编码序列插入pCambia35S-4×Myc-MCS-3×FLAG，获得用于拟南芥cax2突变体遗传转化的过表达载体pCambia35S-4×Myc-MdCAX2L-1-3×FLAG；将MdCAX2L-1启动子序列插入pCambia1301-GUS载体中，获得用于拟南芥转化的启动子载体 pCambia1301-Pro_MdCAX2L-1-GUS；将MdCAX2L-1的编码序列插入pCambia2300-GFP中，获得用于转化苹果愈伤和苹果根系的过表达载体 pCambia2300-MdCAX2L-1-GFP；选择MdCAX2L-1编码序列中前250bp的片段，插入RNAi干扰表达载体pK7GWIWG2D中，获得转化苹果根系的干扰表达载体pK7GWIWG2D-MdCAX2L-1。

以上过表达载体构建方法均采用双酶切及无缝克隆连接方法，具体步骤参照诺唯赞一步法克隆试剂盒说明书(ClonExpress II One Step Cloning Kit,C112, VazymeBiotech Co.,Ltd)。pBI121载体选择BamH I/Sac I酶切位点， pCambia1301-GUS载体构建选择HindⅢ/NcoI酶切位点，pCambia2300-GFP载体构建选择BamH1/Sal1酶切位点。对于RNAi干扰表达载体的构建，利用PCR 克隆MdCAX2L-1基因编码序列的前250bp并插入到RNAi干扰表达载体 pK7GWIWG2D中，构建过程使用BP和LR酶进行两步法连接，具体方法参照gateway系统载体(Gateway BP/LR Clonase II Enzyme mix,ThermoFisher)的构建说明书。

2、遗传转化

(1)拟南芥的遗传转化：将构建好的MdCAX2L-1的过表达载体 pBI121-MdCAX2L-1和pCambia-4×Myc-MdCAX2L-1-3×FLAG)，以及启动子载体pCambia1301-Pro_MdCAX2L-1-GUS通过热击法转化农杆菌GV3101，随后利用农杆菌介导的蘸花法侵染拟南芥获得转基因植株，其中pBI121-MdCAX2L-1用于浸染野生型拟南芥(Col)，使用卡那霉素(50mg/L)进行阳性株系的筛选，阳性株系标记为OE(overexpression)，包括处理中的OE-10和OE-11。pCambia35S-4×Myc-MdCAX2L-1-3×FLAG用于浸染拟南芥突变体cax2 (Stock:SALK_042600C)，使用潮霉素(20mg/L)进行阳性株系的筛选，阳性株系标记为RL(recorveryline),包括处理中的RL-17和RL-30。 pCambia1301-Pro_MdCAX2L-1-GUS用于浸染野生型拟南芥(Col)，使用潮霉素(20 mg/L)进行阳性株系的筛选，阳性株系标记为Line_pro(简称Lp)。具体方法参考文献(Clough and Bent 1998Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana)。

(2)苹果愈伤组织的遗传转化：将pCambia2300-MdCAX2L-1-GFP融合表达载体转化农杆菌EHA105，随后利用农杆菌侵染方法进行苹果愈伤的遗传转化。

具体转化方法如下：液体培养基中培养的苹果愈伤组织每隔15天继代一次以保证愈伤细胞的活性；将液体愈伤在无菌的纱布上过滤，并将过滤后的愈伤细胞与农杆菌悬浮液(OD₆₀₀＝0.6)混合，轻轻摇晃10分钟；将此混合物再经无菌的纱布过滤，并在无菌滤纸上吸除过量的农杆菌，然后将愈伤组织平铺于预培养基上避光生长2天；2天后，用含有250mg/L头孢的无菌水清洗愈伤组织3次，过滤吸去多于水分后平铺于筛选培养基上，暗培养至抗性愈伤细胞团出现；将抗性细胞团在筛选培养基中连续继代筛选3次，随后进行PCR鉴定和MdCAX2L-1表达量鉴定。以上实验过程均在超净台中进行。农杆菌重悬液使用无菌水，侵染过程中使用的培养基配方如下：

