DE69911212T2

DE69911212T2 - Anwendung der hemoproteine in der therapie

Info

Publication number: DE69911212T2
Application number: DE69911212T
Authority: DE
Inventors: S. Jonathan STAMLER; Alfred Hausladen
Original assignee: University of Durham; Duke University
Current assignee: University of Durham; Duke University
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-07-09
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2019-07-10
Also published as: AU751240B2; EP1096950A2; DE69911212D1; ATE249235T1; EP1096950B1; US7112563B2; AU5093499A; CA2337060A1; WO2000002580A3; WO2000002580A2; US20010031727A1

Description

Hämoproteine sind eine Gruppe Proteine, die eine prosthetische Hämgruppe enthalten. Sie umfassen Cytochrome und Hämoglobine. Diese Proteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewinnung biologischer Energie im aeroben Metabolismus der Säuger und Individuen mit Mutationen oder Defekten in diesen Proteinen können Mängel bei der Sauerstoffversorgung (z. B. Sichelzellanämie) und Elektronentransport (z. B. Leigh-Syndrom) besitzen, die mit einer hohen Sterberate einhergehen. In der Tat ist die Bedeutung einer ausgewogenen Sauerstoffversorgung und eines ausgewogenen Sauerstoffverbrauchs nachgewiesen, um einen normalen Metabolismus (z. B. oxidative Phosphorylierung) zu erhalten und einen oxidativen Stress zu vermeiden.
Unter bestimmten Umständen kann es erwünscht sein, die Sauerstoffmenge in einem Säuger entweder systemisch oder lokal (z. B. in einem Organ oder einem Teil davon, Gewebe oder Zellen) zu modulieren (d. h. erhöhen oder zu vermindern). Zum Beispiel kann eine geeignete Modulation der Sauerstoffmengen für Individuen mit Anämie oder oxidativem Stress oder in Individuen, die durch Sauerstoff-Aushungern an der Tumorstelle behandelt werden sollen, von therapeutischem Vorteil sein. Folglich besteht ein Bedarf an Verfahren zur Modulation der Sauerstoffkonzentration in einem Säuger.
Wenn Makrophagen von Bakterien, bakteriellen Produkten, Cytokinen von T-Lymphocyten und Antigenen aktiviert werden, antworten sie durch Umwandlung von Arginin in NO über Stickstoffmonoxid-Synthase. Es ist gezeigt worden, dass die Blockierung des Synthesepfades der NO-Produktion die immunologisch vermittelten Gelenksschädigungen lindern, die in Arthritis-Tiermodellen, wie auch bei Glomerulonephritis vorkommen (McCartney-Francis, N. et al., J. Exp. Med. 178: 749– 754 (1993); Weinberg, J. B. et al., J. Exp. Med. 179: 651–660 (1994)). Es wird ebenfalls vermutet, dass NO eine Rolle bei anderen Entzündungszuständen wie Colitis, Iritis und hämodynamischen Schock spielt. Außerdem sezernieren Tumorzellen NO zur Regulation des Blutflusses. Folglich sind therapeutische Verfahren erwünscht, die die NO-Konzentration vermindern, um diese Zustände zu lindern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die NO- und O₂-Verbrauchsaktivität von natürlich vorkommenden und varianten Hämoproteinen, die hier auch als Desoygenasen oder Hämoproteine mit Desoxygenase-Aktivität (ebenso Hämoproteine mit NO-Verbrauchsaktivität) bezeichnet sind. Hämoproteine können aufgrund ihrer enzymatischen Aktivitäten mit den hier beschriebenen Verfahren zur Charakterisierung enzymatischer Aktivitäten identifiziert werden. Insbesondere betrifft die Erfindung die NO-Verbrauchs- und Desoxygensase-Aktivität von Ascaris Hämoglobin (AH), Myoglobin und Flavohämoglobinen (z. B. Flavohämoglobine von Bakterien, Pflanzen und Pilzen). Ein oder mehrere Hämoproteine können zur Herstellung eines Medikaments zur Verminderung der Sauerstoffkonzentration in einer wässrigen Lösung durch Zugabe eines Hämoproteins mit Desoxygenase-Aktivität zu der wässrigen Lösung wie auch eines Reduktionsmittels und Inkubation der resultierenden Lösung unter Bedingungen, die für die Aktivität der Desoxygenase geeignet sind, verwendet sein. Für eine NO verstärkte Desoxygenase-Aktivität in Abhängigkeit des Enzyms kann NO oder ein NO-Donor zu der wässrigen Lösung gegeben sein, um die Desoxygenase-Aktivität unter geeigneten Bedingungen zu verstärken. Hämoproteine können ebenfalls zur Herstellung eines Medikaments verwendet sein, um die NO-Konzentration in einer wässrigen Lösung zu vermindern.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Hämoproteins zur Herstellung eines Medikaments zur enzymatischen Verminderung der Sauerstoffkonzentration in einem Säuger bereitgestellt, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge besagten Hämoproteins, das eine Desoxygenase-Aktivität besitzt, an besagten Säuger.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung eines NO-verbrauchenden Hämoproteins zur Herstellung eines Medikaments zur enzymatischen Verminderung der Stickstoffmonoxid-Konzentration in einem Säuger bereit, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge des NO-verbrauchenden Hämoproteins an besagten Säuger.
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines Hämoproteins zur Herstellung eines Medikaments zur enzymatischen Bildung einer toxischen reaktiven Sauerstoff Spezies in einem Säuger bereit, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge des Hämoproteins an den Säuger.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein oder mehrere Hämoproteine mit Desoxygenase-Aktivität oder NO-verbrauchender Aktivität und einen physiologisch verträglichen Träger.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Hämoprotein mit Desoxygenase-Aktivität, außer Myoglobin, zur therapeutischen Anwendung bereit.
Deshalb betrifft die Erfindung im Allgemeinen die enzymatische Verminderung der Sauerstoff- und/oder NO-Konzentration in einem Säuger mit Hilfe einer therapeutisch wirksamen Menge eines Hämoproteins mit Desoxygenase-Aktivität.
Folglich betrifft die Erfindung die Verwendung eines Hämoproteins zur Behandlung eines Säugers mit einer Erkrankung, die durch Vorliegen von pathologisch proliferierenden Zellen gekennzeichnet ist, wie beispielsweise Prostatahypertrophie, Restenose (wie von einer Koronararterie), Psorias oder ein Tumor. Die Verwendung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Hämoproteins mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität an einen Säuger in einem derartigen Zustand. In zusätzlichen Anwendungsformen betrifft die Erfindung die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugers mit einem Tumor. In einer Anwendungsform betrifft die Erfindung die Desoxygenierung eines Tumors. Die Verwendung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Hämoproteins mit Desoxygenase-Aktivität an einen Säuger mit einem Tumor. In einer anderen Anwendungsform betrifft die Erfindung eine Antitumor-Therapie. Die Verwendung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Hämoproteins mit Desoxygenase-Aktivität und einer therapeutisch wirksamen Menge eines cytotoxischen Mittels an einen Säuger mit einem Tumor. In einer besonderen Anwendungsform ist das cytotoxische Mittel ein biologisch reduzierendes cytotuxisches Mittel und die Desoxygenase-Aktivität kann eine NO-aktivierte Aktivität sein. In einer anderen Anwendungsform umfasst die Erfindung die Verstärkung der cytotoxischen Aktivität eines biologisch reduzierenden cytotoxischen Mittels. Die Erfindung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Hämoproteins mit Desoxygenase-Aktivität und einer therapeutisch wirksamen Menge eines biologisch reduzierenden cytotoxischen Mittels an einen Säuger mit einem Tumor.
Mit einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge eines Hämoproteins (z. B. ein Globin mit Desoxygenase-Aktivität) zur Herstellung eines Medikaments zur enzymatischen Erzeugung toxischer reaktiver Sauerstoff Spezies (z. B. Wasserstoffperoxid, Superoxid, Hydroxyl) für therapeutische Zwecke (z. B. eine toxische Wirkung in einem Tumor) in einem Säuger, der einer derartigen Therapie bedarf.
Mit einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend ein Hämoprotein mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität und einen physiologisch verträglichen Träger. In einer Anwendungsform umfasst die Zusammensetzung außerdem ein cytotoxisches Mittel (z. B. ein Antitumor-Mittel) und/oder Reduktionsmittel. In einer bevorzugten Anwendungsform ist das cytotoxische Mittel ein biologisch reduzierendes cytotoxisches Mittel.
Die Erfindung betrifft außerdem natürlich vorkommende oder mutierte Hämoproteine mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität, wie hier beschrieben, zur therapeutischen (einschließlich prophylaktischen) oder diagnostischen Anwendung und betrifft die Verwendung derartiger natürlich vorkommender, mutierter oder varianter Hämoproteine, oder aktiver Fragmente irgendeines der vorhergehenden, mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer bestimmten Krankheit oder Zustandes, wie es hier beschrieben ist (z. B. Krebs, Ascaris sp. Infektion, Prostatahypertrophie, Restenose}.
Mit einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der obigen Hämoproteine zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugers, der mit Mikroorganismen oder Parasiten infiziert ist, die ein enzymatisches Hämoprotein zur Regulierung des Sauerstoffspannung nutzen. In einer Anwendungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der obigen Hämoproteine zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines mit einem Nematoden der Gattung Ascaris infizierten Säugers. Die Erfindung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors der NO-Synthase an den infizierten Säuger. Die Erfindung betrifft außerdem NO-Synthase-Inhibitoren zur therapeutischen Anwendung (einschließlich Prophylaxe) oder Diagnose einer mikrobiellen oder parasitären Infektion (z. B. Ascaris sp. Infektion} und betrifft die Verwendung von NO-Synthase-Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mikrobiellen oder parasitären Infektion (z. B. Ascaris sp. Infektion}.
Es sind hier Zusammensetzungen beschrieben, umfassend Hämoproteine zum Beispiel Flavohämoglobine zur pharmazeutischen Anwendung in Verfahren zur Verminderung von NO-Konzentrationen zum Beispiel zur Behandlung von Entzündungszuständen oder Tumoren in Säugern. Flavohämoglobine, die zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung gegeben werden sollen, können aus verschiedenen Bakterien-Spezies, wie beispielsweise E. coli, aus Hefe, wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, aus Pflanzen isoliert sein oder können zum Beispiel in einem Wirtsorganismus rekombinant hergestellt sein. Eine Antitumor-Therapie kann durch Einführen (z. B. durch Infusion) eines Hämoproteins (z. B. Flavohämoglobins oder eine geeignete Zusammensetzung umfassend Flavohämoglobin) in den Tumor in die Tumorstelle durchgeführt sein, die zum Beispiel die Konstriktion von Blutgefäßen und die Verminderung des Blutstroms in Tumoren verursacht. Eine entzündungshemmende Therapie kann durch lokale oder systemische Verabreichung einer Zusammensetzung, umfassend ein Hämoprotein mit NO-verbrauchender Aktivität durchgeführt sein, je nach Eignung in Abhängigkeit der mit der Therapie zu lindernden Erkrankung oder medizinischen Störung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt die Absorptionsspektren von gereinigtem Ascaris Hämoglobin (AH). AH, gereinigt aus perienteraler Flüssigkeit frischer Würmer, war > 95% (FeII)O₂ (Spektrum 1, durchgezogene Linie). AH(FeII)O₂ zeigt einen Peak in der Soret-Region bei 412 nm und Peaks im sichtbaren Spektrum bei 542 und 577 nm. Desoxygenierung von AH erfolgte mittels Inkubation mit Dithionit. AH(FeII) (Spektrum 2, kurz-lang gestrichelte Linie) zeigt einen Soret-Peak bei 428 nm und einen sichtbaren Peak bei 550 nm. Mittels Hexacyanoferrat-Behandlung von AH wurde AH(FeIII) erhalten (Spektrum 3, lang gestrichelte Linie), das einen Soret-Peak bei 407 nm und Peaks bei 539 und 573 nm im sichtbaren Bereich zeigt. Ein charakteristischer Peak bei 630 nm ist ebenfalls vorhanden. NO wurde zu AH(FeIII) gegeben, um AH(FeIII)NO (Spektrum 4, kurz gestrichelte Linie) zu erhalten, das einen Soret-Peak bei 416 nm und Peaks im sichtbaren Bereich bei 532 und 564 nm zeigt.
1B zeigt Differenzspektren für verschiedenen AH-Formen. Das Differenzspektrum von AH(FeIII) gegen AH(FeII)O₂ (Spektrum 1, durchgezogene Linie} zeigt eine Verschiebung in der Soret-Region nach links, mit einem Maximum bei 398 nm und einem Minimum bei 416 nm. Der sichtbare Bereich ist durch eine Verringerung der Absorption gekennzeichnet, mit einem Peak bei 507 nm und einem Anstieg bei 630 nm. AH(FeIII)NO gegen AH(FeII)O₂ (Spektrum 2, gestrichelte Linie) zeigt eine Verschiebung in der Soret-Region nach rechts, mit einem Peak bei 422 nm. Es zeigt sich eine Verringerung über den sichtbaren Bereich, mit Peaks bei 521 nm und 563 nm.
1C zeigt Differenzspektren, die während der Titration von AH mit NO in Abwesenheit von NADPH aufgezeichnet worden sind. Es erfolgten wiederholte Zugaben von NO (aq) (jeweils 1,8 μM) zu AH (6 μM Häm-Gehalt). Spektren wurden unmittelbar nach Mischen aufgezeichnet. Ergebnisse sind als Differenzspektren gegen AH(FeII)O₂ dargestellt. Anfangszugabe von NO führte zu einem schnellen Bildung einer kleinen Menge AH(FeIII) (Spektrum 1, durchgezogene Linie) wie aus einem Anstieg der Absorption bei ungefähr 400 nm zu erkennen ist. Ein Peak im AH(FeIII) Differenzspektrum wurde nach 11 Zugaben von NO (19,8 μM) (Spektrum 2, kurz gestrichelte Linie) beobachtet. Nachfolgende Zugaben von NO bis zu 45 μM führte zu einer AH(FeIII)NO-Zunahme (Spektrum 3, lang gestrichelte Linie), was durch ein Auftauchen eines kleinen Peaks bei 418 und 519 nm zusammen mit einem Anstieg bei 563 zu erkennen war.
1D zeigt Differenzspektren, die während der Titration von AH mit NO in Anwesenheit von NADPH aufgezeichnet wurden. Die bereits für 1C beschriebene Versuchsdurchführung wurde in Anwesenheit von 500 μM NADPH wiederholt. Die Anfangszugabe von NO führte zur Bildung einer größeren Menge an AH(FeIII) (Spektrum 1, durchgezogene Linie). Ein Peak im AH(FeIII)-Spektrum wurde nach nur 8 Zugaben (14,4 μM) (Spektrum 2, kurz gestrichelte Linie) beobachtet. Zugaben von insgesamt 45 μM NO ergaben AH(FeIII) ohne detektierbares AH(FeIII)NO (Spektrum 3, lang gestrichelte Linie). Diese Daten lassen vermuten, dass in Anwesenheit von Cofaktor NADPH AH wirksam NO verbraucht.
1E ist ein Diagramm, das den Nitrosyl-Gesamtgehalt verschiedener Formen von AH nach Transnitrosierung in Anwesenheit oder Abwesenheit von NADPH zeigt. Unter Bedingungen, die eine selektive Transnitrosierung von Thiolen begünstigen (Jia, L. et al., Nature 380: 221–226 (1996)), führte eine Inkubation von AH (178 μM Häm-Gehalt) mit S-Nitrosocystein (zweifacher molarer Überschuss gegenüber Häm) in Abwesenheit von NADPH zu einer schnellen Oxidation des Häms (Daten nicht gezeigt). Photolyse-Chemilumineszenz wurde zur Messung des erhaltenen Nitrosyl-Gesamtgehalts von AH (schraffierte Balken), AH(FeIII)NO (schwarze Balken) und AH-SNO (weiße Balken) eingesetzt. Das gleiche Verfahren wurde in Anwesenheit von 500 μM NADPH wiederholt und führte zur Oxidation des Häm-Teils (nicht gezeigt), aber mit drastisch vermindertem Nitrosyl-Gesamtgehalt, AH(FeIII)NO und AH-SNO, was auf einen NO-Metabolismus hinweist (nicht gezeigt).
