MX2007013870A - Plantas que contienen un gen heterologo de flavohemoglobina y sus metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La eficiencia en el uso del nitrogeno vegetal en el maiz se ha mejorado por la transformacion con un gen de flavohemoglobina; las plantas que comprenden un gen de flavohemoglobina tiene niveles disminuidos de oxido nitrico (NO), acumulacion incrementada de biomasa bajo una condicion de crecimiento con suficiente nitrogeno, y contenido incrementado de clorofila bajo una condicion de crecimiento con nitrogeno limitado; adicionalmente, estas plantas transformadas evidencian mayores niveles de rendimiento.

Description

PLANTAS QUE CONTIENEN UN GEN HETEROLOGO DE FLAVOHEMOGLOBINA Y SUS MÉTODOS DE OSO REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio conforme a 35 USC § 1 19(e) de la solicitud provisional de los Estados Unidos No. de Serie 60/678, 166, presentada el 05/05/2005, e incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad.

Incorporación del listado de secuencia En la presente invención se incorporan como referencia dos copias del listado de secuencia (Copia 1 y Copia 2) y una forma que se puede leer por computadora (CRF) del listado de secuencia, todas en un CD-R's, cada una conteniendo el archivo denominado 52267B_05052006.ST25.txt, el cual es:de 779,000 bits (medida en MS-WINDOWS) y se creó el 5 de mayo de 2006.

CAMPO DE LA INVENCION En la presente invención se describen las invenciones en el campo de la genética vegetal y biología del desarrollo. Más específicamente, las presentes invenciones proveen semillas transgénicas para cosechas, en donde el genoma de dicha semilla comprende ADN recombinante para la expresión de una proteina heteróloga de flavohemoglobina, lo cual resulta en la producción de las plantas transgénicas con crecimiento incrementado, rendimiento y/o eficiencia mejorada en el uso del nitrógeno.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Frecuentemente el nitrógeno es el elemento limitante en el crecimiento y productividad vegetal. El metabolismo, crecimiento y desarrollo de las plantas se afectan profundamente por su abastecimiento de nitrógeno. El abastecimiento restringido del nitrógeno altera la relación retoño a raiz, desarrollo de la raíz, actividad de las enzimas del metabolismo primario y la velocidad de senescencia (muerte) de las hojas más viejas. Todas las cosechas de campo tienen una dependencia fundamental del fertilizante nitrogenado inorgánico. Puesto que el fertilizante se depleta rápidamente a partir dé la mayoria de los suelos, éste se debe suministrar a las cosechas en crecimiento dos o tres veces durante la temporada de crecimiento. El fertilizante nitrogenado, el cual se abastece usualmente como nitrato de amonio, nitrato de potasio, o urea, típicamente responde el 40% de los costos asociados con las cosechas tales como maíz y trigo. Se ha estimado que aproximadamente 11 millones de toneladas del fertilizante nitrogenado se utilizan tanto en Norteamérica como en Europa del oeste anualmente, costándole a los agricultores $2.2 mil millones cada año (Sheldrick, 1987, World Nitrogen Survey, Technical Paper no. 59, Washington, D.C.). Además, las proyecciones del Banco Mundial sugieren que la demanda anual de fertilizante de nitrógeno a nivel mundial se incrementará de aproximadamente 90 millones de toneladas a más de 130 millones de toneladas en los próximos diez años. Una eficiencia incrementada en el uso del nitrógeno por las plantas debe permitir que las cosechas se cultiven con menor consumo del fertilizante, o alternativamente en suelos de menor calidad y por lo tanto podría tener un impacto económico significativo tanto en el desarrollo como en los sistemas de agricultura en desarrollo. Utilizando técnicas convencionales de selección, los criadores vegetales han intentado mejorar la eficiencia en el uso del nitrógeno al explotar la variación disponible en las poblaciones naturales de maíz, trigo, arroz y otras especies de maíz. Sin embargo, existen considerables dificultades asociadas con la selección de poblaciones extensas en los programas convencionales de cruza para rasgos que son difíciles de evaluar bajo condiciones de campo, y dichas estrategias de selección no han sido exitosas por largo tiempo. Los avances recientes en ingeniería genética han provisto las herramientas prerequisito para transformar las plantas para que contengan genes extraños (frecuentemente referidos como "heterogéneos o heterólogos") o genes endógenos mejorados. La capacidad de introducir un ADN específico dentro de los genomas vegetales provee oportunidades adicionales para la generación de plantas con fenotipos mejorados y/o únicos. Las flavohemoglobinas, compuestas de un dominio de unión a heme y un dominio semejante a ferredoxina reductasa, detoxifican los altos niveles de óxido nítrico (NO) a través de la oxigenación de NO hacia N03" funcionando como una NO dioxigenasa (NOD) en Escherichia coli (Vasudevan et al., 1991 , Mol. Gen. Genet. 226: 49-58, y Gardener et al., 2002, J. of Biological Chemistry 270: 8166-8171). Se ha reportado que NO puede participar en muchas respuestas fisiológicas en las plantas, incluyendo respuesta al patógeno, muerte celular programada, germinación (Beligni y Lamattina, 2000, Planta. 210: 215-221), producción de fitoalexina (Noritake, et al., 1996), y emisión de etileno (Leshem, 2000, J. Exp. Bot. 51 : 1471-1473). Además, se encontró que NO tiene un papel critico en la señalización del ácido salicílico (Klessig, et al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 97: 8849-8855), y la señalización de la citoquinína. Se encontró que NO da lugar a rutas de señalización paralelas a través de la actividad incrementada de la óxido nítrico sintasa (NOS, EC1.14.13.39), que media las respuestas de los genes específicos a la tolerancia a la UV-B. Además, se ha reportado que óxido nítrico media las respuestas fotomorfogénicas en el trigo, lechuga, patata y A. thaliana, promueve la elongación de la raíz en el maíz (Gouvea, 1997, Plant Growth Regulation 21 : 183-187), y promueve la maduración en la fresa y el aguacate (Leshem y Pinchasov, 2000, J. Exp. Bot. 51 :1471-1473). La participación del NO en la respuesta de defensa del tabaco es tal vez el papel mejor documentado desempeñado por el óxido nítrico en la señalización vegetal (Klessig, et al., 2000, Proc. Nati, Acad. Sci USA 97: 8849-8855; Foissner, et al., 2000, Plant J. 23: 817-824).

Por lo tanto los inventores contemplaron que la remoción del NO endógeno por la sobre-expresión de las enzimas detoxificantes de NO puede descubrir qué papel(s) desempeña NO en la expresión de rasgos agronómicos en el maíz, tales como la maduración del grano, senescencia de la hoja, resistencia a la enfermedad, crecimiento de la raíz y/o fotomorfogénesis. La sobre-expresión de las enzimas activadas por NO también puede afectar procesos similares. En ambos casos los rasgos agronómicos también se pueden mejorar ya sea por una reducción en el estrés del nitrógeno o una amplificación de la señalización de NO. La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente hallazgo de los inventores de que la expresión de una flavohemoglobina de E. coli en la plantas de maíz resultó en características de crecimiento más robusto bajo cualesquiera condiciones de crecimiento con suficiente nitrógeno o con nitrógeno limitado, y rendimiento incrementado de semilla.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La presente invención se dirige a la semilla a partir de una línea vegetal transgénica, en donde dicha semilla comprende en su genoma un polinucleótido recombinante provisto para la expresión de una proteína flavohemoglobina. De interés particular, la presente ¡nvención provee una semilla transgénica que contiene una proteína flavohemoglobina para producir plantas transgénicas que tienen rasgos agronómicos mejorados. Los rasgos agronómicos mejorados se caracterizan como una velocidad de crecimiento más rápida, biomasa fresca o seca incrementada, rendimiento incrementado de semilla o de fruta, contenido incrementado de nitrógeno en semilla o en fruto, contenido incrementado de aminoácido libre en semilla o en fruto, contenido incrementado de proteína en semilla o en fruto, y/o contenido incrementado de proteína en tejido vegetativo bajo una condición de crecimiento con suficiente nitrógeno o una condición de crecimiento con nitrógeno limitado. También de interés particular en la presente invención es la semilla a partir de plantas de maíz transgénico, preferiblemente plantas de maíz (maíz - Zea mays) o de frijol de soya (soya - Glycine max). Otras plantas de interés en la presente invención para la producción de una semilla transgénica que comprende un gen heterólogo de flavohemoglobina incluyen, sin limitación, algodón, cañóla, trigo, girasol, sorgo, alfalfa, cebada, mijo, arroz, tabaco, cosechas frutales y vegetales, y césped. Por lo tanto, para lograr lo anterior, la presente invención, en un aspecto, provee tres polinucleótidos que no se presentan de manera natural, como se establece en SEQ ID NO 1 , 2, y 260 con codones para expresión vegetal optimizada para expresar la proteína HMP de E. coli, proteína YHB1 de levadura y proteína flavohemoglobina de Erwinia en plantas respectivamente. La presente invención provee adicionalmente construcciones de ADN recombinante para la transformación vegetal que contiene un gen de flavohemoglobina bajo el control de un promotor para la expresión vegetal.

La presente invención, en otro aspecto, provee los métodos para generar una planta transgénica que tiene rasgos agronómicos mejorados incluyendo una velocidad de crecimiento más rápida, biomasa fresca o seca incrementada, rendimiento incrementado de semilla o de fruta, contenido incrementado de nitrógeno en semilla o en fruto, contenido incrementado de aminoácido libre en semilla o en fruto, contenido incrementado de proteína en semilla o en fruto, y/o contenido incrementado de proteína en tejido vegetativo. El método comprende los pasos de transformar una célula vegetal con una construcción de ADN recombinante para la expresión de una proteína flavohemoglobina, regenerar la célula vegetal transformada hacia una planta transgénica que expresa la proteína flavohemoglobina, y seleccionar para identificar una planta que tiene rasgos agronómicos mejorados. Los rasgos agronómicos mejorados se caracterizan como una velocidad de crecimiento más rápida, velocidad de crecimiento incrementada, contenido incrementado de nitrógeno en semilla o en fruto, contenido incrementado de aminoácido libre en semilla o en fruto, y/o contenido incrementado de proteína en tejido vegetativo ya sea bajo una condición de crecimiento con suficiente nitrógeno o una condición con nitrógeno limitado. La presente invención, en incluso otro aspecto, provee proteínas flavohemoglobina ejemplares identificadas como homólogos de HMP de E. Coli como se establece en SEQ ID NO: 130 hasta SEQ ID NO: 256, las cuales se pueden utilizar para practicar la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Y LISTADO DE SECUENCDA Figura 1. Función molecular de una proteína flavohemoglobina en una célula vegetal Figura 2 La construcción de ADN recombinante pMON69471 que comprende SEQ ID NO: 3 para la transformación vegetal Figura 3. La construcción de ADN recombinante pMON67827 que comprende SEQ ID NO: 4 para la transformación vegetal Figura 4. La construcción de ADN recombinante pMON95605 que comprende SEQ ID NO: 105 para la transformación vegetal Figura 5. La construcción para transformación del maíz pMON99286 para la expresión del codón optimizado del gen de HMP de E. coli Figura 6. La construcción para transformación del maíz pMON99261 para la expresión del codón optimizado del gen de HMP de E. coli Figura 7. La construcción para transformación del maiz pMON99276 para la expresión del codón optimizado del gen de HMP de E. coli Figura 8. La construcción para transformación del maíz pMON94446 para la expresión del gen de HMP de E. coli Figura 9. La construcción para transformación del maíz pMON102760 para la expresión del gen de YHB de levadura Figura 10. La construcción para la transformación del frijol de soya pMON95622 para la expresión del gen de HMP de E. coli SEQ ID NO: 1 , el codón optimizado del gen de HMP de E. coli SEQ ID NO: 2, el codón optimizado del gen de YHB de levadura SEQ ID NO: 3, el gen de HMP de E. coli SEQ ID NO: 4, el gen de YHB de levadura SEQ ID NO: 5, la proteína de HMP de E. coli SEQ ID NO: 6, la proteína de YHB de levadura SEQ ID NO: 7 hasta SEQ ID NO: 129, secuencias de ADN de los homólogos de HMP de E. coli SEQ ID NO: 130 hasta SEQ ID NO: 256, secuencias de proteína de los homólogos de HMP de E. coli CUADRO 1 El siguiente cuadro lista una secuencia de ADN identificada como NUC SEQ ID NO y la secuencia de la proteína flavohemoglobina, codificada por el ADN correspondiente, identificada por PEP SEQ 8D NO SEQ ID NO: 257, la secuencia de longitud total de la construcción de ADN recombinante pMON69471 SEQ ID NO: 258, la secuencia de longitud total de la construcción de ADN recombinante pMON67827 SEQ ID NO: 259, la secuencia de longitud total de la construcción de ADN recombinante pMON95605 SEQ ID NO: 260, el codón optimizado del gen HMP a partir de Erwinia carotovora SEQ ID NO: 261 , la secuencia de longitud total de la construcción de ADN recombinante pMON99286 SEQ ID NO: 262, la secuencia de longitud total de la construcción de ADN recombinante pMON99261 SEQ ID NO: 263, la secuencia de longitud total de la construcción de ADN recombinante pMON99276 SEQ ID NO: 264, la secuencia de longitud total de la construcción de ADN recombinante pMON94446 SEQ ID NO: 265, la secuencia de longitud total de la construcción de ADN recombinante pMON102760 SEQ ID NO: 266, la secuencia de longitud total de la construcción de ADN recombinante pMON95622 SEQ ID NO: 267 hasta SEQ ID NO: 272: iniciadores de PCR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente ¡nvención se dirige a la semilla de planta transgénica, en donde el genoma de dicha semilla de planta transgénica comprende un ADN recombinante que codifica una flavohemoglobina, como se provee en la presente invención, y la planta transgénica crecida a partir de dicha semilla. La planta transgénica provista por la presente invención posee un rasgo mejorado en comparación con el rasgo de una planta control bajo cualquier condición de crecimiento con nitrógeno limitado o condición de crecimiento con suficiente nitrógeno. De interés particular son las plantas transgénicas crecidas a partir de semillas transgénicas provistas en la presente invención en donde el rasgo mejorado es el rendimiento incrementado de la semilla. Las construcciones de ADN recombinante descritas por la presente invención comprenden ADN recombinante provisto para la producción del ARNm para modular la expresión del gen, impartiendo rasgos mejorados a las plantas. Como se utiliza en la presente invención, "flavohemoglobina" se refiere a una proteina que está compuesta de un dominio para unión a heme y un dominio para unión a FAD y NAD semejante a ferredoxina reductasa. Esta también se conoce como flavohemoproteína, óxido nítrico dioxigenasa, óxido nítrico oxigenasa y flavodoxina reductasa. Los genes de flavohemoglobina a partir de E. coli, A. eutrophus, Saccharomyces cerevisiae y Vitreoscilla sp se abrevian como HMP, FHP, YHB1 (o YHG), y VHP respectivamente.

