CN103025153B - 由正交配体激活的经修饰的pyr/pyl受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及突变的PYR/PYL受体多肽，以及制备和使用突变的PYR/PYL受体多肽的方法。

Description

由正交配体激活的经修饰的PYR/PYL受体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年4月28日递交的美国临时专利申请No.61/328,999和2011年1月19日递交的美国临时专利申请No.61/434,407的优先权，其内容为所有目的分别以参阅形式并入本文中。
针对联邦政府资助研究和开发的发明的权利声明
本发明在国家科学基金会资金项目No.IOS0820508的政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
升高的温度和减少的新鲜水供给是两种环境胁迫形式，也称非生物胁迫，其降低农业的粮食产量。一种非生物胁迫耐受性的关键调控剂是植物激素脱落酸(ABA)，其在对各种非生物胁迫的应答中由植物合成并主导其适应性应答以提高植物的存活(Cutler,S.等人，植物生物学年评(Annual Review of Plant Biology)(2009)；Nambara,E.等人，植物生物学年评(Annual Review of Plant Biology)56:165-185(2005))。经基因工程改造具有增加的ABA敏感性的作物表明其在干旱条件下提高了产量(Wang,Y.等人，植物杂志(PlantJ)43:413-424(2005))。而且，将ABA或ABA类似物直接应用于大田植物已经表明改善了水的利用效率(Hawkins,A.F.等人，用于农业和便利设施的植物生长调节剂(Plant GrowthRegulators for Agricultural and Amenity Use)(英国农作物保护委员会)(1987)；Kreeb,K.H.等人，对环境胁迫的结构和功能性应答(Structural and FunctionalResponses to Environmental Stresses)(Balogh科学丛书)(1989))；然而，由于其复杂的生产途径和高成本，ABA的该用途没有成功地商业化。
令人感兴趣的是，许多杀菌剂和杀虫剂表现出未知机制的胁迫耐受性“副作用”，并被商业化用于胁迫耐受性用途，其显示了用化学方法控制胁迫耐受性的强烈兴趣和认识需要(Asrar,J.等人，在US 2009/0270254 A1中(孟山都技术公司，美国)(2003)；Beckers,G.J.M.等人，植物生物学当前见解(Current Opinion in Plant Biology)10:425-431(2007)；Schulz,A.等人，US 2007/0124839 A1(拜耳作物科学公司，美国)(2006))。该兴趣的一个重要驱动力是，近100年来获得的玉米产量的巨大提高可主要归因于新高产玉米品种非生物胁迫耐受性的提高(Duvick,D.N.等人，作物科学(Crop Science)39:1622-1630(1999)；Tollenaar,M.等人，农作物研究(Field Crops Research)75:161-169(2002)；Tollenaar,M.等人，作物科学(Crop Sci)39:1597-1604(1999))。由于ABA被认为是植物胁迫生理学的关键性激素调控剂，人们对在作物中调控ABA途径具有强烈兴趣。控制ABA信号转导途径的一个可能的要点是受体蛋白，原则上其能够进行ABA信号转导和胁迫耐受性的化学和基因调控。
近来，新的ABA受体家族，帕雷巴克汀(Pyrabactin)抗性/PYR-样(“PYR/PYL”)家族被确认为ABA信号转导调控剂(Park,S.Y.等人，Science 324:1068-1071(2009))。ABA受体PYL5的过表达赋予拟南芥属植物耐旱性(Santiago,J.等人，植物杂志(The PlantJournal)9999(2009))，将该新受体家族确认为控制植物胁迫耐受性的关键靶标。然而，基因过表达能产生相反的产量后果，其被称为“产量拖累”。产量拖累被认为是由于胁迫耐受性途径未经调控的激活而发生，其与在正常条件下(即，无干旱或其他胁迫因素)发生的生长缓慢有关。获得调控的ABA信号转导控制的一个方式是研制激活ABA受体(即，激动剂)的化学制剂。一旦干旱或其他胁迫条件到来即可将其应用于植物，这使得能够在不良条件下进行选择性保护。这使得在理想的生产条件下胁迫耐受性的优点得以实现而没有降低产量。
原则上，ABA可用作激动剂以实现这些优势。然而，其为天然产物，制造成本高且由于紫外光异构化作用和代谢失活会快速分解。其还对哺乳动物具有生理学作用，从而大大影响其用作农业化学品的合适性(Guri,A.J.等人，Clin Nutr.(2010))。因此，用于控制ABA信号转导的理想试剂应该是便宜、环境上稳定和无毒的分子。
发明概述
本发明提供包含异源表达盒的植物(或源自该植物的植物细胞、种子、花、叶子、果实或其他植物部位或源自该植物加工食品或食品成分)，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与化学品接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被化学品激活，且其中当野生型PYR/PYL受体多肽与所述化学品接触时，所述野生型PYR/PYL受体多肽没有明显被化学品激活。
在一些实施方案中，所述化学品包括杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、植物活化剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂或肥料。
在一些实施方案中，所述化学品选自下组：溴草腈、羟敌草腈、碘苯腈、杀鼠迷、二氯苯腈、环酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述化学品为溴草腈、羟敌草腈、碘苯腈、二氯苯腈、解草嗪或环酰菌胺。
在一些实施方案中，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈激活，对应于SEQID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点21、41、50、57、60、82、92、102、116、125、141和/或151的氨基酸上的另外的突变，其中所述突变选自H21Y、P41L、R50G、T57A、H60R、I82N、S92T、E102G、R116K、T125A、E141Q、E141D、N151D或其组合。
在一些实施方案中，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活，对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、154、158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上的另外的突变，其中所述突变选自R10Q、E12G、E12K、L25R、P27L、S29N、L33F、P42S、E43G、L44F、S47P、V49I、R74C、V75I、V81M、D97N、I110S、Y120C、Y120H、V123I、T124M、N133D、V138M、V139I、V144A、E154G、M158I、V163I、A172T、T173A、V174I、A177T或其组合。
在一些实施方案中，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活，所述突变的PYR/PYL受体多肽包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点59、120和158的氨基酸上的突变，其中所述突变为K59R、Y120H和M158I。在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点62和110的氨基酸位点上的异亮氨酸残基。
在一些实施方案中，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活，对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点27和/或63的氨基酸上的另外的突变，其中所述突变选自P27L、K63N或其组合。
在一些实施方案中，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活，所述突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点26、37、71和/或94的氨基酸上的突变，其中所述突变选自D26G、R37Q、F71S、E94D或其组合。
在一些实施方案中，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活，对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点119的氨基酸上的突变，其中所述突变为N119Y。
在一些实施方案中，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活，所述突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点110、114和/或138的氨基酸上的突变，其中所述突变选自I110T、E114D、V138M或其组合。
在一些实施方案中，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活，对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点24、82、159和/或161的氨基酸上的突变，其中所述突变选自Q24R、I82T、F159L、D161G或其组合。
在一些实施方案中，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活，所述突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点115和/或159的氨基酸上的突变，其中所述突变选自H115Y、F159S、F159L或其组合。
在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽与下述的任一序列基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119，且包含一个或多个如本文所述的突变。
在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述中任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:131-139(即，SEQ ID NO:131、132、133、134、135、136、137、138或139中任一序列)，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈激活。
在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述中任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:124-130或165-178(即，SEQ ID NO:124、125、126、127、128、129、130、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177或178中任一序列)，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活。
在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述中任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:140-144(即，SEQ ID NO:140、141、142、143或144中任一序列)，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活。
在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述中任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:145或146，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活。
在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述中任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:147、148或164，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活。
在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个在含有PYR/PYL受体多肽的配体结合口袋的氨基酸残基上的突变。
在一些实施方案中，当与所述化学品接触时，所述植物与缺少所述表达盒的植物相比具有提高的非生物胁迫耐受性。
本发明还提供提高上述植物的非生物胁迫耐受性的方法，其通过使所述植物与选自下组的化学品接触来实现：溴草腈、羟敌草腈、碘苯腈、杀鼠迷、二氯苯腈、环酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
本发明还提供包含本发明(例如，如本文所述)突变的PYR/PYL受体多肽的多肽。在一些实施方案中，多肽包含突变的PYR/PYL受体多肽，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述中任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:124-148或164-178(即，SEQ ID NO:124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177或178中任一序列)。
本发明还提供编码一个或多个本发明(例如，如本文所述)的突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述中任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:124-148或164-178(即，SEQID NO:124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177或178中任一序列)。本发明还提供分离的核酸，其包含编码一个或多个本发明(例如，如本文所述)的突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列。
本发明还提供制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法，当所述突变的PYR/PYL受体多肽与化学品接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被所述化学品激活，其中当野生型PYR/PYL受体多肽与所述化学品接触时，所述野生型PYR/PYL受体多肽没有明显地被所述化学品激活，所述方法包括：
(a)诱变所述野生型PYR/PYL受体多肽；
(b)使一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽与化学品接触；以及
(c)确定所述化学品是否激活所述一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽，其中激活作用确认所述一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽被所述化学品激活。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(b)之前，筛选所述化学品以确定所述化学品是否与所述野生型PYR/PYL受体多肽结合，然后使一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽与所述化学品接触。
在一些实施方案中，所述方法的确定步骤(c)包括使所述化学品与包含双杂交系统的细胞接触，其中所述双杂交系统检测所述突变的PYR/PYL受体多肽与2型蛋白磷酸酶(PP2C)的相互作用，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽与PP2C的化学特异性相互作用确认了所述突变的PYR/PYL受体多肽被所述化学品激活。
在一些实施方案中，所述方法的化学品包括杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、植物活化剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂或肥料。
在一些实施方案中，所述方法的化学品选自下组：溴草腈、羟敌草腈、碘苯腈、杀鼠迷、二氯苯腈、环酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
本发明还提供表达盒，其包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与化学品接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被所述化学品激活，其中当野生型PYR/PYL受体多肽与化学品接触时，所述野生型PYR/PYL受体多肽没有明显地被所述化学品激活。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述化学品为溴草腈、羟敌草腈、碘苯腈、二氯苯腈、解草嗪或环酰菌胺。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈激活，且对应于SEQ IDNO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点21、41、50、57、60、82、92、102、116、125、141和/或151的氨基酸上的另外的突变，其中所述突变选自H21Y、P41L、R50G、T57A、H60R、I82N、S92T、E102G、R116K、T125A、E141Q、E141D、N151D或其组合。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活，且对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、154、158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上的另外的突变，其中所述突变选自R10Q、E12G、E12K、L25R、P27L、S29N、L33F、P42S、E43G、L44F、S47P、V49I、R74C、V75I、V81M、D97N、I110S、Y120C、Y120H、V123I、T124M、N133D、V138M、V139I、V144A、E154G、M158I、V163I、A172T、T173A、V174I、A177T或其组合。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活，且所述突变的PYR/PYL受体多肽包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点59、120和158的氨基酸上的突变，其中所述突变为K59R、Y120H和M158I。在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点62和110的氨基酸上的异亮氨酸残基。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活，且对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点27和/或63的氨基酸上的另外的突变，其中所述突变选自P27L、K63N或其组合。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活，且所述突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点26、37、71和/或94的氨基酸上的突变，其中所述突变选自D26G、R37Q、F71S、E94D或其组合。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活，且对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点119的氨基酸上的突变，其中所述突变为N119Y。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活，且所述突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点110、114和/或138的氨基酸上的突变，其中所述突变选自I110T、E114D、V138M或其组合。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活，且对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点24、82、159和/或161的氨基酸上的突变，其中所述突变选自Q24R、I82T、F159L、D161G或其组合。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活，且所述突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点115和/或159的氨基酸上的突变，其中所述突变选自H115Y、F159S、F159L或其组合。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:131-139(即，SEQ ID NO:131、132、133、134、135、136、137、138或139中任一序列)，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈激活。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:124-130或165-178(即，SEQ ID NO:124、125、126、127、128、129、130、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177或178中任一序列)，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:140-144(即，SEQ ID NO:140、141、142、143或144中任一序列)，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:145或146，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:147、148或164，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活。
在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个在含有所述PYR/PYL受体多肽的配体结合口袋的氨基酸残基上的突变。
本发明还提供包含本发明表达盒(例如，如本文所述)的表达载体。
本发明还提供包含本发明表达盒(例如，如本文所述)的多核苷酸序列。