1F ist ein Diagramm, das zeigt, dass die A7, E15 und E19 Cystein-Reste von AH nitrosyliert sind und an NO-Reaktionen beteiligt sind. S-Nitrosylierung von rekombinantem D1 und D1-Mutanten, deren Cysteine durch Serine ersetzt sind (A7, E15 und E19), wurden mit 10fachem molaren Überschuss von S-Nitrosocystein und abweichend wie in 1E beschrieben durchgeführt. Für einen Vergleich wurden Ergebnisse gegen Häm-Gehalt standardisiert; Nirosyl-Gesamtgehalt (schraffierte Balken) und SNO-Gehalt (weiße Balken) sind gezeigt. Diese Daten weisen darauf hin, dass das Häm, E15 und A7 Cysteine und in geringerem Umfang E19 Cystein ein Redox-System bilden können, das einen intramolekularen Transfer von Elektronen und/oder NO erlaubt.
2A ist ein Diagramm, das den NO-Verbrauch von AH zeigt. Eine NO-Elektrode wurde zur Messung des Verbrauchs von 6 μM NO eingesetzt. NO-Zugabe zu ausschließlich Puffer (PBS, pH 6) (durchgezogene Linie) ergab eine Peak-Höhe von 4,4 nA, die langsam abnahm. NO-Zugabe zu Puffer plus 500 μM NADPH (kurzlang gestrichelte Linie) ergab ein NO-Signal (4,2 nAmps Peak-Höhe), das langsam mit einer vergleichbaren Geschwindigkeit wie NO in ausschließlich Puffer abnahm. NO-Zugabe zu AH (1,5 μM Häm-Gehalt) ohne NADPH (lang gestrichelte Linie) ergab einen verringerten Peak von 2,5 A, was mit der Reaktion von NO mit Hämgebundenen Sauerstoff übereinstimmt. Abnahme des NO-Signals zeigte allerdings ähnliche Kinetiken wie NO ohne AH. NO-Zugabe zu AH (1,5 μM Häm-Gehalt) plus 500 μM NADPH (kurz gestrichelte Linie) ergab ein vermindertes NO-Signal (2,0 nAmp) und einer erhöhten Abnahmegeschwindigkeit. Präziser, es war eine vollständige Abnahme innerhalb einer Minute im Vergleich zu mehr als 10 min ohne AH oder NADPH zu beobachten.
2B ist eine dreidimensionale zusammengesetzte Abbildung des sichtbaren Spektrums, das die Kinetiken der AH-Wechselwirkung mit NO in Abwesenheit von NADPH zeigt. AH(FeII)O₂ (6 μM Häm) wurde mit Diethylamin NONOat (DEANO) (25 μM) in einem Stopped-Flow-Spektrophotometer gemischt. Vor Mischen wurden alle Lösungen mittels 45 min Durchleiten von Argon-Gas desoxygeniert. Jedes zwanzigste Spektrum aller 50 Sekunden gesammelten Spektren ist gezeigt, was die Abnahme des anfänglichen AH(FeIII)NO zeigt.
2C zeigt modellierte Spektren für die Kinetiken von AH-Wechselwirkungen mit NO in Abwesenheit von NADPH (in 2B gezeigt). Unter Verwendung von Pro-K (Applied Photophysics) zur Berechnung vorhergesagter Spektren war der Algorithmus, der am besten für die Daten passte, war A (Anfangsspektrum) + B (nicht absorbierende Spezies, NO) ergibt D (Endspektrum). Nach NO-Zugabe wird das Anfangsspektrum AH(FeII)O₂ (durchgezogene Linie) in ein modelliertes Zwischenprodukt-Spektrum, das AH(FeIII) (kurz gestrichelte Linie) ähnelt, und anschließend in ein Endspektrum konvertiert, das AH(FeIII)NO (lang gestrichelte Linie) entspricht. Nebenbild: Spektrumsänderungen bei 418 nm. Nach NO-Zugabe fällt die Absorption bei 418 nm stark (innerhalb von 8 sec) von 0,6 auf 0,53, aufgrund der Bildung des AH(FeIII) Zwischenprodukts. Die anschließende Absorptionserhöhung liegt an der Zunahme von AH(FeIII)NO.
2D ist eine dreidimensionale zusammengesetzte Abbildung des sichtbaren Spektrums, das die Kinetiken der AH-Wechselwirkung mit NO in Anwesenheit von NADPH zeigt. AH(FeII)O₂ (6 μM Häm) wurde mit 25 μM Diethylamin NONOat (DEANO) plus 500 μM NADPH (Endkonzentration) unter einer niederen Sauerstoffspannung gemischt. Jedes zwanzigste Spektrum aller 50 Sekunden gesammelten Spektren ist gezeigt, was die Abnahme des anfänglichen AH(FeII)O₂ Spektrums wegen der Oxidation zur Bildung von AH(FeIII) zeigt. Kein AH(FeIII)NO ist im Endspektrum nachzuweisen.
2E zeigt modellierte Spektren für die Kinetiken von AH-Wechselwirkung mit NO in Anwesenheit von NADPH (in 2D gezeigt). Vorhergesagte Spektren wurden wie in 2C beschrieben berechnet. Der Algorithmus, der am besten für die Daten passte, war A (Anfangsspektrum) + B (nicht absorbierende Spezies, NO) ergibt C (Endspektrum). Nach Mischen mit NO wird das Anfangsspektrum von AH(FeII)O₂ (durchgezogene Linie) in ein Endspektrum konvertiert, das AH(FeIII) (kurz gestrichelte Linie) ähnelt. (Das Nebenbild zeigt Spektrumsänderungen bei 418 nm.) Nach NO-Zugabe fällt die Absorption bei 418 nm langsam über 50 sec von 0,6 auf 0,45 ab verglichen mit der schnellen Änderung von 0,6 auf 0,53 in Abwesenheit von NADPH, was vermuten lasst, dass AH(FeIII) mit AH(FeII)O₂ um NO konkurriert.
2F ist ein Diagramm, das den AH-Stoffwechsel von NO zeigt, das von DEANO abgegeben ist. DEANO (5 μM Endkonzentration) wurde zu einer 500 μM NADPH-haltigen Lösung gegeben und NO wurde elektrochemisch gemessen (NO-Peak 3,2 nA). Ähnliche Zugabe von DEANO (5 μM) in Anwesenheit von AH (1,5 μM Häm-Gehalt) und 500 μM NADPH löste keinen erkennbaren Ausschlag aus (kurz-lang gestrichelte Linie), was den effizienten NO-Stoffwechsel demonstriert.
3A ist ein Diagramm, das den Sauerstoffverbrauch von AH zeigt. Eine Clark-Elektrode wurde in ein verschlossenes Glasgefäß für Sauerstoffmessungen verbracht. Zugabe von NO zum Gefäß bildete eine minimale Verringerung der Sauerstoffspannung (lang gestrichelte Linie, 1). Zugabe von 500 μM NADPH zu AH-haltigem (43 μM) Puffer führte zu einem Sauerstoffverbrauch nach einer 2,5 min lag Phase, was einen autokatalytischen Prozess vermuten lässt (kurz gestrichelte Linie, 2). NO (7,5 μM) Zugabe zu Puffer, der sowohl AH (0,43 μM) als auch NADPH (500 μM) enthielt, führte zu einem unmittelbaren schnellen Sauerstoffverbrauch (durchgezogene Linie, 3), wohingegen in Abwesenheit von NADPH kein Sauerstoff verbraucht wurde (punktierte Linie, 4). Wichtig ist, dass die Zugabe von AH zu einem späteren Zeitpunkt den Sauerstoffverbrauch in 4 nicht erhöhte. Der Pfeil gibt den Zeitpunkt der NO-Zugabe in den Linien 1, 3 und 4 und den Zeitpunkt der NADPH-Zugabe für Linie 2 an. Daten sind für drei ähnliche Versuche repräsentativ.
3B ist ein Diagramm, das die NADPH-vermittelte Desoxygenierung von AH zeigt. Eine AH-Lösung (PBS, pH 6,0) wurde mittels 45 min Durchleiten von Argon desoxygeniert (Anfangsspektrum). 500 μM NADPH wurde dann zugegeben und die Spektrumsänderung in die Ligend-freie Fe(II)(Desoxy)Form erfolgte über 10 min. Spektren sind als Differenzen gegen das Spektrum vor NADPH-Zugabe gezeigt.
4 ist eine Abbildung des Evolutionsschemas von Hämoglobinen nach NO-verbundenen Funktionen geordnet. Die Abbildung zeigt die Position von Nematoden-Hämoglobinen an der Verzweigung zwischen Bakterien und höheren Tieren (Sherman, D. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11696–11700 (1992)) und die Umwandlung einer NO-Entgiftungsfunktion in eine respiratorische Funktion. Distal und proximal bezeichnen die Position in der Häm-Tasche. Myr bezeichnet die zurückliegende Zeit in Millionen Jahre.
5A ist ein Diagramm, das den pO₂ in der Perienteralhöhle in frisch isolierten Ascaris Würmern über die Zeit zeigt. Eine Kanüle wurde in den Perienteralraum ~1 cm unterhalb des Kopfes eingeführt, durch die eine faseroptische O₂-Sonde geführt wurde. Sonden-Output fiel mit der Passage in die Höhle auf 4 mm Hg (durchgezogene Linie). Eine zweite Kanüle wurde zum Abziehen der perienteralen Flüssigkeit verwendet. Der perienterale pO₂ war nach vollständiger Drainage drastisch erhöht (gestrichelte Linie).
5B ist ein Diagramm, das die Umkehrbeziehung zwischen der SNO-Menge und der Metallnitrosyl-(FeNO)-Menge in der perienteralen Flüssigkeit frisch isolierter Ascaris Würmer zeigt. Die perienterale Flüssigkeit einzelner weiblicher Ascaris Würmer (Datenpunkte) wurde gesammelt und auf SNO und FeNO mittels Photolysis-Chemilumineszenz untersucht. Daten wurden auf den Ascaris Hämoglobin-Gehalt der Flüssigkeit normiert.
6 ist ein Diagramm des Sauerstoffgehalts gegen die Zeit und zeigt, dass Myoglobin eine Desoxygenase-Aktivität besitzt, die von NO gesteuert ist. Myoglobin wurde zu Phosphat-gepufferter Saline mit einer Endkonzentration von 5 μM gegeben. Sauerstoffverbrauch wurde durch Zugabe von NADPH (Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat, reduzierte Form) oder NADH (Nicotinamid-Adenindinucleotid, reduzierte Form) gestartet. Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs wurde durch Zugabe von 1 bis 25 μM NO beschleunigt, das eine geringe Wirkung besaß, wenn es alleine zugegeben war.
7A ist ein Diagramm, das die Freisetzung von NO aus S-Nitrosothiolen in E. coli über die Zeit zeigt. S-Nitrosocystein (0,1 mM) wurde zu Wachstumsmedium (unterbrochene Linie) oder zu einer Suspension von E. coli in Wachstumsmedium (durchgezogene Linie) gegeben und die NO-Freisetzung über die Zeit wurde mit einer Elektrode gemessen.
7B ist ein Diagramm von NO in Wachstumsmedium, gemessen mit einer Elektrode, und zeigt, dass E. coli Zellen NO sowohl konstitutiv als auch induziert über die Zeit verbrauchen. Eine gesättigte NO-Lösung wurde zum Wachstumsmedium (punktierte Linie) oder zu einer Suspension von E. coli, die nicht behandelt waren (gestrichelte Linie), oder zu E. coli gegeben, die mit 0,2 mM SNO-Cys vorbehandelt waren (durchgezogene Linie).
7C ist ein Graph der Nitrit-Konzentration von 0,5 mM SNO-Cys aus Fraktionen einer Ionenaustausch-Säule, die zur Trennung der Lyase-Aktivitäten in E. coli Zellextrakten verwendet wurde.
7D ist ein Spektrum (Absorption gegen Wellenlänge) von Säulenfraktionen - - aus nicht behandelten (gestrichelte Linie) oder vorbehandelten E. coli Zellen (durchgezogene Linie) hergestellt - - die eine induzierbare NADH-abhängige NO-metabolisierende Aktivität enthalten. Das Spektrum ist für ein Häm-Protein charakteristisch.
8A ist ein Diagramm von NO-Werten, die aus Puffer- oder Extraktproben von Δhmp oder Wildtyp E. coli Zellen nach verschiedenen Behandlungen erhalten wurden: Zugabe von ~10 μM NO zu 20 mM BisTrisPropan, pH 7,0 (Linie 1), NADH-abhängiger NO-Verbrauch von Extrakten unbehandelter Δhmp Zellen (Linie 2) und SNO-Cys behandelter Δhmp mutierter Zellen (Linie 3) oder unbehandelter Wildtyp Zellen (Linie 4) und SNO-Cys behandelter Wildtyp Zellen (Linie 5).
8B ist ein Diagramm, das das Wachstum von E. coli Flüssigkulturen über die Zeit zeigt und als Trübung gemessen wurde. Zellen, die behandelt (+/+) oder unbehandelt (–/+) waren mit 0,2 mM SNO-Cys 90 Minuten lang, erfuhren mit der gleichen Dosis zur Zeit 0 eine Challenge. Kontrollzellen waren weder behandelt noch erfuhren sie eine Challenge mit SNO-Cys (–/–). HMP ist für NO-Verbrauch und Resistenz gegen nitrosativen Stress erforderlich.
9A ist ein Diagramm, das das Signal der NO-Elektrode nach Zugabe von ~10 μM NO zu Puffer (durchgezogene Linie) oder ~10 μM NO (punktierte Linie) oder ~35 μM NO (gestrichelte Linie) zu 40 μg/ml gereinigtem HMP + 0,1 mM NADH zeigt.
9B zeigt Absorptionsspektren von gereinigtem HMP. 450 μg/m1 HMP wurde spektrophotometrisch unter anaeroben Bedingungen untersucht (Linie 1). Zugabe von NADH ergab ein Eisen(II) ähnliches Spektrum (Linie 2). Zugabe von gesättigter NO-Lösung bildete ein Eisen-Nitrosyl Spektrum (Linie 3). Luft-Exposition dieses Eisen-Ntrosyls (mit kurzem Verwirbeln) führte zu einem Sauerstoff gebundenes Eisen(II) Spektrum (Linie 4).
9C zeigt Absorptionsspektren von gereingtem HMP während der aeroben Umsetzung von NO in Anwesenheit von NADH. 300 μM NADH wurde zu 400 μg/ml HMP an Luft gegeben (punktierte Linie). Zugabe von 100 μM NO von gesättigter Lösung führte zu einem NADH-Verbrauch aber zu keiner Abnahme des Sauerstoff gebundenen Eisen(II) Spektrums (durchgezogene Linie).
9D ist ein Diagramm der Peakabsorption (bei 340 nm) von NADH für gereinigtes HMP, inkubiert ohne jegliche weiteren Zusätze (durchgezogene Linie), in Anwesenheit von 100 μM zugefügtem NO (punktierte Linie) oder 1mM zugefügtem KCN (gestrichelte Linie) ist. NADH-Verbrauch ist nicht während der NO-Umwsetzung durch HMP erhöht und nicht von Cyanid zu hemmen.
9E ist ein Diagramm, das zeigt, dass Nitrit und Nitrat die Hauptprodukte des aeroben NO-Stoffwechsels von gereinigtem HMP sind. Das Diagramm zeigt die Nitrit-Erträge nach Zugabe einer NO-gesättigten Lösung zu 40 μg/ml HMP in Anwesenheit von 0,1 mM NADH (durchgezogene Linie) oder nach Autooxidation (schwarzer Balken) oder HMP-Oxidation (schraffierter Balken) von NO, das von 0,1 mM Diethylamin-NO freigesetzt ist.
9F ist ein Diagramm, das den Sauerstoffverbrauch zeigt (mittels Elektroden-Messungen der Sauerstoffkonzentration über die Zeit). NO-Oxidation von HMP (durchgezogene Linie) erhöht den Sauerstoffverbrauch um das vierfache gegenüber NO-Autooxidation (gestrichelte Linie), d. h. die Stöchiometrie lautet 4 NO pro O₂ im ersten Fall und 1 NO pro O₂ im letzteren. Zu den mit Pfeilen angegebenen Zeitpunkten wurde 100 μM NO zugegeben.
10A ist ein Diagramm der GSNO-Konzentration, gemessen in Reaktionsproben von GSNO mit gereinigtem HMP. Spaltung von 200 μM GSNO wurde durch 75 μg/ml HMP in Anwesenheit von 0,1 mM NADH beschleunigt und wurde von 1 mM Cyanid nicht gehemmt.
10B ist ein Diagramm der O₂-Konzentration, wie sie mit einer Elektrode über einen Zeitraum gemessen wurde und zeigt, dass die GSNO-Spaltung unabhängig von Sauerstoff ist. Zugabe von 0,1 mM NADH, mit erstem Pfeil nach einer Minute angegeben, erhöhte Sauerstoffverbrauch von HMP (75 μg/ml). Zugabe von 0,2 mM GSNO, wie mit zweitem Pfeil (bei 4 Minuten; durchgezogene Linie) angegeben, führte zu einer minimalen Veränderung des Sauerstoffverbrauchs. Zugabe von 0,2 mM GSNO und 1mM Cyanid, wie mit zweitem Pfeil (bei 4 Minuten; gestrichelte Linie) angegeben, führte zu einem verringerten Sauerstoffverbrauch.