Como se utiliza en la presente invención, "gen" se refiere a ADN cromosomal, ADN plasmídico, ADNc, ADN sintético, u otro ADN que codifica un péptido, polípéptido, proteína, o molécula de ARN, y regiones que flanquean las secuencias codificantes implicadas en la regulación de la expresión. Como se utiliza en la presente invención, "semilla transgénica" se refiere a una semilla vegetal cuyo genoma ha sido alterado por la incorporación del ADN recombinante, por ejemplo, mediante transformación como se describe en la presente invención. El término "planta transgénica" se utiliza para referirse a la planta producida a partir de un evento de transformación original, o progenie a partir de generaciones posteriores o cruzas de una planta hacia una planta transformada, siempre y cuando la progenie contenga el ADN recombinante en su genoma. Como se utiliza en la presente invención, "ADN recombinante" se refiere a un polinucleótido que tiene una modificación genéticamente diseñada introducida a través de la combinación elementos endógenos y/o exógenos en una unidad de transcripción, manipulación vía mutagénesis, enzimas de restricción, y los similares o simplemente al insertar múltiples copias de una unidad de transcripción nativa. El ADN recombinante puede comprender segmentos de ADN obtenidos a partir de diferentes fuentes, o segmentos de ADN obtenidos a partir de la misma fuente, pero que han sido manipulados para unir los segmentos de ADN que no existen naturalmente en la forma unida. Un polinucleótido recombinante puede existir fuera de la célula, por ejemplo como un fragmento de PCR, o integrado dentro de un genoma, tal como un genoma vegetal. Como se utiliza en la presente invención, "rasgo" se refiere a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica, o física de una planta o material vegetal particular o célula. En algunos casos, esta característica es visible al ojo humano, tal como el tamaño de la semilla o de la planta, o se puede medir mediante técnicas bioquímicas, tales como la detección del contenido de proteína, almidón, o aceite de la semilla o de las hojas, o mediante la observación de un proceso metabólico o fisiológico, por ejemplo, al medir la toma de dióxido de carbono, o mediante la observación del nivel de expresión de un gen o genes, por ejemplo, al emplear el análisis Northern, RT-PCR, ensayos de expresión de microarreglo del gen, o sistemas de expresión del gen reportero, o mediante observaciones agronómicas tales como tolerancia al estrés, rendimiento, o tolerancia al patógeno. Como se utiliza en la presente invención, "planta control" es una planta sin ADN recombinante descrita en la presente invención. Una planta control se utiliza para medir y comparar la mejoría del rasgo en una planta transgénica con dicho ADN recombinante. Una planta control adecuada puede ser una planta no transgénica de la línea parenteral utilizada para generar una planta transgénica en la presente invención. Alternativamente, una planta control puede ser una planta transgénica que comprende un vector vacío o gen marcador, pero no contiene el ADN recombinante que produce la mejoría del rasgo. Una planta control también puede ser una progenie segregante negativa de una planta transgénica hemicigota. Como se utiliza en la presente invención, "rasgo mejorado" se refiere a un rasgo con una mejoría detectable en una planta transgénica en relación con una planta control o una referencia. En algunos casos, la mejoría del rasgo se puede medir cuantitativamente. Por ejemplo, la mejoría del rasgo puede producir al menos una diferencia deseable del 2% en un rasgo observado, al menos una diferencia deseable del 5%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 10%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 20%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 30%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 50%, al menos aproximadamente una diferencia deseable del 70%, o al menos aproximadamente una diferencia del 100%, o una diferencia deseable incluso mayor. En otros casos, la mejoría del rasgo solamente se mide cualitativamente. Se sabe que puede existir una variación natural en un rasgo. Por lo tanto, la mejoría del rasgo observado produce un cambio en la distribución normal del rasgo en la planta transgénica en comparación con la distribución del rasgo observado en una planta control o una planta de referencia, la cual se evalúa mediante los métodos estadísticos provistos en la presente invención. La mejoría en el rasgo incluye, pero no se limita a, incremento en el rendimiento, incluyendo rendimiento incrementado bajo condiciones de no estrés y rendimiento incrementado bajo condiciones de estrés ambiental. Las condiciones de estrés pueden incluir, por ejemplo, sequia, sombra, enfermedad fungal, enfermedad viral, enfermedad bacterial, infestación por insecto, infestación por nemátodo, exposición a la temperatura fría, exposición al calor, estrés osmótico, disponibilidad reducida del nutriente nitrógeno, disponibilidad reducida del nutriente fósforo y alta densidad vegetal. Muchos rasgos agronómicos pueden afectar el "rendimiento", incluyendo sin limitación, altura de la planta, número de vaina, posición de la vaina en la planta, número de internodos, incidencia de fragmentación de la vaina, tamaño de grano, eficiencia de la nodulación y fijación del nitrógeno, eficiencia de la asimilación de nutriente, resistencia al estrés biótico y abiótico, asimilación del carbono, arquitectura de la planta, resistencia al amontonamiento, porcentaje de germinación de la semilla, vigor de la plántula, y rasgos juveniles. Otros rasgos que pueden afectar el rendimiento incluyen, eficiencia de la germinación (incluyendo germinación en condiciones de estrés), velocidad de crecimiento (incluyendo velocidad de crecimiento en condiciones de estrés), número de mazorcas, número de semillas por mazorca, tamaño de semilla, composición de la semilla (almidón, aceite, proteina) y caracteristicas de llenado de la semilla. También de interés es la generación de plantas transgénicas que demuestran propiedades fenotípicas deseables que pueden o no conferir un incremento en el rendimiento general de la planta. Dichas propiedades incluyen morfología vegetal mejorada, fisiología vegetal mejorada o componentes mejorados de la semilla madura cosechada a partir de la planta transgénica.

Como se utiliza en la presente invención, "condición de crecimiento con suficiente nitrógeno" se refiere a la condición de crecimiento en donde el suelo o el medio de crecimiento contiene o recibe suficientes cantidades del nutriente nitrógeno para mantener un crecimiento vegetal saludable y/o para que una planta alcance su rendimiento típico para una especie vegetal particular o una cepa particular. Las condiciones de crecimiento con suficiente nitrógeno varían entre las especies y para las variedades dentro de una especie, y también varían entre diferentes ubicaciones geográficas. Sin embargo, un experto en la técnica sabe qué constituye las condiciones de crecimiento no limitantes por nitrógeno para el cultivo de la mayoría, si no es que de todas, las cosechas importantes, en una ubicación geográfica específica. Por ejemplo, para el cultivo de trigo véase Alcoz, et al., Agronomy Journal 85: 1198-1203 (1993), Rao y Dao, J. Am. Soc. Agronomy 84: 1028-1032 (1992), Howard y Lessman, Agronomy Journal 83: 208-211 (1991); para el cultivo de maíz véase Wood, et al., J. of Plant Nutrition 15: 487-500 (1992), Tollenear, eí al., Agronomy Journal 85: 251-255 (1993), Straw, et al., Tennessee Farm and Home Science: Progress Report, 166: 20-24 (Primavera 1993), Dará, er al., J. Am. Soc. Agronomy 84: 1006-1010 (1992), Binford, et al., Agronomy Journal 84: 53-59 (1992); para el cultivo de frijol de soya véase Chen, et al., Canadian Journal of Plant Science 72: 1049-1056 (1992), Wallace, et al. Journal of Plant Nutrition 13: 1523-1537 (1990); para el cultivo de arroz véase Oritani y Yoshida, Japanese Journal of Crop Science 53: 204-212 (1984); para el cultivo de tomate véase Grubinger, et al., Journal of the American Society for Horticultural Science 118: 212-216 (1993), Cerne, M., Acta Horticulture 277: 179-182, (1990); para el cultivo de la pina véase Asoegwu, S. N., Fertilizer Research 15: 203-210 (1988), Asoegwu, S. N., Fruits 42: 505-509 (1987), para el cultivo de la lechuga véase Richardson y Hardgrave, Journal of the Science of Food and Agriculture 59: 345-349 (1992); para el cultivo de la potata véase Porter y Sisson, American Potato Journal, 68: 493-505 (1991); para el cultivo de cosechas de brassica véase Rahn, et al., Conferencia "Proceedings, second congress of the European Society for Agronomy" Warwick Univ., p. 424-425 (Agosto 23-28, 1992); para el cultivo de banana véase Hegde y Srinivas, Tropical Agriculture 68: 331-334 (1991), Langenegger y Smith, Fruits 43: 639-643 (1988); para el cultivo de fresas véase Human y Kotze, Communications in Soil Science and Plant Analysis 21 : 771-782 (1990); para el cultivo del sorgo véase Mahalle y Seth, Indian Journal of Agricultural Sciences 59: 395-397 (1989); para el cultivo de azúcar de caña véase Yadav, R. L., Fertiliser News 31 : 17-22 (1986), Yadav y Sharma, Indian Journal of Agricultural Sciences 53: 38-43 (1983); para el cultivo de remolacha azucarera véase Draycott, et al., Conferencia "Symposium Nitrogen and Sugar Beet" International Institute for Sugar Beet Research-Bruselas Bélgica, p. 293-303 (1983). Véase también Goh y Haynes, "Nitrogen and Agronomic Practice" en Mineral Nitrogen in the Plant-Soil System, Academic Press, Inc., Orlando, Florida, p. 379-468 (1986), Engelstad, O. P., Fertilizer Technology and Use, Tercera Edición, Soil Science Society of America, p. 633 (1985), Yadav y Sharmna, Indian Journal of Agricultural Sciences, 53: 3-43 (1983). Como se utiliza en la presente ¡nvención, "nutriente de nitrógeno" significa cualquier uno o cualquier mezcla de las sales de nitrato comúnmente utilizadas como fertilizante de nitrógeno vegetal, incluyendo, pero no se limitadas a, nitrato de potasio, nitrato de calcio, nitrato de sodio, nitrato de amonio. El término amonio como se utiliza en la presente invención significa cualquier uno o cualquier mezcla de las sales de amonio comúnmente utilizadas como fertilizante de nitrógeno vegetal, por ejemplo, nitrato de sodio, cloruro de amonio, sulfato de amonio, etc. Un experto en la técnica podría reconocer qué constituye dicho suelo, medio y consumos del fertilizante para la mayoría de las especies vegetales. "Condición de crecimiento con nitrógeno limitado" utilizada en la presente invención se refiere a una condición de crecimiento vegetal que no contiene suficiente nutriente nitrógeno para mantener un crecimiento vegetal saludable y/o para que una planta alcance su rendimiento típico bajo una condición de crecimiento con suficiente nitrógeno. Por ejemplo, una condición con nitrógeno limitado se puede referir a una condición de crecimiento con 50% o menos de los consumos convencionales de nitrógeno. Como se utiliza en la presente invención, "rendimiento incrementado" de una planta transgénica de la presente invención se puede evidenciar y medir de numerosas formas, ¡ncluyendo prueba de peso, número de semillas por planta, peso de la semilla, número de semillas por unidad de área (por ejemplo, semillas, o peso de las semillas, por 4,046 m2), medidas de áridos (35.23 litros) por 4,046 m2, toneladas por 4,046 m2, kilos por hectárea. Por ejemplo, el rendimiento del maíz se puede medir como la producción de granos de maíz desgranados por unidad de área de producción, por ejemplo, en medidas de áridos (35.23 litros) por 4,046 m2o toneladas métricas por hectárea, frecuentemente reportadas en una base con humedad ajustada, por ejemplo, un 15.5% de humedad. El rendimiento incrementado puede resultar a partir de la utilización mejorada de compuestos bioquímicos clave, tales como nitrógeno, fósforo y carbohidrato, o a partir de la tolerancia mejorada al estrés ambiental, tales como frío, calor, sequía, sal, y ataque por plagas o patógenos. El ADN recombinante para mejoría del rasgo también se puede utilizar para proveer plantas transgénicas que tienen crecimiento y desarrollo mejorado, y finalmente rendimiento incrementado, como el resultado de la expresión modificada de los reguladores del crecimiento vegetal o modificación de las rutas del ciclo celular o de fotosíntesis. Como se utiliza en la presente invención, "promotor" incluye la referencia a una región del ADN cascada arriba del sitio de inicio de la transcripción y que participa en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor vegetal" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en las células vegetales ya sea que su origen sea o no una célula vegetal. Los promotores vegetales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se obtienen a partir de plantas, virus vegetales, y bacterias que comprenden genes expresados en células vegetales tales como Agrobacterium o Rhizobium. Los ejemplos de promotores bajo el control del desarrollo incluyen promotores que preferiblemente inician la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, o semillas. Dichos promotores se refieren como promotores "preferidos de tejido". Los promotores que inician la transcripción solamente en ciertos tejidos se refieren como "específicos de tejido". Un promotor específico de "tipo celular" principalmente dirige la expresión en ciertos tipos celulares en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raices u hojas. Un promotor "inducible" o "represible" es un promotor que se encuentra bajo control ambiental. Los ejemplos de las condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por los promotores inducibles incluyen condiciones aeróbicas, o ciertos químicos, o la presencia de luz. Los promotores específicos de tejido, preferidos de tejido, específicos de tipo celular, e inducibles constituyen la clase de promotores "no-constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor el cual es activo bajo la mayoria de las condiciones. Como se utiliza en la presente invención, "orientación antisentido" incluye la referencia a una secuencia polinucleotídica que está operativamente asociada a un promotor en una orientación en donde se transcribe la cadena antisentido. La cadena antisentido es suficientemente complementaria a un producto de transcripción endógeno de tal manera que frecuentemente se inhibe la traducción del producto de transcripción endógeno.