本发明还提供生产具有提高的胁迫耐受性的植物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:124-148或164-178(即，SEQID NO:124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177或178中任一序列)，由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:131-139，由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈激活。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:124-130或165-178，由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的受体多肽被环酰菌胺激活。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:140-144，由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的受体多肽被二氯苯腈激活。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:145-146，由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的受体多肽被解草嗪激活。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽具有下述任一序列或与其基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ IDNO:147-148或164，由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽，且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)接触时，所述突变的受体多肽被BTH激活。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽与下述任一序列基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:1-119(即，SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119中任一序列)并包含对应于SEQ ID NO:1中位点K59的氨基酸X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸；由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽。在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点21、41、50、57、60、82、92、102、116、125、141和/或151的氨基酸上的另外的突变，其中所述突变选自H21Y、P41L、R50G、T57A、H60R、I82N、S92T、E102G、R116K、T125A、E141Q、E141D、N151D或其组合。在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、154、158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上的另外的突变，其中所述突变选自R10Q、E12G、E12K、L25R、P27L、S29N、L33F、P42S、E43G、L44F、S47P、V49I、R74C、V75I、V81M、D97N、I110S、Y120C、Y120H、V123I、T124M、N133D、V138M、V139I、V144A、E154G、M158I、V163I、A172T、T173A、V174I、A177T或其组合。在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQID NO:1)中位点27和/或63的氨基酸上的另外的突变，其中所述突变选自P27L、K63N或其组合。在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点119的氨基酸上的突变，其中所述突变为N119Y。在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点24、82、159和/或161的氨基酸上的突变，其中所述突变选自Q24R、I82T、F159L、D161G或其组合。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽与下述任一序列基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:1-119并包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点26、37、71和/或94的氨基酸上的突变，其中所述突变选自R37Q、F71S、E94D或其组合；由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变的PYR/PYL受体多肽的核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽与下述任一序列基本上相同于(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:1-119并包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点110、114和/或138的氨基酸上的突变，其中所述突变选自I110T、E114D、V138M或其组合；由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽与下述任一序列基本上相同(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:1-119，且所述突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点115和/或159的氨基酸上的突变，其中所述突变选自H115Y、F159S、F159L或其组合；由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽。
在一些实施方案中，所述方法包括种植包含至少一个编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列的转基因植物，所述突变的PYR/PYL受体多肽与下述任一序列基本上相同于(例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同)：SEQ ID NO:1-119，且所述突变的PYR/PYL受体多肽包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点59、120和158的氨基酸上的突变，其中所述突变为K59R、Y120H和M158I；由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽。在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL受体多肽还包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点62和110的氨基酸位点上的异亮氨酸残基。
附图说明
图1.PYR1突变体27-18赋予了对环酰菌胺而非ABA的应答性。使用体外PP2C磷酸酶活性检测测定，与野生型PYR1对照相比，代表性PYR1突变体27-18(包含S47P、K59R和Y120H替换突变)对渐增浓度的脱落酸("ABA")(A)和环酰菌胺(B)的应答性。
图2.确认在27C-2突变体中对环酰菌胺应答性的关键性残基。A.在pBD-PYR1中构建突变体(图示左侧所列)并转入至Y190pAD-HAB1酵母细胞。然后，将转化体在渐增浓度的环酰菌胺下培养，并用X-gal染色对应答性计分，其操作描述于Park等人，2009。如图所示，K59R、Y120H和M158I突变是27C-2对环酰菌胺应答所必需的。B.PYR1K59R、Y120H、M158I突变体的体外特征。按照前述的描述制备重组野生型和突变体PYR1蛋白并用于如之前所述的PP2C检测(Park等人，2009)，不同之处在于所用的受体与磷酸酶的比例为2:1。
图3.通过基因工程将环酰菌胺应答性引入至PYL2。A.将在PYR1(K59R、Y120H、M158I)中足以产生环酰菌胺应答性的同源性突变引入至PYL2(K64R、Y124H、M164I)。此外，在V114I和/或V67I引入口袋残基突变。在pBD-PYL2中构建突变体(图示左侧所列)并转化至Y190pAD-HAB1酵母细胞。然后，将转化体在渐增浓度的环酰菌胺下培养，并用X-gal染色对应答性计分，其操作描述于Park等人，2009。如图所示，通过组合这些突变可以设计出环酰菌胺应答性。B.PYL2K64R、Y124H、M164I、V67I、V114I突变体的体外特征。按照前述的描述制备重组野生型和突变体PYR2蛋白并用于如之前所述的PP2C检测(Park等人，2009)，不同之处在于所用的受体与磷酸酶的比例为2:1。
图4.在35S::GFP-PYL2K64R、Y124H、M164I、V67I、V114I转基因植物中幼苗对环酰菌胺应答的表征。为了研究环酰菌胺应答性PYL2受体的体内敏感性，通过农杆菌介导转化制备表达野生型和突变体受体蛋白的转基因植物。图中所示为源自最初的转基因植物(T1)的分离的表达GFP的T2幼苗。哥伦比亚型(Columbia)为野生型背景，是非转基因的。除了野生型PYL2过表达系以外，对两个单独的PYL2K64R、Y124H、M164I、V67I、V114I(“PYL2MUT”)转基因系进行了表征。将来自各系的种子于黑暗中在含有100μM环酰菌胺的培养基中萌发，吸入后两天对其计分。如图所示两个转基因系而非对照系表现出强烈的萌发后生长抑制。上部分图显示了代表性幼苗的透射光图像，下部分图显示了确认株系的GFP表达的落射荧光并表明株系间的表达水平是相似的。该资料表明PYL2K64R、Y124H、M164I、V67I、V114I受体蛋白激活了对于环酰菌胺应答的表征良好的ABA应答(生长抑制)。
图5.在35S::GFP-PYL2K64R、Y124H、M164I、V67I、V114I转基因植物中幼苗对环酰菌胺的转录应答的表征。将在培养皿中萌发后的源自各株系的表达GFP的T2幼苗分开，并用落射荧光显微镜预筛选，然后在液体培养基培养7天，再将幼苗用100μM环酰菌胺或对照(0.1％DMSO)处理6小时。然后，使用3个表征良好的ABA应答转录(如上所述，Park等人，2009)，从样品中分离RNA并用于定量RT-PCR实验。用于RT-PCR分析的引物序列从Roche公司获得并通过Invitrogen载体合成。使用SybrGreen染料在BioRad CFX 96实时PCR仪上进行定量RT-PCR。mRNA拷贝数表示为每纳克(ng)总RNA的拷贝数。使用ACT2基因对数据归一化。使用靶基因的已知浓度的标准曲线确定拷贝数。所得数据表明，PYL2K64R、Y124H、M164I、V67I、V114I受体蛋白激活了对环酰菌胺应答的ABA信号转导途径。所示数据为3次技术重复的平均值，且误差线显示为标准误差。
图6.环酰菌胺减少了转基因PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I表达植物中的失水。图中所示为在用对照、含100μM环酰菌胺或100μM ABA的溶液处理的转基因植物上进行的3个独立的失水实验(A-C)。按照下述实施例部分的描述处理植物，分开后测量其通过气孔(aerialrosette)的失水。在所有实验中，转基因PYL2系表现出对环酰菌胺处理应答的失水减少。
图7.环酰菌胺预处理没有减少在野生型哥伦比亚型(Columbia)植物中的失水。用对照、含100μM环酰菌胺或100μM ABA的溶液处理哥伦比亚型(Columbia)植物。按照下述实施例部分的描述处理植物，分开后测量其通过气孔(aerial rosette)的失水。
定义
术语“PYR/PYL受体多肽”是指部分表征为存在多聚乙酰环化酶结构域2(PF10604)、多聚乙酰环化酶结构域1(PF03364)和Bet V I结构域(PF03364)中的一个或多个或所有结构域的蛋白，所述结构域在野生型中调节脱落酸(ABA)和ABA类似物信号转导。本领域已知有许多种PYR/PYL受体多肽序列。在一些实施方案中，PYR/PYL受体多肽包含与下述任一序列基本上相同的多肽：PYR1(SEQ ID NO:1)、PYL1(SEQ ID NO:2)、PYL2(SEQ IDNO:3)、PYL3(SEQ ID NO:4)、PYL4(SEQ ID NO:5)、PYL5(SEQ ID NO:6)、PYL6(SEQ ID NO:7)、PYL7(SEQ ID NO:8)、PYL8(SEQ ID NO:9)、PYL9(SEQ ID NO:10)、PYL10(SEQ ID NO:11)、PYL11(SEQ ID NO:12)、PYL12(SEQ ID NO:13)、PYL13(SEQ ID NO:14)和SEQ ID NO:15-119。
“野生型PYR/PYL受体多肽”是指调节脱落酸(ABA)和ABA类似物信号转导的天然产生的PYR/PYL受体多肽。
“突变的PYR/PYL受体多肽”或“修饰的PYR/PYL受体多肽”是指由天然产生的(即，野生型)PYR/PYL受体多肽变异而来的PYR/PYL受体多肽。如本文所用，相比对应的野生型PYR/PYL受体多肽，突变的或修饰的PYR/PYL受体多肽包含一个或多个氨基酸替换。在本文中，可用任何产生非野生型核苷酸序列的方法制备“突变的”多肽或“修饰的”多肽。突变的PYR/PYL受体多肽可能调节或可能不调节脱落酸(ABA)和ABA类似物信号转导。
“对应于[特定序列]的位点[X]”的氨基酸是指在目标多肽中与特定序列的等价氨基酸匹配的氨基酸。通常，如本文所述，对应于PYR/PYL受体多肽的位点的氨基酸可使用比对算法如BLAST进行确定。如本文进一步讨论的，在本发明的典型实施方案中，氨基酸位点的“一致性(correspondence)”通过与包含SEQ ID NO:1的所述PYR/PYL受体多肽的一个区比对而确定。当PYR/PYL受体多肽序列与SEQ ID NO:1不同(例如，通过氨基酸的改变或氨基酸的增加或删除)，其可能为，与不激活野生型PYR/PYL的化学品的激活作用有关的特定突变将不会出现在SEQ ID NO:1中的相同位点序号上。例如，PYL1(SEQ ID NO:2)的氨基酸位点K86匹配于SEQ ID NO:1的氨基酸位点K59，其在两个序列的比对中很容易表明；在该实例中，在SEQ ID NO:2的氨基酸位点86的突变对应于SEQ ID NO:1的位点59。
如下所述，如果两个核苷酸或氨基酸残基的序列在进行最大一致性比对时分别是相同的，那么称这两个核酸序列或多肽为“相同的”。术语“相同的”或“同一性”百分比在两个或更多核酸或多肽序列的情况下是指，当通过一个比较窗口进行最大一致性的比较和比对，使用下列序列比较算法之一进行测量或通过人工比对和目测检查时，两个或更多序列或子序列是相同的或有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的。当序列同一性百分比用于指向蛋白或肽时，认为不相同的残基位点通常是由于保守氨基酸替换而不同，其中氨基酸残基被替换为具有类似化学性质的其他氨基酸残基(例如，荷电或疏水性)从而没有改变该分子的功能性特性。其中可对保守替换中的序列差异、序列同一性百分比进行上调以改正该替换的保守性。进行该调整的方法为本领域技术人员所熟知。通常这涉及到将一个保守替换记为部分错配而非完全错配，从而增加其序列同一性百分比。因此，例如，如相同的氨基酸计分为1，而非保守替换计分为0，那么保守替换的计分为0-1。保守替换计分的计算根据，例如，Meyers&Miller算法，Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988)，例如，如在程序PC/GENE所运行(Intelligenetics公司，美国加利福尼亚州山景城)。
两个核酸或多肽的情况下使用的词语“基本上相同”是指，与参考序列具有至少60％序列同一性的序列。或者，同一性百分比可为60％-100％的任何整数。使用本文所述的程序与参考序列相比，一些实施方案包括至少：60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；如下所述，优选使用标准参数的BLAST。本发明的实施方案提供编码多肽的核酸，所述多肽与下述任一序列基本上相同：SEQID NO:1-119。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，将测试序列与其比较。当使用序列比算法时，将测试和参考序列输入至计算机，随后设计坐标，如需要，还设计序列算法程序参数。可使用默认的程序参数或者也可设计替代性参数。然后，基于程序参数用所述序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
本文所用“比较窗口”包括参考选自20-600的连续相邻位点数目的任何一个片段，通常为约50至约200，更通常为约100至约150，其中将两个序列进行最佳对齐后，可将该序列与参考序列中同样数目的连续相邻位点进行比较。对齐用于比较的序列的方法为本领域所熟知。用于比较的序列最佳对齐的实施可通过，例如，Smith&Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman&Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.48:443(1970)；Pearson&Lipman的搜索类似性方法，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)；计算机操作的算法(Wisconsin公司的遗传软件包GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)，威斯康星州，麦迪逊市科学大道575号)或人工比对和目测检查。
适于确定序列同一性百分比和序列相似性的的算法为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人，(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站公开提供进行BLAST分析的软件。该算法涉及通过确定待查询序列中长度为W的短词(short words)首先确认高分值序列对(high scoring sequence paris，HSP)，当与数据库中同样长度的序列的一个词比对时所述短词匹配或符合一些正值的阈值数T。T是指临近词的阈值数(Altschul等人，如上)。这些最初临近的目标词(word hits)作为种子启动搜索以寻找含有它们的更长HSP。然后将该目标词沿着每个序列的两个方向延伸，只要累计比对分数能够增加即可。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的得分；总是>0)和N(错配残基的得分；总是<0)计算累计分数。对于氨基酸序列，使用打分矩阵计算累计分数。当累计比对分数从其最大值下降至数量X时；由于一个或多个负分值残基比对的累计而使得累计分数趋于0或低于0时；或当到达序列的一个末端时，目标词在每个方向的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用的词数(W)为28，预期值(E)为10，M＝1，N＝-2，进行双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用的词数(W)为3，预期值(E)为10，以及BLOSUM62打分矩阵(参见，Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间可能发生随机匹配的概率指示。例如，如果将测试核酸与参考核酸进行比较后的最小总概率为小于约0.01，更优选小于约10-5，最优选小于约10-20，即认为该核酸与参考序列相似。
“保守性修饰的变异体”应用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守性修饰的变异体是指，编码相同的或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。由于遗传密码简并，许多功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子定义的丙氨酸位点，该密码子可被改变为任何对应的密码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异称为“沉默变异”，其为保守性修饰的变异的一种。本文的每个编码多肽的核酸序列也描述该核酸的每个可能的沉默变异。本领域技术人员应理解，核酸的每个密码子(除AUG外，通常其为编码蛋氨酸的唯一密码子)均可修饰以产生功能上相同的分子。因此，每个编码多肽的核酸的沉默变异暗含在每个描述的序列中。
对于氨基酸序列，本领域技术人员应理解，在核酸、肽、多肽或蛋白序列中的单独替换，其改变了所编码序列的单一氨基酸或少量百分数的氨基酸，即“保守性修饰的变异体”，其中该改变导致用化学性质相似的氨基酸替换氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守替换表为本领域熟知。
下列6个组各自含有彼此保守替换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；以及
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
(参见，例如，Creighton,蛋白质(Proteins)(1984))。
应理解，在突变的PYR/PYL受体多肽中的替换突变不仅包括本说明书中所称的那些特定的氨基酸替换，例如，在本说明书的实施例部分或任何附图或表格中，还包括对这些特定氨基酸进行保守替换的氨基酸，只要该保守性替换的氨基酸不是野生型氨基酸。作为非限制性实例，其中突变的PYR/PYL受体多肽包含丝氨酸-至-苏氨酸的替换，应理解，突变的PYR/PYL受体多肽可替代性地包含丝氨酸-至-丙氨酸的替换，因为苏氨酸和丙氨酸彼此互为保守替换；然而，所述突变的PYR/PYL受体多肽不包含丝氨酸-至-丝氨酸的替换，因为丝氨酸为野生型PYR/PYL多肽中存在的氨基酸。
本文所用术语“激动剂(单/复数)”是指如本文其他地方描述的用体内和体外检测法确认的用于所描述的靶蛋白活性的分子。激动剂为制剂，例如，其诱导或激活靶蛋白的表达，或结合至、刺激、增加、启动、激活、促进、提高作用、敏化或上调靶蛋白(或编码多核苷酸)的活性。激动剂包括天然产生的和合成的分子。在一些实施方案中，所述激动剂为农业化学品，例如，杀菌剂、除草剂、杀虫剂和/或肥料。确定是否激动剂“激活”或“未激活”靶蛋白的检测包括，例如，使纯化的靶蛋白与推定的激动剂接触，然后如上所述确定其对靶蛋白活性的功能效果，或使表达靶蛋白的细胞与推定的激动剂接触，然后如上所述确定其对靶蛋白活性的功能效果。本领域技术人员应该能够确定，一项检测是否适合于确定是否激动剂激活或未激活靶蛋白。将以推定的激动剂处理的包含靶蛋白的样品或检测与无激动剂的对照样品进行比较，以检测其效果范围。指定对照样品(未以激动剂处理)的相对活性值为100％。当相对于对照的活性值为110％，优选150％，优选200％、300％、400％、500％或1000-3000％或更高时，实现了靶蛋白的激活作用。
本文所用术语“正交受体”是指已修饰为选择性识别新配体(“正交配体”)的受体。本文所用术语“正交配体”是指激活突变的或修饰的PYR/PYL受体多肽但不激活野生型PYR/PYL受体多肽的制剂。在一些实施方案中，正交配体为为农业化学品，例如，杀菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、植物激活剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂和/或肥料。
术语“植物”包括整株植物、嫩枝营养器官和/或结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官(例如，苞片、萼片、雄蕊、心皮、花药)、胚珠(包括卵细胞和中央细胞)、种子(包括受精卵、胚胎、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟子房)、幼苗、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)、细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、卫细胞等)及其子代。可用于本发明方法中的植物类别通常宽泛至可实施转化技术的高等和低等植物，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。其包括各种倍性的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。
本文所用术语“启动子”是指能够启动细胞中编码序列进行转录的多核苷酸序列。因此，用于本发明的多核苷酸构建体的启动子包括顺式作用转录调控元件和涉及调节或调控基因转录计时和/或比率的调控序列。例如，启动子可为顺式作用转录调控元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起始点、染色体整合序列、5'和3'端未翻译区或内含子序列，其与转录调控有关。通常这些顺式作用序列与蛋白质或其他生物分子相互作用以进行(打开/关闭、调节、控制等)基因转录。“植物启动子”为能够在植物细胞中启动转录的启动子。“组成性启动子”为能够在几乎所有组织类型中中启动转录的启动子，其中“组织特异性启动子”仅在一种或几种特定组织类型中启动转录。
如果多核苷酸序列源自外来的物种或源自同样物种但在其初始形式上做了修饰，则该多核苷酸序列对生物体或第二多核苷酸序列来说是“异源的”。例如，当说启动子可操作地连接至异源的编码序列时，是指所述编码序列来源于一个物种而所述启动子序列来源于另一个物种；或如果二者来源于相同物种，则所述编码序列与所述启动子并不天然地相关联(例如，为基因修饰的编码序列，例如，来源于相同物种的不同基因，或来源于不同生态型或品种的等位基因)。
“表达盒”是指核酸构建体，当其被引入至宿主细胞后分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。该定义清楚地包括不翻译或不能翻译的反义或正义构建体。本领域技术人员应理解，在转基因表达和内源基因抑制(例如，通过反义或正义抑制)两种情况下，插入的多核苷酸序列不必是相同的，但可仅与其所源自的基因序列基本上相同。如本文所描述，通过参考特定核酸序列，特别地涵盖了这些基本上相同的变异体。
如本文所用术语“非生物胁迫”、“胁迫”或“胁迫条件”是指将植物、植物细胞等暴露于非生命的(“非生物的”)物理或化学制剂，其对植物的代谢、生长、发育、繁殖或生存(总体地说“生长”)具有不利作用。施加于植物的胁迫可由于，例如，环境因子如水(例如，水涝、干旱或脱水)、缺氧条件(例如，低水平的氧和高水平的CO2)、异常渗透条件、盐分或温度(例如，热/高温、冷、冻害或霜)，营养缺乏或暴露于污染或通过激素、第二信使或其他分子。无氧胁迫，例如，由于氧气水平降低(低氧或缺氧)足以产生胁迫应答。因为比如雨季、潮湿季节、突发水涝或过度灌溉植物等发生的将植物、植物部分、组织或分离的细胞长期或暂时地浸没于液体媒介中会导致水涝胁迫。由于对于植物物种的最适宜生长温度范围的温度分别被降低或升高可导致发生冷胁迫或热胁迫。该最适宜生长温度范围易于被本领域技术人员确定或为他们所熟知。脱水胁迫可由于细胞、组织、器官或整个植物失水、膨压降低或减少含水量而诱导。干旱胁迫可由于细胞、组织、器官或生物体损失水分或供水减少而诱导或与其有关。盐分诱导的胁迫(盐胁迫)在细胞内或细胞外环境的渗透势混乱有关或由其所诱导。本文所用术语“非生物胁迫耐受性”或“胁迫耐受性”是指相比正常条件下，植物对非生物胁迫具有增加的抗性或耐受性，并在非生物胁迫条件下能有相对出众的表现。本文所用术语“抗旱性”和“耐旱性”是指相比正常情况，植物对供水减少诱导的胁迫具有增加的抗性或耐受性，并在缺水环境下能活动和生存，并有相对出众的表现。
发明详述
I.简介
令人惊奇的是，属于脱落酸(ABA)受体家族的蛋白，PYR/PYL受体家族，可突变为能够结合和应答除ABA以外的化学品。已发现在ABA存在下，当野生型PYR/PYL受体多肽与某些农业化学品接触时，降低了由ABA导致的PYR/PYL受体激活作用。另一个出人意料的启示是发现了对应于PYR1的K59残基的氨基酸，接触野生型PYR/PYL受体中ABA的PYR/PYL配体结合口袋的保守残基，可被突变为多种变异体从而能够产生多个正交配体的正交受体。