10C ist ein Diagramm, das die Absorptionsmessungen bei 340 nm (Absorptionspeak von NADH) über die Zeit in Proben mit 75 μg/ml gereingtem HMP in Puffer und 0,1 mM NADH nach Zugabe von 0,5 mM GSNO (punktierte Linie), 1 mM Cyanid (gestrichelte und punktierte Linie), GSNO und Cyanid (gestrichelte Linie) oder weder GSNO noch Cyanid (durchgezogene Linie) zeigt. Anfangsabsorptionen waren auf Wert 1 normiert.
10D ist ein Balkendiagramm, das N₂O als das Hauptprodukt der aeroben GSNO-Reduktion durch gereinigtes HMP zeigt. Die Höhe jedes Balken gibt die N₂O-Produktion wie gemessen (Arnelle, D. R. und Stamler, J. S., Arch. Biochem. Biophys. 318: 279–285 (1995)) nach 1 Stunde Inkubation der angegebenen GSNO-Konzentrationen mit 0,5 mM NADH und 75 μg/ml HMP. Der Ertrag ist auf Stickstoff normiert gezeigt (abzüglich des in Abwesenheit des Enzyms gebildeten Ertrags). Nitrit (2%) und Nitrat (5%) waren Nebenprodukte.
11A ist eine Abbildung eines Schemas, das die Reduktase- und Oxygenase-Aktivitäten von HMP zeigt. Die schematische Darstellung des Enzyms leitet sich aus der strukturellen Grundlage des Elektronentransfers ab (Ermler, U. et al., EMBO J., 14: 6067–6077 (1995)).
11B ist eine schematische Darstellung der Stoffwechselpfade für S-Nitrosothiol (SNO) und NO-Abbau in Bakterien. SNO wird zu NO von konstitutiven SNO-Lyasen gespalten oder von einer induzierbaren HMP-Reduktase zu N₂O reduziert. NO autooxidiert dann teilweise, um eine reaktive Stickstoff Spezies (RNS) zu ergeben, oder wird zu NO_x von der induzierbaren HMP-Oxygenase oxidiert. Das Stoffwechselschicksal und/oder Bildung von NO_x ist von oxyR kontrollierten Genen bestimmt (Hausladen, A et al., Ce1186: 719–729 (1996)). Ein kleiner Teil von SNO oder NO kann von HMP-Reduktase zu N₂O im konstitutiven Stoffwechselpfad beziehungsweise induzierbaren anaeroben Stoffwechselpfad umgewandelt werden.
12A ist eine Reproduktion von Spuren von Kraftumwandlern, die den isometrischen Tonus in Aortaringsegmenten des Kaninchens messen. Die Ringe waren mit Phenylephrin (PE) vorkonstringiert. Dann wurde HMP mit den angegebenen Konzentrationen in Abwesenheit (linke 4 Spuren) oder Anwesenheit (rechte 4 Spuren) von 0,1 mM NADH zugegeben.
12B ist eine Reproduktion von Spuren von Kraftumwandlern, die den isometrischen Tonus in Aortaringsegmenten des Kaninchens messen. Die EDRF/NO-abhängige Relaxation wurde durch Zugabe von Acetylcholin (ACh) induziert, dann wurden 0,1 mM NADH und HMP mit den angegebenen Konzentrationen zugegeben. Für den Test mit 100 nM HMP wurde eine zweite 0,1 mM NADH-Dosis gegeben, was mit Pfeil angegeben ist.
13 ist eine graphische Darstellung des relativen Blutflusses gegen die Zeit. Blutfluss wurde unter Verwendung eines Laser-Dopplers in einem Fensterkammer-Präparat des dorsalen Hautlappens gemessen. Hämoglobin-Infusion (t = 0 min) verringert minimal den Blutfluss in einem Mamma-Adenocarcinom-Modell.
14 ist ein Diagramm eines relativen Tumor-Blutflusses gegen die Zeit (Minuten), das eine mit 25 mg/kg NO-Dioxygenase TV (HMP) induzierte Abnahme des Tumor-Blutflusses in Fischer Ratten zeigt, die ein Ratten-Mamma-Adenocarcinom (R3230Ac) im Hinterlauf tragen. Tumor-Blutfluss wurde unter Verwendung einer Laser-Doppler-Durchflusssonde (Oxford; UK) gemessen. Systemische hämodynamische Eigenschaften änderten sich nicht. Jede Kurve repräsentiert eine Ratte. Die dicke schwarze Linie stellt den Durchschnitt dar. Der senkrechte Pfeil bei 10 Minuten gibt die Infusion der NO-Dioxygenase an.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Mit dem parasitären Nematoden Ascaris lumbricoides sind weltweit eine Milliarde Menschen infiziert. Seine perienterale Flüssigkeit enthält ein Hämoglobin, das Sauerstoff fast 25.000 mal fester bindet als menschliches Hämoglobin. Trotz enormer Forschungsanstrengungen in den letzten fünfzig Jahren blieb die biologische Funktion dieses Moleküls nicht bestimmbar. Die distale Hämtasche enthält ein Metall, Sauerstoff und Thiol (Yang, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4224– 4228 (1995)), von denen bekannt ist, dass sie mit Stickstoffinonoxid (NO) und verwandten Molekülen reagieren können.
Ascaris lumbricoides enthält reichliche Mengen an Hämoglobin mit einer außerordentlichen Sauerstoff Affinität (P₅₀ 0,001–0,004 mm Hg) (Davenport, H. E., Proc. R. Soc. London Ser. B, 136: 355–270 (1949); Okazaki, T. & Wittenberg, J. B., Biochim. Biophys: Acta, 111: 503–511 (1965). Ascaris Hämoglobin (AH) enthält insgesamt 16 Globin-Einheiten; es gibt acht identische Polypeptide, jedes mit zwei hintereinander liegenden Globin-Faltungen (Darawshe, S., et al., Biochem. J., 242: 689–694 (1987); Sherman, D. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11696– 11700 (1992)). Die hohe Sauerstoff Affinität erlaubt AH bei geringer Sauerstoffspannung des Darms gesättigt zu bleiben. Die feste Sauerstoffbindung ist das Resultat einer sehr geringen Sauerstoff Dissoziationsrate, -wohingegen die Aufnahmerate für Sauerstoff der von Säuger-Hämoglobinen ähnelt. (Davenport, H. E., Proc. R. Soc. London Ser. B, 136: 355–270 (1949) Okazaki, T. & Wittenberg, J. B., Biochim. Biophys. Acta, 111: 503–511 (1965)). Ein Vergleich mit anderen Invertebraten-Hämoglobinen, Mutagenese, spektroskopische Analyse und Aufklärung der Kristallstruktur der ersten Globin-Domäne (D1) von AH haben die molekulare Basis für die hohe Sauerstoff-Affmität aufgezeigt. (Yang, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4224–4228 (1995); De Baere, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1594–1597 (1994); Huang, S., et al., J. Biol. Chem. 271: 958–963 (1996); Kloek, A. P., et al., J. Biol. Chem. 269: 2377–2379 (1994); Peterson, E. S., et al., Biochem. 36(42): 13110–13121 (1997)). Das heißt, eine starke Wasserstoffbrückenbindung mit dem B10 Tyrosin-Hydroxyl wie auch eine schwache Wechselwirkung mit dem distalen E7 Glutamin-Rest stabilisiert den gebundenen Sauerstoff Liganden. Da AH eine derart hohe Affinität für Sauerstoff besitzt, scheint es unwahrscheinlich, dass seine Funktion der Sauerstoffversorgung dient.
Flavohämoglobin (HMP), wie es hier beschrieben ist, besitzt einen (Flavo)Reduktase-Entgiftungsmechanismus für SNO und einen Metall-Entgiftungsmechanismus für NO (11A). Die Reduktase-Domäne reduziert GSNO zu N₂O unabhängig von O₂, während die Häm-haltige Domäne NO zu Nitrat (und Nitrit) oxidiert. Folglich ist N₂O das alleinige Produkt der Enzymkatalyse unter anaeroben Bedingungen, während NO_x ^– ebenfalls bei aeroben Mechanismus gebildet wird. Die Reaktionen von GSNO und NO mit Säuger-Hämoglobinen sind sehr verschieden: Sie ergeben Peroxynitrosyl (Wade, R. S. und Castro, C. E., Chem. Res. Toxicol. 9: 1382–1390 (1996); Eich, R. F., et al., Biochemistry, 35: 6976–6983 (1996)), und Thionitrosyl-Derivate (Jia, L., et al., Nature 380: 221–226 (1996)), die vielfältige antimikrobielle Aktivitäten besitzen (MacMicking, J. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5243–5248 (1997), DeGroote, M. A. et al., Science 272: 414–417 (1996), Hausladen, A. et al., Cell 86: 719–729 (1996), DeGroote, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13997–14001 (1997). Durch folglich festes Binden eines Reduktase-Moduls an die Globin-Domäne, Zhu, H. & Riggs, A. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5015–5019 (1992); Andrews, S. C. et al., FEBS Lett. 302: 247–252 (1992)) hat HMP offensichtlich die Mittel entwickelt, Bakterien vor diesen nachteiligen chemischen Reaktionen zu schützen.
Im Beispielteil hier beschriebene Untersuchungen zeigen unvorhergesehene neuartige Stoffwechselpfade und streng regulierte Entgiftungsmechanismen sowohl für SNO als auch NO mittels HMP (11B). Ein konstitutiver aerober Stoffwechselpfad, der zu Nitrit führt, nutzt mehrere Lyasen, die GSNO in NO umwandeln, und geringe Level an HMP, das die Substratumwandlung direkt katalysiert. Konstitutive anaerobe Reduktion von GSNO ist wesentlich weniger effizient und rückt die Bedeutung der Lyase-Aktivitäten in den Vordergrund. Komponenten dieser Synthesewege können entweder bei Stressreaktionen oder homöostatischen Mechanismen, einschließlich wohl bekannter NO-Funktionen, beteiligt sein. Die Bakterienzelle enthält ebenfalls NO- und SNO-reaktive Gene, die induziert werden, wenn reaktive Stickstoff Spezies eine gefährliche Schwelle überschreiten (Hausladen, A. et al., Cell 86: 719–729 (1996)). Flavohämoglobin spielt eine zentrale Rolle bei induzierbaren Stoffwechselpfaden, die für eine Entgiftung verwendbar sind: Bei den aeroben HMP-Mechanismen wird GSNO direkt zu N₂O metabolisiert und NO, das frei wird oder sonstwie gebildet ist, wird enzymatisch zu NO_x ^– oxidiert. OxyR bestimmt dann das metabolische Schicksal von Nitrit; (Hausladen, A. et al., Cell 86: 719–729 (1996)), (oder anderes beeinflusst seine Anhäufung) durch eine Steuerung derjenigen Gene, die sowohl an Reduktions- als auch Oxidationsmechanismen beteiligt sein können. Auf dem anaeroben Pfad reduziert HMP GSNO (und vielleicht NO) zu N₂O. Ein SNO-Mangel ist vor kurzem bei Asthma festgestellt worden (Gaston, B. et al., Lancet 351 (9112): 1317–1319, 1998). Dies vergrößert die Möglichkeit, dass Defekte in (S)NO-Stoffwechselpfaden zu einer Humanerkrankung beitragen können.
Wie hier beschrieben, wurde eine Untersuchung von Ascaris Hämoglobin (AH) durchgeführt. Im Verlauf dieser Untersuchung wurde festgestellt, dass Ascaris Hämoglobin enzymatisch Sauerstoff in einer Reaktion, die von NO beschleunigt wird, verbrauchen kann. Vom Mechanismus aus gesehen, ist an der Sauerstoff verbrauchenden Reaktion eine erstmals entdeckte chemische Reaktion eines Redox-Triplets aus einem Häm, Thiol und NO beteiligt. In weiteren Untersuchungen wurde festgestellt, dass ebenso Myglobin (Beispiel 3) und Flavohämoglobin den Sauerstoff verbrauch katalysieren können. Dieses Aufzeigen der Desoxygenase-Aktivität von repräsentativen Mitgliedern von drei gänzlich verschiedenen Hämoproteinklassen (d. h. Ascaris Hämoglobin, Myoglobinen und Flavohämoglobinen) zeigt, dass Desoxygenase-Aktivität ein allgemeines Kennzeichen von Hämoproteinen ist.
Diese Ergebnisse zeigen das Vorhandensein zusätzlicher Reaktionswege für Sauerstoff, neben der Fixierung als Nitrat, die von NO ausgelöst sind. Eine Peroxidase- oder Oxidasereaktion ist eine denkbare Möglichkeit, da von Hämoglobinen bekannt ist, dass sie Peroxidase/Oxidasefunktionen ausüben, die von NO-verwandten Spezies katalysiert werden können (Landino, L. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 15069–15074 (1996); Lissi, E., Free Radical Biol. & Med., 24(9): 1535–1536 (1998); Maccarrone, M., et al., FEBS Lett., 410: 470–476 (1997)). Es ist bekannt, dass weitere Redox-Cofaktoren, wie beispielsweise E19 Thiol in AH, dieses chemische Verhalten in Hämoglobinen unterstützen (Balagopalakrishna, C., et al., Biochem., 37: 13194–13202 (1998) (Gleichung (1) und (2)). Alternativ kann der Sauerstoffverbrauch der P450-ähnlichen Aktivität von Hämoglobin zugeschrieben werden. AH (FeIII)O₂ ^– + (cys)S^– + 2H⁺ ⇆ AH(FeIII)O₂H₂ + 'S(cys) (1) AH(FeIII)O₂H₂ + 'S(cys) + 2e^– + 2H⁺ ⇆ AH(FeIII) + 'S(cys) + 2H₂O (2)
Aus den hier beschriebenen Daten wurde ein Modell für den Verbrauch von O₂ und NO durch AH entwickelt, das hier als Erläuterung angeführt ist und nicht als Einschränkung anzusehen ist. Die distale Tasche von AH enthält eine starke Vernetzung aus Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Sauerstoff Liganden, B10 Tyrosin und E7 Glutamin (Yang, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4224–4228 (1995); Peterson; E. S. et al., Biochem., 36(42): 13110–13121 (1997)). Der gebundene Sauerstoffbesitzt einen starken Superoxid-Charakter (Beispiel 1, Gleichung (5)), der für die Stabilität eine Wasserstoffbrückenbindung benötigt, wie es durch die hohe Autooxidationsrate von Mutanten gezeigt wurde, wo B10 Tyrosin gegen Phenylalanin oder Leucin ausgetauscht war (De Baere, I., ., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1594–1597 (1994); Kloek, A. P., et al., J. Biol. Chem., 269: 2377–2379 (1994)). Die Überprüfung der Autooxidation von humanem Hämoglobin führte zu dem Vorschlag, dass eine Oxidation über eine Protonenstaffette unter Beteiligung des distalen Histidin-Restes erfolgt (Balagopalakrishna, C., et al., Biochem., 35: 6393– 6398 (1996)). In AH hat das distale Glutamin und Tyrosin einen hohen pK_s, folglich erfolgt keine Protonierung bei physiologischem pH-Wert. AH-gebundenes Superoxid ist deshalb unter den meisten Bedingungen stabil. Allerdings diffundiert NO sehr gut und vermag in die distale Tasche einzudringen und führt zur Bildung einer Häm-Oxidation und Nitrat (Beispiel 1, Gleichung (6)).