Como se utiliza en la presente invención, "operativamente asociado" se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un fragmento de ácido nucleico particular de manera que la función de uno se afecta por el otro. Por ejemplo, un promotor está operativamente asociado con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante (por ejemplo, que la secuencia codificante se encuentra bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes se pueden asociar operativamente a las secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido. Como se utiliza en la presente invención, "secuencia consenso" se refiere a una secuencia artificial de aminoácidos de partes conservadas de las proteinas codificadas por genes homólogos, por ejemplo, como se determina por un alineamiento CLUSTALW de la secuencia de aminoácidos de proteinas homologas. Los genes homólogos son genes relacionados a un segundo gen, que codifican proteinas con la misma función biológica o con una función biológica similar a la proteina codificada por el segundo gen. Los genes homólogos se pueden generar por el evento de especiación (véase ortólogo) o por el evento de duplicación genética (véase parálogo). "Ortólogos" se refieren a una serie de genes homólogos en diferentes especies que se han desarrollado a partir un gen común ancestral por especificación. Normalmente, los ortólogos retienen la misma función en el curso de la evolución; y los "parálogos" se refieren a una serie de genes homólogos en las mismas especies que han divergido entre sí como una consecuencia de la duplicación genética. Por lo tanto, los genes homólogos se pueden formar a partir del mismo organismo o a partir de un organismo diferente. Como se utiliza en la presente ¡nvención, "homólogo" significa una proteína que lleva a cabo la misma función biológica que una segunda proteína incluyendo aquellas identificadas por la búsqueda de la identidad de secuencia. La identidad porcentual se refiere al grado en el cual dos segmentos de ADN óptimamente alineados o de proteína son invariantes a través de una ventana de alineamiento de los componentes, por ejemplo, secuencia nucleotídica o secuencia de aminoácidos. Una "identidad de fracción" para los segmentos alineados de una secuencia prueba y una secuencia de referencia es el número de componentes idénticos que se comparten por las secuencias de los dos segmentos alineados dividido por el número total de componentes de la secuencia en el segmento de referencia en una ventana de alineamiento que es la más pequeña de la secuencia prueba total o la secuencia de referencia total. La "identidad porcentual " ("% de identidad") es la identidad de fracción por 100 veces. "% de identidad con una secuencia de aminoácidos consenso" es 100 veces la identidad de fracción en una ventana de alineamiento de una secuencia de aminoácidos de una proteina prueba óptimamente alieneada a la secuencia de aminoácidos consenso de esta invención.

Construcciones de ADN recombinante Como se utiliza en la presente invención, "expresión" se refiere a la transcripción del DNA para producir ARN. El ARN resultante puede ser sin limitación ARNm que codifica una proteína, ARN antisentido que es complementario a un ARNm que codifica una proteína, o un transcrito de ARN que comprende una combinación de regiones de gen sentido y antisentido, tales como para uso en tecnología de ARNi. La expresión como se utiliza en la presente invención también se puede referir a la producción de la proteína codificada a partir del ARNm. La "expresión ectópica" se refiere a la expresión de una molécula de ARN o una proteína en un tipo celular diferente a un tipo celular en el cual el ARN o la proteína normalmente se expresa, o en un momento diferente a un momento en el cual el ARN o la proteína normalmente se expresa, o a un nivel de expresión diferente al nivel en el cual el ARN se expresa normalmente. La "sobre-expresión" utilizada en la presente invención indica que el nivel de expresión de una proteína blanco, en una planta transgénica o en una célula hospedera de la planta transgénica, excede los niveles de expresión en una planta no transgénica. En una modalidad preferida de la presente invención, una construcción de ADN recombinante comprende el polinucleótido de interés en la orientación sentido en relación con el promotor para lograr la sobre-expresión del gen. La presente invención provee construcciones de ADN recombinante que comprenden un polinucleótido descrito en la presente invención, el cual codifica una proteina flavohemoglobina. Dichas construcciones típicamente también comprenden un promotor operativamente asociado a dicho polinucle?tido para proveer para la expresión en una planta blanco. Otros componentes de la construcción pueden incluir elementos reguladores adicionales, tales como regiones no traducidas hacia 5' o 3' (tales como los sitios de poliadenilación), regiones del intrón, y péptidos de tránsito o péptidos señal. En una modalidad preferida, un polinucleótido de la presente invención está operativamente asociado en una construcción de ADN recombinante a un promotor functional en una planta para proveer la expresión del polinucleótido en la orientación sentido de tal manera que se produce un polipéptido deseado para lograr la sobre-expresión o expresión ectópica. Las construcciones recombinantes preparadas de conformidad con la presente invención también pueden incluir generalmente una región de ADN no traducida hacia 3' (UTR) que típicamente contiene una secuencia de poliadenilación después de la región codificante del polinucleótido. Los ejemplos de UTRs útiles hacia 3' incluyen aquellas a partir del gen de la nopalin sintasa de Agrobacterium tumefaciens (nos), un gen que codifica la subunidad pequeña de una ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa-oxigenasa (rbcS), y el transcrito T7 de Agrobacterium tumefaciens. Las construcciones y vectores también pueden incluir un péptido de tránsito para el direccionamiento de un gen blanco hacia un organelo vegetal, particularmente hacia un cloroplasto, leucoplasto u otro organelo plastidio. Para las descripciones del uso de los péptidos de tránsito del cloroplasto, véase la Patente de E.U.A. 5, 188,642 y la Patente de E.U.A. No. 5,728,925, incorporada en la presente invención como referencia. La construcción de ADN recombinante pueden incluir otros elementos. Por ejemplo, la construcción puede contener segmentos de ADN que proveen la función de replicación y la selección del antibiótico en células bacterianas. Por ejemplo, la construcción puede contener un origen de la replicación de E. coli tal como ori322 o un origen de replicación con un mayor intervalo de hospedero tales como oriV, oriRi u oriColE. La construcción también puede comprender un marcador de selección tal como un Ec-ntpll-Tn5 que codifica un gen de la neomicina fosfotransferasa II obtenida a partir de Tn5 confiriendo resistencia a una neomicina y canamicina, Spc/Str que codifica para Tn7 aminoglicósído adeniltransferasa (aadA) confiriendo resistencia a espectinomicina o estreptomicina, o una gentamicina (Gm, Gent) o uno de muchos genes marcadores de selección conocidos. El vector o construcción también pueden incluir un marcador de selección y otros elementos como sea adecuado para la selección de células vegetales o bacterianas que tienen construcciones de DNA de la invención. Las construcciones de DNA se diseñan con marcadores de selección adecuados que pueden conferir tolerancia a la célula con respecto al antibiótico o al herbicida tolerance. Las secuencias polinucleotídicas para tolerancia al antibiótico incluyen, pero no se limitan a, secuencias polinucleotídicas que codifica para proteínas implicadas en la tolerancia a canamicina, neomicina, higromicina, y otros antibióticos conocidos en la técnica. Un gen para tolerancia al antibiótico en dicho vector se puede reemplazar por el gen de tolerancia al herbicida que codifica para la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS, descrita en la Patente de E.U.A. Nos. 5,627,061 , y 5,633,435; Padgette, ef al. Herbicide Resistant Crops, Lewis Publishers, 53-85, 1996; y en Penaloza-Vazquez, er al., Plant Cell Reports 14: 482-487, 1995) y aroA (Patente de E.U.A. Número 5,094,945) para tolerancia a glifosato, bromoxinil nitrilasa (Bxn) para tolerancia al bromoxinil (Patente de E.U.A. No. 4,810,648), fitoeno desaturasa (crtl (Misawa, et al., Plant J. 4: 833-840, 1993; y Misawa, et al., Plant J. 6: 481 -489, 1994) para tolerancia al norflurazon, acetohidroxiácido sintasa (AHAS, Sathasiivan, et al., Nucí. Acids Res. 18: 2188-2193, 1990). Los herbicida para los cuales se ha demostrado la tolerancia de la planta transgénica y para los cuales el método de la presente invención se puede aplicar incluyen, pero no se limitan a: glifosato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinil, delapon, ciclohezanediona, inhibidores de la protoporfirionógeno oxidasa, y herbicidas de isoxaslutol. Otros ejemplos de los marcadores de selección, marcadores que se pueden explorar y otros elementos se conocen bien en la técnica y se pueden utilizar fácilmente en la presente invención. Aquellos expertos en la técnica se deben referir a los siguientes para detalles (para los marcadores de selección, véase Potrykus, et al., Mol. Gen. Genet. 199: 183-188, 1985; Hinchee, et al., Bio. Techno. 6: 915-922, 1988; Stalker, et al., J. Biol. Chem. 263: 6310-6314, 1988; Solicitud de Patente Europea 154,204; Thillet, ef al., J. Biol. Chem. 263: 12500-12508, 1988; para los marcadores que se pueden explorar véase, Jefferson, Plant Mol. Biol, Rep. 5: 387-405, 1987; Jefferson, et al., EMBO J. 6: 3901-3907, 1987; Sutcliffe, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3737-3741 , 1978; Ow, ef al., Science 234: 856-859, 1986; Ikatu, et al., Bio. Technol. 8: 241-242, 1990; y para otros elementos véase, Solicitud de Patente Europea Publication Número 0218571 ; Koziel et al., Plant Mol. Biol. 32: 393-405; 1996). En una modalidad de la presente invención, las construcciones de ADN recombinante también incluyen un péptido de tránsito para el direccionamiento de un gen blanco hacia un organelo vegetal, particularmente hacia un cloroplasto, leucoplasto u otro organelo plastidio. Para las descripciones del uso de los péptidos de tránsito del cloroplasto véase la Patente de E.U.A. No. 5, 188,642 y la Patente de E.U.A. No. 5,728,925, incorporadas en la presente invención como referencias. Para la destrucción de la región del péptido de tránsito de un gen EPSPS de la Arabidopsis útil en in la presente invención, véase Klee, H.J. et al., (MGG (1987) 210: 437-442). Los componentes esenciales del cassette de expresión en la construcción de ADN recombinante de la presente invención están operativamente asociados entre sí en un orden específico para ocasionar la expresión del productor del gen deseado, por ejemplo, proteína flavohemoglobina, en una planta. Los órdenes específicos de los componentes esenciales operativamente asociados a los vectores de expresión se ilustran en la figura 2-4.

ADN recombinante y polinucleótidos Como se utiliza en la presente invención, ambos términos "una secuencia codificante" y "una molécula polinucleotídica codificante" significan una molécula polinucleotídica que se puede traducir hacia un polipéptido, usualmente vía ARNm, cuando se coloca bajo el control de moléculas reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio de la traducción en el extremo hacia 5' y un codón de paro de la traducción en el extremo hacia 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, ADN genómico, ADNc, y moléculas polinucleotídicas quiméricas. Una secuencia codificante puede ser un ADN artificial. Un ADN artificial, como se utiliza en la presente invención significa una molécula polinucleotídica de ADN que no se presenta de manera natural. Los polinucleótidos ejemplares que comprenden una secuencia codificante para una flavohemoglobina para uso en la presente invención para mejorar los rasgos en plantas se proveen en la presente invención como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, así como los homólogos de dichas moléculas de ADN. Una subpoblación del ADN ejemplar incluye fragmentos de los polinucleótidos completamente descritos que consisten de oligonucleótidos de al menos 15, preferiblemente al menos 16 ó 17, más preferiblemente al menos 18 ó 19, e incluso más preferiblemente al menos 20 o más, nucleótidos consecutivos. Dichos oligonucleótidos son fragmentos de las moléculas más grandes que tienen una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 hasta SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 7 hasta SEQ ID NO: 129, y encuentran uso, por ejemplo, como sondas e iniciadores para la detección de los polinucleótidos de la presente invención. También de interés en la presente invención son las variantes del ADN provistas en la presente invención. Dichas variantes se pueden presentar de manera natural, incluyendo ADN a partir de los genes homólogos a partir de las mismas especies o de especies diferentes, o pueden ser variantes no naturales, por ejemplo un ADN artificial, por ejemplo ADN sintetizado utilizando métodos de síntesis química, o generados utilizando técnicas de ADN recombinante. La degeneración del código genético provee la posibilidad de sustituir al menos una base de la secuencia que codifica la proteína de un gen con una base diferente sin ocasionar que cambie la secuencia de aminoácidos del polipéptido producido a partir del gen. Por lo tanto, un ADN útil en la presente invención puede tener cualquier secuencia de bases que ha sido cambiada a partir de las secuencias provistas en la presente invención mediante la sustitución de conformidad con la degeneración del código genético. Las moléculas de ADN artificial se pueden diseñar mediante una variedad de métodos, tales como, las méíodos conocidos en la técnica que se basan en la sustitución del codón(es) de un primer polinucleótido para crear un equivalente, o incluso un polinucleótido artificial mejorado, de segunda generación, en donde este nuevo polinucleótido artificial es útil para la expresión mejorada en plantas transgénicas. El aspecto del diseño frecuentemente emplea un cuadro de uso del codón. El cuadro se produce mediante la compilación de la frecuencia de ocurrencia de los codones en una colección de secuencias codificantes aisladas a partir de una planta, tipo vegetal, familia o género. Otros aspectos del diseño incluyen la reducción de la presencia de señales de poliadenilación, sitios de procesamiento del intrón, o extensiones largas AT o GC de la secuencia (Patente de E.U.A. 5,500,365, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad). Las secuencias codificante de longitud total o fragmentos de las mismas se pueden elaborar de ADN artificial utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Dichas moléculas ejemplares de ADN artificial provistas por la presente invención se establecen como SEQ ID NO: 1 , 2 y 260. Los homólogos de los genes que proveen ADN que demostraron ser útiles para proveer rasgos en las plantas modelo descritas en la presente invención generalmente demostrarán una identidad significativa con el ADN provisto en la presente invención. El ADN es sustancialmente idéntico a un ADN de referencia si, cuando las secuencias de los polinucleótidos se alinean óptimamente existe aproximadamente 60% de equivalencia de nucleótidos; más preferiblemente 70%; más preferiblemente 80% de equivalencia; más preferiblemente 85% de equivalencia; más preferiblemente 90%; más preferiblemente 95%; y/o más preferiblemente 98% o 99% de equivalencia en relación con una ventana de comparación. Una ventana de comparación es preferiblemente de al menos 50-100 nucleótidos, y más preferiblemente es de la longitud total del polinucleótido provisto en la presente invención. El alineamiento óptimo de las secuencias para el alineamiento de una ventana de comparación se puede llevar a cabo mediante algoritmos; preferiblemente mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, the Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0-10.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl). El polinucleótido de referencia puede ser una molécula de longitud total o una porción de una molécula más larga. Preferiblemente, la ventana de comparación para la determinación de la identidad polinucleotídica de las secuencias que codifican la proteína es la región codificante total.