预培养基：4.43g/L MS+30g/L蔗糖+1.5mg/L 2,4-D+0.4mg/L 6-BA+7.5g/L agar,pH5.8。

筛选培养基：4.43g/L MS+30g/L蔗糖+1.5mg/L 2,4-D+0.4mg/L 6-BA+30mg/L卡那霉素+7.5g/L Agar,pH5.8。

(3)苹果植株根系的遗传转化：将构建好的过表达载体 pCambia2300-MdCAX2L-1-GFP和RNAi干扰表达载体 pK7GWIWG2D-MdCAX2L-1以及相应的空载体分别转化发根农杆菌K599。发根农杆菌介导的根系转基因方法参考(Xiang et al.2005；Hernandez-Piedra etal. 2020)，有部分改动，具体如下：挑取阳性克隆在添加50mg/L硫酸链霉素和 50mg/L的卡那霉素或30mg/L的壮观霉素素的YEP培养基中进行培养直到 OD₆₀₀＝0.6，菌液离心并用无菌水重悬待用。取培养一个月左右的‘GL-3’组培苗，在距顶端约1.5厘米处的茎段上用刀片切断，切口为平整的斜口。取上部茎段浸泡于农杆菌重悬液中，并在真空泵中用0.08Mpa抽真空15分钟。将茎段捞出并放于无菌滤纸上吸去多余的菌液，随后插入到带有培养基的组培瓶中培养生根。大约1-1.5个月之后，对长出来的根系进行活体GFP荧光观察，筛选阳性转基因株系。培养基配方如下：4.43g/L MS+15g/L蔗糖+250mg/L头孢+7.5g/L Agar,pH5.8。

五、苹果MdCAX2L-1过表达对拟南芥耐钡性影响的功能鉴定

将T₃代转基因种子(OE和RL株系)和对照种子(野生型Col和突变体 cax2)4℃低温春化3天，随后播种于含有机基质/蛭石/珍珠岩混合物(1：1： 1，v：v：v)的营养钵中，培养温度设置为白天23度/晚上22度，光周期为8h光照/16h黑暗。培养一个月后，挑选生长状态一致的幼苗移栽入新的营养钵，用含20mM BaCl₂的水溶液进行处理，每隔7天浇灌一次，持续处理14 天。处理后野生型拟南芥受到显著的钡胁迫伤害，表现为叶片干枯发黄，而过表达株系仅少数叶片表现出失绿或干枯表型(图4，图A)。取样测定了拟南芥叶片的相对生长量，根系活力，叶绿素含量，相对离子渗漏(REL)，MDA含量及钡离子的相对积累量，结果表明钡胁迫下过表达株系的相对生长量更高(图4，图B)，根系活力也更大(图4，图C)，叶绿素含量也更高(图4，图D)，而相对离子渗漏REL及MDA含量更低(图4，图E，图F)，这些结果说明MdCAX2L-1过表达能使拟南芥受到更小的伤害。另外，钡离子含量测定结果表明过表达株系在钡胁迫下积累的钡离子含量更高(图4，图G)，结合受到的伤害更小，说明MdCAX2L-1能够将钡离子隔离进入液泡，从而减轻了高浓度的钡离子对植物的伤害。

六、苹果MdCAX2L-1过表达对苹果愈伤耐钡性和钡胁迫下抗氧化酶活性影响的功能鉴定

挑选生长一致的苹果愈伤组织，取0.1g平铺在含有不同浓度氯化钡的MS 培养基上(图5，图A)，每个株系铺9块，此为1个重复，共设置9个生物学重复。黑暗下培养20天之后，称取各处理下愈伤的鲜重。结果表明，转基因愈伤在含BaCl₂的MS培养基中生长的更快，鲜重更高(图5，图A，图B)。另外，钡离子含量测定结果表明，转基因愈伤在BaCl₂处理下积累的钡离子浓度更高(图5，图C)。我们还测定了愈伤组织的抗氧化酶(CAT,POD和SOD)活性，结果表明钡胁迫处理下转基因愈伤的酶活显著高于对照(图5，图D)。这些结果说明，MdCAX2L-1过表达能够通过将钡离子隔离进入液泡和提高抗氧化酶活来增强苹果愈伤对钡离子的耐受性。