Sobald Ascaris Methämoglobin gebildet ist, bindet es wirksam NO (Beispiel 1, Gleichung (7)); das Vorhandensein eines distalen Glutamins beschleunigt die Reaktion. Photolyse-Chemilumineszenz und Stopped-Flow-Analysen lassen vermuten, dass das AH(FeIII)NO Intermediat im Gleichgewicht mit SNO(E15cys) vorliegt (Beispiel 1, Gleichung (8)). Diese Schlussfolgerung wird auch dadurch gestützt, dass S-Nitrosocystein in der Lage ist, Häme in nativem AH zu oxidieren, aber nicht in E15 Cystein-Mangelmutanten. Sauerstoff bindet dann an Eisen(II)Häm von SNO-haltigen Molekülen (Beispiel 1, Gleichung (9)), die einen nicht stabilen Peroxynitrosyl-Komplex innerhalb der distalen Tasche bilden können, der zur Bildung von Nitrat zerfällt (Beispiel 1, Gleichung (10) – (13)). Eine Beteiligung der (Thiyl) Radikal-Chemie (Gleichung (10)) stimmt mit einer Peroxidase-Funktion überein (Landino, L. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 15069–15074 (1996); Lissi, E., Free Radical Biol. & Med., 24(9): 1535–1536 (1998); Maccarrone, M., et al., FEBS Lett., 410: 470–476 (1997)), aber es können auch alternative Reaktionsschemas angeführt werden. Darüber hinaus haben Balagopalakrishna et al. vor kurzem eine Thiyl-Radikal induzierte Peroxid (Fe(III)Häm-Komplex) Bildung in Säuger-Hämoglobin gezeigt. (Balagopalakrishna, C., et al., Biochem., 37: 13194–13202 (1998)). Es ist nicht klar, welche NO-verwandte Spezies AH für einen O₂ Metabolismus startet; allerdings ist das Peroxynitrosyl-Intermediat ein ausgezeichneter Katalyse-Kandidat. Weil es als Substrat für derartige Hämoproteine dient, ist bekannt, dass Peroxynitrit die Peroxydase-Aktivität aktiviert. (Landino, L. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 15069–15074 (1996)). Trotz dieser Mechanismus-Probleme zeigen die hier beschriebenen Daten eindeutig, dass Ascaris Hämoglobin NO und Sauerstoff in NADPH-abhängiger Weise verbraucht. Erwachsener Ascaris suum metabolisiert anaerob (Komuniecki, P. R., et al., Exp. Parasitol., 76: 424–437 (1993)) und es wird vermutet, dass freier Sauerstoff für ihn hoch toxisch ist (Blaxter, M. L., Parasitol. Today, 9: 353–360 (1993)). Folglich ist Ascaris Hämoglobin eine Stickstoffinonoxidaktivierte Desoxygenase, die endogen gebildetes NO als ein Cosubstrat für die Sauerstoffentgiftung nutzen kann.
Im Hämoglobin-Stammbaum befinden sich die Nematoden an der Gabelung zwischen den ursprünglichen bakteriellen Flavohämoglobinen, von denen vor kurzen entdeckt worden ist, dass sie bei der NO-Entgiftung eine Funktion besitzen (Crawford, M. J., and Goldberg, D. E., J. Biol. Chem. 273: 12543–12547 (1988); Hausladen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14100–14105 (1998)), und den cooperativen Säuger-Hämoglobinen, von denen vor kurzem entdeckt worden ist, dass sie eine Funktion in der NO-Versorgung besitzen (Gow, A. J. & Stamler, et al., Nature, 391: 169–173 (1998); Jia, L., et al., Nature, 380: 221–226 (1996); Stamler, et al., Science 276: 2034–2037 (1997)). Eine NAD(P)H-abhängige Reduktase-Aktivität unterstützt den NO-Metabolismus in Bakterien, wohingegen kritische Thiole die NO-Donorfunktion unterstützen, die die O₂-Versorgung in Säugern reguliert. Ascaris Hämoglobin scheint eine „evolutionäre Brücke" darzustellen, es behält eine primitive Reduktase-Funktion bei, aber eine die zur Steuerung der Sauerstoffspannung analog der Atmungsfunktion von Säuger-Hämoglobinen entwickelt ist. Darüber hinaus steuert es diesen Effekt durch die Nutzung von NO, wiederum analog zu Säuger-Hämoglobinen, die Thiole in die Häm-Tasche eingebaut haben, um die NO-Bioaktivität zu konservieren (Gow, A. J. & Stamler, et al., Nature, 391: 169–173 (1998); Jia, L., et al., Nature, 380: 221–226 (1996); Stamler, et al., Science 276: 2034– 2037 (1997)). Die Positionierung eines Thiols in der distalen Tasche von AH im Gegensatz zur proximalen Tasche von Säuger-Hämoglobin ermöglicht die alternativen NO-verbundenen Funktionen von Desoxygenierung beziehungsweise Oxygenierung. Mit anderen Worten, Hämoglobine haben eine ursprüngliche NO-Metabolismusfunktion in eine respiratorische Funktion durch Einbau von Thiolen transformiert, die die Nutzung von NO ermöglichen (4). Obwohl die primäre Funktion von AH die Entfernung von Sauerstoff im Nematoden zu sein scheint, kann AH ebenfalls große Mengen an NO entgiften, das von angeborenen Wirtsabwehrsystemen gebildet ist, was an bakterielle Flavohämoglobine erinnert, die NO zu Nitrat metabolisieren (Hausladen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14100–14105 (1998)).
Die hier beschriebene Untersuchung von Ascaris Hämoglobin hat eine neuartige NO-Chemie unter Beteiligung der Enzymaktivität einer Häm-, Thiol-, NO-Redox-Triade zu Tage gefördert. Des weiteren ist die bislang unbekannte Funktion von Ascaris Hämoglobin, nämlich die Sauerstoff Entgiftung, genau beschrieben worden. Die Identifizierung einer einzigartigen Strukturanpassung von Ascaris Hämoglobin, die vor 1500 Millionen Jahren geschah, schafft ein neues Paradigma, wo Hämoglobine verschiedene NO-verbundene Funktionen entwickelt haben.
Die Erfindung betrifft Hämoproteine und die Desoxygenase-Aktivität von Hämoproteinen. Ein Aspekt der Erfindung betrifft das Hämoglobin von Nematoden der Gattung Ascaris und betrifft die Verwendung des Hämoglobins zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Säugern, die mit Ascaris sp. infiziert sind.
Freier Sauerstoff ist für Ascaris sp. toxisch und, wie hier beschrieben, fungiert AH als eine NO-aktivierte Desoxygenase zur Sauerstoff-Entgiftung. Folglich kann die Verabreichung eines Mittels, das die NO-Produktion hemmt (vermindert oder verhindert) wie beispielsweise ein geeigneter NO-Synthase-Inhibitor, zur Hemmung der Desoxygenase-Aktivität von AH führen. Folglich kann die Konzentration an freiem Sauerstoff auf für Ascaris toxische Mengen ansteigen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Hämoglobins zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugers, der mit einem Mikroorganismus oder Parasiten infiziert ist, in dem Hämoglobin zur Regulation der Sauerstoff spannung Verwendung findet. In einer Anwendungsform wird die Erfindung zur Behandlung eines Säugers angewandt, der mit einem Nematoden der Gattung Ascaris infiziert ist. Die Anwendung umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Inhibitors der NO-Synthase an den infizierten Säuger. Der Säuger kann mit einer beliebigen Spezies der Gattung Ascaris wie beispielsweise Ascaris lumbricoides oder Ascaris suum infiziert sein.
NO-Synthase-Inhibitoren, die für eine Verwendung bei den Anwendungen der Erfindung geeignet sind, können eine Ascaris NO-Synthase, eine Säuger NO-Synthase (z. B. NO-Synthase von Endothelzellen, induzierbare NO-Synthase, neuronale NO-Synthase) oder eine Kombination davon sein. Mehrere Verbindungen, die NO-Synthase hemmen können, sind in der Technik bekannt, wie beispielsweise Inhibitoren der L-Arginin-Aufnahme- (z. B. L-Lysin, L-Ornithin, Canavanin, Homoarginin), Arginase, NG-Nitro-L-arginin, L-Nitroargininmethylester, N-Monomethyl-L-arginin, 2-Ethyl-2-thio-pseudoharnstoff, L-N6-(1-Lninoethyl)lysin, Aminoguanidin, 7-Nitroindazol und ähnliche. Weitere Verbindungen, die eine NO-Synthase hemmen können, können unter Anwendung geeigneter Verfahren identifiziert werden, wie beispielsweise die in U.S. Patenten, Nr. 5.883.251 und 5.874.472, beschriebenen Verfahren, deren gesamte Inhalte hier durch Quellenangabe als eingefügt gelten. NO-Synthase-Inhibitoren können zum Beispiel durch Durchmusterung von Bibliotheken oder Sammlungen von Molekülen wie beispielsweise das „Chemical Repository of the National Cancer Institute" identifiziert werden. Auf diese Weise identifizierte Inhibitoren können zur Behandlung eines mit Ascaris sp. infizierten Säugers verwendet sein.
Eine weitere Quelle von Verbindungen, die NO-Synthase hemmen können, sind kombinatorische Bibliotheken, die viele strukturverschiedene Molekül-Spezies enthalten können. Kombinatorische Bibliotheken können zur Identifizierung von Führungsverbindungen oder zur Optimierung einer zuvor identifizierten Führungsverbindung verwendet sein. Derartige Bibliotheken können mit bekannten Verfahren der kombinatorischen Chemie hergestellt sein und mit geeigneten Verfahren durchmustert werden.
Die Wahl des speziellen NO-Synthase-Inhibitors hängt von einer Reihe an Faktoren ab, einschließlich der infizierenden Spezies und des Alters, Geschlechts, Gewichts, der Arzneimitteltoleranz und des allgemeinen Gesundheitszustands des Säugers. Der erfahrene Praktiker vermag den geeignetesten NO-Synthase-Inhibitor für eine Verabreichung auf Basis dieser und weiterer Betrachtungen zu wählen. In einem Beispiel kann eine 50 Jahre alte männliche mit Ascaris sp. infizierte Person, die über eine gastrointestinale Verstimmung klagt, mit L-Monomethylarginin mit einer Dosis von 0,1 mg/kg pro Tag drei Wochen lang behandelt werden.
Gemäß der Verfahren der Erfindung kann ein oder mehrere NO-Synthase-Inhibitoren an den Säuger allein oder mit anderen Therapiemitteln wie beispielsweise Antinematoden-Mittel (z. B. Mebendazol, Ivermectin) über einen geeigneten Pfad verabreicht sein. Es wird eine therapeutisch wirksame Menge verabreicht. Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine zur Erzielung des gewünschten therapeutischen Effekts oder prophylaktischen Effekts hinreichende Menge unter den Verabreichungsbedingungen wie beispielsweise eine Menge, die hinreichend ist, die Lebensfähigkeit von Ascaris zu vermindern oder die Aktivität der NO-Synthase zu hemmen. Der NO-Synthase-Inhibitor und ein beliebiges weiteres Mittel (z. B. Antinematoden-Mittel) können in einer einzigen oder in mehreren Dosen verabreicht sein. Die Dosierung kann mit Hilfe in der Technik bekannter Verfahren ermittelt sein und ist abhängig zum Beispiel von dem speziellen Hämoprotein und weiteren gewählten Mitteln, des Alters, der Medikamentempfindlichkeit und -toleranz und des Gesamtwohlbefindens des Säugers.
Verschiedene Verabreichungspfade sind möglich, einschließlich zum Beispiel orale, nahrungsgebundene, topikale, transdermale, rektale, parenterale (z. B. intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre, intrathekale, intracerebrale, subkutane Injektion, intradermale Injektion) und Inhalation (z. B. intrabronchiale, intranasale oder orale Inhalation, Intranasaltropfen) Verabreichungspfade in Abhängigkeit des NO-Synthase-Inhibitors und der zu behandelnden Krankheit oder Zustands. Eine Verabreichung kann lokal oder systemisch, wie es indiziert ist, erfolgen. Die bevorzugte Verabreichungsart kann vom gewählten speziellen NO-Synthase-Inhibitor abhängig sein: allerdings ist im Allgemeinen die orale oder parenterale Verbreichung bevorzugt.
Der NO-Synthase-Inhibitor kann dem Säuger als Teil einer Zusammensetzung, umfassend einen NO-Synthase-Inhibitor und einen pharmazeutisch oder physiologisch verträglichen Träger, verabreicht sein. Die Formulierung (z. B. Lösung, Emulsion, Kapsel) variiert entsprechend des ausgewählten Verabreichungspfades. Geeignete physiologische Träger können inerte Bestandteile enthalten, die nicht mit dem NO-Synthase-Inhibitor wechselwirken. Pharmazeutische Formulierungsstandardtechniken können eingesetzt sein, die beispielsweise in Reminton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, beschrieben sind. Geeignete physiologische Träger für eine parenterale Verabreichung umfassen zum Beispiel steriles Wasser, physiologische Saline, bakteriostatische Saline (Saline, die etwa 0,9% mg/ml Benzylalkohol enthalt), Phosphat-gepufferte Saline, Hanks Lösung, Ringers-Lactat und ähnliches. Verfahren zum Einkapseln von Zusammensetzungen (wie beispielsweise in einer Beschichtung aus fester Gelatine oder Cyclodextran) sind in der Technik bekannt (Baker, et al., „Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986). Zur Inhalation kann das Mittel solubilisiert und in einer geeigneten Abgabevorrichtung zur Verabreichung (z. B. Zerstäuber, Vernebler oder Aerosolverteiler) verbracht werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft therapeutische Anwendungen, worin ein Hämoprotein (z. B. Globin, Cytochrom) mit Desoxygenase-Aktivität und NO-Verbrauchsaktivität an einen Säuger verabreicht ist.
Alle Hämoproteine besitzen bis zu einem gewissen Umfang ein chemisches Redox-Vermögen, während aber Cytochrome als Oxidasen/Reduktasen wohl bekannt sind, wurde allerdings von den Globinen (z. B. Hämoglobine, Myoglobine) vermutet, dass sie prinzipiell der Sauerstoffversorgung dienen. Alle Redox-Reaktionen, die in Globine enthaltenden Reaktionssystemen festgestellt werden können, sind generell als triviale Nebenreaktionen betrachtet worden. Wie hier beschrieben, können Globine als Enzyme fungieren, die Redox-Reaktionen (z. B. NO-aktivierte Desoxygenierung) katalysieren, wenn geeignete Substrate und/oder Cofaktoren (z. B. NO, NADH, NADPH) in geeigneten Konzentrationen vorliegen. In der Tat ist die Hauptfunktion mancher Globine die Redox-Chemie. Zum Beispiel kann eine Flavohämoglobin-katalysierte Desoxygenierung Bakterien vor toxischen Wirkungen von NO schützen und AH-katalysierte Desoxygenierung kann Ascaris vor toxischen Mengen von O₂ schützen, wie es hier beschrieben ist. Darüber hinaus haben Untersuchungen gezeigt, dass Myoglobin nicht erforderlich ist, die Stoffwechsel erfordernisse bei körperlicher Bewegung oder Trächtigkeit von Mäusen zu erfüllen (Garry, D. J., Nature 395: 905–908 (1988)), was darauf hindeutet, dass die Primärfunktion von Myoglobin die Regulation der Sauerstoffspannung sein kann.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „NO-aktivierte Desoxygenase-Aktivität" auf eine Enzymaktivität (d. h. eine katalytische Aktivität), die eine Sauerstoff (O₂) verbrauchende chemische Reaktion mit einem gegebenen Reduktionsmittel fördert, worin die katalytische Rate (z. B. die Sauerstoffverbrauchsrate) erhöht ist, wenn NO im Reaktionssystem vorhanden ist. Zum Beispiel kann in Abwesenheit von NO die Sauerstoff verbrauchende Reaktion durch ein Protein mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität langsam voranschreiten, so dass der Verbrauch eines Reaktanten (z. B. Sauerstoff, NO) und/oder die Anhäufung eines Produkts relativ gering ist. Wenn NO in das Reaktionssystem gelangt, kann allerdings eine höhere Verbrauchsrate des Reaktanten (z. B. Sauerstoff, NO) und/oder Produktanhäufung unter Anwendung geeigneter Verfahren, wie beispielsweise die hier beschriebenen Verfahren, gemessen werden.
Das Hämoprotein kann ein natürlich vorkommendes Protein, das Desoxygenase-Aktivität besitzt (die NO-aktiviert sein kann), eine aktive Variante davon oder ein enzymatisch aktives Fragment eines natürlich vorkommenden Enzyms oder aktiver Variante davon sein. Ein variantes Hämoprotein unterscheidet sich typischerweise in der Aminosäure-Sequenz von einem anderen Referenz-Hämoprotein. Im Allgemeinen sind die Unterschiede begrenzt, so dass die Sequenzen des Referenz-Polypeptids und der Variante insgesamt sehr ähnlich und in vielen Regionen identisch sind. Ein variantes Hämoprotein und ein Referenz-Hämoprotein können sich in der Aminosäure-Sequenz durch eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, Additionen, Deletionen, Verkürzungen, Fusionen oder beliebigen Kombinationen davon unterscheiden. Variante Hämoproteine umfassen natürlich vorkommende Varianten (z. B. Allel-Formen) und Varianten, von denen nicht bekannt ist, dass sie natürlicherweise vorkommen. Nicht natürlich vorkommende variante Hämoproteine können unter Anwendung geeigneter Verfahren hergestellt sein, zum Beispiel durch direkte Synthese, Mutagenese (z. B. Punktmutagenese, Scanning-Mutagenese) und anderen Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie. Hämoproteine und Varianten davon, die eine Desoxygenase-Aktivität besitzen, können unter Anwendung geeigneter Tests wie beispielsweise hier die beschriebenen Sauerstoffverbrauchs- und NO-Metabolismustests identifiziert werden. Vorzugsweise ist das Hämoprotein ein Globin oder aktive Variante davon. Bevorzugter ist das Hämoprotein AH, ein Myoglobin (z. B. vom Menschen, Pferd), ein Flavohämoglobin (z. B. Escherichia toll, Salmonella sp., Mycobacterium tuberculosis) oder eine aktive Variante irgendeines der vorhergehenden.