Polipéptidos y proteinas Los polipéptidos provistos por la presente invención son proteínas totales o al menos una porción adecuada de la proteína total para impartir la actividad biológica relevante de la proteína. El término "proteína" también incluye moléculas que consisten de una o más cadenas polípepíidica. Por lo tanto, una proteina útil en la presente invención puede constituir una proteina total que tiene la actividad biológica deseada, o puede constiíuír una porción de una proteína oligomérica que tiene múltiples cadenas polipeptídicas. Las proteínas útiles para la generación de plantas transgénicas que tienen rasgos mejorados incluyen las proteínas con una secuencia de aminoácidos provista en la presente invención como SEQ ID NO: 5 y 6, así como homólogos de dichas proteínas. Los homólogos de las proteínas útiles en la presente invención se pueden identificar mediante comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína con respecto a las secuencias de aminoácidos de las proteínas a partir de la misma fuente de plantas o a partir de diferentes fuentes, por ejemplo manualmente o mediante el uso de algoritmos de búsqueda conocidos basados en homología tales como aquellos comúnmente conocidos y referidos como BLAST, FASTA, y Smith-Waterman. Como se utiliza en la presente invención, un homólogo es una proteina a partir del mismo organismo o a partir de un organismo diferente que lleva a cabo la misma función biológica que el polipéptido con el cual se compara. Una relación ortóloga entre dos organismos no necesariamente se manifiesta como una correspondencia uno a uno entre dos genes, debido a que un gen puede estar duplicado o deletado después de la separación filogenética del organismo, tal como la especiación. Para una proteína dada, puede no existir un ortólogo o puede existir más de un ortólogo. Otros factores de complicación incluyen transcritos alternativamente procesados a partir del mismo gen, identificación limitada del gen, copias redundantes del mismo gen con diferentes longitudes de secuencia o secuencia corregida. Un programa de alineamiento de secuencia local, por ejemplo BLAST, puede ser útil para la búsqueda de una base de datos de secuencias para encontrar secuencias similares, y el valor de suma de la espectativa (valor E) utilizado para medir la similitud de la secuencia de bases. Puesto que una proteína acierto con el mejor valor E-para un organismo particular puede no ser necesariamente un ortólogo o el único ortólogo, se utiliza una búsqueda recíproca BLAST en la presente invención para filtrar las secuencias de aciertos con valores E significativos para la identificación del ortólogo. El BLAST reciproco produce la búsqueda de los aciertos significativos en contra de una base de datos de secuencias de aminoácidos a partir del organismo base que son similares a la secuencia de la proteína de búsqueda. Un acierto es probablemente un ortólogo, cuando el mejor acierto del BLAST recíproco es la proteína de búsqueda misma o una proteina codificada por un gen duplicado después de la especiación. Por lo tanto, el homólogo se utiliza en la presente invención para describir proteínas que se asume que tienen similitud de función por la inferencia a partir de la similitud de las secuencias de bases. Un aspecto adicional de la invención comprende proteínas homologas funcionales que difieren en uno o más aminoácidos a partir de aquellas de una proteína con un rasgo mejorado descrita en la presente invención como el resultado de una o más de las sustituciones conservativas de aminoácidos bien conocidas, por ejemplo valina es un sustituto conservativo para alanina y treonina es un sustituto conservativo para serina. Las sustituciones conservativas para un aminoácido dentro de la secuencia nativa se pueden seleccionar a partir de otros miembros de una clásica a la cual pertenece el aminoácidos que se presenta de manera natural. Los aminoácidos representativos dentro de estas diversas clases incluyen, pero no se limitan a: (1) aminoácidos ácidos (negativamente cargados) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (positivamente cargados) tales como arginina, histidina, y lisina; (3) aminoácidos neutros polares tales como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; y (4) aminoácidos neutros no polares (hidrófobos) tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, y metionina. Los sustitutos conservados para un aminoácido dentro de una secuencia nativa de aminoácidos se pueden seleccionar a partir de otros miembros del grupo al cual pertenece el aminoácido que se presenta de manera natural. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofano; un grupo dé aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginína, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos para sustituciones de aminoácidos naturalmente conservativos son: valina-leucina, valina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valína, ácido aspártico-ácido glutámico, y asparagina-glutamina. Un aspecto adicional de la invención comprende proteínas que difieren en uno o más aminoácidos en comparación con aquellos de una secuencia de proteína descrita como el resultado de la deleción o inserción de uno o más aminoácidos en una secuencia nativa. Los homólogos descritos provistos en la presente invención generalmente demostrarán identidad de secuencia significativa. De interés particular son las proteinas que tienen al menos 50% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia o mayor, por ejemplo al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ó 6. Por supuesto las proteínas útiles también incluyen aquellas con mayor identidad, por ejemplo 90% a 99% de identidad. Los homólogos de identidad de proteína se determinan por el alineamiento óptimo de la secuencia de aminoácidos de un homólogo putativo de la proteína con una secuencia de aminoácidos definida y mediante el cálculo del porcentaje de identidad y de los aminoácidos conservativamente sustituidos con respecto a la ventana de comparación. La ventana de comparación para la determinación de la identidad puede ser la secuencia de aminoácidos total descrita en la presente invención, por ejemplo la secuencia total de cualesquiera de SEQ ID NO: 5 y 6. Los genes que son homólogos entre sí se pueden agrupar en familias y se incluyen en múltiples alineamientos de secuencia. Luego se puede derivar una secuencia consenso para cada grupo. Este análisis permite la derivación de residuos conservados y específicos de clase (familia) o motivos que son funcionalmente importantes. Estos residuos conservados y motivos se pueden validar adicionalmente con la estructura 3D de la proteina si está disponible. La secuencia consenso se puede utilizar para definir el alcance total de la invención, por ejemplo para identificar las proteínas con una relación homologa.

Promotores El promotor que ocasiona la expresión de una ARN que está operativamente asociada a la molécula polinucleotídica en una construcción usualmente controla el patrón de expresión del polipéptido traducido en una planta. Los promotores para la práctica de la invención se pueden obtener a partir de diversas fuentes incluyendo, pero no limitadas a, plantas y virus vegetales. Varios promotores, incluyendo promotores constitutivos, promotores inducibles y promotores específicos de tejido, promotores mejorados por tejido que son activos en células vegetales se han descrito en la literatura. Se prefieren que el promotor particular seleccionado deba ser capaz de ocasionar la expresión adecuada para resultar en la producción de una cantidad efectiva de un polipéptido para ocasionar el fenotipo deseado. La "sobre-expresión del gen" utilizada en la presente invención en referencia con un polinucleótido o polipéptido indica que el nivel de expresión de una proteína: blanco, en una planta transgénica o en una célula hospedera de la planta transgénica, excede los niveles de expresión en una planta no transgénica. En una modalidad preferida de la presente invención, una construcción de ADN recombinante comprende el polinucleótido de interés en la orientación sentido en relación con el promotor para lograr la sobre-expresión del gen. De conformidad con la presente invención, los promotores constitutivos están activos bajo la mayoria de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o de diferenciación celular. Estos promotores son adecuados para proveer la expresión de la secuencia polinucleotidica en muchas etapas del desarrollo vegetal y en una mayoría de tejidos. Una variedad de promotores constitutivos se conocen en la técnica. Los ejemplos de los promotores constitutivos que están activos en células vegetales incluyen pero no se limitan a los promotores de la nopalina sintasa (NOS); los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Patente de E.U.A. No. 5,858,642, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad); el promotor del virus del mosaico de escrofularia (P-FMV, Patente de E.U.A. No. 6,051 ,753, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad); promotores de la actina, tal como el promotor de la actina del arroz (P-Os.Actl , Patente de E.U.A. No. 5,641 ,876, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad). Además, los promotores se pueden alterar para que contengan una o más "secuencias potenciadoras" para ayudar a elevar la expresión del gen. Dichos potenciadores se conocen en la técnica. Mediante la inclusión de una secuencia potenciada con dichas construcciones, se puede mejorar la expresión de la proteína seleccionada. Estos potenciadores frecuentemente se encuentran hacia 5' con respecto al inicio de la transcripción en un promotor que funciona en células eucariontes, pero frecuentemente se pueden insertar en la orientación hacia adelante o reversa hacia 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante. En algunos casos, estos elementos potenciadores hacia 5' son intrones. Se considera que son particularmente útiles como potenciadores son los intrones hacia 5' de los genes de la actina del arroz 1 y de la actina del arroz 2. Los ejemplos de otros potenciadores que se pueden utilizar de conformidad con la invención incluyen los elementos a partir de promotor CaMV 35S, los genes de la octopina sintasa, en gen de la alcohol deshidrogenasa del maiz, el gen shrunken 1 del maiz y los promotores a partir de eucariontes no vegetales. Los promotores preferidos de tejido ocasionan la transcripción o la transcripción mejorada de la secuencia polinucleotídica en células específicas o tejidos en tiempos específicos durante el desarrollo vegetal, tales cqmo en los tejidos vegetativos o reproductivos. Los ejemplos de promotores preferidos de tejido bajo el control del desarrollo incluyen los promotores que inician la transcripción principalmente en ciertos tejidos, tal como en los tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces, hojas o tallos, o tejidos reproductivos, tales como frutos, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores, o cualquier tejido embrionario, o cualquier combinación de los mismos. Los promotores de tejido reproductivo preferidos pueden ser, por ejemplo, preferidos de óvulo, preferidos de embrión, preferidos de endospermo, preferidos de integumento, preferidos de polen, preferidos de pétalo, preferidos de sépalo, o algunas combinaciones de los mismos. El promotor(s) preferido(s) de tejido también incluirá promotores que pueden ocasionar la transcripción, o la transcripción mejorada en un tejido vegetal deseado en una etapa deseada de desarrollo vegetal. Un ejemplo de dicho promotor incluye, pero no se limita a, una plántula o un promotor preferido de plántula temprana. Un experto en la técnica reconocerá que un promotor preferido de tejido puede dirigir la expresión de moléculas polinucleotídicas operativamente asociadas en tejidos diferentes al tejido blanco. Por lo tanto, como se utiliza en la presente invención, un promotor preferido de tejido es uno que dirige la expresión preferencialmente no solamente en el tejido blanco, sino que también puede llevar a cierta expresión en otros tejidos. En una modalidad de esta invención, se desea la expresión preferencial en tejidos verdes vegetales. Los promotores de interés para dichos usos incluyen aquellos a partir de los genes tales como el gen de la aldolasa del maíz FDA (Solicitud de Patente de E.U.A. No. de Publicación 20040216189, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad), aldolasa y piruvato ortofosfato diquinasa (PPDK) (Taniguchi et al. (2000) Plant Cell Physiol. 41(1): 42-48). En otra modalidad de esta invención, se desea la expresión preferencial en el tejido de raíz vegetal. El promotor ejemplar de interés para dichos usos se deriva a partir del gen de la nicotianamina sintasa de Maíz (Solicitud de Patente de E.U.A. No. de Publicación 20030131377, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad) y el promotor RCC3 del arroz (Solicitud de Patente de E.U.A. No. de Serie 1 1/075,1 13, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad). En incluso otra modalidad de esta invención, se desea la expresión preferencial en el tejido vegetal de floema. Un promotor ejemplar de interés para dicho uso es el promotor del virus baciliforme tungro del arroz (RTBV) (Patente de E.U.A. 5,824,857, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad). En la práctica de la presente invención, también se puede utilizar un promotor inducible para expresar de manera ectópica el gen estructural en la construcción del ADN recombinante. El promotor inducible puede ocasionar la expresión condicional de una secuencia polinucleotídica bajo la influencia de condiciones ambientales cambiantes o condiciones de desarrollo cambiantes. Por ejemplo, dichos promotores pueden ocasionar la expresión de la secuencia polinucleotídíca a ciertas temperaturas o intervalos de temperatura, o en una etapa(s) específica(s) del desarrollo vegetal tal como en la etapa de germinación temprana o la etapa de maduración tardía de una planta. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, el promotor inclusive por luz a partir de la subunidad pequeña de la ribulosa- 1 ,5-bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO); el promotor inducible por sequía del maíz (Busk et al., Plant J. 1 1 : 1285-1295, 1997), el promotor inducible por frío, sequía, y alta concentración de sal a partir de la patata (Kirch, Plant Mol. Biol. 33: 897-909, 1997), y muchos promotores insensibles por frío conocidos en la técnica; por ejemplo los promotores rd29a y cor15a a partir de Arabidopsis (Genbank ID: D13044 y U01377), blt101 y blt4.8 a partir de cebada (Genbank ID: AJ310994 y U63993), wcs120 a partir de trigo (Genbank ID:AF031235), mlip15 a partir del maiz (Genbank ID: D26563) y bn1 15 a partir de Brassica (Genbank ID: U01377).