当随后对PYR/PYL受体多肽进行诱变和筛选以确定是否能够提高PYR/PYL受体与这些信化学激动剂的结合，出人意料地发现PYR/PYL受体多肽中一些突变导致由非天然配体(正交配体)激活所述突变的PYR/PYL多肽。而且，在一些情况下，所述突变重新构建了PYR/PYL的配体结合口袋，因而同时废除了天然配体(ABA)激活突变的PYR/PYL多肽的能力。
因此，有可能改变ABA受体如PYR/PYL受体多肽，以便除ABA以外的化合物可用于选择性地激活它们。而且，由于突变的PYR/PYL受体(正交受体)可通过应用正交配体(例如，作为一个程序的一部分而促进植物对缺水的应答)而被选择性地激活，可以避免“产量下降(yield drag)”的问题。产量下降通常与受体过表达有关，正常或最佳生长条件下(即，无干旱或其他胁迫)基因过表达与生长缓慢有关。
II.突变的PYR/PYL受体多肽
本发明提供：突变的PYR/PYL受体多肽，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受体多肽的化学品激活；以及编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受体多肽的化学品激活；包括编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的表达盒和表达载体，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受体多肽的化学品激活；包括突变PYR/PYL受体多肽的植物，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受体多肽的化学品激活；生产包括突变PYR/PYL受体多肽的植物的方法，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受体多肽的化学品激活；以及制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法。
在一些实施方案中，当PYR/PYL受体多肽与化学品接触时，突变的PYR/PYL受体多肽，而非野生型PYR/PYL受体多肽，被化学品溴草腈、羟敌草腈、碘苯腈、杀鼠迷、二氯苯腈、环酰菌胺、解草嗪或BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)激活。在本发明另一个实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽被不激活野生型PYR/PYL受体多肽的化学品激活，也被不激活野生型PYR/PYL受体多肽的化合物ABA激活。
众多野生型(天然产生的)PYR/PYL多肽序列为本领已知。尽管PYR1首先在拟南芥中被确定为脱落酸(ABA)受体，其实PYR1是在拟南芥的同样蛋白家族中也调节ABA信号转导的至少14种蛋白(PYR/PYL蛋白)的小组成员之一。该蛋白家族也存在于其他植物中(参见，例如，序列LISTING)，其部分特征在于存在多聚乙酰环化酶结构域2(PF10604)、多聚乙酰环化酶结构域1(PF03364)和Bet V I结构域(PF03364)中的一个或多个或全部。START/Bet v1超级家族结构域描述于，例如，Radauer，BMC Evol.Biol.8:286(2008)。在一些实施方案中，野生型PYR/PYL受体多肽包含SEQ ID NO:1-119中任一序列。在一些实施方案中，野生型PYR/PYL受体多肽与SEQ ID NO:1-119中任一序列基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％或99％相同)。
突变的PYR/PYL受体多肽是源自天然产生的(即，野生型)PYR/PYL受体多肽的变异体。变异体包括，例如，保持活性的融合蛋白、缺失、插入或突变。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽与下述任一序列基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％或99％相同)：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119，并包括如本文所述的与对应野生型PYR/PYL受体多肽相关的1、2、3、4、5、6或更多个突变。此外，在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽还包含与异源氨基酸序列融合的氨基和/或羧基末端。
发明人发现了许多影响对化学品应答的突变。一些突变在不同化学品的测试过程中产生并在一些情况下使得修饰的PYR/PYL受体蛋白能够对不同的一系列化学品产生应答。情况并非总是这样，一些突变显示出对一种化学品的选择性，而不显示出通过其他化学品促进对修饰的PYR/PYL受体蛋白的激活。在一些情况下，对于修饰的PYR/PYL受体蛋白来说单个突变足以使其通过化学品激动剂而激活。在其他情况下，多个突变使得修饰的PYR/PYL受体蛋白通过化学品激动剂而激活。在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体蛋白含有2、3、4、5、6或更多个突变，以便蛋白通过化学品激动剂而被激活。
修饰的PYR/PYL受体蛋白可在PYR/PYL受体多肽序列的任何位点发生突变。在一些情况下，如本文所讨论，突变可在PYR/PYL多肽的配体结合口袋中发生。然而，突变不必在PYR/PYL多肽的配体结合口袋中发生，以实现被正交配体激活。撇开特定理论的束缚而推测，由配体结合口袋外发生的导致PYR/PYL受体蛋白被正交配体激活的的突变，对配体结合结构具有间接影响，所述配体结合结构使得受体具有被正交配体激活的能力。进一步推测，对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中氨基酸K59的位点的特定突变使得PYR/PYL受体多肽相比野生型PYR/PYL受体多肽，能够更容易地被正交配体激活，其为对正交受体进行基因操作的理想特性。
本文所述的任何突变可产生于SEQ ID NO:1-119中任一序列的多肽或与SEQ IDNO:1-119中任一序列基本上相同的多肽。或者，上述任何突变可产生于含有确定PYR/PYL蛋白的任何一致性序列的多肽，例如，如下所述的。
一致性序列
PYR/PYL受体蛋白的描述，可参照确认保守氨基酸或基序(即，其中序列中的改变会改变蛋白功能)的序列比对和序列比对中发生变异的区(即，其中的序列变异不会明显影响蛋白活性)。SEQ ID NO:120-123提供了用于确认野生型PYR/PYL受体多肽的一致性序列。SEQ ID NO:120-123的一致性序列通过对拟南芥PYR/PYL受体蛋白家族所有14个成员的比对而产生。在SEQ ID NO:120-123的一致性序列中，大写字母表示在拟南芥PYR/PYL受体蛋白家族所有14个成员中完全保守的氨基酸残基，而"x"在拟南芥PYR/PYL受体蛋白家族所有14个成员中并非完全保守的氨基酸残基，其可为任何氨基酸。应理解，在一些实施方案中，当选择一个氨基酸插入至以"x"标记的位点，所述氨基酸选择在野生型或突变的PYR/PYL蛋白中对应位点发现的那些氨基酸。
PYR1至PYL13
CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQ ID NO:120)
GxxRxVxxxSxxPAxxSxExLxxxD(SEQ ID NO:121)
GGxHRLxNYxS(SEQ ID NO:122)
ESxxVDxPxGxxxxxTxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:123)
一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQ ID NO:120)包含对应于PYR1(SEQ ID NO:1)的氨基酸30-65的区。一致性序列GxxRxVxxxSxxPAxxSxExLxxxD(SEQID NO:121)包含对应于PYR1(SEQ ID NO:1)的氨基酸76-100的区。一致性序列GGxHRLxNYxS(SEQ ID NO:122)包含对应于PYR1(SEQ ID NO:1)的氨基酸112-122的区。ESxxVDxPxGxxxxxTxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:123)包含对应于PYR1(SEQ ID NO:1)的氨基酸141-171的区。
在一些情况下，PYR/PYL突变在SEQ ID NO:120-123的一致性序列内的残基上发生。在一些情况下，突变在PYR/PYL受体蛋白家族所有14个成员的完全保守的残基上发生。在一些情况下，突变在不完全保守的残基上发生。如本文所示，一致性序列内残基上的替换突变被描述为替换一致性序列氨基酸的括号。如果一个以上的氨基酸被这样的括号包住，就表明被括号包住的任一个氨基酸均可被替换为在所述一致性序列该残基上的野生型氨基酸。
此外，修饰的PYR/PYL受体蛋白可在一致性序列内包含一个以上的突变，或可包含至少2或更多的一致性序列且各一致性序列具有至少一个突变。
K59.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)。
Y120.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列GGxHRLxN[HC]xS(SEQID NO:150)。
I110.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列[STCAYW]xGGxHRLxNYxS(SEQ ID NO:151)。
P42.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAP[ST]xxxWxxxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQ ID NO:152)。
S47.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxW[PRA]xxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQ ID NO:153)。
K59和Y120.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和GGxHRLxN[HC]Xs(SEQ ID NO:150)。
K59和I110.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和[STCAYW]xGGxHRLxNYxS(SEQ ID NO:151)。
K59和P42.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAP[ST]xxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:154)。
K59和S47.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxW[PRA]xxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:155)。
H60.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxxx[R]FxxxC(SEQ ID NO:156)。
S92.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列GxxRxVxxxSxxPAxx[T]xExLxxxD(SEQ ID NO:157)。
E140.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列[GQD]SxxVDxPxGNxxxxTxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:158)。
K59和H60.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW][R]FxxxC(SEQ ID NO:159)。
K59和S92.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和GxxRxVxxxSxxPAxx[T]xExLxxxD(SEQ ID NO:157)。
K59和E140.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和[GQD]SxxVDxPxGNxxxxTxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:158)。
E94.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列GxxRxVxxxSxxPAxxSx[D]xLxxxD(SEQ ID NO:160)。
K59和E94.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和GxxRxVxxxSxxPAxxSx[D]xLxxxD(SEQ ID NO:160)。
N119.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列GGxHRLx[Y]YxS(SEQ IDNO:161)。
K59和N119.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和GGxHRLx[Y]YxS(SEQ ID NO:161)。
H115.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列GGx[Y]RLxNYxS(SEQ IDNO:162)。
F159.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列ESxxVDxPxGNxxxxTxx[SL]xxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:163)。
K59和F159.在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和ESxxVDxPxGNxxxxTxx[SL]xxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:163)。
因此，在一些实施方案中，本发明所述突变的PYR/PYL受体多肽包含一个或多个如上所述的一致性序列(SEQ ID NO:149-163)或其保守性变异体。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，所述突变的PYR/PYL受体多肽包含一个或多个如上所述的一致性序列(SEQ ID NO:149-163)或其保守性变异体。
修饰的PYR/PYL受体蛋白也可参考PYR/PYL多肽的序列标识符(“SEQ ID”)描述。修饰的PYR/PYL受体可包含本文所列举的SEQ ID，并进一步包含如本文所述的至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)在一个氨基酸位点的突变(例如，替换、缺失或插入突变)。因此，在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽包含SEQ ID NO:1-119中任一序列且还包括至少一个在任一氨基酸位点的突变。
或者，修饰的PYR/PYL受体可与本文所列举的SEQ ID基本上相同，并进一步包含在氨基酸位点上的至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)突变。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽与SEQ ID NO:1-119中任一序列基本上相同，还包括在任一氨基酸位点上的至少一个突变。
在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体蛋白在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中氨基酸位点59的残基上被修饰。在该残基上的突变，也称“K59”，破坏了修饰的PYR/PYL受体蛋白的ABA应答性。
在一些情况下，K59突变不仅足以废除修饰的PYR/PYL受体蛋白的ABA敏感性，还足以赋予修饰的PYR/PYL受体蛋白对新化学激动剂("正交配体")的敏感性。在一些情况下，导致受体被正交配体激活的K59突变为：丙氨酸残基替换为野生型残基，半胱氨酸残基替换为野生型残基，天冬氨酸残基替换为野生型残基，谷氨酸残基替换为野生型残基，苯丙氨酸残基替换为野生型残基，甘氨酸残基替换为野生型残基，组氨酸残基替换为野生型残基，亮氨酸残基替换为野生型残基，蛋氨酸残基替换为野生型残基，天冬酰胺残基替换为野生型残基，谷氨酰胺残基替换为野生型残基，精氨酸残基替换为野生型残基，丝氨酸残基替换为野生型残基，苏氨酸残基替换为野生型残基，缬氨酸残基替换为野生型残基，酪氨酸残基替换为野生型残基，或色氨酸残基替换为野生型残基。
此外，除K59突变外，修饰的PYR/PYL受体蛋白可包含至少一个以上突变。如下述的表1-5所示，已发现当修饰包括K59突变和在所述蛋白其他残基上的1、2、3、4或5个另外的突变时，很多化学激动剂可激活修饰的PYR/PYL受体蛋白。突变组合的非限制性示例列举，其中K59是一个突变位点，且其中修饰的PYR/PYL受体没有被ABA激活而是被正交配体激活，包括：
S47、K59和Y120
K59、Y120和V144
P42、K59和Y120
P42、K59、Y120和T124
P42、K59、Y120和E154
E12、E43、K59、I110和N133
E12、L25、E43、K59、I110和N133
P27、K59和K63
T57和K59
R50、K59和E141
K59、H60和N151
K59、H60、E102、T125和E141
K59和I82
K59和S92
H21、K59、H60、S92和R116
P41、K59和H60
K59和N119
Q24、K59、I82、F159和D161
K59、Y120和M158
P42、K59、Y120和M158
P42、K59、D97、Y120、V163和A172
P42、L44、K59、Y120、V138和M158
P42、K59、Y120、V123、V139和M158
S47、V49、K59、Y120、M158和A177
K59、V81、Y120、M158和V163
P27、P42、K59、D97、Y120、M158和T173
P42、K59、R74、Y120和M158
S29、K59、D97、Y120、V163和A172
P42、K59、Y120、V123、V139、M158和V163
K59、V81、Y120、M158和V163
E12、K59、V75、D97、Y120、V163和A172
L33、P42、K59、Y120、V123和M158
P42、K59、Y120、M158、V163和V174
R10、P42、K59、D97、Y120、V163和A172。
因此，在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的K59位的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸为X，其中X为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸或色氨酸。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽还包含从天然产生的残基至非天然产生的残基的至少一个另外的突变，所述突变在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、154、158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个另外的突变，所述突变为从对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、154、158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上的天然产生的残基至丙氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽包含至少一个另外的突变，所述突变在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、154、158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上，其中所述突变选自R10Q、E12G、E12K、L25R、P27L、S29N、L33F、P42S、E43G、L44F、S47P、V49I、R74C、V75I、V81M、D97N、I110S、Y120C、Y120H、V123I、T124M、N133D、V138M、V139I、V144A、E154G、M158I、V163I、A172T、T173A、V174I、A177T或其组合。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽还包括在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点62和110的一个或多个氨基酸位点上的异亮氨酸残基。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点62和110的一个或多个氨基酸位点上的缬氨酸-至-异亮氨酸突变。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个所述突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。
在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体蛋白已在除K59残基外的残基上被修饰。除K59以外的突变的非限制性示例列举，其中突变废除了ABA的激活作用但提高了正交配体对修饰的PYR/PYL受体蛋白的激活作用，包括：
D26
E94
F159。
因此，在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽包含在对应于PYR1(SEQ IDNO:1)中氨基酸位点26的氨基酸上的突变，其中所述突变为D26G。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中氨基酸位点94的氨基酸上的突变，其中所述突变为E94D。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽包含在对应于PYR1(SEQID NO:1)中氨基酸位点159的氨基酸上的突变，其中所述突变为F159L。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个所述突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。
在一些情况下，修饰的PYR/PYL受体蛋白已在除K59残基外的至少两个残基上被修饰。除K59突变以外的非限制性示例列举，其中所述突变废除了ABA的激活作用但提高了正交配体对修饰的PYR/PYL受体蛋白的激活作用，包括：
R37和F71
I110、E114和V138
H115和F159。
因此，在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽包含在对应于PYR1(SEQ IDNO:1)中位点37、71、110、114、115、138和/或159的氨基酸上的至少两个突变，其中所述突变选自R37Q、F71S、I110T、E114D、H115Y、V138M、F159S或其组合。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个所述突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽包含SEQ ID NO:124-148或164-178中任一序列。
PYR/PYL的配体结合口袋
PYR/PYL受体蛋白具有一个保守的START-结构域配体结合口袋，其两侧连接有两个称为“门”和“栓”的环(Melcher,K.等人，自然(Nature)462(2009))。ABA在配体结合口袋与PYR/PYL受体蛋白结合，且ABA结合诱导两个环关闭而将ABA封闭于配体结合口袋中。在野生型PYR/PYL受体蛋白中，当ABA结合至PYR/PYL受体蛋白的口袋中时，包括所述配体结合口袋的残基是那些具有长度在4埃以内的ABA或伴随ABA的水分子侧链的残基。例如，PYR1(SEQID NO:1)中包含配体结合口袋的残基为：P55、K59、F61、I62、R79、V81、V83、P88、A89、S92、E94、F108、I110、H115、L117、Y120、E141、F159、V163和N167。
在一些实施方案中，PYR/PYL受体多肽在包括PYR/PYL受体蛋白的配体结合口袋的至少一个氨基酸残基上发生突变。因此，在一些实施方案中突变的PYR/PYL受体多肽包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点55、59、61、62、79、81、83、88、89、92、94、108、110、115、117、120、141、159、163和/或167的氨基酸上的至少一个突变，其中所述突变选自P55、K59、F61、I62、R79、V81、V83、P88、A89、S92、E94、F108、I110、H115、L117、Y120、E141、F159、V163、N167或其组合。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个所述突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。.