Das zu verabreichende Hämoprotein kann unter Anwendung geeigneter Verfahren hergestellt sein. Zum Beispiel kann das Hämoprotein aus Zellen erhalten werden, in denen (z. B. Bakterien, Hefe, Reticulocyten, rekombinante Zellen) es produziert wird, unter Anwendung herkömmlicher Verfahren (z. B. Homogenisierung, Fällung, differentielle Zentrifugation, Chromatographie, präparative Elektrophorese). In einer Anwendungsform ist das Hämoprotein aus Zellen isoliert, in denen es natürlicherweise gebildet wird. Der Ausdruck „isoliert", wie hier verwendet, weist darauf hin, dass das Hämoprotein in einem physikalischen Milieu vorliegt, das sich von dem unterscheidet, in dem es natürlicherweise vorkommt. Zum Beispiel kann das isolierte Hämoprotein hinsichtlich des komplexen zellulären Milieus, in dem es natürlicherweise vorkommt, stofflich isoliert sein, und kann bis zur Homogenität besonders gereinigt sein, zum Beispiel wie mittels analytischer Elektrophorese oder Chromatographie (z. B. HPLC) bestimmt.
In einer Anwendungsform beinhaltet die Anwendung der Erfindung eine enzymatische Konzentrationsverringerung von Sauerstoff, Stickstoffinonoxid oder einer Kombination davon in einem Säuger. Die Anwendung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Hämoproteins mit Desoxygenase-Aktivität an einen Säuger, der einer derartigen Therapie bedarf. Ein Hämoprotein kann einzeln oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Hämoproteinen oder anderen therapeutischen Mitteln verabreicht sein.
In einer anderen Anwendungsform ist die Erfindung zur Behandlung eines Säugers mit einer Erkrankung angewandt, die durch pathologisch proliferierende Zellen gekennzeichnet ist. Die Erfindung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Hämoproteins mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität an einen Säuger, der einer derartigen Therapie bedarf. Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck „pathologisch proliferierende Zellen" Zellen, die zu einem pathologischen Zustand als ein Ergebnis der Proliferation beitragen. Eine „pathologisch prolifierierende Zelle" kann kanzerös oder nicht kanzerös sein und kann zu der Krankheitsentstehung, zum Beispiel von Tumoren, Prostatahypertrophie, Psorias und Restenose, beitragen.
In weiteren Anwendungsformen findet die Erfindung zur Behandlung (durch Verringerung der Größe oder Verlangsamung oder Verhinderung des Wachstums) von Tumoren Verwendung, wie beispielsweise die bei Erkrankungen vorkommen, die gemeinhin als Krebs bezeichnet sind (z. B. Sarkom, Carcinom, Adenom, Lymphom, Leukämie). In einer Anwendungsform umfasst die Erfindung Desoxygenierung eines Tumors, umfassend Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Hämoproteins mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität an einen Säuger mit einem Tumor. Der Ausdruck „Desoxygenieren", wie hier verwendet, bezeichnet eine Enzym-katalysierte Verringerung der Sauerstoffspannung, um einen Hypoxie-Bereich zu schaffen. Die Desoxygenierung von Tumoren kann zu einer verringerten Proliferation von Tumorzellen führen und kann die Wirksamkeit bestimmter Therapien erhöhen oder die Zellen dafür sensibilisieren. Zum Beispiel kann die Desoxygenierung von Tumoren die Wirksamkeit bestimmter cytotoxischer Mittel erhöhen, wie beispielsweise die Klasse Hypoxie-aktivierter Cytotoxine, die allgemein als biologisch reduzierende cytotoxische Mittel bezeichnet werden. Das Hämoprotein mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität kann an einen Säuger vor, nach oder gleichzeitig mit einem biologisch reduzierenden cytotoxischen Mittel oder einer anderen Therapie verabreicht sein.
Im Allgemeinen sind biologisch reduzierende cytotoxische Mittel wie beispielsweise nitroaromatische Verbindungen (z. B. 2-Nitroimidazole (z. B. Misonidazol, Etanidazol), 1,2,4-Benzotriazindioxide (z. B. Tyrapazamin), Chinone (z. B. Mitomycin C) als inaktive Prodrugs verabreicht, die, wenn sie unter hypoxischen Bedingungen metabolisiert sind, cytotoxisch werden. Folglich können diese Mittel zum bevorzugten Abtöten von Zellen in Hypoxie-Bereichen verwendet sein. Folglich umfasst in einer anderen Anwendungsform die Erfindung eine Verstärkung der cytotoxischen Aktivität eines cytotoxischen Mittels (z. B. ein biologisch reduzierendes Mittel), umfassend Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines oder mehrerer Hämoproteine mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität und einer therapeutisch wirksamen Menge eines oder mehrerer cytotoxischer Mittel an einen Säuger mit einem oder mehreren Tumoren. In einer noch anderen Anwendungsform kann die Erfindung in einer Antitumor- Therapie angewandt sein, umfassend Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Hämoproteins mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität und einer therapeutisch wirksamen Menge eines cytotoxischen Mittels (z. B. ein biologisch reduzierendes Mittel) an einen Säuger mit einem Tumor. Siehe zum Beispiel Kelson, A. B. et al., Anticancer Drug Design 13: 575–592 (1998); Rauth, A. M. et al., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 42: 755–762 (1998), hinsichtlich biologisch reduzierender Mittel. In einem Erfindungsbeispiel kann ein Mann mit einem Tumor, der sich nicht nach Behandlung mit einer Standardchemotherapie zurückbildete, mit einer Standarddosis eines Chemotherapeutikums zusammen mit einem Hämoprotein mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität mit einer Dosis von 0,1 mg/kg, die in einer Stunde infundiert wird, behandelt werden.
Die hier und in Hausladen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14100– 14105 (1998) beschriebenen katalytischen Reaktionen (Gleichungen 1, 2, 5–13 und Gleichungen 14–17) umfassen die Bildung von reaktiven Sauerstoff Spezies (z. B. Superoxid, Wasserstoffperoxid) als Zwischenprodukte. Unter bestimmten Bedingungen können sich derartige Sauerstoff Spezies anhäufen. Zum Beispiel, wenn wenig oder kein Stickstoffinonoxid und eine große Menge eines Reduktionsmittels (z. B. etwa 5 mM oder mehr) vorhanden ist, können Superoxid und/oder Wasserstoff peroxid vorzugsweise von AH, Myoglobinen und Flavohämoglobinen gebildet werden. Eine Darstellung eines möglichen Mechanismus am Häm-Eisen, mit dem Flavohämoglobine reaktive Sauerstoff Spezies bilden können, ist als Gleichungen (3), (3a), (3b) und (4) dargestellt. Fe(III) + NADH → Fe(II) + NAD⁺ (3) Fe(II) + O₂ → Fe(II)O₂ (3a) Fe(II)O₂ → Fe(III)O₂ ^– (3b) Fe(II)O₂ → Fe(III) + O₂ ^– (4)
Wie in Beispiel 3, Gleichungen (14)–(17) gezeigt, ist die Chemie des O₂-Verbrauchs relativ komplex. Ein Mechanismus, mit dem Myoglobine eine reaktive Sauerstoff Spezies bilden können, umfasst eine Reaktion zwischen dem in Gleichung (14) gebildeten Superoxid-Zwischenprodukt und MbFe(II)O₂, um Wasserstoff peroxid, O₂ und MbFe(III) zu bilden. Das gebildete MbFe(III) kann von NADH reduziert werden und dann O₂ binden und mit einem weiteren Superoxid-Anion reagieren. NO kann die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies von Myoglobin in Abhängigkeit der Reaktionsbedingungen unterschiedlich beeinflussen. Zum Beispiel beschleunigt NO die Reaktion, wenn eine geringe Konzentration (z. B. etwa 100 μM oder weniger) an Reduktionsmittel eingesetzt ist und NO hemmt die Reaktion, wenn eine hohe Konzentration (z. B. etwa 5 mM oder mehr) an Reduktionsmittel eingesetzt ist.
In einer anderen Anwendungsform umfasst die Erfindung eine enzymatische Bildung toxischer reaktiver Sauerstoff Spezies (z. B. Wasserstoffperoxid, Superoxid) für therapeutische Zwecke, z. B. zur Behandlung einer Erkrankung, die durch pathologisch proliferierende Zellen gekennzeichnet ist. Die Erfindung umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Hämoproteins (z. B. Hämoprotein mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität) an einen Säuger, der einer derartigen Therapie bedarf., In einer Anwendungsform umfasst die Erfindung außerdem die Verabreichung eines Reduktionsmittels. In einem Beispiel sind Flavohämoglobin und NADH lokal verabreicht, um einen mit toxischen reaktiven Sauerstoff Spezies angereicherten Bereich aufgrund ihrer Bildung herzustellen. In einem anderen Beispiel ist AH systemisch verabreicht und NADH ist mittels Injektion in einen Tumor lokal verabreicht. In diesem Beispiel kann der Tumor mit toxischen reaktiven Sauerstoff-Spezies aufgrund ihrer Bildung angereichert werden. Weitere Therapiemittel oder -verfahren können auf den mit toxischen reaktiven Sauerstoff-Spezies angereicherten Bereich ausgerichtet sein und zu einer besseren Therapie führen. Zum Beispiel können cytotoxische Mittel mit einem Wirkungsmechanismus, der die Bildung von toxischen reaktiven Sauerstoff Spezies wie beispielsweise Anthracyclin-Derivate (z. B. Adriamycin) umfasst, verabreicht sein. Falls erwünscht, können cytotoxische Mittel oder weitere therapeutische Mittel auf den Tumor durch Einkapselung dieser Mittel in Liposomen, gegebenenfalls mit einem Reduktionsmittel wie beispielsweise NADPH, gerichtet sein. Zusätzlich kann der durch eine enzymatische Reaktion mit reaktiven Sauerstoff-Spezies angereicherte Bereich bestrahlt werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, umfassend ein Hämoprotein mit Desoxygenase-Aktivität (z. B. AH, ein Myoglobin, ein Flavohämoglobin) oder ein aktives Fragment davon und einen physiologisch verträglichen Träger. Die Zusammensetzung kann außerdem ein cytotoxisches Mittel (z. B. ein Antitumor-Mittel), ein Reduktionsmittel (z. B. ein biologisches Reduktionsmittel) und/oder einen NO-Donor als eine NO-Quelle wie hier beschrieben umfassen. In einer bevorzugten Anwendungsform ist das cytotoxische Mittel ein biologisch reduzierendes cytotoxisches Mittel.
Gemäß der Erfindung können ein oder mehrere Hämoproteine und/oder weitere therapeutische Mittel (z. B. NO-Synthase-Inhibitor, cytotoxisches Mittel) an den Säuger über einen geeigneten Pfad verabreicht sein. Eine therapeutisch wirksame Menge eines Hämoproteins und/oder weiteres Mittel wird verabreicht. Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge, die hinreichend ist, die gewünschte therapeutische oder prophylaktische Wirkung unter den Verabreichungsbedingungen zu erzielen, wie beispielsweise eine Menge, die hinreichend ist, die Sauerstoff-Konzentration zu verringern (z. B. Desoxygenierung), die Stickstoffmonoxid-Konzentration zu verringern, die Aktivität von NO-Synthase zu hemmen, die cytotoxische Aktivität eines cytotoxischen Mittels zu verstärken, einen mit toxischen reaktiven Sauerstoff Spezies angereicherten Bereich zu bilden, die Proliferationsrate von Tumorzellen zu senken oder Tumorzellen abzutöten. Das zu verabreichende Hämoprotein und ein beliebiges weiteres Mittel (z. B. cytotoxisches Arzneimittel) kann in einer einzigen Dosis oder in mehreren Dosen verabreicht sein. Die Dosierung kann mit Hilfe in der Technik bekannter Verfahren bestimmt sein und ist zum Beispiel von dem speziellen Hämoprotein und weiteren gewählten Mitteln, der Art der Erkrankung (z. B. Tumortyp), dem Alter, der Medikamentempfindlichkeit und – toleranz und dem allgemeinem Wohlbefinden des Säugers abhängig.
Wie hier beschrieben, kann die Desoxygenase-Aktivität von Hämoproteinen durch Reduktionsmittel verstärkt sein wie beispielsweise von biologischen Reduktionsmitteln (z. B. NADH, NADPH, Biopterin, Flavinen und Thiolen wie beispielsweise N-Acetylcystein oder anderen Reduktionsmitteln, die in Zellen vorhanden sind). Folglich kann ein Reduktionsmittel zusammen mit einem Hämoprotein oder mit einem Hämoprotein und einem weiteren Mittel in Übereinstimmung mit den therapeutischen Verfahren der Erfindung verabreicht sein. In einem Beispiel ist N-Acetylcystein (100 mg/kg) zusammen mit AH (1 mg/kg) verabreicht.
Es sind verschiedene Verabreichungspfade möglich, einschließlich zum Beispiel orale, nahrungsgebundene, topikale, transdermale, rektale, parenterale (z. B. intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre, intrathekale, intracerebrale, subkutane Injektion, intradermale Injektion) und Inhalation (z. B. intrabronchiale, intranasale oder orale Inhalation, Intranasaltropfen) Verabreichungspfade in Abhängigkeit des Hämoproteins und/oder Mittels und der zu behandelnden Krankheit oder Zustands. Verabreichung kann lokal oder systemisch, wie es indiziert ist, erfolgen. Die bevorzugte Verabreichungsart kannabhängig vom gewählten speziellen Hämoprotein und/oder Mittel und dem bestimmten zu behandelnden Zustand (z. B. Krankheit) verschieden sein, allerdings ist im Allgemeinen die orale oder parenterale Verbreichung bevorzugt.
Das Hämoprotein und beliebige zusätzliche therapeutische Mittel können als ein neutrales Präparat oder als ein physiologisch verträgliches Salz verabreicht sein. Salze von Verbindungen, die ein Amin oder andere basische Gruppe enthalten, können zum Beispiel durch Reaktion mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure wie beispielsweise Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff, Essigsäure, Perchlorsäure und ähnliches erhalten sein. Verbindungen mit quartären Ammoniumgruppen enthalten ebenfalls ein Gegenion wie beispielsweise Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Perchlorat und ähnliche. Salze von Verbindungen, die eine Carboxylsäure oder andere saure funktionelle Gruppe enthalten, können durch Reaktion mit einer geeigneten Base zum Beispiel einer Hydroxid-Base hergestellt sein. Salze von sauren funktionellen Gruppen enthalten ein Gegenkation wie beispielsweise Natrium, Kalium oder ähnliches.
Das Hämoprotein und/oder Mittel kann an einen Säuger als Teil einer Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes Hämoprotein und einen pharmazeutisch oder physiologisch verträglichen Träger, verabreicht sein. Eine Formulierung (z. B. Lösung, Emulsion, Kapsel) variiert entsprechend des ausgewählten Verabreichungspfades. Geeignete physiologische Träger können inerte Bestandteile enthalten, die nicht mit dem Hämoprotein und/oder Mittel wechselwirken. Pharmazeutische Formulierungsstandardtechniken können angewandt sein, die beispielsweise in Reminton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, beschrieben sind. Geeignete physiologische Träger für eine parenterale Verabreichung umfassen zum Beispiel steriles Wasser, physiologische Saline, bakteriostatische Saline (Saline, die etwa 0,9% mg/ml Benzylalkohol enthält), Phosphat-gepufferte Saline, Hanks Lösung, Ringers-Lactat und ähnliches. Verfahren zum Einkapseln von Zusammensetzungen (wie beispielsweise in einer Beschichtung aus fester Gelatine oder Cyclodextran) sind in der Technik bekannt (Baker, et al., „Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986). Für eine Inhalation kann das Mittel solubilisiert und in einer geeigneten Abgabevorrichtung zur Verabreichung (z. B. Zerstäuber, Vernebler oder Aerosolverteiler) verbracht werden. Zusätzlich kann das Hämoprotein in Liposomen oder Micellen, gegebenenfalls mit einem Reduktionsmittel und/oder cytotoxischen Mittel komplexiert sein, als ein Verfahren zum bevorzugten Zielen auf Tumorzellen. Flavohämoglobin kann zum Beispiel in Kombination mit anderen Arzneimitteln verabreicht sein, oder kann in Kombination mit Flavin-Quellen wie beispielsweise NADH und/oder biologisch verträglichen Thiolen wie beispielsweise Glutathion verabreicht sein.