Transformación vegetal Están disponibles diversos métodos para la introducción de un gen heterólogo que codifica la flavohemoglobina, provistos por la presente invención, en células vegetales y se conocen por aquellos expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a: (1 ) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, Cell, 22(2): 479-488, 1980), electroporación (Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82(17): 5824-5828, 1985; Patente de E.U.A. No. 5,384,253) y administración mediada por mícroproyectil (biolísticps o tecnología de pistola de genes) (Christou ef al., Bio/Technology 9: 957, 1991 ; Fynan ef al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90(24): 1 1478-1 1482, 1993); (2) métodos de administración mediada por virus (Clapp, Clin. Perinatol., 20(1): 155-168, 1993; Lu et al., J. Exp. Med., 178(6): 2089-2096, 1993; Eglitis y Anderson, Biotechniques, 6(7): 608-614, 1988; y (3) métodos de transformación mediada por Agrobacterium. Los métodos más comúnmente utilizados para la transformación de células vegetales son el procedimiento para la transferencia del ADN mediada por Agrobacterium (Fraley ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803, 1983) y los biolisticos o el proceso mediado por bombardeo de microproyectil (por ejemplo la pistola de genes). Típicamente, se desea la transformación nuclear pero cuando es deseable transformar específicamente a los plastidios, tales como cloroplastos o amiloplastos, los plastidios vegetales se pueden transformar utilizando una administración mediada por microproyectil del polinucleótido deseado para ciertas especies vegetales tales como las especies de tabaco, Arabidopsis, patata y Brassica. La transformación mediada por Agrobacterium se logra a través del uso de una bacteria del suelo genéticamente diseñada que pertenece al género Agrobacterium. Una cepa desarmada de Agrobacterium C58 (ABI) que contiene una construcción de ADN se puede utilizar para todos los experimentos. De conformidad con este método, la construcción se transfiere hacia Agrobacterium mediante un método de apareamiento triparental (Ditta ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. 77: 7347-7351 ). Los cultivos líquidos de Agrobacterium se inician a partir de soluciones de almacenamiento en glicerol o a partir de una placa recientemente sembrada y crecida durante toda la noche a 26°C-28°C con agitación (aproximadamente 150 rpm) hasta una fase de crecimiento medio logarítmico en medio LB líquido, pH 7.0 que contiene 50 mg/l de canamicína, 50 mg/l de estreptomicina y espectinomicina y 25 mg/l de cloramfenicol con 200 µM de acetosiringona (AS). Las células de Agrobacterium se resuspenden en el medio para inoculación (CM4C líquido) y la densidad se ajusta a D066o de 1. Los embriones de maíz inmaduros HillxLH198 tipo II y Hill recientemente aislados se inoculan con Agrobacterium que contiene una construcción de ADN de la presente invención y se co-cultivaron por 2-3 días en la oscuridad a 23°C. Los embriones se transfieren entonces a medio de retraso (N6 1-100-12/micro/Carb 500/20 µM de AgN03) y se incubaron a 28°C por 4 a 5 dias. Todos los cultivos subsecuentes se mantuvieron a esta temperatura. Los "Coleoptiles" (vainas protectoras que cubre el retoño emergente en plantas monocotiledóneas) se removieron una semana después de la inoculación. Los embriones se transfirieron al medio de selección inicial (N61-0-12/Carb 500/0.5 mM de glifosato). Dos semanas después, los tejidos sobrevivientes se transfirieron al segundo medio de selección (N61-0-12/Carb 500/1.0 mM de glifosato). Los callos sobrevivientes se subcultivaron cada 2 semanas hasta que los eventos puedan ser identificados. Esto toma usualmente 3 subcultivos en un medio de selección deseado. Una vez que los eventos han sido identificados, el tejido se apiló para la regeneración. Para la regeneración, los tejidos de callos se transfieren al medio para regeneración (MSOD, 0.1 µM de ABA) y se incuban por dos semanas. Los callos regenerados se transfieren a un medio con alto contenido de sacarosa y se incuban por dos semanas. Las plántulas se transforman en medio MSOD en un recipiente para cultivo y se mantienen por dos semanas. Luego las plantas con raices se transfieren al suelo. Después de la identificación de las plantas transformadas apropiadas, las plantas se pueden crecer para producir cantidades deseadas de semillas de las invenciones. Con respecto de bombardeo por microproyectil (Patente de E.U.A. No. 5,550,318; Patente de E.U.A. No. 5,538,880; Patente de E.U.A.

No. 5,610,042; y Publicación PCT WO 95/06128; cada una de las cuales se incorpora específicamente en la presente ¡nvención como referencia en su totalidad), las partículas se revisten con ácidos nucleicos y se administran dentro de las células mediante una fuerza propulsora. Una modalidad ilustrativa de un método para la administración de ADN dentro de las células vegetales mediante la aceleración es el Biolistics Particle Delivery System (Sistema de Administración de Partículas Biolísticas) (BioRad, Hercules, CA), que se puede utilizar para impulsar las partículas revestidas con ADN o las células a través de una pantalla, tal como una pantalla de acero inoxidable o una pantalla Nytex, sobre una superficie del filtro revestido con células de una planta monocotiledónea cultivadas en suspensión. La pantalla dispersa las partículas de manera que no se administran a las células recipientes en agregados grandes. Las técnicas de bombardeo de microproyectil son ampliamente aplicables, y se pueden utilizar para transformar virtualmente cualesquiera especies vegetales. Los ejemplos de especies que se han transformado mediante bombardeo por microproyectil incluyen especies de monocotiledóneas tales como el maiz (Publicación PCT WO 95/06128), cebada (Rítala et al., 1994; Hensgens ef al., 1993), trigo (Patente de E.U.A. No. 5,563,055, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad), arroz (Hensgens et al., 1993), avena (Torbet ef al., 1995; Torbet et al., 1998), centeno (Hensgens et al., 1993), azúcar de caña (Bower ef al., 1992), y sorgo (Casa et al., 1993; Hagio et al., 1991); así como numerosas dicotiledóneas incluyendo tabaco (Tomes et al., 1990; Buising y Benbow, 1994), frijol de soya (Patente de E.U.A. No. 5,322,783, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad), girasol (Knittel ef al. 1994), cacahuate (Singsit ef al., 1997), algodón (McCabe y Martinell, 1993), tomate (Van Eck ef al. 1995), y legumbres en general (Patente de E.U.A. No. 5,563,055, específicamente incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad). Para la transformación por bombardeo de microproyectil de conformidad con la presente ¡nvención, se pueden optimizar tanto los parámetros físicos como biológicos. Los factores físicos son aquellos que incluyen la manipulación del ADN/precipitación de microproyectil o aquellos que afectan el vuelo y velocidad ya sea del macro- o microproyectil. Los factores biológicos incluyen todos los pasos implicados en la manipulación de las células antes e inmediatamente después del bombardeo, tal como el ajuste osmótico de las células blanco para ayudar a aliviar el trauma asociado con el bombardeo, la orientación de un embrión inmaduro u otro tejido blanco en relación con la trayectoria de la partícula, y también la naturaleza de la transformación del ADN, tal como ADN linearizado o plásmidos intactos superenrollados. Se cree que las manipulaciones del pre-bombardeo son especialmente importantes para la transformación exitosa de los embriones inmaduros. Por consiguiente, se contempla que uno puede desear ajustar varios de los parámetros del bombardeo en estudios a escala pequeña para optimizar completamente las condiciones. Uno puede desear particularmente ajustar los parámetros físicos tales como la concentración de ADN, distancia de espacio, distancia de vuelo, distancia del tejido, y presión del helio. Adicionalmente se contempla que el grado de helio puede afectar la eficiencia de la transformación. Uno también puede optimizar los factores de reducción del trauma (TRFs) al modificar las condiciones que influyen el estado fisiológico de las células recipientes y que por lo tanto pueden influir las eficiencias de transformación y de integración. Por ejemplo, se puede ajustar el estado osmótico, hidratación del tejido y el estado del subcultivo o el ciclo celular de las células del recipiente para la transformación óptima. Para seleccionar o evaluar las células vegetales transformadas sin importar la metodología de transformación, el ADN introducido dentro de la célula contiene un gen que funciona en un tejido vegetal regenerable para producir un compuesto que confiere la resistencia del tejido vegetal a un compuesto de otra manera tóxico. Los genes de interés para uso como un marcador de selección, el marcador que se puede explorar, o que se pueden evaluar incluirán pero no se limitan a GUS, proteina fluorescente verde (GFP), luciferasa (LUX), genes para tolerancia a antibiótico o genes para tolerancia a herbicida. Los ejemplos de genes para resistencia a antibiótico incluyen las penicilinas, canamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprim); cloramfenicol; canamicina y tetraciclina. Los genes marcadores de selección particularmente preferidos para uso en la presente invención incluirán genes que confieren resistencia a compuestos tales como antibióticos semejantes a canamicina (nptll), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4) (Dekeyser ef al., Plant Physiol., 90: 217-223, 1989), y herbicidas semejantes a glifosato (Della-Cioppa ef al., Bio Technology, 5: 579-584, 1987). También se pueden implementar otros dispositivos para selección incluyendo pero no limitados a tolerancia a la fosfinotricina, bialaphos, y mecanismos de selección positiva (Joersbo ef al., Mol. Breed., 4: 111-117, 1998) y son consideradas dentro del alcance de la presente invención. La regeneración, desarrollo, y cultivo de plantas a partir de diversos explantes transformados están bien documentados en la técnica. Estos procesos de regeneración y de crecimiento típicamente incluyen los pasos de selección de células transformadas y cultivo de aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales del desarrollo embrionario hasta la etapa de plántula con raíces. Los embriones y las semillas transgénicas se regeneran de manera similar. Los retoños con raíces transgénicos resultantes se plantan posteriormente en un medio de crecimiento apropiado para planta tal como el suelo. Las células que sobreviven a la exposición al agente de selección, o las células que han sido evaluadas de manera positiva en un ensayo de exploración, se pueden cultivar en medio que mantiene la regeneración de las plantas. En una modalidad, los medios MS y N6 se pueden modificar al incluir sustancias adicionales tales como reguladores de crecimiento. Un regulador de crecimiento preferido para dichos propósitos es dicamba o 2,4-D. Sin embargo, se pueden emplear otros reguladores de crecimiento, incluyendo NAA, NAA + 2,4-D o tal vez incluso picloram. Se ha encontrado que la mejoría del medio en esta forma y en formas similares facilita el crecimiento de las células en etapas de desarrollo especificas. El tejido se puede mantener en un medio básico con reguladores de crecimiento hasta que está disponible suficiente tejido para empezar con los esfuerzos de regeneración vegetal, o después de rondas repetidas de selección manual, hasta que la morfología del tejido es adecuada para la regeneración, al menos 2 semanas, luego se transfiere hacia un medio que conduce a la maduración de los embrioides. Los cultivos se transfirieron cada 2 semanas en este medio. El desarrollo del retoño señalizará el tiempo para transferir el medio que carece de reguladores de crecimiento. Las células transformadas, identificadas por la selección o exploración y cultivadas en un medio apropiado que mantiene la regeneración, se dejarán madurar hacia plantas. Las plántulas en desarrollo se transfieren a una mezcla para crecimiento de planta sin suelo, y se endurecen, por ejemplo, en una cámara ambientalmente controlada aproximadamente a 85% de humedad relativa, 600 ppm de C02, y 25-250 microeinsteins m"2 s"1 de luz, antes de la transferencia a un invernadero o a una cámara de crecimiento para maduración. Preferiblemente las plantas se maduran ya sea en una cámara de crecimiento o en un invernadero. Las plantas se regeneran de aproxim damente 6 semanas a 10 meses después de que se ha identificado un transformante, dependiendo del tejido inicial. Durante la regeneración, las células se crecen en medio sólido en recipientes para cultivo de tejidos. Las modalidades ilustrativas de dichos recipientes son cajas de Petri y los estudios de planta. Las plantas regeneradas preferiblemente se crecen de aproximadamente 19 a 28°C. Después de que las plantas regeneradas han alcanzado la etapa de retoño y desarrollo de la raiz, éstas pueden transferir a un invernadero para crecimiento adicional y evaluación. Nótese, sin embargo, que las semillas de las plantas transformadas ocasionalmente pueden requerir rescate del embrión debido al cese del desarrollo de la semilla y a la senescencia prematura de las plantas. Para rescatar a los embriones en desarrollo, éstos se pueden escindir a partir de las semillas desinfectadas en la superficie 10-20 días después de la polinización y se cultivaron. Una modalidad del medio utilizado para el cultivo en esta etapa comprende sales MS, 2% de sacarosa, y 5.5 g/l de agarose. En el rescate del embrión, los embriones grandes (definido como mayor de 3 mm en longitud) se germinan directamente en un medio apropiado. Los embriones más pequeños que esto pueden ser cultivados por 1 semana en medio que contiene los ingredientes anteriormente mencionados junto con 10"5M ácido abscísico y luego se transfieren a un medio libre de regulador de crecimiento para germinación. La presente invención se puede utilizar con cualquier célula o tejido transformable. Por transformable como se utiliza en la presente invención se entiende una célula o tejido que es capaz de llevar a cabo una propagación adicional para dar lugar a una planta. Aquellos expertos en la técnica reconocen que numerosas células vegetales o tejidos son transformables en los cuales después de la inserción del ADN exógeno y de las condiciones apropiadas de cultivo las células vegetales o tejidos se pueden formar hacia una planta diferenciada. El tejido adecuado para estos propósitos pueden incluir pero no se limita a embriones inmaduros, tejido escutelar, cultivos de célula para suspensión, inflorescencia inmadura, meristemo del retoño, explantes nodales, tejido del callo, tejido del hipocotiledón, cotiledones, raíces, y hojas. Se puede utilizar cualquier medio para cultivo vegetal adecuado. Los ejemplos de medios adecuados incluirán pero no se limitan a medio basado en MS (Murashige y Skoog, Physiol. Plant, 15: 473-497, 1962) o medio basado en N6 (Chu et al., Scientia Sinica 18: 659, 1975) suplementado con reguladores adicionales para crecimiento vegetal incluyendo pero no limitado a auxinas tales como picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolinico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y dicamba (ácido 3,6-dicloroanisico); citoquininas tales como BAP (6-bencilaminopurina) y quinetina; ABA; y giberelínas. Otros aditivos para el medio pueden incluir pero no se limitan a aminoácidos, macroelementos, hierro, microelementos, vitaminas y orgánicos, carbohidratos, componentes no definidos del medio tales como hidrolisados de caseína, con o sin cualquier agente gelificante apropiado tal como una forma de agar, tal como una agarosa con bajo punto de fusión o Geirite si se desea. Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con la variedad de medios de cultivo para tejidos, los cuales cuando se suplementan de manera apropiada, mantienen el crecimiento y el desarrollo del tejido vegetal y son adecuados para la transformación vegetal y regeneración. Estos medios para cultivo de tejidos se pueden obtener ya sea como una preparación comercial, o se puede preparar y modificar de manera habitual. Los ejemplos de dichos medios incluirán pero no se limitarán a Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, Physiol. Plant, 15: 473-497, 1962), N6 (Chu ef al., Scientia Sinica 18: 659, 1975), Linsmaier y Skoog (Linsmaier y Skoog, Physio. Plant., 18: 100, 1965), Uchimiya y Murashige (Uchimiya y Murashige, Plant Physiol. 15: 473, 1962), medio B5 de Gamborg (Gamborg et al., Exp. Cell Res., 50: 151 , 1968), medio D (Duncan et al., Planta, 165: 322-332, 1985), medio para planta leñosa de McCown (McCown y Lloyd, HortScience 16: 453, 1981), Niísch y Nitsch (Nitsch y Nitsch, Science 163: 85-87, 1969), y Schenk y Hildebrandt (Schenk y Hildebrandt, Can. J. Bot. 50: 199-204, 1972) o derivaciones de estos medios suplementados de manera adecuada. Aquellos expertos en la técnica están conscientes de que los medios y suplementos de medios tales como los nutrientes y reguladores del crecimiento para uso en la transformación y regeneración y en otras condiciones de cultivo lales como intensidad de luz durante la incubación, pH, y temperaturas de incubación que pueden ser optimizadas para la variedad particular de interés.