本发明的实施方案在本发明的方法和组合物(例如，表达盒、植物等)中提供上述蛋白的用途和/或编码该多肽的核酸序列。编码植物野生型PYR/PYL受体(例如，从其中PYR/PYL序列还未确认的植物中)的多核苷酸序列的分离可通过许多技术来实现。例如，基于本文公开的PYR/PYL编码序列(例如，在序列表中列出的)的寡核苷酸探针可用于确认在cDNA或基因组DNA库中的所需野生型PYR/PYL基因。为构建基因组库，通过随机破碎来产生大片段的基因组DNA，例如，使用限制性内切酶，并连接至载体DNA以形成可包装至合适载体的串联体。为制备cDNA库，从所需组织如特定植物物种的叶子中分离mRNA，并从所述mRNA制备含有目标基因转录本的cDNA库。或者，可从自其中PYR/PYL基因已表达的其他组织中提取的mRNA制备cDNA。
然后，可用基于本文公开的PYR/PYL基因序列的探针筛选cDNA或基因组库。可用探针与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同植物物种中的同源基因。或者，可用培养的抗-多肽的抗体筛选mRNA表达库。
或者，编码PYR/PYL的核酸可用扩增技术从核酸样品扩增。例如，可用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA、cDNA、基因组库或cDNA库直接扩增PYR/PYL的编码序列。也可使用PCR和其他体外扩增方法，例如，克隆待表达的编码PYR/PYL的多核苷酸序列，将核酸用作探针用于检测样品中所需mRNA的存在，以用于核酸测序或其他目的。全面的PCR概述参见PCR指南：方法和应用指导(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)，(Innis,M.,Gelfand,D.,Sninsky,J.和White,T.编著)，圣迭戈，学术出版社(AcademicPress)(1990)。用于从植物组织中确认序列的合适引物和探针通过将本文提供的序列与其他相关基因进行比较而产生。
在一些实施方案中，许多植物的部分或全部基因组已经测序并公开了确认的阅读框。通过BLAST搜索可以在各种植物中确认野生型PYR/PYL的编码序列。
III.化学激动剂和激动剂制剂
本发明的实施方案提供农业化学制剂，其被配制用于接触突变的PYR/PYL受体多肽和/或含有突变的PYR/PYL受体多肽的植物，其中所述制剂含有本发明的突变PYR/PYL多肽的激动剂。在一些实施方案中，农业化学激动剂包括杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、植物活化剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂或肥料。在一些实施方案中，农业化学激动剂选自下组：溴草腈、羟敌草腈、碘苯腈、杀鼠迷、二氯苯腈、环酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
农业化学品通常制备并作为可促进吸收和效率的酯或盐用于植物。普遍存在的细胞酯酶的功能可将酯(或同系物如S-甲基衍生物或阿拉酸式苯)转变为生物活性形式的自由酸或醇。例如，溴草腈丁酯、溴草腈庚酸酯、溴草腈辛酸酯和溴草腈-钾为溴草腈的替代性制剂。吸收后这些化合物在植物中形成同样的生物活性种类(溴草腈)。羟敌草腈和碘苯腈的类似变异体能够制备且为已知(例如，碘苯腈-锂、碘苯腈辛酸酯、碘苯腈-钠等)。BTH为阿拉酸式苯的S-甲基衍生物，其为BTH在植物中的活性形式。
环酰菌胺
已发现，突变对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸，并一起突变PYR/PYL受体多肽中至少一个以上氨基酸导致修饰的受体被环酰菌胺(表1、7和8)激活。导致所述修饰的受体被环酰菌胺激活的突变组合的非限制性例举，包括：
S47P、K59R和Y120H
K59R、Y120H和V144A
P42S、K59R和Y120C
P42S、K59R、Y120C和T124M
P42S、K59R、Y120C和E154G
E12G、E43G、K59R、I110S和N133D
E12G、L25R、E43G、K59R、I110S和N133D
K59R、Y120H和M158I
P42S、K59R、Y120H和M158I
P42S、K59R、D97N、Y120H、V163I和A172T
P42S、L44F、K59R、Y120H、V138M和M158I
P42S、K59R、Y120H、V123I、V139I和M158I
S47P、V49I、K59R、Y120H、M158I和A177T
K59R、V81M、Y120C、M158I和V163I
P27L、P42S、K59R、D97N、Y120H、M158I和T173A
P42S、K59R、R74C、Y120H和M158I
S29N、K59R、D97N、Y120H、V163I和A172T
P42S、K59R、Y120H、V123I、V139I、M158I和V163I
K59R、V81M、Y120H、M158I和V163I
E12K、K59R、V75I、D97N、Y120H、V163I和A172T
L33F、P42S、K59R、Y120H、V123I和M158I
P42S、K59R、Y120H、M158I、V163I和V174I
R10Q、P42S、K59R、D97N、Y120H、V163I和A172T。
因此，在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体被环酰菌胺激活。在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL蛋白包含对应于上述各组的一组或多组突变。在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体蛋白包含对应于上述各组的任一组，还包括在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点62和110的一个或多个氨基酸位点上的异亮氨酸残基。在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体蛋白包含在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位点62和110的一个或多个氨基酸位点上的缬氨酸-至-异亮氨酸突变(例如，在PYL2(SEQ ID NO:3)中氨基酸位点64和/或114上的缬氨酸-至-异亮氨酸突变，其分别对应于PYR1中位点62和110)。在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体蛋白与SEQ ID NO:1-119任一序列基本上相同和/或包含选自SEQ ID NO:149-163的一个或多个一致性序列。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。
此外，在本发明一些实施方案中，筛选修饰的PYR/PYL受体多肽的方法包括筛选所述修饰的多肽以确定其是否被环酰菌胺激活。
溴草腈
已发现，突变对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸，并一起突变PYR/PYL受体多肽中至少一个以上氨基酸导致所述修饰的受体被溴草腈(表2)激活。导致所述修饰的受体被溴草腈激活的突变组合的非限制性例举，包括：
T57A和K59R
R50G、K59R和E141Q
K59、H60R和N151D
K59R、H60R、E102G、T125A和E141D
K59R和I82N
K59R和S92T
H21Y、K59R、H60R、S92T和R116K
P41L、K59R和H60R。
因此，在一些实施方案中，本发明修饰的PYR/PYL受体被溴草腈或溴草腈类似物羟敌草腈和碘苯腈激活。在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL蛋白包含对应于上述各组的一组或多组突变。在一些实施方案中，该蛋白与SEQ ID NO:1-119中任一序列基本上相同和/或包含选自SEQ ID NO:149-163的一个或多个一致性序列。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。
此外，在本发明一些实施方案中，筛选修饰的PYR/PYL受体多肽的方法包括筛选所述修饰的多肽以确定其是否被溴草腈或溴草腈类似物羟敌草腈和碘苯腈激活。
二氯苯腈
在一些情况下，仅突变对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸导致修饰的受体被二氯苯腈(表3)激活。突变对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸，并一起突变PYR/PYL受体多肽中至少一个以上氨基酸导致所述修饰的受体被二氯苯腈激活。在一些情况下，为使二氯苯腈激活所述受体，并不需要突变所述修饰的PYR/PYL受体多肽中对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸，只要在PYR/PYL受体多肽中另一个氨基酸上存在至少一个突变。导致修饰的PYR/PYL受体被二氯苯腈激活的突变组合的非限制性例举，包括：
K59R
D26G
E94D
R37Q和F71S
P27L、K59R和K63N。
因此，在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体被二氯苯腈激活。在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL蛋白包含对应于上述各组的一组或多组突变。在一些实施方案中，该蛋白与SEQ ID NO:1-119中任一序列基本上相同和/或包含选自SEQ ID NO:149-163的一个或多个一致性序列。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。
此外，在本发明一些实施方案中，筛选修饰的PYR/PYL受体多肽的方法包括筛选所述修饰的多肽以确定其是否被二氯苯腈激活。
解草嗪
在一些情况下，仅突变对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸导致修饰的受体被解草嗪(表4)激活。在一些情况下，为使解草嗪激活所述受体，并不需要突变修饰的PYR/PYL受体多肽中对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸，只要在所述PYR/PYL受体多肽中另一个氨基酸上存在至少一个突变。导致修饰的PYR/PYL受体被解草嗪激活的突变组合的非限制性例举，包括：
K59R和N119Y
I110T、E114D和V138M。
因此，在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体被解草嗪激活。在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL蛋白包含对应于上述各组的一组或多组突变。在一些实施方案中，该蛋白与SEQ ID NO:1-119中任一序列基本上相同和/或包含选自SEQ ID NO:149-163的一个或多个一致性序列。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。
此外，在本发明一些实施方案中，筛选修饰的PYR/PYL受体多肽的方法包括筛选所述修饰的多肽以确定其是否被解草嗪激活。
BTH
在一些情况下，突变PYR/PYL受体多肽中一个氨基酸导致修饰的受体被BTH(表5)激活。在一些情况下，突变PYR/PYL受体多肽中两个或更多氨基酸导致所述修饰的受体被BTH激活。导致修饰的PYR/PYL受体被BTH激活的突变组合的非限制性例举，包括：
Q24R、K59R、I82T、F159L和D161G
H115Y和F159S
F159L。
因此，在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体被BTH激活。在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL蛋白包含对应于上述各组的一组或多组突变。在一些实施方案中，该蛋白与SEQ ID NO:1-119中任一序列基本上相同和/或包含选自SEQ ID NO:149-163的一个或多个一致性序列。在一些实施方案中，本发明提供编码一个或多个所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。
此外，在本发明一些实施方案中，筛选修饰的PYR/PYL受体多肽的方法包括筛选所述修饰的多肽以确定其是否被BTH激活。
可通过本领域人员已知的各种方法制备化学激动剂，例如，描述于综合有机转化(Comprehensive Organic Transformations)，第二版，Richard C.Larock编著，1999中的方法。上述方法中的起始原料可商业获得(Sigma-Aldrich公司)或可通过本领域人员已知的方法制备。
在一些实施方案中，预期的农业化学制剂被配制为用于与植物接触。根据本发明，所述制剂适于例如在载体中处理植物或植物繁殖材料如种子。合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、涂覆剂、多糖和研磨剂。示例性载体包括水、水溶液、浆液、固体和干粉(例如，泥炭、小麦、麦麸、蛭石、粘土、巴氏杀菌的土壤、许多形式的碳酸钙、白云石、各种等级的石膏、膨润土和其它粘土矿物、岩石磷酸盐和其它磷化合物、二氧化钛、腐殖质、滑石、藻酸盐和活性炭)。本领域技术人员已知的任何农业上合适的载体均可接受并可考虑用于本发明中。任选地，所述制剂还可包括至少一个表面活性剂、除草剂、杀真菌剂、杀虫剂或肥料。
农业化学制剂与突变的PYR/PYL受体多肽的接触可在体外进行(例如，其中突变的PYR/PYL受体多肽以纯化形式存在或在酵母细胞中表达)或在体内进行(例如，其中突变的PYR/PYL受体多肽由植物表达)。可使用各种已知的方法使农业化学制剂与突变的PYR/PYL受体多肽在体外接触，例如，通过将所述制剂应用于蛋白结合试验、哺乳动物或酵母双杂交试验、竞争试验或使用其他生物体的基于细胞的实验。
可使用各种已知的方法使农业化学制剂与突变的PYR/PYL受体多肽在体内(例如，与植物)接触，例如，通过在繁殖材料上喷洒、雾化、撒粉、散布组合物，或在植物上涂刷或倾浇组合物或与其接触，或在种子的情况下，通过涂覆、包衣种子或其他方法处理种子。或者，在种植以前直接处理植物或种子，可将本发明所述制剂引入至用于播种种子的土壤或其他媒介中。在一些实施方案中，该实施方案中也使用载体。如上所述，载体可为固体或液体。在一些实施方案中，将泥炭悬浮于水中作为化学激动剂的载体，种植时将混合物喷洒至土壤或种植媒介和/或种子上。
IV.制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法
本发明的实施方案提供制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法，所述突变的PYR/PYL受体多肽被不激活野生型PYR/PYL受体多肽的化学品激动剂激活。在一些实施方案中，方法包括诱变野生型PYR/PYL受体多肽，使一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽与推定的化学激动剂接触，以及确定所述化学品是否激活所述一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽，其中激活作用确认所述一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽被所述化学品激活。
突变的PYR/PYL受体多肽可通过对编码对应野生型PYR/PYL受体多肽(例如，SEQID NO:1-119中任一序列的野生型PYR/PYL多肽或本发明突变体PYR/PYL受体多肽产生的对应变异体)的DNA序列进行突变而构建，如通过使用通常所说的定点诱变技术。可通过本领域技术人员熟知的各种聚合酶链反应(PCR)技术对编码野生型PYR/PYL受体多肽的核酸分子进行突变(参见，例如，PCR策略(PCR Strategies)(M.A.Innis，D.H.Gelfand和J.J.Sninsky编著，1995，学术出版社(Academic Press)，加利福尼亚州圣迭戈市)第14章；PCR指南：方法和应用指导(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)(M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky和T.J.White编著，学术出版社(Academic Press)，纽约，1990)。
以非限制性实例的方式，诱变可通过易错PCR扩增(ePCR)的方法来完成，为了提高DNA复制的错误增加率，其修改了PCR反应条件(例如，使用易错聚合酶，改变镁或锰的浓度，或提供未经平衡的dNTP比率)。用于ePCR诱变的试剂盒可商业获得，如PCR诱变试剂盒(Stratagene公司)和PCR随机诱变试剂盒(Clontech公司)。简而言之，将DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)、盐(例如，MgCl2,MgSO4或MnSO4)、未经平衡比率的dNTP、反应缓冲剂和DNA模板组合起来按照生产商的指导进行标准的PCR扩增。ePCR扩增后，将反应产物克隆至合适的载体以构建诱变库，然后如下所述将其转化至合适的细胞(例如，酵母细胞)用于随后的筛选(例如，通过双杂交筛选)。
或者，可通过重组(即，DNA改组)来完成诱变。简而言之，通过将亲本DNA随机破碎再使用PCR进行重组，使用体外同源重组进行DNA改组而产生改组的突变体库，导致随机引入的点突变。进行DNA改组的方法为本领域已知(参见，例如，Stebel,S.C.等人，MethodsMol Biol 352:167-190(2007))。
任选地，为了提高分离的突变体蛋白的效率，可进行多轮诱变。因此，在一些实施方案中，分离自ePCR的PYR/PYL突变体以及随后的筛选可合并，且用作模板用于后来几轮诱变。
V.筛选突变的PYR/PYL受体多肽的激动作用(Agonism)
本发明实施方案还提供筛选推定的化学激动剂的方法以确定，当推定的激动剂与PYR/PYL受体多肽接触时，是否推定的激动剂激活突变的PYR/PYL受体多肽，而不明显激活野生型PYR/PYL受体多肽。如本文所用，如果一种制剂的存在导致PYR/PYL受体蛋白的激活作用或活性上调，那么该制剂就“激活(agonize)”该受体，例如，提高来自PYR/PYL受体的下游信号转导。对于本发明，如果当一种制剂以不大于200μM的浓度存在时，使该制剂与PYR/PYL受体接触导致PYR/PYL受体的激活作用或活性上调，那么该制剂激活所述PYR/PYL受体。如果当一种制剂以不大于200μM的浓度存在时，使该制剂与PYR/PYL受体接触不诱导PYR/PYL受体蛋白的激活作用或活性上调，那么该制剂不明显激活所述PYR/PYL受体。如本文所用，“激活作用(activation)”需要由所述制剂诱导的最小活性阈值。确定是否该符合的(met)最小活性阈值能够实现，例如，通过使用酶法磷酸酶试验，设定必须诱导的酶活性水平的最小值，或在颜色检测试剂存在下(例如，磷酸对硝基苯酯)，通过使用酶的磷酸酶试验，其中如果观察到颜色变化则最小活性阈值符合要求。