Darüber hinaus kann das Hämoprotein über eine in vivo Expression des rekombinanten Proteins verabreicht sein. In vivo Expression kann über eine somatische Zellexpression gemäß geeigneter Verfahren (siehe z. B. U.S. Patent, Nr. 5.399.346) bewerkstelligt sein. In dieser Anwendungsform kann eine das Protein codierende Nucleinsäure in einen retroviralen, adenoviralen oder anderen geeigneten Vektor (bevorzugt ein replikationsdefekter infektiöser Vektor) zum Überbringen eingebaut sein oder kann in eine transfizierte oder transformierte Wirtszelle eingeführt sein, die das Protein zum Überbringen exprimieren vermag. In der letzteren Anwendungsform können die Zellen (allein oder in einer Schutzvorrichtung) in einer Menge implantiert, injiziert oder anderweitig eingeführt sein, die effektiv ist, das Protein in einer therapeutisch wirksamen Menge zu exprimieren.
Die Hämoproteine mit Desoxygenase-Aktivität können zur Verringerung der Sauerstoffkonzentration in einer wässrigen Lösung mit einem pH von etwa 3 bis etwa 8 verwendet sein. Vorzugsweise für Desoxygenasen mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität umfasst die wässrige Lösung NO oder NO wird zu der Lösung entweder direkt (z. B. mittels Einleiten von NO in die Lösung) oder indirekt gegeben. NO kann zu einer Lösung indirekt mittels Zugabe eines oder mehrerer NO-Synthase-Enzyme und geeigneter Substrate (z. B. Arginin) oder eines geeigneten NO-Donors (z. B. DEANO) zu der Lösung gegeben sein. Eine Reihe geeigneter NO-Donoren sind in der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Feelisch, M. und Stamler, J. S. „Donors of Nitrogen Oxides" in : Eds., Feelisch, M. und Stamler, J. S., Methods in Nitric Oxide Research, John Wiley and Sons, Chichester, UK, Seiten 71–115 (1996)). Die wässrige Lösung kann eine Reihe gelöster Stoffe (z. B. organische Ionen, anorganische Ionen, Detergenzien) und/oder organischer Lösemittel enthalten. Die Mengen an gelösten Stoffen und/oder organischen Lösemitteln können die Desoxygenierungsgeschwindigkeit beeinflussen. Die maximale Konzentration bestimmter gelöster Stoffe und/oder organischer Lösemittel, die ein Voranschreiten der Desoxygenierung mit einer erwünschten Geschwindigkeit erlauben, können ohne weiteres unter Anwendung herkömmlicher Verfahren bestimmt werden. Folglich finden Hämoproteine mit NO-aktivierter Desoxygenase-Aktivität in der Industrie Verwendung, wo eine Verringerung der Sauerstoffkonzentration erwünscht ist.
Wie hier verwendet, umfassen „NO" und „Stickstoffmonoxid" biologisch aktive Formen Stickstoffmonoxid, die für physiologische Funktionen als verantwortlich erkannt worden sind, wie beispielsweise Relaxation der glatten Muskelzelle, Abtöten von Bakterien und Abtöten von Bakterien von weißen Blutzellen, synaptische Transmitterfunktion, Freisetzung von Adrenalin aus dem Nebennierenmark, Darmperistaltik, Regulation des Penistonus und Hemmung der Blutgerinnung. „NO" umfasst die freie Radikalform wie auch das Nitrosyl-Anion (NO^–) und Nitrosonium (NO⁺). Nitrosothiole (SNO), die durch Nitrosylierung von Thiolen gebildet werden, können als „Carrier" von NO dienen, mit dem Effekt, die kurze physiologische Halbwertzeit von NO zu verlängern. Folglich können NO-Carrier ebenfalls biologisch aktive Formen von Stickstoffmonoxid sein.
HMP als therapeutisches Mittel
Die Flavohämoglobine (HMP) können für therpeutische Zwecke eingesetzt sein. Es ist hier gezeigt, dass die enzymatische Aktivität von HMP Blutgefäße durch Abfangen von endogenem NO konstringiert, aber in Gegensatz zu Säuger-Hämoglobin, arbeitet HMP nur in Anwesenheit eines Substrats NAD(P)H und funktioniert bei sehr geringen HMP-Konzentrationen. Wie im Beispielteil unter Verwendung einer Infusion von HMP in ein Tumor-Tiermodell gezeigt, verändert HMP den Blutfluss in einem Tumor, ohne die systemischen hämodynamischen Eigenschaften (d. h. Blutdruck und Herzschlag) zu verändern.
Stickstoffmonoxid-Produktion ist mit einer Vielzahl an pathologischen Zuständen in Zusammenhang gebracht worden. Übermäßige NO-Biosynthese von Immunzellen bei Sepsis verursacht möglicherweise letale Hypotension. Diese pathophysiologische Manifestation von nitrosativem Stress hat zur Suche von wirksamen NO-Fängern geführt, die für eine Konstriktion von Blutgefäßen verabreicht werden können. Hämoglobin (Hb), das natürlicherweise diese Funktionen in Säugern erfüllt, ist ausgiebig als ein Fänger bei einem septischen Schock getestet worden. Allerdings wird oxyHb bei der Reaktion mit NO verbraucht (d. h. zu metHb oxidiert) und kann nicht leicht reduziert werden. Um wirksam zu sein, wird Hb mit relativ hohen Konzentrationen eingesetzt, das das Potential negativer Wirkungen erhöht, die mit der Verabreichung von zellfreiem Hämoglobin verbunden sind.
Auf der anderen Seite fangen Flavohämoglobine NO sehr effektiv ab (Hausladen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14100–14105 (1998); Gardner, P. R. et al., Biol. Chem. 273: 26528–26533 (1988)) und anders wie humanes Hb, erfolgt dies enzymatisch (Ioannidis, N. et al., Biochem. J. 288: 649–655 (1992); Poole, R. K. et al., Proc. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 255: 251–258 (1994)). Dies verleiht HMP das Potential, NO in therapeutischen Anwendungen bei wesentlich geringeren Konzentrationen als Hb abzufangen. Zusätzlich kann HMP durch Substrat reguliert sein, wohingegen die Aktivität von oxyHb gleichbleibend ist. Mit NO-Elektroden-Tests wurde festgestellt, dass nanomolare HMP-Konzentrationen NO in vitro effektiv eliminieren können. Die Fähigkeit von HMP, die NO-abhängige Vasorelaxation der Kaninchen-Aorta aufzuheben, ist mit einem gut etablierten Verfahren untersucht worden, in dem die von zahlreichen Mitteln induzierten Kontraktionen oder Relaxationen aufgezeichnet werden (Beispiel 5). Siehe Stamler, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 444–448 (1992).
Mit Phenylephrin (PE) vorkonstringierte Aorta-Ringe zeigen eine langsame Relakation über die Zeit. Die schnellen Relaxationen nach Zugabe von Acetylcholin (ACh) zu PE konstringierten Gefäßen stellt die klassische Vasodilatation dar, die vom endothelialen Relaxing-Faktor (EDRF) abhängig ist und von NO vermittelt ist. 12A zeigt, dass gereinigtes HMP mit Konzentrationen von kleiner als 1 nM bemerkenswerte langandauernde Vasokonstriktion in Aorta-Segmenten in Anwesenheit von NADH auslöste, während in Abwesenheit von NADH keine Konstriktion zu beobachten war. Andauernde Konstriktion, entweder spontane oder ACh induzierte Relaxationen wurden nur erhalten, wenn sowohl NADH als auch HMP vorhanden waren, was zeigte, dass HMP, wenn es in einem therapeutischen Verfahren verabreicht ist, eine NO-induzierte Hypotension zu revertieren vermag, wie sie beispielsweise bei einer Sepsis vorkommt, und das Ausmaß der Vasokonstriktion von NAD(P)H kontrolliert ist. Dies steht im Gegensatz zur Verwendung von oxyHb als ein therapeutisches Verfahren bei Sepsis, das durch Komplikationen wie Lungen-Hypertension als unerwünschte Nebenwirkung begleitet ist.
Ein anderes System ist zur Untersuchung des Blutflusses zu Tumoren etabliert worden (Dewhirst, M. W. et al., Radiat. Res. 130: 171–182 (1992); Dewhirst, M. W. et al., Cancer Res. 54: 3333–3336 (1994); Foltz, R. M. et al., Neurosurgerey 36: 976–984 (1995)), das partiell von NO abhängt. Es ist bekannt, dass Mittel, die den Blutfluss zu Tumoren verringern können, zur Verlangsamung des Tumorwachstums eingesetzt werden können, insbesondere zusammen mit einer Chemotherapie. Dieses Modell ist zur Erforschung der Verwendung von HMP als mögliches Antitumor-Mittel eingesetzt worden. 14 verdeutlicht die Anwendung dieses Modells. Humanes Hämoglobin verringert effektiv den Blutfluss zu Tumoren (13), allerdings hat humanes Hämoglobin systemische Nebenwirkungen (verursacht einen erhöhten Blutdruck) und konstringiert Blutgefäße ohne Unterschied. Im Gegensatz zu Hämoglobin ist HMP ein Enzym und kann bei geringeren Konzentrationen durch Substrat reguliert werden. Eine Selektivität kann durch lokale Verabreichung des Substrates erreicht werden. Darüber hinaus bildet HMP enzymatisch O₂ ^–, um Tumore abzutöten, sobald es NO eliminiert hat. HMP erhöht nicht den Blutdruck, sondern verringert den Blutfluss in Tumoren (14). HMP war mit 50–100 ng, systemisch infundiert, verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung einer oder mehrerer Arten einer Zusammensetzung, umfassend Flavohämoglobin, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung eines Entzündungszustandes in einem Säuger bereit. Der Entzündungszustand kann akut oder chronisch sein und kann diejenigen Entzündungszustände umfassen, die mit Immun- oder Autoimmunerkrankungen einhergehen, seien sie systemisch oder organspezifisch, oder mit Infektionen einhergehen. Spezifische Beispiele für Zustände, die in Übereinstimmung mit dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren behandelt oder verhindert sein können, umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, systemischen Lupus erythomatodes, Psorias, Lupus erythomatodes chronicus discoides, Kollagen-(Gefäß)-Krankheit, Diabetes mellitus, Myositis, Polyarteriitis, Sklerodermie, Sarkoidose, granulomatöse Läsionen wie beispielsweise hepatische Granulomatose, Darmentzündung, Thyroiditis, Multiple Sklerose, Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung, Transplantat-Abstoßung, Sepsis, akutes respiratorische Insuffizienz, Myokardinfarkt, Schlaganfall, Zirrhose, Periodontitis, Gingivitis, AIDS-Demenz, Glomerulonephritis, hämodynamische Beeinträchtigung durch Schock und Entzündung des Zentralnervensystems.
Zusammensetzungen, umfassend Flavohämoglobin, können ebenfalls zur Behandlung von Erkrankungen verabreicht sein, die mit der Dysregulation des Blutflusses verbunden sind, wie beispielsweise diabetische Retinopathie und Krebs, wo eine lokale Konstriktion von Tumoren versorgenden Blutgefäßen Tumore an Sauerstoff aushungern können.
Weitere Anwendungen für isoliertes Flavohämoglobin-Protein oder Flavohämoglobin umfassende Zusammensetzungen beinhalten die Behandlung von Krebs. Die lokale Verbreichung von Flavohämoglobin in einen Tumor oder in örtliche Nähe eines Tumors kann die Konstriktion von Blutgefäßen auslösen, die den Tumor mit Blut versorgen, wobei dadurch die den Tumor erreichenden Sauerstoff und Nährstoffmengen verringert werden. Eine weitere Anwendung einer Flavohämoglobin umfassenden Zusammensetzung ist die lokale Bildung von Superoxid und weiteren reaktiven Sauerstoff-Spezies von O₂ in Abwesenheit von NO oder biologisch wichtigen NO-Trägern wie beispielsweise S-Nitrosothiole. Superoxid ist mit funktionellen Gruppen in Biomolekülen hoch reaktiv und ein Vorläufer toxischer Sauerstoff Spezies. Lokal verabreichtes Flavohämoglobin kann dazu dienen, die Tumorzellen für Strahlen- oder Chemotherapie mit Hilfe seiner Aktivität zur Bildung von Superoxid sensibilisieren. Die lokale Verabreichung von Flavohämoglobin kann mittels Injektion mit einer Nadel oder mittels Implantation einer Vorrichtung erfolgen, die eine kontinuierliche Dosis oder mehrfache Dosen Flavohämoglobin langsam abgibt, zum Beispiel eine Infusionspumpe. Flavohämoglobin oder eine Flavohämoglobin umfassende Zusammensetzung kann allein oder zusammen mit weiteren Pharmazeutika in einer Antitumor-Therapie verabreicht sein.
Die an ein Tier oder einen Menschen im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verabreichte Dosis sollte hinreichend sein, eine prophylaktische oder therapeutische Reaktion im Tier in einem vernünftigen Zeitrahmen zu bewirken. Der Fachmann weiß, dass die bevorzugte Dosierung von einer Reihe an Faktoren abhängt, einschließlich der Aktivität der Enzym-Zusammensetzung, des Zustandes des Säugers, des Körpergewichts des Säugers, der Schwere der Entzündung und, wo die Verabreichung lokal erfolgen soll, von der zu behandelnden Stelle. Die Dosis-Höhe wird ebenfalls durch mögliche Nebenwirkungen bestimmt, die die Verabreichung des Flavohämoglobins begleiten könnten.
Geeignete Mittel zur Verabreichung eines isolierten Flavohämoglobins oder einer Flavohämoglobin umfassenden Zusammensetzung umfassen parenterale Pfade, insbesondere intravenöse Injektion. Verabreichung kann ebenfalls durch Injektion in einen lokalen Entzündungsherd, wie in ein Gelenk, oder durch Inhalation, wie für die ARDS-Behandlung, erfolgen. Eine Flavohämoglobin umfassende Zusammensetzung kann zum Beispiel mit subkutanen, intramuskulären, intravenösen, intradermalen Verfahren oder in Aerosol-Form überbracht oder verabreicht sein. Einige Beispiele der lokalen Verabreichung beinhalten eine Injektion in einen Muskel, Sehne oder Cyste. Intraartikuläre Injektion oder Injektion in ein Gelenkzwischenraum kann bei bestimmten Arthritis-Fällen bevorzugt sein.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert, die in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind.
BEISPIELE
Abkürzungen: SNO, S-Nitrosothiol; GSNO, S-Nitrosoglutathion; SNO-Cys, S-Nitrosocystein; DEANO, Diethylamin-NO; HMP, Flavohämoprotein; NOS, Stickstoffmonoxid-Synthase; SOD, Superoxiddismutase; EDRF, endothelialer Relaxing-Faktor.
Verfahren für Beispiele 1–3
Mutierte Hämoglobin-Konstrukte. Klonierung und Charakterisierung der Ascaris Hämoglobin Domäne eins (D1) und mutierter D1 mit einem Leucin anstelle von B10 Tyrosin (B10YL) sind beschrieben worden (Kloek A. P., et al., J. Biol. Chem. 268: 17669–17671 (1993)). D1 mit Serin anstatt A7 Cystein (A7CS) wurde mittels PCR hergestellt unter Verwendung von D1 cDNA als Template mit einem synthetischen Vorwärtsprimer (5'gcatccatggcgaataaaacgagagaactatccatgaaatcactcgaa 3') (SEQ ID NR.:1), der die Mutation enthält, und einem synthetischen Rückwärtsprimer für das äußerste 3' Ende des Gens, wie beschrieben (Kloek A. P., et al., J. Biol. Chem. 268: 17669–17671 (1993)). Eine zweischrittige PCR-Strategie wurde eingesetzt, um jeden der anderen zwei D1 Cystein-Reste zu Serin zu mutieren. D1 cDNA wurde als Template verwendet und synthetische Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die äußersten 5' und 3' Enden waren wie beschrieben. Die synthetischen mutierten Primer, die in dem ersten PCR-Schritt verwendet wurden, waren wie folgt: D1 mit E15 Cystein (Rest 72) zu Serin (E15CS) 5'ctcttggcaagccacgttctt 3' (SEQ ID NR.:2) mutiert und ihr Komplement; und D1 mit E19 Cystein (Rest 76) zu Serin (E19CS) 5'gcatgccacgttctttccgccacctacgatgac 3' (SEQ m NR.: 3) mutiert und ihr Komplement. Mutierte D1-Konstrukte wurden, wie beschrieben, in pET-8C kloniert (Minning, D. M., et al., J. Biol. Chem, 270: 22248– 22253 (1995)).