Las plantas transqénicas que expresan una proteína de flavohemoqlobina heteróloqa tienen rasgo(s) aqronómico(s) meiorado(s) En una modalidad de la presente invención, se han generado las plantas transgénicas que expresan HMP de E. coli y se ha mostrado que contiene un mayor nivel de contenido de clorofila, bajo una condición de crecimiento con nitrógeno limitado, en comparación con las plantas control. El mayor nivel de contenido de clorofila es una característica de un crecimiento más robusto. En otro aspecto, de conformidad con la presente invención, las plantas transgénicas que expresan HMP de E. coli también exhiben un crecimiento más robusto bajo una condición de crecimiento con suficiente nitrógeno, mostrada como una masa incrementada de retoño fresco. En incluso otro aspecto, de conformidad con la presente ¡nvención, la expresión de HMP de E. coli en la plantas de maiz reduce significativamente el nivel de NO en tejidos de hoja. En incluso otro aspecto, de conformidad con la presente ¡nvención, también se ha mostrado que las plantas transgénicas de maíz que expresan HMP de E. coli tienen un rendimiento incrementado de semilla bajo condiciones de campo. En otra modalidad de la présenle invención, también se han generado las plantas transgénicas de maíz que expresan YHB1 de levadura y se ha mostrado que tienen un rendimiento incrementado. Como se ilustra en la figura 1 , de conformidad con la presente invención, los inventores contemplan que, bajo la condición de crecimiento con nitrógeno limitado, la presencia de flavohemoglobina puede mejorar el crecimiento vegetal al incrementar el nitrato disponible, mientras que, bajo la condición de crecimiento con suficiente nitrógeno o la condición de crecimiento con nitrógeno limitado, la presencia de flavohemoglobina puede mejorar el crecimiento vegetal mediante la reducción del efecto tóxico de NO.

También de conformidad con la presente invención, las plantas transgénicas que expresan una flavohemoglobina heteróloga tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consisíe de SEQ ID NO: 130 hasta SEQ ID NO: 256, las cuales se identifican como los homólogos de la proteína de HMP de E. coli por la presente invención. Las plantas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Acacia, alfalfa, eneldo, manzana, chabacano, alcachofa, arúgula, espárrago, aguacate, banana, cebada, frijoles, remolacha, zarzamora, arándano, brócoli, calabacita de Bruselas, calabaza, cañóla, cantalupo, zanahoria, mandioca, coliflor, apio, cereza, cilantro, cítricos, variedad de mandarina (clementine), café, maíz, algodón, pepino, abeto Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucaliptos, heléchos, abetos, árboles de la floresta, calabacín, uva, toronja, ligamaza, jicama, kíwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino de incienso, mango, melón, hongo, nuez, avena, okra, cebolla, naranja,, una planta ornamental, papaya, perejil, chícharo, durazno, cacahuate, pera, pimiento, pérsimo, pino, pina, plátano, ciruela, granada, álamo, patata, calabaza, membrillo, pino radiado, achicoria, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sureste, frijol de soya, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, azúcar de caña, girasol, camote, liquidámbar, tangerina, té, tabaco, tomate, césped, una vid, sandía, trigo, batata, y zapallito italiano. Las plantas de cosecha se definen como plantas, que se cultivan para producir uno o más producios comerciales. Los ejemplos de dichas cosechas o plantas de cosecha incluyen pero no se limitan a frijol de soya, cañóla, colza, algodón (semilla de algodón), girasol, y granos tales como maíz, trigo, arroz, y centeno. La colza, la semilla de colza o cañóla se utiliza de manera como sinónimo en la presente descripción. Las plantas transgénicas de la presente invención se pueden cultivar de manera productiva bajo condiciones de crecimiento con nitrógeno limitado (por ejemplo, suelos con poca cantidad de nitrógeno y con bajo consumo del fertilizante de nitrógeno) que podrían ocasionar que cese el crecimiento de las plantas de tipo silvestre, hasta que se disminuya de tal manera que hace a las plantas de tipo silvestre prácticamenle inútiles, u ocasiona una reducción del rendimiento significativa de las plantas de tipo silvestre. Las plantas transgénicas también se pueden utilizar de manera ventajosa para alcanzar una madurez más temprana, crecimiento más rápido, y/o mayor rendimiento de cosecha y/o para producir alimentos y forrajes animales más nuíritivos cuando se cultivan utilizando las condiciones de crecimiento con suficiente nitrógeno (por ejemplo, suelos o medios que coníiene o que reciben cantidades suficientes de nutrieníes de nitrógeno para mantener el crecimiento de la planta sana). En otro aspecto, las plantas transgénicas con una eficiencia incrementada en el uso del nitrógeno provistas por la presente invención tendrán beneficios ambientales en general, tales como la reducción de la cantidad de nitrato leashed a partir del suelo y dentro del agua de pozo. Los siguientes ejemplos se proveen para elucidar de mejor manera la práctica de la presente invención y no deben interpretarse en ninguna forma para limitar el alcance de la presente invención. Aquellos expertos en la lécnica reconocerán que diversas modificaciones, adiciones, sustituciones, íruncaciones, etc., se pueden elaborar a los métodos y genes descritos en la presente ¡nvención aunque sin apartarse del espíritu y alcance de la presente ¡nvención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción para la transformación vegetal A. Construcciones para transformación del maiz Los vectores de destino GATEWAY™ (disponibles a partir de Invitrogen Life Technologies, Carisbad, CA) se pueden construir para cada molécula de ADN descrita en la presente invención para la transformación del maíz. Lps elementos de cada vector de destino se resumen en en el cuadro 2 a continuación e incluyen una región para la transcripción del marcador de selección y una región para transcripción de la inserción del ADN. La región para transcripción del marcador de selección comprende un promotor del Virus del Mosaico de la Coliflor 35S operativamente asociado a un gen que codifica neomicina fosfotransferasa II (npfll) seguido tanto por la región hacía 3' de gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (nos) como por la región hacia 3' de gen inhibidor II de la proteinasa la pataía (pin\\). La región de íranscripción de la inserción de ADN comprende un promotor de actina 1 del arroz, un potenciador de la actina 1 del arroz exón 1 intrón 1 , un sitio de inserción flanqueado por att y la región hacia 3' de gen pin\\ de la pataía. Seguido por procedimientos estándares provistos por Invitrogen la región de inserción flanqueada por att se reemplaza mediante la recombinación con un ADN para mejoría del rasgo, en una orientación sentido para la expresión de una proteína flavohemoglobina. Aunque el vector con el gen de flavohemoglobina descrito en la presente invención insertado en la región de inserción flanqueada por att es útil para la transformación vegetal mediante la administración directa de ADN, dicho bombardeo del microproyectil, es preferible bombardear el tejido vegetal blanco con las unidades de transcripción en tándem que han sido cortadas a partir del vector.

CUADRO 2 Elementos de un vector ejemplar para transformaciómi del maíz Las consírucciones ejemplares para dicha íransformación del maíz elaboradas por la preseníe invención incluyen pMON69471 que comprende SEQ NO 3 como se muestra en la figura 2, pMON67827 que comprende SEQ NO 4 como se muestra en la figura 3 Para la transformación de las plantas mediada por Agrobacterium el vector también comprende los límites del ADN-T a partir de Agrobacterium que flanquean las unidades de transcripción. Los elementos de un vector de expresión ejemplar, pMON95605, se ilustran en la figura 4 y en el cuadro 3. Los elementos de otro vector de expresión ejemplar, pMON99286, se ilustran en la figura 5 y en el cuadro 4. Incluso los elementos de otro vector de expresión ejemplar, pMON99261 , se ilustran en la figura 6 y en el cuadro 5. Incluso los elemenlos de otro vector de expresión ejemplar, pMON99276, se ilustran en la figura 7 y en el cuadro 6. Incluso los elementos de otro vector de expresión ejemplar, pMON94446, se ilustran en la figura 8 y en el cuadro 7. Los elementos de otro vector de expresión ejemplar, pMON 102760, se ilustran en la figura 9 y en el cuadro 8. Estas construcciones para transformación del maíz se ensamblaron utilizando la tecnología conocida en la técnica.

CUADRO 3 Comentario de los nombres del elemento utilizado en el mapa plasro de PMON96505 CUADRO 4 Annotation of element ñames used en el mapa plasmídico de pMON99286 CUADRO 5 Comentario de los nombres del elemento utilizado en el mapa plasmídico de p ON99261 sv promotor de aadA para la expresión del gen para resistencia a P-Ec.aadA-SPC/STR 8518 - 8559 espectinomicina y estreptomicina Región codificante para Tn7 adenililtransferasa (AAD(3")) que confiere CR-Ec.aadA-SPC/STR 8560 - 9348 resistencia a espectinomicina y estreptomicina Terminador de aadA para la expresión del gen para resistencia a T-Ec.aadA-SPC/STR 9349 - 9406 espectinomicina y estreptomicina B-AGRtu.borde derecho 9543 - 9899 Secuencia del borde derecho para el ADN-T de transferencia Potenciador derivado a partir de la región promotora de la fructosa- E-Zm.FDA 9922 - 1 1036 bisfosfato aldolasa del maíz P-Zm.PPD -l : l : 10 1 1078 - 1 1863 Promotor a partir del gen de la piruvato ortofosfato diquinase del maíz Región no traducida hacia 5' a partir del gen de la piruvato ortofosfato L-Zm.PPDK 1 1864 - 12028 diquinasa del maíz Intrón HSP70 de Zea mays con secuencia del exón flanqueante que I-Zm.DnaK 12042 - 12845 mejora la expresión en plantas CR- Ec.PHE0006515_Codón-optimizado E.coli HMP 12882 - 14072 SEQ ID NO: 1 CUADRO 6 Comentario de los nombre de elemento utilizado en el mapa plasmídico de pMON99276 oo CUADRO 7 Comentario de los nombres del elemento utilizado en el mapa plasmídico de pMON94446 o --J o CUADRO 8 Comentario de los nombres del elemento utilizado en el mapa plasmídico de pMON102760 - c.aa - - espec nomcna y esrepomcna Las construcciones para transformación mediada por Agrobacterium se prepararon con cada uno de los genes de flavohemoglobinas con el ADN solamente en la orientación sentido a la expresión de la proteina cognada flavohemoglobina. Cada construcción se transformó en callos del maiz el cual se propagó en una planta que se creció para producir la semilla transgénica. Las plantas de la progenie se auto-polinizaron para producir la semilla que se seleccionó para la semilla homocigota. La semilla homocigota se utilizó para la producción de las plantas endogámicas, para la introducción del rasgo dentro de las lineas élite, y para la cruza para elaborar la semilla hibrida. El maiz transgénico incluyendo endogámicos e híbridos también se producen con ADN a partir de cada uno de los homólogos identificados.

B. Construcción para transformación del frijol de soya Las construcciones para uso en la transformación del frijol de soya se pueden preparar mediante clonación basada en enzima de restricción en un Vector de expresión común. Los elementos de un vector de expresión común ejemplar se muestran en el cuadro 9 a continuación e incluyen un cassette de expresión del marcador de selección y un cassette de expresión del gen de interés. El cassette de expresión del marcador de selección comprende el promotor del gen act 7 de Arabidopsis (AtAct7) con el intrón y UTR hacia 5', el péptido de tránsito de EPSPS de Arabidopsis, la región codificante sintética de CP4 con un uso del codón preferido de dicotiledóneas y una UTR hacia 3' del gen de la nopalina sintasa. El cassette de expresión del gen de interés comprende un promotor del Virus del Mosaico de la Coliflor 35S operativamente asociado a un gen para mejoría del rasgo en una orientación sentido para la expresión de una flavohemoglogina. Los vectores similar a aquellos antepormente descritos se pueden elaborar para uso en los sistemas de transformación del frijol de soya mediados por Agrobacterium, con cada uno de los genes de flavohemoglobina seleccionados a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 hasta SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 7 hasta SEQ ID NO: 129, y SEQ ID NO: 260 con el ADN en orientación sentido para la expresión de la proteína cognada. Se produjeron las plantas transgénicas de frijol de soya que expresan una proteina de flavohemoglobina heteróloga. Las plantas transgénicas de frijol de soya también se produjeron con ADN a paríir de cada uno de los homólogos identificados y proveyeron semillas para plantas con rasgos agronómicos mejorados.

CUADRO 9 Elementos de una construcción ejemplar para transformación del frijol de soya Las construcciones ejemplares para transformación de dicho frijol de soya elaboradas por la presente invención incluyen pMON95622 que comprende SEQ NO: 3 como se muestra en la figura 10.

EJEMPLO 2 Caracterización de la expresión del transgéBD Las construcciones, pMON69471 se construyó con una secuencia derivada a partir de la región hacia 3' del gen pinll de patata, el cual se podria utilizar para ensayar el nivel relativo de la expresión del transgén. El ARN total se extrajo a partir de los lisados de tejido mediante métodos regulares conocidos en la técnica y el ARNm extraído se analizó mediante Taqman® con sondas especificas al terminador del inhibidor de la proteasa de patata (PINII). Los valores representan la media a partir de cuatro plantas individuales. Los iniciadores para la amplificación del terminador PINII son los siguientes: Pinll F-4 (iniciador hacia adelanle) GATGCACACATAGTGACATGCTAATCAC (SEQ ID NO: 267), Sonda Pinll 4 ATTACACATAACACACAACTTTGATGCCCACAT (SEQ ID NO: 268), Pinll R-4 (¡niciador reverso) GGATGATCTCTTTCTCTTATTCAGATAATTAG (SEQ ID NO: 269). Dentro de cada reacción de PCR, un ARN 18S estándar para la amplificación de ARNr se utilizó como un control interno. Los iniciadores para la amplificación de ARNr 18S son los siguientes: el iniciador hacia adelante CGTCCCTGCCCTTTGTACAC (SEQ ID NO: 270), el iniciador reverso CGAACACTTCACCGGATCATT (SEQ ID NO: 271) y el iniciador interno vic-CCGCCCGTCGCTCCTACCGAT-iamra (SEQ ID NO: 272). Las condiciones de RT-PCR fueron 48°C por 30 minutos, 95°C por 10 minutos, 95°C por 15 segundos, y 56°C por 1 minuto por 40 ciclos.