可使用许多不同筛选方案确认激活突变的PYR/PYL受体多肽而非野生型PYR/PYL受体多肽的化学制剂。可使用分离的、纯化的或部分纯化的制剂进行筛选。在一些实施方案中，可使用纯化的或部分纯化的PYR/PYL多肽。
或者，可使用基于细胞的或基于植物的筛选方法。例如，可使用天然表达野生型PYR/PYL受体多肽的细胞或重组地表达野生型或突变的PYR/PYL受体多肽的细胞。在一些实施方案中，所用细胞为植物细胞、动物细胞、细菌细胞、真菌细胞，包括但不限于酵母细胞，昆虫细胞或哺乳动物细胞。总的来说，筛选方法涉及筛选一个或多个化学制剂以确认激活突变PYR/PYL受体多肽的活性(例如，激活突变的PYR/PYL受体多肽或增加突变的PYR/PYL受体多肽表达或编码突变的PYR/PYL受体多肽的转录体)的制剂，但该制剂并不激活野生型PYR/PYL受体多肽的活性。任选地，筛选方法可包含两个筛选过程：首先，筛选多个推定的激动剂以确认与野生型PYR/PYL受体多肽发生弱相互作用的化合物(“弱配体”)，然后，筛选这些针对野生型PYR/PYL受体多肽的弱配体和多个诱变的PYR/PYL受体多肽，从而确定哪个突变的PYR/PYL受体多肽被弱配体激活以及哪个弱配体只是选择性激活突变的PYR/PYL受体多肽而不激活野生型PYR/PYL受体多肽。
结合试验
任选地，通过筛选能够结合野生型PYR/PRL受体多肽的制剂而进行初步筛选。弱结合配体预选提高了分离被所述制剂激活的突变PYR/PYL受体多肽的频率，推测因为需要配体结合位点的更少改变来实现分子识别。
结合试验可包括使野生型PYR/PYL受体多肽与一种或多种化学制剂结合并允许蛋白和化学制剂有足够时间来形成结合复合体。使用众多已有分析技术中的任何技术均可检测所形成的任何结合复合体。蛋白结合试验包括但不限于，测量共沉淀或在非变性SDS聚丙烯酰胺凝胶上共迁移和在免疫印迹上共迁移的方法(参见，例如，Bennet,J.P.和Yamamura,H.I.(1985)“神经递质、激素或药物受体结合方法(Neurotransmitter,Hormone or DrugReceptor Binding Methods)”，神经递质受体结合(Neurotransmitter ReceptorBinding)(Yamamura,H.I.,等人编著),pp.61-89。其他结合试验包括使用质谱或NMR技术确认分子结合至PYR/PYL多肽或标记底物的置换(例如，标记的农业化学品)。该试验中所用的PYR/PYL多肽蛋白可天然地表达、克隆或合成。
激动剂试验
激动剂试验可包括筛选推定的化学激动剂(其可能已预选或未预选为弱结合配体)以确定哪个推定的激动剂激活至少一个突变的PYR/PYL受体多肽而不激活野生型PYR/PYL受体多肽，和/或用推定的化学激动剂(其可能已预选或未预选为弱结合配体)筛选诱变的PYR/PYL受体多肽以确定哪个诱变的PYR/PYL受体多肽被所述推定的激动剂激活。
可使用任何数量的试验筛选突变PYR/PYL受体多肽的激动剂。一种活性试验包括检测是否一种推定的激动剂能够以激动剂-特定方式诱导突变的PYR/PYL蛋白与2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽结合。可使用哺乳动物或酵母双杂交法(参见，例如，Bartel,P.L.等人，Methods Enzymol,254:241(1995))确认当在一起在细胞中表达时互相作用或结合的多肽或其他分子。在一些实施方案中，激活突变的PYR/PYL受体多肽而非野生型PYR/PYL受体多肽的制剂，在PYR/PYL多肽和2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽之间于双杂交试验确认，其中激动剂被确认为激活或使PYR/PYL多肽和PP2C多肽相结合的制剂。因此，两种多肽在所述制剂存在下结合，而其在无所述制剂下不结合。任选地，阳性和阴性挑选方案均可用于双杂交试验中。例如，酵母双杂交试验可使用URA3报告菌株进行阳性和阴性挑选；在无外源尿嘧啶供给下URA菌株的生长使得能够对促进激动剂应答性(即，激动剂-促进的蛋白-蛋白相互作用)的突变体进行阳性挑选，当在FOA(5-氟-乳清酸，其被URA3代谢为有毒代谢物)上生长时使得能够选择促进激动剂应答(例如，去除导致组成性(即，非配体化)相互作用的突变体)的突变体。
还提供了筛选提高突变PYR/PYL受体多肽的表达而不提高野生型PYR/PYL受体多肽的表达的化合物。筛选方法通常包括进行基于细胞的或基于植物的试验，其中使测试化合物与一个或多个表达PYR/PYL多肽的细胞接触，然后检测在PYR/PYL表达(转录或翻译产物)上的增加。试验可在天然表达野生型PYR/PYL的细胞中进行，或在重组改变后表达突变的或野生型PYR/PYL的细胞中进行。可进行各种对照试验以确信所观察的活性是真实的，包括与缺少报告构建体的细胞进行平行反应，或不使含有所述报告构建体的细胞与测试化合物接触。
通过任何前述筛选方法初步确认的制剂和突变的PYR/PYL受体多肽，可进一步检测以证实其明显的活性和/或确定所述制剂和/或突变PYR/PYL受体多肽的其他生物功能。在一些情况下，对于所确认制剂和/或突变的PYR/PYL受体多肽，检测其对植物胁迫(例如，耐旱性)、种子萌发或受ABA作用的另一表现型的影响能力。本领域已知很多这种试验和表现型，并能够根据本发明方法使用。
VI.重组表达载体
一旦获得了编码突变PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列，其也可用于制备在转基因植物中在异源启动子的控制下表达所述突变的PYR/PYL受体多肽的表达盒。突变的PYR/PYL多核苷酸的表达增加可用于，例如，生产对不激活内源PYR/PYL受体蛋白的化学激动剂产生应答的植物，由此而提高非生物胁迫抗性。
本领域熟知的众多方法中的任何方法均可用于促进植物中的突变PYR/PYL活性或表达。其可靶向任何器官如枝芽营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实。或者，突变的PYR/PYL多核苷酸可进行组成性表达(例如，使用CaMV 35S启动子)。
为了在上述技术中使用突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列，制备适于转化植物细胞的重组DNA载体。转化各种高等植物物种的技术是已知的并描述于技术和科技文献中。参见，例如，Weising等人，Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)。优选地，将编码突变的PYR/PYL受体多肽的DNA序列与转录和翻译启动调控序列组合，所述启动调控序列调控从转化植物目标组织的基因进行序列转录。
例如，可使用植物启动子片段调控再生植物各种组织中突变的PYR/PYL多核苷酸的表达。本文将这样的启动子称为“组成性”启动子，其在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下具有活性。组成性启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录启动区，源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1'-或2'-启动子，来自各种植物基因的其他转录启动区也为本领域技术人员所知。
或者，植物启动子可在特定组织(组织特异性启动子)或者也可在更加精确的环境控制下(可诱导性启动子)调控突变的PYR/PYL受体蛋白的表达。在发育控制下的组织特异性启动子的实例包括仅在一些组织如叶子或保卫细胞(包括但不限于那些公布于WO/2005/085449；美国专利No.6,653,535；Li等人,Sci China C Life Sci.2005年4月，48(2):181-6；Husebye等人，植物生理学(Plant Physiol),2002年4月,Vol.128,pp.1180-1188；以及Plesch,等人，Gene,Volume 249,Number 1,16May 2000,pp.83-89(7))中启动转录的启动子。可通过可诱导性启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、升高的温度或光的存在。
如果期望合适的蛋白表达，在编码区的3'-端需要含有多腺苷酸化区。所述多腺苷酸化区可来自天然产生的PYR/PYL基因、各种其他植物基因或T-DNA。
含有所述序列(例如，启动子或PYR/PYL编码区)的载体通常包括在植物细胞上赋予可选择的表现型的标记基因。例如，所述标记基因可编码杀生剂抗性，尤其是抗生素抗性如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性，或除草剂抗性如对绿黄隆(chlorosluforon)或Basta的抗性。
在一些实施方案中，所述突变的PYR/PYL核酸序列在植物细胞中重组地表达。可制备适于转化植物细胞的各种不同表达构建体如表达盒和载体。转化各种高等植物物种的技术是已知的并描述于技术和科技文献中。参见，例如，Weising等人Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)。可将编码PYR/PYL蛋白的DNA序列与顺式作用(启动子)和反式作用(增强子)转录调控序列组合，以调控转化的植物目标组织中的转录时间、组织类型和水平。也可使用翻译控制元件。
本发明实施方案还提供了可操作地连接至启动子的突变PYR/PYL核酸，在一些实施方案中，所述启动子能够启动植物中PYR/PYL编码序列的转录。所述启动子可源自，例如，植物或病毒来源。所述启动子可具有，例如，组成型活性、可诱导性或组织特异性。在构建本发明的重组表达盒、载体、转基因中，可选择不同的启动子并用于区别地调控基因表达，例如，在植物或动物的一些或所有组织中。
组成性启动子
可使用启动子片段调控在所有转化细胞或组织中突变的PYR/PYL核酸的表达，例如，再生植物的转化细胞或组织。术语“组成性调控元件”是指赋予可操作地连接的核酸分子表达水平的调控元件，所述核酸分子相对独立于所述组成性调控元件表达的细胞或组织类型。在植物中表达的组成性调控元件通常在大量细胞和组织类型中广泛表达。在生理条件下连续地调控表达的启动子被称为“组成性”启动子，并在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下具有活性。
可用于在转基因植物中异位表达的各种组成性调控元件为本领域熟知。例如花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子，是一种被很好地表征的在所有植物组织中产生高表达水平的组成性调控元件(Odell等人，自然(Nature)313:810-812(1985))。由于其在很多不同的植物物种中具有活性，CaMV 35S启动子非常有用(Benfey和Chua,科学(Science)250:959-966(1990)；Futterer等人，Physiol.Plant 79:154(1990)；Odell等人，supra,1985)。其中内在启动子元件已复制的串联35S启动子赋予了比未修饰的35S启动子更高的表达水平(Kay等人，科学(Science)236:1299(1987))。其他有用的组成性调控元件包括，例如，花椰菜花叶病毒19S启动子；玄参花叶病毒启动子；以及胭脂碱合成酶(nos)基因启动子(Singer等人，Plant Mol.Biol.14:433(1990)；An,植物生理学(Plant Physiol.)81:86(1986))。
其他的组成性调控元件，包括在单子叶植物中有效表达的组成性调控元件，也是本领域已知的，例如，the pEmu启动子和基于水稻肌动蛋白-1的5'区的启动子(Last等人，Theor.Appl.Genet.81:581(1991)；Mcelroy等人，Mol.Gen.Genet.231:150(1991)；Mcelroy等人，植物细胞(Plant Cell)2:163(1990))。组合有来自不同基因的元件的嵌合性调控元件也可用于编码突变PYR/PYL受体蛋白的核酸分子的异位表达(Comai等人，PlantMol.Biol.15:373(1990))。
其他组成性启动子的实例包括来自根癌农杆菌T-DNA的1'-或2'-启动子(参见，例如，Mengiste(1997)supra；O'Grady(1995)Plant Mol.Biol.29:99-108)；肌动蛋白启动子如拟南芥(Arabidopsis)肌动蛋白基因启动子(参见，例如，Huang(1997)PlantMol.Biol.1997 33:125-139)；酒精脱氢酶(Adh)基因启动子(参见，例如，Millar(1996)Plant Mol.Biol.31:897-904)；来自拟南芥的ACT11(Huang等人Plant Mol.Biol.33:125-139(1996)),来自拟南芥的Cat3(GenBank No.U43147，Zhong等人，Mol.Gen.Genet.251:196-203(1996))，来自油菜(Brassica napus)的编码硬脂酰-酰基载体蛋白脱氢酶的基因(Genbank No.X74782,Solocombe等人Plant Physiol.104:1167-1176(1994))，来自玉米的GPc1(GenBank No.X15596,Martinez等人J.Mol.Biol 208:551-565(1989))，来自玉米的Gpc2(GenBank No.U45855,Manjunath等人，Plant Mol.Biol.33:97-112(1997))，来自各种植物基因的其他转录启动区为本领域技术人员所知。参见，Holtorf Plant Mol.Biol.29:637-646(1995)。
可诱导性启动子
或者，植物启动子可调控改变的环境条件或发育条件影响下的突变PYR/PYL多核苷酸的表达。可通过可诱导性启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、升高的温度或光的存在。本发明将这样的启动子称为“可诱导性”启动子。例如，本发明可整合干旱特异性启动子如玉米的干旱-可诱导性启动子(例如，玉米的rab17干旱-可诱导性启动子(Vilardell等人(1991)Plant Mol.Biol.17:985-993；Vilardell等人(1994)PlantMol.Biol.24:561-569))；或者来自马铃薯的寒冷、干旱和高盐可诱导性启动子(Kirch(1997)Plant Mol.Biol.33:897-909)。
或者，将当暴露于植物激素如生长素时可诱导的植物启动子用于表达突变的PYR/PYL多核苷酸。例如，本发明可使用大豆的生长素-应答元件E1启动子片段(AuxREs)(Glycine max L.)(Liu(1997)植物生理学(Plant Physiol.)115:397-407)；生长素-应答性拟南芥GST6启动子(也对水杨酸和过氧化氢产生应答)(Chen(1996)Plant J.10:955-966)；烟草的生长素-可诱导性parC启动子(Sakai(1996)37:906-913)；植物生物素应答元件(Streit(1997)Mol.Plant Microbe Interact.10:933-937)；以及对胁迫激素脱落酸产生应答的启动子(Sheen(1996)科学(Science)274:1900-1902)。
当暴露于可用于植物的化学制剂如除草剂或抗生素时可诱导的植物启动子，也可用于表达突变的PYR/PYL多核苷酸。例如，可使用被苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子(De Veylder(1997)植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)38:568-577)；应用不同的除草剂安全剂诱导独特的基因表达方式，包括在根部、排水器和顶端分生组织中的表达。PYR/PYL编码序列也可在例如四环素-可诱导性启动子的控制下，例如，含有燕麦(Avenasativa L.)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物(Masgrau(1997)Plant J.11:465-473)；或水杨酸应答性元件(Stange(1997)Plant J.11:1315-1324；Uknes等人，植物细胞(PlantCell)5:159-169(1993)；Bi等人，Plant J.8:235-245(1995))。
有用的可诱导性调控元件的实例包括铜-可诱导性调控元件(Mett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4567-4571(1993)；Furst等人，细胞(Cell)55:705-717(1988))；四环素和盐酸氯四环素-可诱导性调控元件(Gatz等人，Plant J.2:397-404(1992)；等人，Mol.Gen.Genet.243:32-38(1994)；Gatz,Meth.Cell Biol.50:411-424(1995))；蜕皮激素可诱导性调控元件(Christopherson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314-6318(1992)；Kreutzweiser等人，Ecotoxicol.Environ.Safety 28:14-24(1994))；热激可诱导性调控元件(Takahashi等人，植物生理学(Plant Physiol.)99:383-390(1992)；Yabe等人，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)35:1207-1219(1994)；Ueda等人，Mol.Gen.Genet.250:533-539(1996))；以及lac操纵子元件，其被用于与组成性表达的lac阻抑蛋白结合而赋予，例如，IPTG-可诱导表达(Wilde等人，EMBO J.11:1251-1259(1992))。可用于本发明的转基因植物的可诱导性调控元件也可为，例如，来自菠菜亚硝酸盐还原酶基因的硝酸盐-可诱导性启动子(Back等人，Plant Mol.Biol.17:9(1991))或光-可诱导性启动子如那些与RuBP羧化酶小亚单位或LHCP基因家族有关的启动子(Feinbaum等人，Mol.Gen.Genet.226:449(1991)；Lam和Chua,科学(Science)248:471(1990))。
组织特异性启动子
或者，所述植物启动子可调控突变的PYR/PYL多核苷酸在特定组织中的表达(组织特异性启动子)。组织特异性启动子是在植物发育中的特定时间在特定细胞或组织如营养组织或生殖组织中具有活性的转录调控元件。
在发育控制下的组织特异性启动子的实例包括仅(或主要仅)在某些组织如营养组织中启动转录的启动子，所述营养组织为，例如，根或叶或生殖组织如果实、胚珠、种子、花粉、花瓣、花或任何胚胎组织或上皮或叶肉。生殖组织特异性启动子可为，例如，胚珠-特异性、胚胎-特异性、胚乳-特异性、珠被-特异性、种子和种皮-特异性、花粉-特异性、花瓣-特异性、萼片-特异性或它们的一些组合。在一些实施方案中，所述启动子为细胞类型特异性，例如，保卫细胞-特异性。