Hämoglobin-Expression und Reinigung. Natives Ascaris Hämoglobin (AH) wurde aus der Hämolymphe von frisch erhaltenen Ascaris suum (Carolina Biological Supply Co.) mittels Ultrazentrifugation bei 80.000 g für 16 Stunden pelletiert. Das Hämoglobin wurde weiter durch Fraktionierung auf einer Waters DEAE-5PW Anionen-Austauscher-Säule, eluiert mit einem linearen Gradienten von 50 bis 500 mM NaCl, gereinigt. Gereinigte Globine entsprachen > 95% vom Gesamt-Protein wie mittels SDS-PAGE bestimmt worden war.
Herstellung von Desoxy-, Eisen(III)- und Eisen(III)-Nitrosylhämoglobin. Natives Ascaris Desoxyhämoglobin wurde nach einer über 10 minütigen Inkubation von AH(FeII)O₂ mit Natriumdithionit erhalten. AH(FeII)O₂ (6 μM Häm-Gehalt) wurde übernacht in Gegenwart von 50 μM Kaliumhexacyanoferrat inkubiert, um Häm vollständig zu. oxidieren. Um AH(FeIII)NO zu erhalten, wurde eine Endkonzentration von 18 μM NO zu dem Cyanoferrat-oxidiertem AH gegeben. Spektren wurden mit einem Perkin Elmer UV/Vis Spektrometer, Lambda 2S aufgezeichnet. Der Häm-Gehalt wurde mit Hilfe des Pyridin-Hämochromagen-Verfahrens (Antonini, E. & Brunori, M., Frontiers in Biology, 21 (1971)) bestimmt.
Titrierung von AH mit NO. Die Konzentration von NO-gesättigten Lösungen variierte zwischen 1,2 und 1,8 mM. Die NO-Konzentration in Stammlösungen wurde mittels Titration von NO gegen Oxyhämoglobin und Beobachtung der Absoptionsänderung bei 630 nm bestimmt. Stickstoffinonoxid aus der Stammlösung wurde aufeinanderfolgend durch Injektion in einer gasdichten Hamiltonspritze mit einer Teflondichtung zu 1 ml AH (6 μM Häm-Gehalt) in Phosphat-gepufferter Saline (PBS), pH 6, in Anwesenheit oder Abwesenheit von 500 μM NADPH gegeben. Spektren wurden sofort nach jeder NO-Zugabe aufgezeichnet.
NO-Metabolismus. Es wurde eine Clark NO-Elektrode (Iso-NO, World Precision Instruments), die in einem Glasgefäß mit Rührer eingetaucht war, verwendet, um den NO-Verbrauch zu messen. NO wurde mit einer Endkonzentration von 6 μM zu AH (1,5 μM Häm-Gehalt) in PBS, pH 6, in Anwesenheit oder Abwesenheit von 500 μM NADPH gegeben. Um die Endprodukte des NO-Metabolismus zu bestimmen, wurden verschiedene Mengen des NO-Donors, Diethylamin-NO (DEANO) zu AH (1,5 μM Häm-Gehalt) mit 500 μM NADPH in PBS, pH 6, gegeben. Die Proben wurden auf Nitrit und Nitrat mittels der Greiss-Reaktion und Hochleistungskapillar-Elektrophorese (Applied Biosystems) (Hausladen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14100–14105 (1998)) untersucht.
S-Nitrosylierung von Hämoglobinen. Die Transnitrosierung von Globinen wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Jia, L., et al., Nature, 380: 221–226 (1996)). Globine wurden in Gegenwart eines 2- bis 10fachen Überschusses an S-Nitrosocystein in 10% v/v Borax, 100 μM Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), pH9, inkubiert. S-Nitroso-Gruppen (SNO) und Nitrosylhäme (Fe-NO) wurden mittels Photolyse-Chemilumineszenz in Anwesenheit oder Abwesenheit eines sechsfachen molaren Überschusses an HgCl₂ (U.S. Patent Nr. 5.891.735; Gow, A. J. & Stamler, J. S. Nature, 391: 169–173 (1998)) gemessen.
Kinetische Analyse von AH. Ein Applied Biosystems Stopped-Flow-Spektrophotometer wurde für kinetische Untersuchungen von AH eingesetzt. Spektren von 350–750 nm wurden gesammelt. AH wurde mit einer Endkonzentration von 6 μM Häm-Gehalt mit 25 μM DEANO in Anwesenheit oder Abwesenheit von 500 μM NADPH verwendet. Lösungen wurden durch 45 minütiges Durchleiten von Argon desoxygeniert. Die Daten wurden mit Hilfe der Pro-K Software für den SX.18MV analysiert.
Sauerstoffverbrauch. 2 ml PBS, pH 6, wurde in einem verschlossenen Glasgefäß verbracht, in dem sich eine Clark-Elektrode befand,. NADPH, NO oder AH konnten mittels Injektion durch eine Kapillaröffnung mit Hilfe einer gasdichten Spritze zugefügt werden. Die Daten wurden mit Hilfe eines analogen Schreibers gesammelt.
Beispiel 1: Ascaris Hämoglobin: Eine Stickstoffinonoxid-aktivierte Desoxygenase
Extinktionskoeffizienten-Spektren für verschieden mit Liganden besetzte und oxidierte Formen von AH wurden gebildet, von denen Differenzspektren abgeleitet wurden. (1A und 1B). Absorptionsdifferenz-Spektroskopie wurde dann eingesetzt, um die Reaktion von NO mit AH zu untersuchen. NO wurde gegen 6 μM AH (Häm-Gehalt) in 1,8 μM Schritten titriert. Die Zugabe von NO führte zu einer sofortigen Bildung von Methämoglobin (1C), während eine Oxidation durch Hexacyanoferrat (Davenport, H. E., Proc. R. Soc. London Ser. B, 136: 355–270 (1949)), die eine Dissoziation von gebundenen Sauerstoff Liganden erfordert, in AH über viele Minuten stattfindet. Der Peak des gebildeten Eisen(III)Häms wurde nach einer Zugabe von 19,8 mM NO beobachtet, d. h. mit einer NO-Konzentration, die die Konzentration von Häm weit überschreitet (1D). Weitere NO-Zugaben bis zu insgesamt 45 μM, induzierte mit dem Verbrauch von O₂ die Anreicherung von AH(FeIII)NO. Zusammengefasst lassen die Daten vermuten, dass das NO AH(FeIII)O₂ direkt zu Methämoglobin (Gleichung (5) und (6)) oxidiert, dass NO mit MetAH reagiert, um AH(FeIII)NO (Gleichung (7)) zu bilden und, dass zusätzliche Reaktionen stattfinden müssen. AH(FeII)O₂ → AH(FeIII)O₂ ^– (5) AH(FeIII)O₂ ^– + NO' → AH(FeIII) + NO₃ ^– (6) AH(FeIII) + NO' → AH(FeIII)NO (7)
Die Photolyse-Chemilumineszenz wurde eingesetzt, um den NO-Gehalt von 6 μM AH im Anschluss an die oben beschriebene schrittweise Zugabe von 45 μM NO zu messen. Die Analyse detektierte 7,8 μM NO in AH, von dem 65% (5,1 μM) S-Nitrosothiol (AH-SNO) war. Die Daten stimmen mit dem Vorliegen eines Gleichgewichts überein, das sich bekanntlich zwischen Fe(III)NO im Säuger-Hämoglobin und SNO (Gleichung (8)) einstellt, aber grundsätzliche Fragen bleiben offen. Erstens, der Transfer von NO^– von Häm zu Thiol in AH würde zwangsläufig mit einer Bindung von Sauerstoff (Gleichung (9)) gekoppelt sein, was nicht festgestellt worden ist. Zweitens, die NO-Massenbilanz geht nicht auf. Das heißt, das meiste zugefügte NO weder eine Chemilumineszenz-detektierbare noch spektralaktive Nitrosyl-Spezies bildet. AH(FeIII)NO + (Cys)S^– ⇆ AH(FeII) + (cys)SNO (8) AH(FeII) + (Cys)SNO + O₂ ⇆ AH(FeII)O₂ + (Cys)SNO (9)
Demgemäß könnte NO in einer Reaktion mit Sauerstoff verbraucht werden, um Nitrat zu bilden (Gleichung (10)); allerdings würde dies eine Elektronenquelle benötigen (Gleichung (11)). AH(FeII)O₂ + (Cys)SNO ⇆ AH(FeIII) + (cys)S' + No3^– (10) AH(FeIII) + (Cys)S' + e^– ⇆ AH(FeIII) + (Cys)S^– (11)
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass AH in der Lage ist, oxidiertes Cytochrom c in einer NADPH-abhängigen Weise zu reduzieren (Sherman, D. R., et al., Science 258: 1930–1932 (1992)). Die obige Titration wurde in Anwesenheit von NADPH wiederholt (1D). Es wurde festgestellt, dass NADPH die Effizienz erhöhte, mit der AH von NO oxidiert wurde,. Präziser, ein Peak in der AH(FeIII) Ausbeute wurde mit nur 14 μM NO beobachtet. Signifikanter war, dass nur minimal AH(FeIII)NO (1,6 μM) und kein AH-SNO detektiert wurde, sogar nach einer Zugabe von 45 μM NO (im Vergleich zu 6 μM Häm-Gehalt.). Die ausbleibende Anhäufung von AH(FeIII)NO oder von AH-SNO in Anwesenheit von NADPH lässt vermuten, dass AH in einer NADPH-abhängigen Weise NO metabolisierte. Die in Abwesenheit des Substrats NADPH gebildeten NO/SNO-Komplexe sind wahrscheinlich Reaktionsintermediate.
Eine Analyse von frischer perienteraler Flüssigkeit von Ascaris zeigte das Vorhandensein von endogenem SNO (annähernd 5% relativ zum Häm-Gehalt, Daten nicht gezeigt). Bei Inkubation von AH mit S-Nitrosocystein unter Bedingungen, die selektiv humanes Hämoglobin S-nitrosylieren (Jia, L., et al., Nature, 380: 221–226 (1996)), wurde AH-SNO gebildet (1E). Jedoch wurden die Häme im AH schnell durch S-Nitrosocystein oxidiert und signifikante Mengen an Hämgebundenem NO wurden detektiert. Dies unterscheidet sich vom humanen Hämoglobin, wo nur eine geringe Häm-Oxydation beobachtet wird (Jia, L., et al., Nature, 380: 221–226 (1996)). Wie aus den Gleichungen 8–10 vorhergesagt, waren die Level von Häm-gebundenem NO und AH-SNO durch Zugabe von NADPH signifikant reduziert und darüber hinaus reicherte sich Nitrat (NO₃ ^–) in den Reaktionsmischungen an (siehe weiter unten). Untersuchungen einer Mutante der ersten Häm-Domäne (D1), die durch die Substitution von B10 Tyrosin zu Leucin oxidiert wurde, wiesen auf eine Kopplung von Häm mit Thiol in NO-Reaktionen hin. Eine Behandlung mit S-Nitrosocystein führte zu der Bildung von D1-SNO und zu einer Reduktion der Häme. Diese Daten insgesamt wiesen darauf hin, dass Thiol(e) und Häm(e) in AH-Redoxpartner sind, die NO und/oder Elektronen übertragen und dass NO in diesen Reaktionen metabolisiert wird.
Die erste Globinfaltung, D1, enthält drei Cystein-Reste (A7, E15 und E19), die in der zweiten Globinfaltung, D2 (obgleich D2 und intaktes AH nicht kloniert worden sind) konserviert sind. Um die Einbindung dieser Thiole in die AH-Funktion zu bestimmen, wurden die Wirkungen der S-Nitrosylierung von rekombinanten D1 und Mutanten in jedem der drei Cystein-Reste untersucht (1F). Behandlung mit S-Nitrosocystein induzierte eine Oxidation von nativem D1 und aller Mutanten. Eine Mutation des in der proximalen Hämtasche liegenden E19 Cysteins (analog zu humanem Cysβ93) hatte nur eine bescheidene Wirkung auf die Bildung sowohl von S-Nitrosothiol als auch von Häm-gebundenen NO. Im Gegensatz dazu blockiert eine Mutation des E15 Cysteins, das in enger Nachbarschaft zu der Ligandenbindungsstelle liegt (Darawshe, S., et al., Biochem. J., 242: 689–694 (1987)), die SNO-Bildung ebenso wie die nachfolgende Produktion von Häm-gebundenem NO. E 15 Cystein besitzt folglich eine entscheidende Rolle in Häm-Thiol Interaktionen. NO wurde ineffizient durch das E15 Thiol in der A7 Mutante eingefangen. Diese Beobachtungen stimmen mit einem Modell überein, worin ein anfängliches Einfangen von NO⁺ durch das A7 Oberflächen-Cystein, anschließend intramolekularer Transfer der NO-Gruppe auf interne Thiole, höchst wahrscheinlich E15 Cystein, und dann auf Häm. Die Gestaltung der distalen Tasche kann die Interaktion zwischen dem an das Häm gebundene O₂ und dem an das E 15 Thiol gebundenen NO erleichtern, die ein Peroxynitrosyl-Intermediat bilden, welches sich dann zu Nitrat umlagert (Gleichung (12) und (13)). AH(FeII)O₂ + SNO(E15cys) ⇆ AH(FeII)OOONS(E15cys) (12) AH(FeII)OOONS(E15cys) + e^– ⇆ + AH(FeIII)(E15cys)S^– + NO₃ ^– (13)
NO wurde zu AH in Lösung zugegeben, um die Möglichkeit zu testen, dass es enzymatisch verbraucht wird. NO-Level wurden direkt über eine elektrochemische Sonde gemessen. AH verminderte den NO-Level im Vergleich zur NO-Konzentration in AH-freien Lösungen (2A). Diese Verminderung war annähernd äquivalent zu der vorhandenen Häm-Konzentration (1,5 μM Häm, 1,9–2,1 μM NO Verminderung), was auf eine einzige Reaktion von NO mit AH(FeII)O₂ hinweist. In diesen Experimenten, die in Abwesenheit von NADPH durchgeführt wurden, entspricht die NO-Abnahmerate der im Puffer beobachteten Rate. Im Gegensatz dazu wurde die NO-Abnahme durch AH um mehr als das 10fache in Gegenwart von NADPH beschleunigt. Folglich metabolisiert AH NO enzymatisch auf eine NADPH-abhängigen Weise.
Stopped-Flow-Spektrophotometrie wurde eingesetzt, um weitere Einsichten in den Mechanismus des NO-Verbrauchs durch AH zu gewinnen. Die Zugabe von 25 μM NO zu 6 μM AH in Abwesenheit von NADPH (2B und 2C), führte zu der schnellen AH(FeIII) Bildung (beobachtete anfängliche Rate 888 nMs^–1), gefolgt von einer AH(FeIII)NO Bildung (beobachtete Rate 26 nMs^–1). AH(FeIII)NO wurde zuerst gebildet, um die Oxidation von AH(FeII)O₂ zu vervollständigen. Eine Zugabe von 500 μM NADPH verlangsamte die NO-induzierte Stoffumwandlung von AH(FeII)O₂ (2D und 2E) zu AH(FeIII) (beobachtete anfängliche Rate 290 nMs^–1), erhöhte aber die Ausbeute an oxidiertem AH und verhinderte, dass sich detektierbares AH(FeIII)NO bildete. Die langsamere Bildung von AH(FeIII) in Gegenwart von NADPH und die frühe Detektion von AH(FeIII)NO in seiner Abwesenheit lasst vermuten, dass AH(FeIII) mit AH(FeIII)O₂ um NO konkurriert. Frühere Arbeiten mit anderen Globinen zeigten, dass der Ersatz des distalen Histidins mit Glutamin die Reaktivität des Häm-Eisens mit NO 1000fach erhöhte (Sharma, V. S., et al., Biochem., 26: 3837–3843 (1987); Sharma, V. S., et al., Biochem., 22: 3897–3902 (1983)). Die verminderte Rate der AH(FeIII) Bildung in Gegenwart von NADPH ist höchst wahrscheinlich ein Ergebnis des NO-Umwandlung, d. h. die beobachtete Rate ist die Kombination von AH(FeIII)-Produktion und Verbrauch.