CUADRO 10 Niveles relativos de expresión del transgén en plantas trapsgénicgis qioe comprenden SEQ NO: 3 EJEMPLO 3 Caracterización de los fenotipos fisiológicos de las plantas transgéonócas que expresan una proteína de flavohemoglobina heteróloga La eficiencia fisiológica de las plañías íransgénicas de maíz (evaluados como híbridos) se pueden evaluar para los rasgos de eficiencia en el uso del nilrógeno (NUE) en selección de nitrógeno (N) de alta resolución. Los datos recolectados se compararon con las mediciones a partir de los coníroles de íipo silvestre utilizando un modelo estadístico para determinar si los cambios se deben al transgén. Los dalos crudos se analizaron mediante el software SAS. Los resultados mosírados en la presente ¡nvención son la comparación de las plantas transgénicas en relación con los controles de tipo silvestre. (1 ) Preparación de medio para la siembra con un protocolo NUE Materiales para siembra utilizados: Metro Mix 200 (vendedor: Hummert) número de catálogo 10-0325, Scotts Micro Max Nutrients (vendedor: Hummert) número de catálogo 07-6330, macetas OS 4 0.8 cm x 3 2.2 cm (vendedor: Hummert) número de catálogo 16-1415, bandejas OS (vendedor: Hummert) número de catálogo 16-1515, solución de macronutrientes de Hoagland, estacas de plástico de 12.7 cm (vendedor: Hummerí) amarillas número de catálogo 49-1569, blancas número de catálogo 49-1505, marcas con números indicando el material contenido en las macetas. Macetas Fill 500 para limitar con Metro Mix 200 hasta un peso de -140 g/maceta. Las macetas se llenaron de manera uniforme mediante el uso de una báscula. Se añadieron 0.4 g de nutrienles Micro Max a cada maceía. Los ingredíeníes se agitaron con una espátula hasta una profundidad de 7.5 cm mientras se prevenía la pérdida de material. (2) Siembra con una panlalla NUE en el invernadero a. Germinación de la semilla Adición ligera de agua a cada mácela dos veces utilizando agua purificada por osmosis reversa. La primera adición de agua se debe presentar justo después de la siembra, y la segunda adición de agua se debe presentar después de que la semilla ha sido sembrada en la maceta. Diez semillas de cada registro (1 semilla por maceta) se sembraron para seleccionar ocho plántulas uniformemente sanas. Adicionalmente se plantaron los controles de tipo silvestre para uso como limites de los surcos. Alternalivamente, 15 semillas de cada regislro (1 semilla por maceta) se sembraron para seleccionar 12 plántulas uniformemente sanas (esle número más grande de plántulas se utiliza para la segunda siembra, o confirmación). Las macetas se colocan en cada uno de los 12 anaqueles en la cámara para crecimiento Conviron por siete días. Esto se realiza para permitir una germinación más uniforme y un crecimiento más temprano de la plántula. Los siguientes ajustes de la cámara de crecimiento son 25°C/día y 22°C/noche, 14 horas de luz y diez horas de oscuridad, humedad -80%, e intensidad de la luz -350 µmol/m2/s (al nivel de la maceta). La adición de agua se realiza via esfera capilar similar a los bancos de invernadero con duración de diez minulos íres veces ál día. b. Transferencia de la pláníula Después de siete días, se eligen las plántulas con mejor altura o las 12 plántulas para el primer proceso o para el paso de confirmación, respectivamente y se transfieren a bancos de invernadero. Las macetas se separan 20 cm (de centro a centro) y se colocan sobre los bancos utilizando los patrones de separación impresos en la estera capilar. La estera Vaílex matting crea una malla con 384 posiciones, lodas con un iniervalo al azar, en combinaciones de hileras. Las macetas adicionales de los controles se colocan a lo largo de la parte exterior del bloque experimental para reducir los efectos del borde. Las plantas se dejan crecer por 28 días bajo una concentración disminuida de N o por 23 dias bajo una alia conceníración de N. Los macronuíríentes se dispensan en la forma de una solución de macronutrieníes (véase la composición a coníinuación) que contiene cantidades precisas de N añadido (2 mM de NH4N03 para limitar la selección del N y 20 mM de NH4N03 para un proceso con alta selección de N). A cada maceta se le dispensan manualmente 100 ml de solución de nuírieníe íres veces a la semana en días aliemos iniciando los días ocho y diez después de la siembra para procesos con alia concentración de N y baja concentración de N, respecíivameníe. En el día de la aplicación de nuírieníe, no se realizaron las adiciones de agua por 20 minutos a las 05:00 y 13:00 horas. La estera vaítex se debe cambiar cada tercer proceso para evilar la acumulación de N y la acumulación de malerial en la raiz.

CUADRO 11 Este Cuadro muestra la cantidad de nutrientes en la solución ñuto® míe para cualquier pantalla con baja concentración de nitrógeno o concentración de nitrógeno Noia: Ajuste el pH a 5.6 con HCl o KOH c. Mediciones de la cosecha y recolección de datos Después de 28 días del crecimiento de la planta para procesos con baja concentración de N y 23 días del crecimiento de la plañía para procesos con alta concentración de N, las siguientes mediciones se tomaron (codificación fenotípica en paréntesis): masa fresca total del retoño (g) (SFM) medido para el balance electrónico de Sartorius, clorofila en hoja V6 medida por el Minolía SPAD melro (unidades relativas) (LC), área de la hoja V6 (cm2) (LA) medida por un medidor Li-Cor del área de la hoja, masa fresca de la hoja V6 (g) (LFM) medido por una báscula electrónica de Saríorius, y masa seca de la roja V6 (g) (LDM) medida por una báscula electrónica de Saríorius. Los datos crudos se analizaron mediante el sofíware SAS. Los resullados mostrados son la comparación de las plantas transgénicas en relación con los controles de íipo silvestre. Para tomar una lectura de la roja, las muestras se escindieron a partir de la hoja V6. Puesto que las lecturas del medidor de clorofila de las hojas del maíz se afectan por la parte de la hoja y la posición de la hoja en la plañía que es muestreada, las lectoras del medidor SPAD se realizaron en seis hojas de las plantas. Se tomaron tres mediciones por hoja, de las cuales la primera lectura se tomó a partir de un punto a la mitad de la distancia entre la punta de la hoja y el collar y a la mitad del camino a partir del margen de la hoja la costilla media mientras que se tomaron dos mediciones hacia la punta de la hoja. Las mediciones se resíringieron en el área a paríir de 1/2 a 3/4 de la longilud total de la roja (a partir de la base) con aproximadameníe un espacio igual enlre ésías. Se lomó el promedio de íres mediciones a paríir de la máquina SPAD. La caraclerización de los fenotipos fisiológicos de conformidad con el procedimiento anteriormente descrito se llevó a cabo para las líneas íransgénícas de maíz que comprenden SEQ NO: 3 incluyendo ZM_M21516, ZM_M21505, ZM_M20388 y ZM_M21509.

CUADRO 12 Nivel de clorofila incrementado en la planta transgénicas del maíz que comprende el gen de HMP de E. coli crecidas bajo la condición de nitrógeno limitado (a): altamente significativo, p<0.01 en la sene de datos actual (b): significativo, 0.01 <p<0.05 en la sene de datos actual (c): significativo, 0.05<p<0.1 en la sene de datos actual (n): no significativo, p>0.1 en la sene de datos actual oo ND: no determinado en la serie de datos actual CUADRO 13 Masa fresca incrementada del retoño en el transgénico que comprende el gen de HMP de E. coli bajo la condición de nitrógeno suficiente (a): altameníe significativo, p<0.01 en la serie de datos actual (b): significativo, 0 01 <p<0.05 en la serie de datos actual (c): significativo, 0.05<p<0.1 en la serie de datos actual (n): no significativo, p>0.01 en la serie de datos actual oo -fc. ND: no determinado en la serie de datos actual EJEMPLO 4 Caracterización del rendimiento de la planta De interés particular es la identificación de las plantas transgénicas que tienen rendimiento mejorado como el resultado del potencial mejorado de "sink" de la semilla y/o fuerza. El método de sink incluye estrategias para mejorar el potencial de "sink" (el número y tamaño de las células del endospermo de los granos) y para mejorar una fuerza de sink (la velocidad de biosintesís del almidón). El potencial de Sink se puede establecer muy temprano duranle el desarrollo del grano, como el número de células del endospermo y el tamaño de la semilla se determinan dentro de los primeros pocos días después de la polinización. El flujo de carbono hacia la mazorca durante el desarrollo se puede limitar por el tamaño del sink del grano. Las mejorías en lafuerza del sink se ha sugerido que mejoran el rendimiento al promover la redistribución de la fotoasimilación a paríir del tallo con respecto al tejido del grano. Gran parte del incremento en el rendimiento del maíz de las pasadas décadas ha resultado a partir de un incremento en la densidad de la siembra. Durante ese periodo, el rendimiento del maiz se ha incrementado una relación de 73.98 litros/4, 046 m /año, pero la densidad de la siembra se ha incrementado una relación de 250 plantas/4, 046 m2/año. Una caracíerislica del híbrido moderno de maiz es la capacidad de esías variedades a ser sembradas a una alia densidad. Muchos estudios han mostrado que una densidad de siembra mayor a la actual debe resultar en una mayor producción de biomasa, pero el germplasma actual no tiene un buen desempeño a estas altas densidades. Un método para incrementar el rendimiento es incrementar el índice de la cosecha (Hl), la producción de la biomasa que se localizan en el grano en comparación con la biomasa total, con alta densidad de siembra. La capacidad de una planta para convertir el C02 y la luz hacia el carbono que se puede exportar a las semillas en desarrollo se conoce como un potencial de la fuente. Varias líneas de incidencia genética, fisiológica y bioquímica sugieren que el potencial de la fuente es un contribuyente directo al rendimiento. Los métodos para incrementar el potencial de la fuente, y por lo tanto el rendimiento para mejorar la asimilación neta del carbono incluye el incremento de la eficiencia foíosintéíica intrínseca, alteración del paríicionamíento y exportación de los elemenlos asimilados, y modificación de la arquiteclura de la planta. Se han identificado los genes que pueden cambiar estas propiedades de manera benéfica y se han inlroducido en las plañías. El diseño de la prueba de rendimiento por la presente invención es un proceso de exploración del rendimiento del híbrido de alta resolución. Este se basa en las pruebas complementarias por dos años de la multi-ubicación. Ambos ensayos del año 1 y del año 2 son de multi ubicación, experimentos particulares por localización dispuestos utilizando un diseño experimental basado espacialmente. Todos los ensayos en diferentes ubicaciones se crecieron bajo las prácticas de manejo de producción óplima, y máximo control de la plaga. (1) ensayo del año 1 El ensayo del año 1 es el primer nivel de selección para el rendimiento cuando se esperan muchos eventos íransgénicos a ser evaluados utilizando el método anteriormente mencionado con un poder moderado (85%) para detecíar 7.5% diferencia en el rendimiento. En cada localización de campo por hasta 16 ubicaciones geográficas diferentes, los eventos que representan las construcciones de ADN recombinante seleccionadas a partir de la presente invención, las múltiples plantas control positivas y negativas, y las macetas con el agenle polinizante se siembran. El tamaño del lote es dos veces los surcos del lote, 60 metros de largo x 1.5 metros de ancho con 30 en distancia entre los surcos y 1.5 metros entre los intervalos. Los eventos agrupados dentro de las construcciones se colocan al azar en el campo. Todos los otros registros también se colocaron al azar en el campo. Un lote polinizante (LH244XLH59) se siembra para cada dos lotes de eventos íransgénicos estériles del macho. La densidad de la siembra es de aproximadamente 28000-33000 plantas/4, 046 m2. El ensayo está abierto a la polinización. (2) ensayo del año 2 El ensayo del año 2 es un ensayo de rendimiento de confirmación con eventos avanzados basándose en el desempeño de rendimiento del híbrido del año 1. Los ensayos del año 2 se diseñaron para proveer >80% del poder para detectar 5-10% de de la diferencia de rendimiento. En cada una de hasta 16 ubicaciones geográficas diferentes (o al menos 20 ambientes en crecimiento), lotes que comprenden eventos que representan las construcciones de ADN recombinante seleccionadas a partir de la presente invención, se sembraron múltiples lotes plantas positivas y negativas control, y polinizante. El tamaño del lote es de dos lotes de surcos, 60 metros de largo x 1.5 m de ancho con 75 cm de distancia entre los surcos y 1 .5 metros entre los intervalos. Los eventos que representan la misma conslrucción se agrupan dentro del bloque de la construcción y esa sección se coloca al azar en el campus. Todos los otros registros también se colocan al azar en el campo. Un lote polinizante (LH244XLH59) se siembra para cada dos lotes de eventos transgénicos del macho estéril. La densidad de la siembra es de aproximadamente 28000 a 33000 plantas/4, 046 m2. El ensayo está abierto a la polinización. (3) Méíodo esíadislico Este método comprende tres componentes principales: el modelado de la autocorrrelación especial del campo de prueba separadamente de cada ubicación, el ajuste de los fenotipos de los registros del transgén para la dependencia espacial para cada ubicación, y la realización de un análisis de ubicación entre y lomando las decisiones de avance ,del gen. Además, el método también tiene la capacidad de estimar los efectos de diferentes fuentes de semilla y el ajuste consiguiente. Esto se realiza separadamente para cada ubicación cuando los fenotipos de registros del transgén se ajustan para la dependencia espacial. a. Modelamiento de la autocorrelación espacial b.

Estimación de los parámetros de covarianza La estimación de los parámetros de covarianza del semívariograma es el primer paso. Un modelo de covarianza esférico se asume para modelar la autocorrelación espacial. Debido al tamaño y a la naturaleza del ensayo, es altamente probable que la autocorrelación espacial pueda cambiar. Por lo tanto, la anisotropía también se asume junto con la estructura de la covarianza esférica. La siguiente serie de ecuaciones describe la forma estadísííca del modelo de covarianza esférica anisoírópica.

C(h-ß) = vJ(h = 0) + < 1) en donde /(») es el indicador de la función, i X + = [cos(pp l\ S0)(x] - x2) - s' (pp /] S0)(y] - y2)]la):. = [sin( p /180)( , - x2) + cos(pp I] i0)(y] - y2)]l?v en donde Si = (x-? , yi) son las coordenadas espaciales para una localización y s2 = (x2, y2) son las coordenadas espaciales para la segunda localización. Existen 5 parámetros de covarianza, ? = (v,s , p, ?n,?j) , en donde v es el efecto de nugget, cf es el la estructura de soporte parcial, p es una roíación en grados en el sentido del reloj a partir del norte, ?n es un parámetro en escala para el eje menor y ?¡ es un parámetro en escala para el eje mayor de una elipse anisotrópica de la covarianza igual. Los cinco parámetros de covarianza que definen la tendencia espacial serán eslimados medíanle el uso de los datos a parlir de los lotes fuertemente replicados por el polinizante vía el método de probabilidad máxima restringida. En un ensayo de campo de múltiples ubicaciones, la tendencia espacial está moderadamente separada de cada ubicación. b. Construcción de la matriz que varianza-covarianza Después de la obtención de los parámetros de varianza del modelo, la estructura de varianza-covarianza se generará a partir de los datos establecidos a ser analizados. Esta estructura de varianza-covarianza contendrá la información espacial requerida para ajustar los rendimientos del transgén (no replicado) para la dependencia espacial.