七、根系中过表达MdCAX2L-1对苹果植株耐钡性影响的功能鉴定

1、根系中表达MdCAX2L-1的苹果转基因根系的鉴定

将发根农杆菌侵染后发出新根的‘GL-3’苹果植株的根系置于激光共聚焦显微镜下，并选择GFP通道进行转基因材料的绿色荧光鉴定(图6，图A)。另外，对转基因株系的根取样提取RNA进行MdCAX2L-1表达量测定(图6，图B)。通过以上两种方式，保证每一种转基因载体获得不少于20棵植株(每一棵都是一个株系)用于后续钡胁迫处理(处理组，BaCl₂)，相同数量的植株正常浇灌蒸馏水作为对照组(Control)。

2、根系中过表达MdCAX2L-1增强了转基因苹果植株的耐钡性

苹果植株的钡胁迫处理方式与拟南芥的处理相似，对移栽于营养钵中的苹果苗进行50mM BaCl₂浇灌，每隔5天浇一次，处理周期共10天。表型比较发现，处理后MdCAX2L-1过表达株系受到的钡胁迫损伤明显较轻，叶片仍保持绿色，而RNAi干扰表达株系的叶片上则出现较多的黄色斑点，并且多数叶片有干枯死亡情况(图6，图C)。随后，对叶片的相对离子渗漏(REL)，MDA 含量进行测定，发现过表达株系的数值显著低于对照，RNAi干扰表达株系则相反(图6，图D，图E)。胁迫损伤会显著影响植物光合作用，通过对苹果植株的叶绿素荧光Fv/Fm(图6，图F，图G)和叶片的净光合速率Pn(图6，图H)进行测定，发现过表达株系的Fv/Fm和Pn均显著高于对照和RNAi干扰株系，说明光合作用单位受损较小。以上结果说明MdCAX2L-1过表达能够增强苹果植株的耐钡性，干扰MdCAX2L-1表达则会降低苹果植株耐钡性。

3、根系中过表达MdCAX2L-1缓解了钡对苹果根系的伤害并控制Ba²⁺向地上部分的运输。

我们观察了钡胁迫下各转基因株系的根系大小，结果表明MdCAX2L-1过表达株系的根系生长明显优于对照和RNAi干扰表达株系(图7，图A)，并且根系活力也显著高于对照和RNAi干扰表达株系(图7，图B)。

我们还测定了处理组和对照组中各转基因植株根系中的过氧化氢和超氧阴离子的积累，我们发现这两种物质在过表达根系中积累的更少，在RNAi干扰表达株系中更多(图7，图C，图D)。为了探明原因，我们测定了根系的抗氧化酶的活性，发现，酶活与ROS的积累趋势相反(图7，图E)，这表明，MdCAX2L-1可以调控抗氧化酶的活性。

最后，我们测定了植株各部分的钡含量，我们发现，过表达根系的钡含量积累的最多(图7，图F)，结合过表达根系受到的伤害最小，我们猜测是根系吸收的钡储存在液泡中，从而减轻了钡离子对根系的伤害；过表达株系的地上部分叶片受到的伤害最小，积累的钡离子也最小，而RNAi干扰表达株系呈现相反的趋势(图7，图B)，我们得出结论，当面对同样外界的高钡环境时， MdCAX2L-1在根部过表达能将钡离子隔离进入液泡，从而减少了往地上部分的运输，这也就解释了在RNAi干扰表达株系中，与对照相比，整株钡离子含量没有显著差异(图7，图H)，但是RNAi干扰表达株系的叶片中却有显著高于对照株系叶片的钡含量。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种苹果离子转运体MdCAX2L-1的转基因植株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cggatgtgcc ttcttcactg gtg 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgacagccat caacagcaat cctg 24

Claims (3)

1.一种苹果离子转运体MdCAX2L-1在转基因中的应用，其特征在于，所述苹果离子转运体MdCAX2L-1的表达可以提高苹果植株对钡的耐受性，所述苹果离子转运体MdCAX2L-1的过表达可以提高酵母对钙的耐受性。

2.如权利要求1所述的苹果离子转运体MdCAX2L-1在转基因中的应用，其特征在于，所述MdCAX2L-1的过表达能提高转基因酵母对钡的耐受性。

3.一种权利要求1所述的苹果离子转运体MdCAX2L-1的苹果转基因植株在耐高浓度钡中的应用。

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