其他组织特异性启动子包括种子启动子。合适的种子-特异性启动子来自下列基因：玉米的MAC1(Sheridan(1996)Genetics 142:1009-1020)；玉米的Cat3(GenBankNo.L05934,Abler(1993)Plant Mol.Biol.22:10131-1038)；拟南芥的vivparous-1(Genbank No.U93215)；拟南芥的atmyc1(Urao(1996)Plant Mol.Biol.32:571-57；Conceicao(1994)Plant 5:493-505)；油菜的napA(GenBank No.J02798,Josefsson(1987)JBL 26:12196-1301)；以及油菜的油菜籽蛋白基因家族(Sjodahl(1995)Planta 197:264-271)。
许多特异性地在营养组织如叶、茎、根和块根中具有活性的启动子也可用于编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。例如，可使用控制马铃薯块茎中的主要储藏蛋白马铃薯糖蛋白的启动子，参见，例如，Kim(1994)Plant Mol.Biol.26:603-615；Martin(1997)Plant J.11:53-62。也可使用在根中表现出高活性的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的ORF13启动子(Hansen(1997)Mol.Gen.Genet.254:337-343。其他有用的营养组织特异性启动子包括：编码主要的芋头(Colocasia esculenta L.Schott)球茎蛋白家族球蛋白的基因的tarin启动子(Bezerra(1995)Plant Mol.Biol.28:137-144)；在芋头球茎发育过程中具有活性的仙茅甜蛋白启动子(de Castro(1992)植物细胞(Plant Cell)4:1549-1559)以及烟草根-特异性基因TobRB7的启动子，其表达定位于根分生组织和未成熟的中轴区(Yamamoto(1991)植物细胞(Plant Cell)3:371-382)。
可使用叶-特异性启动子如核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)启动子。例如，番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因在叶和光-生长幼苗中表达，仅RBCS1和RBCS2在发育中的番茄果实表达(Meier(1997)FEBS Lett.415:91-95)。可使用几乎仅在叶片和叶鞘的叶肉细胞中高水平表达的核酮糖二磷酸羧化酶启动子，其描述于Matsuoka(1994)Plant J.6:311-319。另一种叶-特异性启动子为捕光叶绿素a/b结合蛋白基因启动子，参见，例如，Shiina(1997)植物生理学(Plant Physiol.)115:477-483；Casal(1998)植物生理学(Plant Physiol.)116:1533-1538。拟南芥(Arabidopsis thaliana)myb-相关基因启动子(Atmyb5)为叶-特异性的，其描述于Li(1996)FEBS Lett.379:117-121。Atmyb5启动子在幼嫩莲座叶和茎叶边缘发育的叶毛、托叶和上皮细胞中和未成熟的种子中表达。Atmyb5mRNA在从受精到胚胎发育的16个细胞阶段期间出现，并持续至超过心形阶段。也可使用在玉米中确认的叶子启动子，Busk(1997)Plant J.11:1285-1295。
另一类有用的营养组织特异性启动子为分生组织(根尖和茎尖)启动子。例如，可使用在发育中的芽尖或根尖分生组织具有活性的“SHOOTMERISTEMLESS”和“SCARECROW”启动子，描述于Di Laurenzio(1996)细胞(Cell)86:423-433；和Long(1996)自然(Nature)379:66-69。另一个有用的启动子为控制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因表达的启动子，其表达限于分生组织和花器官(柱头分泌区、成熟花粉颗粒、雌蕊维管组织和受精卵细胞)组织(参见，例如，Enjuto(1995)植物细胞(Plant Cell).7:517-527)。还可使用在分生组织-特异性表达的玉米和其他物种的kn1-相关基因，参见，例如，Granger(1996)Plant Mol.Biol.31:373-378；Kerstetter(1994)植物细胞(Plant Cell)6:1877-1887；Hake(1995)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.350:45-51。例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)KNAT1启动子(参见，例如，Lincoln(1994)植物细胞((PlantCell))6:1859-1876)。
本领域技术人员应理解，组织特异性启动子可启动在除目标组织以外的组织中可操作地连接的序列的表达。因此，如本文所用，组织特异性启动子优先启动目标组织中的表达，但也可启动其他组织中的一些表达。
在另一个实施方案中，突变的PYR/PYL多核苷酸通过转座因子而表达。这使得所述组成型活性多肽能够进行组成性、周期性和低频率的表达。本发明还提供源自病毒的组织特异性启动子的应用，包括例如，烟草花叶病毒亚基因组启动子(Kumagai(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1679-1683；水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)，其仅在感染的水稻植物韧皮部细胞中复制，且其启动子启动强的韧皮部-特异性报告基因表达；木薯叶脉花叶病毒(CVMV)启动子，在维管组织、叶肉组织细胞和根尖组织中具有高活性(Verdaguer(1996)Plant Mol.Biol.31:1129-1139)。
VII.转基因植物的生产
如本文详述，如本文所述在植物中，本发明的实施方案提供含有用于表达突变体PYR/PYL受体蛋白的重组表达盒的转基因植物。在一些实施方案中，所产生的转基因植物含有除所述转基因植物以外的物种的多核苷酸的完整或部分序列。应理解，转基因植物包括所述植物或引入所述表达盒的植物以及含有所述表达盒的这种植物或植物细胞的子代，包括具有稳定地整合至染色体的所述表达盒的子代。
可通过各种常规技术将包含由异源启动子启动的PYR/PYL编码序列的重组表达载体引入至期望的植物基因组中。例如，可使用一些技术如电穿孔和植物细胞原生质体微注射，将DNA构建体直接引入至植物细胞的基因组DNA，或使用冲击法如DNA粒子轰击法直接将DNA构建体引入至植物组织中。或者，可将DNA构建体与合适的T-DNA侧翼区组合并引入至常规的根癌农杆菌宿主载体。根癌农杆菌宿主的毒力作用使得在当细胞被细菌感染时启动，将所述构建体和邻近标记插入至植物细胞DNA。虽然本发明包括突变PYR/PYL的瞬时表达，通常通过本发明构建体的表达源于将表达盒插入至所述植物基因组中，例如，从而至少一些植物子代也含有所述整合的表达盒。
微注射技术也可用于该目的。这些技术为本领域熟知并充分记载于文献中。使用聚乙二醇沉淀法引入DNA构建体描述于Paszkowski等人EMBO J.3:2717-2722(1984)。电穿孔技术描述于Fromm等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824(1985)。冲击法转化技术描述于Klein等人自然(Nature)327:70-73(1987)。
根癌农杆菌-介导的转化技术包括卸甲(disarming)或使用二元载体，其描述于科学文献。参见，例如，Horsch等人，科学(Science)233:496-498(1984)，以及Fraley等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803(1983)。
可将通过上述任何转化技术产生的转化的植物细胞培养为具有转化的基因型的完整植物，从而具有期望的提高了非生物胁迫抗性的表型。这种再生技术取决于对组织培养生长培养基中的某些植物激素的控制，通常取决于与期望的核苷酸序列一起引入的杀生剂和/或除草剂标记物。从培养的原生质体进行植物再生描述于Evans等人，原生体分离和培养(Protoplasts Isolation and Culture)，植物细胞培养手册(Handbook of PalntCell Culture)，pp.124-176,麦克米兰出版公司，纽约，1983；植物、植物原生质体的结合、再生(Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts)，pp.21-73,CRC出版社，博卡拉顿(Boca Raton),1985。也可从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。这种再生技术概述于Klee等人Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-486(1987)。
本领域技术人员应理解，将表达盒稳定地整合至转基因植物中并确认为可操作后，可通过有性杂交将其引入至其他植物。可根据需要杂交的物种使用众多标准育种技术中的任何技术。
本发明表达盒可用于赋予几乎任何植物非生物胁迫抗性。因此，本发明可应用于广泛的植物，包括下述各属的物种：天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)，Heterocallis、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、墨角兰属(Majorana)、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、黍属(Panieum)、Pannesetum、鳄梨属(Persea)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、葫芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉米属(Zea)。在一些实施方案中，所述植物选自下组：水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、油菜、草坪草和苜蓿。在一些实施方案中，所述植物为观赏植物。在一些实施方案中，所述植物为蔬菜植物或水果植物。
本领域技术人员应理解，许多植物物种可用作模式植物以预测转基因表达在其他植物中的表型效果。例如，众所周知，烟草(烟草属)和拟南芥植物均可用作转基因表达的模式植物，尤其是在其他双子叶植物中。
在一些实施方案中，与除了所述突变的PYR/PYL受体多肽的表达以外其他方面相同的植物相比，本发明植物具有提高的对某些化学激动剂的敏感性。对激活ABA受体的PYR/PYL家族的激动剂的敏感性，可通过观察或测量任何由ABA介导的表型来检测。本领域技术人员应理解，ABA是已充分研究的植物激素，ABA介导许多特征变化，任何变化均可检测以确定是否ABA的敏感性已被改变。在一些实施方案中，改变的ABA敏感性通过改变的种子萌发时间或改变的胁迫(例如，干旱)耐受性得以证实。
可根据众多已知技术中的任何技术检测非生物胁迫抗性。例如，对于耐旱性，植物可生长在所提供的水分少于适宜水分的条件下。可通过众多标准测量中的任何一种包括膨压、生长、产量等的测量来确定抗旱性。
实施例
下列实施例用于说明本发明而非旨在限制本发明的范围。
实施例1:PYR1正交受体的分离
为了分离突变的(正交的)PYR/PYL受体，首先确认出合适的靶配体。接着，进行受体诱变和选择实验以确认对靶正交配体产生应答的正交受体。总体上说，诱变前靶配体对受体的起始亲和力越高，实现靶标识别所需突变的数目就越少。具有混杂配体结合口袋的蛋白与那些具有高度选择性口袋的蛋白相比是固有的进行基因工程操作的更好起始点，因为相比高度选择性结合的口袋，混杂配体结合口袋更可能与大量配体发生弱接触。而且，能在异源宿主如酿酒酵母(S.cerevisiae)中测量其功能的受体蛋白是进行受体基因工程操作的优选靶标，因为这种试验使得大量变异受体能够被快速筛选。
方法和结果
使用两步法分离PYR1正交受体。首先对大量系列化合物进行筛选以确认与受体发生弱相互作用的化合物，根据它们在竞争实验中取代受体-结合ABA的能力来定义确认。一旦确认了弱结合配体，将从最终应用前景上具有最理想特性的弱结合配体用作进行重复诱变和筛选方案的靶标。弱结合配体的预选提高了分离新受体蛋白的频率，实现分子识别所需的配体结合位点改变比较少。然而，预选并非成功的先决条件。
配体预选。从大量约～1500可商业获得的农业化学品中筛选得到结构不同的74种农业化学品。当以相对于ABA超过1000-倍的量加入(即，100nM ABA和100μM测试化学品)时，在合适的酵母菌株中测量这74种化合物降低ABA-促进的PYR/PYL-PP2C蛋白-蛋白相互作用的能力。该试验筛选揭示，密切相关的除草剂溴草腈及其氯代类似物羟敌草腈、灭鼠剂杀鼠迷、除草剂二氯苯腈和杀真菌剂环酰菌胺均与ABA竞争。观察到的74种化合物筛选出5种的命中率表明，与PYR/PYL配体结合口袋的弱结合是普遍的，这与观察到的START蛋白具有混杂的配体结合口袋相一致(Mogensen,J.E.等人，生物化学杂志(Journal of BiologicalChemistry)277:23684-23692(2002))。
基于PCR的PYR1诱变。为了确认改变激动剂应答性的PYR/PYL突变，使用已有方案通过易错PCR对PYR1的编码序列进行突变(Lin-Goerke等人，生物技术(Biotechniques)23:409-412(1997))，并克隆至酵母双杂交载体pBD-GAL4中产生～70,000个突变体的库(称为ePCR1库)。将该质粒库在大肠杆菌(E.coli)中扩增，然后转化至酿酒酵母菌株MAV99中与由质粒pAD-HAB1编码的Gal4激活结构域(AD)-PP2C融合蛋白共转化，如前文所述(Park等人，科学(Science)324:1068-1071(2009))。MAV99(Vidal等人，Proc Natl Acad Sci USA 93:10315-10320(1996))是含有Gal4激活的URA3报告基因的反向双杂交菌株。该菌株在无外源尿嘧啶供给下无法生长。然而，如果该菌株表达了使得PYR1和HAB1之间发生蛋白-蛋白相互作用的PYR1突变体，则所述URA3报告基因被激活，其使得菌株生长并最后形成菌落。因此，BD-PYR1和AD-HAB1在MAV99菌株中的共表达使得允许非天然激动剂促进PYR1-HAB1相互作用的PYR1突变的阳性挑选方案能够进行，其可观察为激动剂促进的无尿嘧啶添加下的生长。此外，在生长培养基中包含化合物5-氟-乳清酸(FOA，其通过URA3代谢为有毒代谢物)而非尿嘧啶，使得能够筛选赋予BD-PYR1和AD-HAB1之间的激动剂-非依赖性方式相互作用的突变(“组成性突变”)。在该筛选策略中组成性突变是不期望的突变，因为靶标农业化学品分子将不调控组成性突变体的活性。由于调节的和组成性PYR1突变体均使得表达HAB1-AD的MAV99菌株在无外源尿嘧啶供给下生长，使用阳性和阴性两种挑选方案都是有益的。
农业化学品应答性突变体的分离。为了确认赋予对非天然农业化学激动剂应答性的PYR1突变，将ePCR1库转化至MAV99/pAD-HAB1菌株以建立称为“A”的库。然后，使A库在含有0.15％FOA的培养基上生长。如此建立的突变体库称为“A'”库，其为具有降低数目的组成性突变的PYR1突变体库。
然后，将A'库用于使用不同农业化学品的各种筛选实验。例如，为了分离环酰菌胺应答性突变，将～300,000个A'细胞接种到缺少尿嘧啶且含有200μM环酰菌胺的生长培养基上。孵育几天后，出现了～80个菌落，单独收集并在含有或缺少环酰菌胺的生长培养基上再次测试。在缺少环酰菌胺的平板培养基上生长的菌落含有在制备A'库期间未去除的组成性突变而被放弃。将剩余的～30个突变的PYR1编码序列测序，结果表明分离出7个不同的突变序列(表1)：
27-18:S47P、K59R、Y120H
27-24:K59R、Y120H、V144A
27-31:P42S、K59R、Y120C
27-28:P42S、K59R、Y120C、T124M
27-9:P42S、K59R、Y120C、E154G
27-36:E12G、E43G、K59R、I110S、N133D
27-14:E12G、L25R、E43G、K59R、I110S、N133D
表1.环酰菌胺应答的PYR/PYL受体多肽突变体
ePCR1＝70,000个克隆起始大小的PYR1易错PCR诱变库。
*在缺少尿嘧啶的培养基上测量生长，并使用报告菌株MAV99，其仅在当PYR1-GAL4BD和HAB1-GAL4AD之间的激动剂-促进的蛋白-蛋白相互作用重新组成了GAL4活性并使得所述菌株的URA3基因能够表达时才生长。
通过针对代表性突变的酵母双杂交确认了PYR1突变体的环酰菌胺应答性。从最初的酵母细胞中分离出针对3个代表性突变克隆(27-9、27-18和27-36)的质粒并转化至表达pAD-HAB1的YRG-2报告菌株(Park等人，科学(Science)324:1068-1071(2009))，其中Gal4启动了LacZ报告基因的表达使得能用比色法显示激动剂应答。所用环酰菌胺的浓度为1、5、10、25和50μM。通过亮蓝(LacZ-阳性)染色的测定，突变体27-18在所有测试浓度下对环酰菌胺产生强烈应答。突变体27-9对浓度为5、10、25和50μM的环酰菌胺产生强烈应答，在浓度为1μM时为弱阳性。突变体27-36对浓度为25和50μM的环酰菌胺产生应答。
为了进一步探测正交受体-配体的相互作用，表达了针对环酰菌胺-应答突变体27-18的重组蛋白，该突变体在PYR1中有3个突变。6X-His-PYR1(27-18)蛋白与野生型PYR1蛋白一起得到表达和纯化。使用磷酸酶活性检测测定这两种蛋白在应答ABA或环酰菌胺浓度增加时抑制PP2C活性的能力，其中PYR/PYL受体的激活通过PP2C活性的抑制进行监测(图1)。磷酸酶活性检测按照Park等人，科学(Science)324:1068-1071(2009)的描述实施，很小的修改为：所用检测缓冲液为10mM Mn++而非Mg++；结果发现该修改提高了HAB1的特异性活性～10倍。还发现，ABA不激活突变体27-18，但有效地激活了野生型PYR1蛋白(图1A)，因此表明了突变体27-18对ABA敏感。而且，突变体27-18被环酰菌胺激活，而野生型PYR1蛋白却不被其激活(图1B)，因此表明了突变体PYR/PYL受体多肽可用于控制对环酰菌胺产生应答的PP2C的活性。
按照上述对环酰菌胺应答性PYR1突变体的筛选实施对溴草腈(表2)、二氯苯腈(表3)和解草嗪(表4)应答性PYR1突变体的筛选，各自使用200μM测试化合物和上述制备的A'库。针对代表性突变克隆74A-1和74A-2通过酵母双杂交试验确认了溴草腈应答性。所用溴草腈的浓度为5、10、25和50μM。突变体74A-1和74A-2均对浓度为10、25和50μM的溴草腈产生应答。