Ajuste de los datos del íransgén para la dependencia espacial El ajuste de los datos del transgén para la dependencia espacial es el siguiente paso. En este caso, un modelo anidado que representa mejor el tratamiento y el diseño experimental del estudio se utilizará junto con la estructura de varianza-covarianza para ajustar los rendimientos de registros del transgén para la dependencia espacial. Durante este procedimiento los efectos del vivero o del lote de semilla también se pueden modelar y esíimar para ajusfar los rendimientos para cualquier rendimiento ocasionado por las diferencias del lote de la semilla.

Análisis de ubicación combinada Los datos espacialmente ajustados a paríir de ubicaciones difereníes se generaron ¡nicialmente. Luego lodos los daíos ajusíados serán combinados y analizados asumiendo ubicaciones como replicaciones utilizando la tercera fase de este método. En este análisis, las varianzas de intra e inter-ubicación serán combinadas para estimar el error estándar del transgén y cualesquiera datos del tratamiento control asociado. El análisis de rendimiento de conformidad con el procedimiento anteriormente descrito se llevó a cabo para las lineas transgénicas del maiz que comprenden SEQ NO: 3 incluyendo ZM_M21516, ZM_M21505, ZM_M20388 y ZM_M21509, y las líneas transgénícas del maíz que comprenden SEQ NO: 4 incluyendo ZM M14965, ZM_M16110, ZM_M16104 y ZM M14973.

CUADRO 14 Resultados de rendimiento del año 1 para las plantas transgénicas maiz que comprenden el gen HMP de E.

CUADRO 15 Resultados de rendimiento del año 2 para las plantas transgénieag maiz que comprenden el gen HMP de E.

En 2004, el rendimiento control medio fue del 8032.44 Medidas de áridos (35 23 litros)/4,046 m2contra 179.9 bushels/acre en 2005, este último siendo un año de sequía La toma reducida de agua durante las condiciones de sequía también restringe la toma de nutriente a partir de la solución del suelo por lo tanto confundiendo la respuesta de rendimiento Por lo tanto, las diferencias en el rendimiento potencial y las condiciones de crecimiento a partir de 2004 hasta 2005 no permiten una comparación válida de la respuesta de rendimiento, pero proveen una clave del efecto del gen con la interacción ambiental.

CUADRO 16 Resultados del rendimiento del año 1 para las plantas transgénieas de maiz que comprenden el gen YHB1 de levadura CUADRO 17 Resultados del rendimiento del año 2 para las plantas Iransgénics maiz que comprenden el gen YHB1 de levadura En general, en 2004, el ambiente en las ubicaciones de la prueba de rendimiento en campo fue más favorable para el rendimiento de producción que en 2003, lo cual puede producir la diferencia en el desempeño del rendimiento de las plantas transgénicas que comprenden SEQ ID NO' 4 EJEMPLO 5 HMP de E. coli reduce el nivel de NO en las plantas Un análisis de microscopía confocal se llevó a cabo para detectar los niveles de NO en las plantas transgénicas de maiz que comprenden el gen de HMP de E coli utilizando un colorante específico a NO denominados DAF-2DA (Calbiochem). DAF-2DA es el reactivo más sensible disponible para la detección de NO: su límite de detección es de 5 nM, dos órdenes de magniíud menor que el siguienle mejor método, la espectroscopia de resonancia paramagnética. Para los eventos del maíz, es decir ZM_M21505, ZM_M21516, ZM_M20388, ZM_M 21509 y los controles no transgénicos se plantaron en el invernadero bajo las condiciones de crecimiento estándares del maíz. 12 plantas/evento se crecieron en la presencia de cualesquiera de las condiciones de crecimiento con nitrógeno limitado (2 mM de nitrato de amonio) o la condición de crecimiento con suficiente nitrógeno (20 mM de nitrato de amonio). Adicionalmente, las plantas de los bordes se incluyeron en el experimenío para asegurar la homogeneidad en las condiciones de crecimiento. Las plantas se separaron al azar uíilizando un programa Make-a-map de Virgo. Cuando las plañías alcanzaron la eíapa de V6, se cosecharon muestras de 5X5 cm de las hojas a partir del segmento terminal de la hoja y se incubaron inmediatamente en Tris 10 mM pH=7 durante el transporte al laboratorio de microscopía. Al menos diez secciones muy delgadas (de un mm de ancho) por muestra se generaron entonces a partir de cada hoja cosechada y se incubaron en la oscuridad en DAF-2DA 10 micromolar en agua desfilada por 1 hoja bajo agilación suave. Los niveles de NO se visualizan uíilizando un microscopio de barrido láser confocal (Zeiss LSM510). Las imágenes se procesaron utilizando el Zeiss LSM Image Browser. En promedio, se analizaron tres plantas por evento junto con los controles crecidos bajo las mismas condiciones. En los cualro eventos, las plantas transgénícas crecidas bajó condiciones de nitrógeno limitado o de nitrógeno suficiente mostraron niveles menores de NO en comparación con los controles crecidos bajo las mismas condiciones. Este experimento también permitió la exploración de la expresión espacial de NO en la plantas de maíz. Ya sea bajo la condición de crecimiento con nitrógeno suficiente como la condición de crecimiento con nitrógeno limitado, las señales de tinción DAF-2DA se localizaron en las células de la vaina y las células del mesofilo de las plantas control, sugiriendo que estas células participar en el metabolismo de NO y que también pueden coníener las esterasas requeridas para activación de DAF2-DA. También se observó una reducción de la señal DAF-2DA en las células de la vaina y las células del mesofilo en las plantas transgénicas de maíz que comprende el gen de HMP de E. coli, que es consistente con la actividad molecular esperada de la flavohemoglobina y el patrón esperado de expresión del transgén dirigido por el promotor de actina del arroz en estos tipos celulares. Además, la función del hístograma provisío por el Cari Zeiss LSM Image Examiner se uíilizó para cuantificar las señales específicas a NO. Los inventores han demostrado una disminución en la intensidad de tinción de DAF2-DA en las plantas transgénicas contra las plantas control en cinco plantas que pertenecen al evento ZM_M21516.

CUADRO 18 Disminución en el porcentaje de la intensidad de extinción del DAFg-DA en cinco plantas transgénicas del evento ZM M21516 EJEMPLO 6 Análisis del contenido de aminoácidos libres en plantas transgénicas de maiz que comprenden el gen HMP de E. coló Los eventos transgénicos y controles no transgénicos se crecieron bajo suficiente nitrógeno fertilizado con 101 kg de N/Ac. Cuando las plañías alcanzaron la etapa V12, la hoja de la mazorca se promovió a partir de 12 plantas cada una de tipo silvestre o de cualesquiera eventos transgénicos, y luego se analizaron para los aminoácidos libres. Las muestras se prepararon de manera precisa pesando aproximadamente 50 mg del polvo seco homogéneo y se exírajo con 1.5 ml de una solución de TCA al 10% p/v. la muesíra se aclaró medianíe cenírifugación y se analizaron 0.5 ul del sobrenadante para los aminoácidos libres. El sistema CLAR consistió de un CLAR Agilent 1100 con un automuestra enfriado, un deteclor de fluorescencia, y un sistema de datos HP Chemstation. La separación de los aminoácidos se llevó a cabo utilizando la derivación en precolumna con o-ftalaldehido (OPA) seguida por separación utilizando una columna Zorbax Eclipse-AAA de 4.6 X 75 mm, 3.5 um. La detección fue mediante fluorescencia y se recolectaron los cromatogramas utilizando HP Chemstation. Todos los estándares y los reactivos se obtuvieron a partir de Agilent Technologies. Referencia: Rapid, Accurate, Sensitive and Reproducible Analysis of Amino Acids; John W. Henderson, Robert D. Ricker, Bpan A. Bidlingmeyer, Cliff Woodward, Agilent publication 5980-1193EN CUADRO 19 Niveles de aminoácidos libres en las hojas de la plante del maiz (a): significativo, p<0.05 en la serie de datos actual (n): no significativo en la serie de datos actual 0: no detectado en la serie de datos acfual EJEMPLO 7 Identificación de los homólogos Se construyó una "base de datos de todas las proteínas" que se puede buscar en BLAST de las secuencias conocidas de proteínas utilizando una base de datos de secuencias patentada y la base de datos de aminoácidos no redundantes (nr.aa) del the National Center for Biotechnology Informaíion (NCBl). Para E. Coli, a partir de las cuales se obtuvo la secuencia polinucleotídíca como se establece en SEQ ID NO: 1 , se elaboró una "base de datos de proteína del organismo" de las secuencias de proteínas conocidas del organismo. La base de datos de proteína del organismo es una subpoblación de las bases de datos de todas las proteínas basándose en la identificación de la taxonomía de the NCBl para el organismo. La base de datos de todas las proíeinas se invesíigó uíilizando la secuencia de aminoácidos como se eslablece en SEQ ID NO: 5 medíanle "blaslp" con un valor límite E de 1e-8. Hasta 1000 aciertos se maniuvieron, y se separaron por los nombres del organismo. Para cada organismo diferente a E. coli, se mantuvo una lista para los aciertos a partir del organismo de búsqueda mismo con un valor E más significativo que el mejor acierto del organismo. La lista probablemente contiene genes duplicados, y se refiere como la lista núcleo. Se mantuvo otra lista para los aciertos a partir de cada organismo, clasificada por el valor E, y se refiere como la lisia de Acierto.

La base de datos de proteína del organismo se investigó utilizando la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 5 utilizando "blastp" con un valor límite E de 1e-4. Hasta 1000 aciertos se mantuvieron. Se elaboró una base de datos para búsqueda en BLAST basándose en estos aciertos, y se refiere como "SubDB". SubDB se investigó con cada secuencia en la lista de Acierto utilizando "blastp" con un valor límite E de 1e-8. El acierto con el mejor valor E se comparó con la lista núcleo para el organismo correspondiente a partir del organismo correspondiente. El acierto se consideró como un probable ortólogo si pertenece a la lista núcleo, de otra manera no se consideró como un probable ortólogo y no exisíe una investigación adicional de las secuencias en la lista Acierto para el mismo organismo. Se identificaron los ortólogos probables a partir de un gran número de disíintos organismos y se reportaron por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 130 a SEQ ID NO: 256. Todas las patentes, solicitudes de pateníe y publicaciones citadas en la presente invención se incorporan como referencia en su íoíalidad hasía el mismo grado como si cada palente individual, solicííud de patenle o publicación se indicara específicamente e individualmente para ser incorporada como referencia.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 - Un ADN que se presenta de manera no natural que comprende una secuencia polinucleotídíca seleccionada a partir del grupo que consisle de SEQ ID NO: 1 , 2 y 260, y complemenlos de la misma. 2 - Una construcción de ADN recombinante para la transformación vegetal que comprende un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 , 2 y 260. 3 - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque comprende adicionalmenle un promolor para la expresión vegetal. 4 - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 3, caracíerizada además porque dicho promolor se selecciona a parlir de un grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor preferido de tejido verde, un promotor preferido de floema y un promotor preferido de tejido de raíz. 5.- Una semilla transgénica que comprende un gen heterólogo de flavohemoglobina en su genoma, en donde las plantas transgénicas crecidas a partir de dicha semilla transgénica exhiben un rasgo agronómico mejorado, en comparación con una planta control. 6 - La semilla transgénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho gen de flavohemoglobina codifica una proteína que liene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5 y 6, y homólogos de las mismas. 7 - La semilla transgénica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicho homólogo tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 130 hasta SEQ ID NO: 256. 8 - La semilla transgénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho rasgo agronómico mejorado es una: (a) velocidad de crecimiento más rápido, (b) biomasa fresca o seca incremeníada, (c) rendimiento incrementado de semilla o de fruta, (d) contenido incrementado de nitrógeno en semilla o en fruto, (e) contenido incrementado de aminoácido libre en planta completa, (f) contenido incrementado de aminoácido libre en semilla o fruto, (g) contenido incrementado de proteína en semilla o fruto, (h) nivel de clorofila incrementado, y/o (i) contenido incrementado de proteína en tejido vegetativo. 9.- La semilla transgénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dichas plantas transgénicas que tienen un rasgo agronómico mejorado se crecen bajo una condición de crecimiento con suficiente nitrógeno o una condición de crecimiento con nitrógeno limitado. 10 - Un método para la producción de una plañía transgénica que tienen un rasgo agronómico mejorado, en donde dicho méíodo comprende (a) la transformación de células vegetales con una construcción de ADN recombinante para expresar una proteina flavohemoglobina; (b) la regeneración de las plantas a partir de dichas células; y (c) la selección de dichas plantas para identificar un rasgo agronómico mejorado. 1 1.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho rasgo agronómico mejorado es una: (a) velocidad de crecimiento más rápido, (b) biomasa fresca o seca incrementada, (c) rendimiento incrementado de semilla o de fruta, (d) contenido incrementado de niírógeno en semilla o en fruto, (e) contenido incrementado de aminoácido libre en planta compleía, (f) coníenido incrementado de aminoácido libre en semilla o fruto, (g) conlenido incrementado de proteina en semilla o fruto, (h) nivel de clorofila incrementado, y/o (i) contenido incremenlado de proteína en tejido vegetativo. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dichas plantas íransgénicas se crecen bajo una condición de crecimiento con suficiente nitrógeno o una condición de crecimiento con nitrógeno limitado. 13 - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracierizado además porque dicha construcción de ADN recombinante comprende un polinucleótido que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consisíe de SEQ ID NO: 5 y 6, y homólogos de las mismas. 14.- El mélodo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho homólogo tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 130 hasta SEQ ID NO: 256. 15.- El mélodo de conformidad con la reivindicación 14, caracierizado además porque dicha construcción de ADN recombinante comprende adicionalmente un promotor para la expresión vegetal. 16 - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho promotor seleccionado a partir del grupo que consiste de un promotor conslitutivo, un promotor preferido de raíz, un promotor preferido de floema y un promotor preferido de tejido verde. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho promotor constitutivo es el promotor de actina del arroz. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho promotor preferido de raiz es el promotor RCC3 del arroz. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho promotor preferido de tejido verde es el promotor FDA o PPDK. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho promotor preferido de floema es el promotor RTBV.