表2.溴草腈应答的PYR/PYL受体多肽突变体
ePCR1＝70,000个克隆起始大小的PYR1易错PCR诱变库；第一轮改组的＝使用分离的ePCR突变体制备的PYR1改组突变体库。
*在缺少尿嘧啶的培养基上测量生长，并使用报告菌株MAV99，其仅在当PYR1-GAL4BD和HAB1-GAL4AD之间的激动剂-促进的蛋白-蛋白相互作用重新组成了GAL4活性并使得所述菌株的URA3基因能够表达时才生长。
表3.二氯苯腈应答的PYR/PYL受体多肽突变体
ePCR1＝70,000个克隆起始大小的PYR1易错PCR诱变库。
*在缺少尿嘧啶的培养基上测量生长，并使用报告菌株MAV99，其仅在当PYR1-GAL4BD和HAB1-GAL4AD之间的激动剂-促进的蛋白-蛋白相互作用重新组成了GAL4活性并使得菌株的URA3基因能够表达时才生长。
表4.解草嗪应答的PYR/PYL受体多肽突变体
ePCR1＝70,000个克隆起始大小的PYR1易错PCR诱变库。
*在缺少尿嘧啶的培养基上测量生长，并使用报告菌株MAV99，其仅在当PYR1-GAL4BD和HAB1-GAL4AD之间的激动剂-促进的蛋白-蛋白相互作用重新组成了GAL4活性并使得菌株的URA3基因能够表达时才生长。
使用DNA改组改进初始突变体。使用DNA改组对现有突变或变异进行重组是快速提高蛋白功能和活性的可靠方法(Stemmer,自然(Nature)370:389-391(1994))。为了改进所分离的溴草腈应答性PYR1突变体，将通过筛选A'库(74A-12、74A-24、74A-1、74A-4、74A-13、74A-2和74A-15)确认的针对7个突变体序列的质粒DNA，与等摩尔量针对最初PYR1ePCR1突变体库的质粒混合。将ePCR1DNA加入至改组反应中使得能够将新的突变引入至现有突变中，因此增加了序列多样性的可能。使用现成的方案对该混合DNA进行改组(Muller等人，Nucleic Acids Res 33:e117(2005))，并将改组的PCR产物DNA克隆至pBD-GAL4中制备～50,000个克隆，收集并命名为“B”库，将其在大肠杆菌中扩增并引入至酵母菌株MAV99与pAD-HAB1共转化。然后使这些细胞生长于0.15％FOA中以除去组成性突变体，产生“B'”库。然后使该B'库在缺少添加的尿嘧啶且含有0.5μM溴草腈的平板培养基上生长。分离出两个独特的非组成性克隆(74B-1和74B-7)(表2)。
鉴于这些实验显示的PYR1的可塑性，我们试图确定是否可以针对没有使用上文描述的酵母竞争实验进行弱结合预筛选的靶配体来分离正交受体。使用与上文所描述的方法相同的筛选方法筛选出对BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)产生应答性的突变体。该筛选导致成功出对BTH产生应答性的3个不同PYR1突变体(表5)。酵母双杂交试验确认了针对代表性突变克隆BTH-9的BTH应答性。所用溴草腈的浓度为25、50、100和200μM，突变体BTH-9对浓度为50、100和200μM的BTH产生应答。因此，PYR1的可塑性使得许多正交受体变异体能够被分离。
表5.BTH应答的PYR/PYL受体多肽突变体
ePCR1＝70,000个克隆起始大小的PYR1易错PCR诱变库。
*在缺少尿嘧啶的培养基上测量生长，并使用报告菌株MAV99，其仅在当PYR1-GAL4BD和HAB1-GAL4 AD之间的激动剂-促进的蛋白-蛋白相互作用重新组成了GAL4活性并使得菌株的URA3基因能够表达时才生长。
实施例2:K59位点的突变使PYR对不同的正交配体敏感
对表1-5中筛选数据的检查揭示，针对对于所有筛选的化学品,含有K59位点突变的受体被分离至少一次。在大多数情况下，K59R突变存在于针对各筛选的化学品而分离的大多数正交受体中。该出人意料的观察表明，K59是能够有利地靶向基因工程操作有效的正交受体。关于对应于PYR1中K59氨基酸位点的突变频繁发生的两个合理推测是：“闸”假说和“口袋形状”假说。闸假说认为，K59残基的功能是部分作为“闸开关”机制以帮助使受体在无ABA结合时处于其“关闭”状态；因此，K59的突变可破坏维持与ABA结合相关的受体激活作用的控制机制，并防止受体被非天然配体激活。口袋形状假说认为，在对应于K59位点的突变改变了PYR/PYL受体的结合口袋而产生了一个新的口袋表面，其促进了PYR/PYL和正交配体之间的相互作用从而提高了结合亲和力。
为了测定这两个假说，在PYR1中构建了一系列的K59突变体，并检测它们对天然配体ABA和正交配体二氯苯腈的敏感性(表6)。二氯苯腈被选为这些研究的模式正交配体，因为观察到其为弱PYR/PYL激动剂(即，其能够以200μM或更高的浓度弱激活受体)。因此二氯苯腈提供了一种用于探测突变体对于正交配体的敏感性的测试分子。
表6.K59突变对正交配体二氯苯腈的应答性
如表6所示，野生型PYR1没有被50μM二氯苯腈激活。然而，16种构建的K59替换突变体中的14种被50μM二氯苯腈激活。因此，K59上的大多数突变提高了对二氯苯腈的敏感性。将这些结果与在本发明所述的筛选中分离的普遍的K59R突变(例如，在实施例1和表1-5中)结合起来表明，K59上的许多突变有利于构建被非天然(即，正交的)配体激活的受体，还表明K59更可能是按照闸假说而非口袋形状假说发挥作用，因为口袋形状假说预测，促进一种正交配体结合的改变的口袋表面很可能也是促进另一种正交配体结合的形状。
讨论
在这一系列突变体中分离的受体突变优选地位于其侧链指向PYR1的配体结合口袋中的残基上。并不奇怪的是，作为PYR1的配体结合口袋的表面必需重塑形状以便与新配体结合。另外，在正交受体(即，K59R、S92T)中分离的突变改变了在PYR/PYL ABA受体家族中的不变位点。这些位点是不变的，因为其涉及ABA识别并处于合适的ABA结合的强大自然选择下。由于已知在保守ABA-结合残基的突变会降低ABA应答性，当正交受体在植物细胞中表达时，预期其对ABA不敏感。该特征的优点是，正交受体的过表达不会导致在不存在控制性正交配体时的ABA信号转导激活。
通常PYR1和PYR/PYL蛋白的生化功能是抑制PP2C活性。这可使用酵母双杂交或其他基于细胞的方法在活细胞中测量。也可在体外使用酶法磷酸酶试验，在颜色检测试剂存在下(例如，磷酸对硝基苯酯)下进行测量。我们注意到，上述作用的基于酵母的试验提供了配体结合的间接指示器。也可能一些筛选的化合物可降低酵母菌株的ABA应答性而未结合至其中央口袋中。为了解决该可能的限制，可使用体外竞争试验或基于细胞的试验用其他生物体作为替代性方法来确定弱结合靶化合物。
实施例3:环酰菌胺受体敏感性的提高
制备环酰菌胺应答的PYR1变异体
如实施例1中详细描述，针对环酰菌胺应答性突变体的PCR1突变体库的筛选导致了对环酰菌胺产生应答的一些突变体PYR1受体的分离(表1)。为了提高环酰菌胺受体敏感性，使用前述指出的同样通用实验方案进行DNA改组。简而言之，将等摩尔量针对表1所示的环酰菌胺受体的质粒DNA汇集后与等摩尔量的ePCR1库DNA合并。按照如实施例1所描述，使用汇集的模板进行DNA改组。制备了～400,000个改组变异体的A库(称为“27B”)。如上文所描述将针对该库的DNA引入至MAV99pAD-HAB1酵母菌株，并将所得的酵母细胞收集后，使其在含FOA的平板培养基上生长以减少该库中的组成性突变体，产生了27B'库。将27B'库接种至缺少尿嘧啶但含有20μM环酰菌胺的培养基上。从这些平板中挑选出～50个阳性，并随后在缺少尿嘧啶的培养基上重新测试以将组成性突变体(即，假阳性)与那些对环酰菌胺产生特异性应答的突变体(即，真阳性)区分开。将针对真阳性的PYR1编码序列测序从而产生下述一系列环酰菌胺-应答性PYR1变异体(表7)：
表7.从第2轮改组中确认的环酰菌胺应答的PYR/PYL受体多肽突变体
克隆# 存在的突变 SEQ ID NO
27B-1 P42S、K59R、D97N、Y120H、V163I、A172T 165
27B-2 P42S、L44F、K59R、Y120H、V138M、M158I 166
27B-3 P42S、K59R、Y120H、V123I、V139I、M158I 167
27B-4 S47P、V49I、K59R、Y120H、M158I、A177T 168
27B-7 K59R、V81M、Y120C、M158I、V163I 169
27B-8 P42S、K59R、D97N、Y120H、V163I、A172T 165
进行第3轮改组，将针对如表7所示的“27B”突变体的DNA与ePCR1库组合以产生～150,000个克隆的库，然后将其转化至MAV99pAD-HAB1。使用前文所述方法，然后通过在FOA上生长去除组成性突变体，再通过在缺少尿嘧啶但含有1.5μM环酰菌胺的培养基上生长而筛选环酰菌胺敏感性突变体。该试验产生了下述环酰菌胺应答性变异体(表8)：
表8.从第3轮改组中确认的环酰菌胺应答的PYR/PYL受体多肽突变体
克隆# 存在的突变 SEQ ID NO
27C-1 P27L、P42S、K59R、D97N、Y120H、M158I、T173A 170
27C-2 P42S、K59R、R74C、Y120H、M158I 171
27C-3 S29N、K59R、D97N、Y120H、V163I、A72T 172
27C-5 P42S、K59R、Y120H、V123I、V139I、M158I、V163I 173
27C-16 K59R、V81M、Y120H、M158I、V163I 174
27C-18 E12K、K59R、V75I、D97N、Y120H、V163I、A172T 175
27C-19 L33F、P42S、K59R、Y120H、V123I、M158I 176
27C-20 P42S、K59R、Y120H、M158I、V163I、V174I 177
27C-21 R10Q、P42S、K59R、D97N、Y120H、V163I、A172T 178
在环酰菌胺-应答突变体27C-2中确立特异性突变的作用
诱变方案经常会引入不影响期望的功能的假突变。为了确定通过筛选确认的残基的相关性，我们集中关注确认的高敏感性环酰菌胺-应答突变体27C-2，相比野生型PYR1序列，其含有5个突变(P42S、K59R、R74C、Y120H和M158I；SEQ ID NO:171；参见表8)。K59R、Y120H和M158I在许多其他分离的突变体中的存在暗示它们可能是对环酰菌胺敏感性其作用的突变。为了探测这5个突变在环酰菌胺应答上的作用，使用定点诱变将这些残基中的各残基恢复野生型残基中。然后将所得的克隆转化至Y190pAD-HAB1酵母报告菌株，在一定浓度范围测定其对环酰菌胺的应答性。如图2A所示，该试验确定K59R、Y120H和M158I足以与环酰菌胺敏感性相关，并确定在27C-2克隆中突变P42S和R74C不足以赋予环酰菌胺敏感性。此外，体外受体试验表明PYR1K59R,Y120H,M158I三倍突变体对环酰菌胺(IC50值～0.4μM)敏感(图2B)，这表明所观察的PYR1K59R,Y120H,M158I三倍突变体对环酰菌胺的敏感性不是用于确认三倍突变体的酵母试验系统的假象。
将环酰菌胺敏感性基因工程引入至PYL2
PYR1是PYR/PYL受体蛋白家族的成员，该家族在拟南芥中含有14个成员。而且，在27C-2中足以与环酰菌胺应答性相关的突变位于配体结合口袋(K59R、Y120H)或PYR/PYL-PP2C界面(M158I)中的不变或保守残基上。鉴于这些残基的保守性，我们推测环酰菌胺敏感性可以通过使其他PYR/PYL受体中的同源残基发生突变而被基因工程操作至其他受体家族成员。为了检测这一点，我们引入了YL2中的同源突变(K64R，对应于PYR1中的K59R；Y124H，对应于PYR1中的Y120H；以及M164I，对应于PYR1中的M158I)，产生了突变体PYL2K64R ,Y124H,M164I。如图3A所示，当使用酵母双杂交试验测试(菌株Y190pAD-HAB1)时，该突变体未显示出环酰菌胺应答性。最近的工作(Peterson等人，Nat Struct Mol Biol 17:1109-1113(2010))已显示，受体家族成员之间的微小序列变异影响了受体对选择性激动剂帕雷巴克汀(Pyrabactin)的敏感性。具体地，PYR1和PYL1显示出对帕雷巴克汀(Pyrabactin)的强应答性，而PYL2(和其他家族成员)则未显示出应答性。遗传、生化和结构上的研究表明，PYR1的配体结合口袋中两个主要残基确定了帕雷巴克汀(Pyrabactin)激动剂活性在PYR1和PYL2之间的差异。在PYR1中，这些残基为异亮氨酸I62和I110，而在PYL2中，同源残基(分别为氨基酸位点64和114)被体积较小的缬氨酸V67和V114取代。基于这两个残基在受体之间对配体应答性影响差异上的作用，我们假设，I62和I110对环酰菌胺应答起着重要作用。因此，我们将V67I和V114I突变(单独或组合地)引入至PYL2K64R,Y124H,M164I受体。一起加入V67I和V114I突变使得最终的突变体受体PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I在酵母试验(图3A)和体外PP2C抑制试验(图3B)中能够对环酰菌胺产生应答。
正交受体在植物中的效用
为了检验在酵母和体外试验中观察到的环酰菌胺应答是否在植物中起作用，使用标准的分子克隆方法将转基因的35S::GFP-PYL2和35S::GFP-PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I植物构建到pEGAD的修改版中(Cutler等人，Proc Natl Acad Sci USA 97:3718-3723(2000))，其中6X-组氨酸标签被添加到GFP的N-末端。使用花序浸渍法制备转基因植物，并用Leica GFP解剖显微镜通过落射荧光筛选幼苗以确定初步的转基因(T1)。将GFP+转基因植物种植至成熟并收获T2种子用于进一步分析。
为了确定环酰菌胺应答性PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I突变体是否在植物中起作用，检测T2分离子(segregant)和合适的野生型对照在100μM环酰菌胺上生长的能力，因为受体的激活作用应该会抑制萌发。表达突变体受体的植物表现出强的生长抑制，表明ABA途径在表达该突变体的植物中而非野生型受体中被环酰菌胺激活(图4)。为了进一步检验ABA-应答激活作用，我们接着使用定量RT-PCR方法，针对3个ABA报告基因(P5CS1、RD29A和NCED3)的激活作用，检测GFP+转基因植物(T2分离子)和合适的对照对暴露于液体培养物中的环酰菌胺的应答。如图5所示，在两个独立的PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I转基因系中所有3个基因显示出被环酰菌胺充分诱导。因此，正常由ABA体内调控的基因可使用PYL2K64R ,Y124H,M164I,V67I,V114I突变体受体而由环酰菌胺激活。
为了进一步确定环酰菌胺应答性PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I突变体受体是否在植物中起作用，我们对环酰菌胺在使得野生型植物或过表达PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I的植物中分开的叶子减少失水的能力进行检测。将转基因或对照(野生型)植物种植在16小时光照/8小时黑暗循环下生长3周，然后用100μM(+)-ABA、100μM环酰菌胺或对照(含有0.1％吐温-20，0.1％DMSO)处理。进行ABA处理作为阳性对照。在进行失水试验之前，傍晚喷灌植物。第二天上午，处理后约16小时，将试验样品的地上部分莲座形叶收集后转至称重盘，每个测量样品8株植物，并保持在～90-100μEinstein/m2荧光灯光照下。在每个20分钟的时间间隔点测量每组8株的4组植物。在整个8周的时间间隔中重复试验3次。在所有试验中，环酰菌胺预处理足以降低PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I转基因植物的失水(图6A-C)，尽管其效率低于ABA。然而应注意，ABA能够激活植物基因组中所有的PYR/PYL受体(至少拟南芥中的13个受体)，而环酰菌胺选择性激活单独的基因工程操作的受体PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I。作为环酰菌胺效果的对照，我们用100μM(+)-ABA、100μM环酰菌胺或对照(含0.1％吐温-20，0.1％DMSO)，按照上述处理所述转基因植物同样的方案处理野生型植物。这些试验表明，环酰菌胺并不影响野生型植物的失水(图7)。因此，环酰菌胺应答性PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I突变体在转基因植物中的表达使得环酰菌胺能够激活ABA信号转导和生理应答。
应理解，本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，且基于这些本领域技术人员可以做出各种修改或改变，它们也包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围之内。为所有目的，本发明引用的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式全部并入本文中。

Claims (25)

1.提高植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述植物为含有异源表达盒的植物，所述表达盒含有可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，所述方法包括使所述植物与激活所述突变的PYR/PYL受体多肽的化学品接触，其中当所述化学品以不大于200μM的浓度存在且与野生型PYR/PYL受体多肽接触时，所述化学品不诱导所述野生型PYR/PYL受体多肽的激活；并且其中：
所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:131-139中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈激活；或者
所述突变的PYR/PYL受体多肽(i)为PYR1K59R,Y120H,M158I突变体或PYL2K64R ,Y124H,M164I,V67I,V114I突变体或(ii)为SEQ ID NO:124-130或165-178中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活；或者
所述突变的PYR/PYL受体多肽(i)为PYR1K59A、PYR1K59C、PYR1K59F、PYR1K59G、PYR1K59H、PYR1K59L、PYR1K59M、PYR1K59R、PYR1K59S、PYR1K59T、PYR1K59V、PYR1K59Y、PYR1K59N或PYR1K59W突变体或(ii)为SEQ ID NO:140-144中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活；或者
所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:145-146中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活；或者
所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:147-148或164中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:131-139中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈激活。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽为PYR1K59R,Y120H,M158I突变体或PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I突变体，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:124-130或165-178中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽为PYR1K59A、PYR1K59C、PYR1K59F、PYR1K59G、PYR1K59H、PYR1K59L、PYR1K59M、PYR1K59R、PYR1K59S、PYR1K59T、PYR1K59V、PYR1K59Y、PYR1K59N或PYR1K59W突变体并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:140-144中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:145-146中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:147-148或164中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活。
9.一种表达盒，其包含可操作地连接至编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当所述突变的PYR/PYL受体多肽与化学品接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被所述化学品激活，且其中当所述化学品以不大于200μM的浓度存在且与野生型PYR/PYL受体多肽接触时，所述化学品不诱导所述野生型PYR/PYL受体多肽的激活；并且其中：
所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:131-139中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈激活；或者
所述突变的PYR/PYL受体多肽(i)为PYR1K59R,Y120H,M158I突变体或PYL2K64R ,Y124H,M164I,V67I,V114I突变体或(ii)为SEQ ID NO:124-130或165-178中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活；或者
所述突变的PYR/PYL受体多肽(i)为PYR1K59A、PYR1K59C、PYR1K59F、PYR1K59G、PYR1K59H、PYR1K59L、PYR1K59M、PYR1K59R、PYR1K59S、PYR1K59T、PYR1K59V、PYR1K59Y、PYR1K59N或PYR1K59W突变体或(ii)为SEQ ID NO:140-144中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活；或者
所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:145-146中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活；或者
所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:147-148或164中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活。
10.根据权利要求9所述的表达盒，其中，所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:131-139中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被溴草腈、羟敌草腈或碘苯腈激活。
11.根据权利要求9所述的表达盒，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽为PYR1K59R ,Y120H,M158I突变体或PYL2K64R,Y124H,M164I,V67I,V114I突变体，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活。
12.根据权利要求9所述的表达盒，其中，所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:124-130或SEQ ID NO:165-178中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与环酰菌胺接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被环酰菌胺激活。
13.根据权利要求9所述的表达盒，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽为PYR1K59A、PYR1K59C、PYR1K59F、PYR1K59G、PYR1K59H、PYR1K59L、PYR1K59M、PYR1K59R、PYR1K59S、PYR1K59T、PYR1K59V、PYR1K59Y、PYR1K59N或PYR1K59W突变体并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活。
14.根据权利要求9所述的表达盒，其中，所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:140-144中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与二氯苯腈接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被二氯苯腈激活。
15.根据权利要求9所述的表达盒，其中，所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:145-146中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激活。
16.根据权利要求9所述的表达盒，其中，所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:147-148或164中的任一序列，并且当所述突变的PYR/PYL受体多肽与BTH接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被BTH激活。
17.根据权利要求9所述的表达盒，其中，所述启动子是可诱导的。
18.根据权利要求9所述的表达盒，其中，所述启动子是组织特异性启动子。
19.一种表达载体，其包含如权利要求9-18中任一项所述的表达盒。
20.一种生产具有提高的非生物胁迫耐受性的植物的方法，所述方法包括：
将权利要求9-18中任一项所述的表达盒引入至多株植物中；和
筛选出与缺少所述表达盒的植物相比，具有提高的非生物胁迫耐受性的含有所述表达盒的植物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，含有所述表达盒的植物与缺少所述表达盒的植物相比，具有提高的耐旱性。
22.一种培育具有提高的胁迫耐受性的植物的方法，所述方法包括：将含有权利要求9-18中任一项所述的表达盒的转基因植物与另一植物杂交。
23.一种生产具有提高的胁迫耐受性的植物的方法，所述方法包括种植一种转基因植物，所述转基因植物包含至少一个编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列，所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:124-148或164-178中的任一序列，由此所述转基因植物表达所述突变的PYR/PYL受体多肽。
24.突变的PYR/PYL受体多肽，所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:124-148或164-178中的任一序列。
25.一种多核苷酸，其编码突变的PYR/PYL受体多肽，所述突变的PYR/PYL受体多肽为SEQ ID NO:124-148或164-178中的任一序列。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2625891T3 (es) 2009-02-13 2017-07-20 The Regents Of The University Of California Control de la tolerancia al estrés, eficiencia del uso de agua y expresión génica en plantas mediante el uso de nuevas proteínas receptoras de ABA y agonistas sintéticos
US10704056B2 (en) 2011-07-01 2020-07-07 The Regents Of The University Of California Constitutively active ABA receptor mutants
CN103125485B (zh) * 2011-12-03 2014-06-04 深圳诺普信农化股份有限公司 一种含环酰菌胺的杀菌组合物
EA025432B1 (ru) * 2012-03-30 2016-12-30 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Синтетические соединения для вегетативной реакции на ава
WO2014159394A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Regents Of The University Of California Modified pyr/pyl receptors activated by orthogonal ligands
CN104170823A (zh) * 2013-05-23 2014-12-03 中国科学院上海生命科学研究院 一种增强植物抗逆性的小分子化合物
KR20160025602A (ko) 2013-06-28 2016-03-08 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Aba 반응을 유도하는 화합물
US9518268B2 (en) * 2013-07-19 2016-12-13 Purdue Research Foundation Drought tolerant transgenic plants and method of making same
CA2958767A1 (en) * 2014-08-26 2016-03-03 The Regents Of The University Of California Hypersensitive aba receptors
WO2016043985A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 The Regents Of The University Of California Modified plant water use by cell type expression of pyr/pyl proteins
US10919943B2 (en) 2016-03-25 2021-02-16 The Regents Of The University Of California Mutant proteins enabling agrochemical control of plant gene expression
US10905120B2 (en) 2016-11-28 2021-02-02 The Regents Of The University Of California ABA receptor agonists that modulate transpiration
CN108410909B (zh) * 2018-04-12 2021-08-03 吉林大学 一种利用植物激素aba及小分子物质pyr调节细胞通路的方法
KR102213526B1 (ko) * 2019-04-11 2021-02-08 중앙대학교 산학협력단 애기장대 앱시스산 수용체 rcar5를 이용한 식물체의 저온 스트레스 저항성 증진방법
CN111616048B (zh) * 2020-04-27 2021-08-20 云南省农业科学院药用植物研究所 一种天冬组培快繁新方法
KR102448536B1 (ko) * 2020-06-03 2022-09-29 대한민국 Aba 수용체 돌연변이 및 이의 용도
CN112759631B (zh) * 2021-01-21 2022-09-27 深圳市儿童医院 Pyl3蛋白突变体及其应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5625130A (en) * 1995-03-07 1997-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Oilseed Brassica bearing an endogenous oil wherein the levels of oleic, alpha-linolenic, and saturated fatty acids are simultaneously provided in an atypical highly beneficial distribution via genetic control
US6653535B1 (en) 1999-05-28 2003-11-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for modulating water-use efficiency or productivity in a plant by transforming with a DNA encoding a NAPD-malic enzyme operably linked to a guard cell or an epidermal cell promoter
MXPA02004932A (es) * 1999-11-17 2003-02-27 Pioneer Hi Bred Int Modulacion de la respuesta de plantas a acido abscisico.
US20050244971A1 (en) * 2002-04-24 2005-11-03 Korea Kumho Petrochemical Co., Ltd. Transgenic plants with enhanced stress tolerance
ITMI20040363A1 (it) 2004-02-27 2004-05-27 Univ Degli Studi Milano Cassetta per l'espressione di acidi nucleici negli stomi
CA2597614A1 (en) * 2004-12-09 2006-06-15 The University Of Manitoba Plant proteins having an abscisic acid binding site and methods of use
EP1731037A1 (en) 2005-06-04 2006-12-13 Bayer CropScience AG Increase of stress tolerance by application of neonicotinoids on plants engineered to be stress tolerant
EP1937063A1 (en) * 2005-10-17 2008-07-02 Isagro Ricerca S.r.l. Compounds and relative use for the control of phytopathogens
DE102005057250A1 (de) 2005-11-29 2007-06-06 Bayer Cropscience Gmbh Wirkstoffe zur Steigerung der Stressabwehr in Pflanzen gegenüber abiotischem Stress und Methoden zu ihrer Auffindung
US9491916B2 (en) * 2006-02-07 2016-11-15 Washington State University Mutation breeding for resistance to fungal disease and for drought tolerance
ES2625891T3 (es) * 2009-02-13 2017-07-20 The Regents Of The University Of California Control de la tolerancia al estrés, eficiencia del uso de agua y expresión génica en plantas mediante el uso de nuevas proteínas receptoras de ABA y agonistas sintéticos

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Structural Mechanism of Abscisic Acid Binding and Signaling by Dimeric PYR1;Noriyuki Nishimura et al;《Science》;20091204;第326卷(第5958期);第3页最后1段 *

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