Die Produkte des NO-Verbrauchs durch AH wurden mit Hilfe des NO-Donors Diethylamin NONOat (DEANO) bestimmt. In Kontrolluntersuchungen setzten 5 μM DEANO NO über 2 min. frei (2F). Wenn AH vorhanden war, war allerdings NO elektrochemisch nicht detektierbar. Das heißt, AH metabolisierte NO. Verschiedene Mengen an DEANO (1–8 μM, Ausbeute 2–16 μM NO) wurden in NADPH-Lösungen mit und ohne AH (1,5 μM Häm-Gehalt) inkubiert und die Produkte wurden auf Nitrit und Nitrat (Tabelle 1) untersucht. In Abwesenheit von AH führte 1,5 μM DEANO zu keinem detektierbaren Nitrit oder Nitrat, vermutlich auf Grund des Verlustes an NO an die Atmosphäre. Allerdings in Gegenwart von AH wurde NO effektiv eingefangen und als Nitrat fixiert. Bei Zugabe ansteigender Mengen an DEANO metabolisierten AH-haltige Lösungen NO primär zu Nitrat, während in Abwesenheit von AH nahezu äquimolare Mengen an Nitrit und Nitrat beobachtet wurden. AH-Transformation von NO zu Nitrat wurde sogar bei einer sehr. geringen Sauerstoffspannung beobachtet (Daten nicht gezeigt). Zusammengefasst zeigen diese Daten eindeutig eine enzymatische Funktion für AH bei der Metabolisierung von NO und Sauerstoff, um Nitrat zu produzieren.
Tabelle 1
Endproduktanalyse des NO-Metabolismus von AH. Unterschiedliche Mengen an DEANO wurden zu 500 μM NADPH-haltigen Lösungen mit oder ohne AH (1,5 μM Häm-Gehalt) gegeben. Bildung von Nitrit und Nitrat wurden sowohl mit der Greiss-Reaktion als auch mit Hochleistungskapillar-Elektrophorese bestimmt. Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung für drei Experimente.
Der Verbrauch von Sauerstoff durch AH wurde mittels einer Clark-Elektrode in einem geschlossenen Gefäß untersucht (3A). Eine Inkubation von gereinigtem AH-Protein mit NADPH verursachte eine Reduktion der Sauerstoffspannung, sogar in Abwesenheit von NO. Das sichtbare Spektrum von AH mit Sauerstoff Liganden veränderte sich, entsprechend seiner hohen Affinität für Sauerstoff, mit Abnahme der Sauerstoffspannung nicht. In vollständig Sauerstoff freiem Puffer wurde allerdings das Protein in die Desoxy-Form durch NADPH (3B) umgewandelt. Folglich zeigt AH eine intrinsische NADPH-Oxidase Aktivität. Die Zugabe von NO in das Gefäß führte darüber hinaus zu einer schnellen Beschleunigung des Sauerstoff verbrauchs. Der gesamte Sauerstoff, der bei Zugabe von 10 μM NO zu der Reaktionsmischung, verbraucht wurde, betrug insgesamt 43 μM. Selbst wenn man eine Hintergrundrate des Sauerstoffverbrauchs berücksichtigt, entspricht dies einem Verhältnis von zwei Sauerstoffinolekülen pro NO. Eine NO-Zugabe zu AH vor NADPH, das eine Bildung von AH(FeIII)NO ermöglichen würde, hemmte den Sauerstoffverbrauch vollständig.
Beispiel 2: AH reduziert die Sauerstoffspannung in der Perienteralhöhle von Ascaris und im Darm infizierter Wirte.
Die Sauerstoffspannung im Darm mit Ascaris suum infizierter Schweine und der Sauerstoff- und NO-Gehalt der perienteralen Flüssigkeit von Würmern (Ascaris suum), die einem oxidativen Stress ausgesetzt waren, wurden gemessen. Ascaris kann durch den Schweinedarm wandern, hält sich aber vorwiegend in dem Jejunum auf. Vierzig Messungen des Jejunum pO₂ wurden bei zwei Schweinen durchgeführt. Der gemessene Jejunum pO₂ reichte von 0 bis 10 mm Hg mit einem offensichtlichen O₂-Gradienten von der Darmwand (~10 mm Hg) zum Lumen (~0 mm Hg). Elf Würmer wurden aus den Schweinedärmen isoliert. Eine Kanüle wurde in die Perienteralhöhle von drei dieser Würmer eingeführt. Bei jedem Wurm wurde die Kanüle ~1 cm unterhalb des Kopfes inseriert, und eine faseroptische O₂-Sonde wurde durch die Kanüle eingeführt. Wenn die Würmer oxidativem Stress ausgesetzt waren, blieb der pO₂ der Höhle konstant bei 4 mm Hg (5A). Eine zweite Kanüle wurde in die Perienteralhöhle eingeführt, und die AH-haltige perienterale Flüssigkeit der Höhle wurde abgezogen. Nachdem die perienterale Flüssigkeit abgezogen war, stieg der pO₂ der Höhle auf ~40 mm Hg (5A) an.
Die perienterale Flüssigkeit eines einzelnen frisch isolierten erwachsenen weiblichen Ascaris Wurms wurde gesammelt und auf SNO- und FeNO-Gehalt mittels Photolysis-Chemilumineszenz untersucht. Die frisch isolierte perienterale Flüssigkeit enthielt 6,15 ± 0,37 μM gebundenes NO (1–2 NO pro Oktamer AH), welches als SNO und Metallnitrosyl (FeNO) (5B) vorlag. Darüber hinaus war die Menge an SNO- in der perienteralen Flüssigkeit umgekehrt proportional zum Metallnitrosyl-Gehalt, was im Einklang mit der funktionalen Kopplung zwischen Häm und Thiol (Gleichung (8) steht.
Die Daten zeigen, dass AH eine Stickstoffinonoxid-aktivierte Desoxygenase ist, die endogen produziertes NO zur Sauerstoffentgiftung verwenden kann.
Beispiel 3: Myoglobin katalysierte Desoxygenierung
Myoglobin (aus humanem Herzen; Sigma, St. Louis, MO) wurde zu belüfteter Phosphat-gepufferter Saline bei Raumtemperatur mit einer Endkonzentration von 5 μM gegeben. Der Sauerstoffverbrauch wurde durch Zugabe von 200 μM–1 mM NADPH oder NADH initiiert. Die Reaktion wurde mit einer Clark-Elektrode in einem geschlossenen Gefäß verfolgt. Die Sauerstoffverbrauchsrate von Myoglobin wurde durch die Zugabe von 1 bis 25 mM NO weiter dramatisch beschleunigt. Eine Zugabe von NO allein (d. h. ohne NADPH oder NADH) hatte auf den Sauerstoffverbrauch eine geringe Wirkung. Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt.
Aus diesen Daten wurde ein Modell für den Verbrauch von O₂ Myoglobin konstruiert, das hier als Erläuterung angeführt ist und nicht als Einschränkung zu verstehen ist. MbFe(II) + O₂ ⇆ MbFe(II)O₂ + O₂ + e^– → MbFe(II)O₂ + O₂ ^– (14) MbFe(II)O₂ + O₂ ^– + H⁺ ⇆ MbFe(III)-OOH + O₂ (15) Mb(FeIII)-OOH + e^– → MbFe(II)-OOH + 3e^– → MbFe(IV) + 2H₂O (16) MbFe(IV) + 2e^– → MbFe(II) (17)
Methoden für Beispiel 4
Kultur
Anzucht von Escherichia coli Stamm RK4936 in Minimalmedium, Ernte der Zellen und Lyse erfolgten, wie beschrieben (Hausladen, A. et al., Cell 86: 719–729 (1996)). Die Stämme YMC10 (Wildtyp) und RB9060 (Δgln, Δhmp) (Liu, J. & Magasanik, B., J. Bacteriol., 175: 7441–7449 (1993)) wurden von Dr A. Ninfa, University of Michigan, zur Verfügung gestellt. Der HMP überproduzierende Stamm AN1459/pPL757 wurde von Dr. N. E. Dixon, Australian National University, zur Verfügung gestellt; (Love, C. A. et al., Gene, 176: 49–53 (1996)). Um HMP zu induzieren, wurden Zellen aus einer Übernachtkultur (1% Inoculum) bis zu einer A₆₀₀ von 1,0 angezogen und dann 50fach in frischem Medium verdünnt. Wenn die A₆₀₀ 0,2 erreicht hatte, wurden die Zellen mit 0,2 mM S-Nitrosocystein (SNO-Cys) behandelt und weitere 90 Min. angezogen. Die Zellen wurden zur Enzymreinigung mittels Zentrifugation geerntet. Um auf induzierbare Resistenz zu testen, wurden die vorbehandelten Zellen in frischem, vorgewärmten Medium verdünnt (auf eine A₆₀₀ von 0,1) und erneut einer Challenge mit 0,2 mit 0,2 mM SNO-Cys unterzogen. Die Zelldichte wurde dann alle 15 Min 2 Stunden lang aufgezeichnet. Zur HMP-Reinigung wurde Stamm AN1459/pPL757 aus einer Übernachtkultur (2% Inoculum) bei 30°C in 4 Liter LB Medium/50 μg/ml Ampicillin bis zu einer A₆₀₀ von 0,5 angezogen und dann mit 1 mM a-Aminolevulinsäure, 1 mM ATP und 100 μM Riboflavin supplementiert (Martasek, P. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 219: 359–365 (1996); Seo, H. G. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 208: 10–8 (1995)). Die Temperatur wurde dann auf 42°C erhöht und die Zellen wurden für weitere 6 Stunden im Dunkeln wachsen gelassen. Nach der Ernte mittels Zentrifugation wurde das Zellpellet bei –20°C aufbewahrt.
SNO- und NO-Metabolismus
Eine NO-Elektrode des Typs Clark (Iso-NO, World Precision Instruments), die in einem gerührten Glasgefäß eingetaucht war, wurde verwendet, um die NO-Freisetzung oder den NO-Verbrauch von Bakterien oder Proteinen zu messen. Die Zellen wurden in 2 ml Minimalmedium auf eine A₆₀₀ von 1,0 suspendiert. SNO-Cys oder eine anaerobe NO-Lösung wurde dann mit einer Endkonzentration von 100 μM beziehungsweise 5 μM zugegeben. Der NO-Verbrauch von HMP-Säulenfraktionen oder gereinigtem HMP wurde in 20 ml BisTrisPropan, pH 7,0, in Gegenwart von 0,1 mM NADH gemessen. Für Messungen der aeroben Endprodukte von NO-Reaktionen wurde entweder der NO-Donor Diethylamin-NO (0,1 mM) oder NO-Lösungen zu den geschlossenen Gefäßen, die bis zur Kapazitätsgrenze gefüllt waren (d. h. enthielten keinen Totvolumen), gegeben. Die Lösung wurde dann mit der Griess-Reaktion auf Nitrit und Nitrat (Schmidt, H. H. H. W. & Kehn, M., in Methods in Nitric Oxide Research (eds Feelisch, M. & Stamler, J. B.). 491–497 (Wiley, Chichester, England 1996)), und/oder gleichzeitig mittels Kapillarelektrophorese unter Verwendung einer 75 μm × 100 cm CE-select Amin-Kapillare (Supelco) bei 20 kV untersucht. Die Kapillare wurde regelmäßig mit einer Amin-Regenerierungslösung (eCAP, Beckman) neubeschichtet. Der GSNO-Abbau wurde mit der Saville-Reaktion (Stamler, J. B. & Feelisch, M., in Methods in Nitric Oxide Research (eds. Feelisch, M. & Stamler J. B.) 521–539 (Wiley, Chichester, England 1996) oder durch die Abnahme der Absorption bei 340 nm verfolgt. N₂O Messungen wurden im Totvolumen der geschlossenen Gefäße, die mit einer 50% Kapazität gefüllt waren, mittels GC-MS durchgeführt (Arnelle, D. R. & Stamler, J. B. Arch. Biochem. Biophys. 318: 279–285 (1995)). Zum Durchmustern auf SNO-Lyase und NO-metabolisierende Aktivität, wurden Säulenfraktionen mit 0,1 mM SNO-Cys oder 10 μM NO behandelt und auf NO_x Produktion und die Fähigkeit, eine NO-Spaltung zu beschleunigen, untersucht. Der Sauerstoffverbrauch wurde mit einer Clark Elektrode (Yellow Spring Instruments) in einer wärmeregulierten Zelle ohne Totvolumen gemessen.
Enzym-Reinigung
Die durch eine Zentrifugation bei 100 000 g gewonnenen, in 20 mM BisTrisPropan, pH 7,0, löslichen Extrakte wurden auf einer MonoQ HR 10/10 Säule (Pharmacia) mit einem linearen Gradienten von 0–1 M NaCl getrennt und auf SNO-Lyase- und NO-Verbrauchsaktivitäten untersucht. Rohextrakte aus dem HMP überproduzierenden Stamm wurden mit 100 μM Hämin und 1 mM DTT behandelt und dann auf eine 2,5 × 70 cm Q-Sepharose FF Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit einem linaearen Gradienten von 0–0,5 M NaCl getrennt. Die Fraktionen, die eine intensive braune Farbe zeigten, waren > 95% reines HMP, wie mittels SDS-Gelelektrophorese beurteilt wurde.
Beispiel 4: Demonstration der katalytischen Aktivität von Flavohämoglobin
Es wurde die Hypothese getestet, ob SNO von Zellen homolytisch zu NO gespalten wird. 7A zeigt, dass in Nährmedium suspendierte Zellen die NO-Freisetzungsrate aus SNO signifikant steigerten verglichen mit Nährmedium allein. Eine Hitze- und Diamid-Hemmung der Reaktion in zellulären Extrakten lieferten einen zusätzlichen Beweis für eine enzymatische Lyase-Aktivität. Allerdings folgt die NO-Abbaurate durch suspendierte Zellen nicht der dritten kinetischen Regel der Autooxidation. Die Zellen beschleunigten eher den NO-Zerfall. Diese NO-metabolisierende Aktivität war in Zellen, die mit SNO (7B) vorbehandelt waren, deutlich erhöht. Das heißt, die Stoffwechselaktivität war induzierbar. Ergänzende Untersuchungen mit Extrakten zeigten, dass die NO-Transformation NADH-abhängig war. Es ist zuvor gezeigt worden, dass OxyR eine Kontrolle über das metabolische Schicksal von SNO ausübt, und dass ein mutierter Stamm hochsensitiv für eine SNO-induzierte Cytostase ist (Hausladen, A. et al., Cell 86: 719–729 (1996)). Allerdings waren sowohl die konstitutive SNO-Lyase (SNO → S + NO) als auch die induzierbaren NO-metabolische Aktivitäten in OxyR-defizienten Zellen vorhanden (nicht gezeigt). Zusammengefasst stimmen diese Ergebnisse mit den OxyR-unabhängigen Pfaden überein, die SNO zu NO spalteten, NO metabolisieren und Nitrat bilden.
Zur Reinigung und Charakterisierung der Enzyme wurden Chromatographie-Fraktionen von SNO behandelten und unbehandelten Extrakten auf SNO-Lyase und NADH-abhängige NO-metabolische Aktivitäten durchmustert. Eine Anionenaustausch-Chromatographie trennte drei Hauptpeaks mit SNO-Aktivität (7C) und einen Peak mit der NO-metabolisierenden Aktivität. Diese Fraktion katalysierte ebenfalls den NADH-abhängigen Abbau von GSNO. NADH + 2 GSNO + H⁺ → N₂O + GSSG + NAD⁺ + H₂O (18)
Die NO- und GSNO- Verbrauchsaktivitäten waren in Extrakten von unbehandelten Zellen gering, wurden aber durch SNO-Behandlung stark induziert (nicht gezeigt). Die Chromatographie-Fraktion, die die Aktivitäten enthielt, zeigte ein anderes Hämoglobin-Spektrum nach SNO-Exposition (7D). E. coli besitzt ein Flavohämoglobin (HMP) unbekannter Funktion, von dem behauptet wird, dass es von NO induziert wird (Poole, R. K. Ioannidis, N. & Orii, Proc. R: Soc. Lond. B. Biol. Sci., 255: 251–258 (1994); Poole, R. K. et al. Microbiology 142: 1141–1148 (1996), Poole, R. K. et al., Microbiology 143: 1557–1565 (1997); Poole, R. K. et al., J. Bacteriol., 178: 5487–5492 (1996)). Weitere Reinigung des Hämproteins durch SDS-Gelelektrophorese, Untersuchungen auf Eisen(III)Reduktase-Aktivität (Eschenbrenner, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 198: 127–131 (1994)), und Untersuchungen von HMP-defizienten Mutanten identifizierten die NO/GSNO-metabolisierenden Aktivitäten mit HMP. Insbesondere waren Extrakte von der HMP-Mutante nicht in der Lage, einen NADH-abhängigen NO-Verbrauch zu katalysieren (8A) und ein HMP-Mangel erhöhte markant die Empfänglichkeit für SNO-induzierte Cytostase deutlich und schränkte die induzierbare Resistenz auf nitrosativen Stress (8B) schwer ein.
HMP übte ebenfalls eine Kontrolle auf SNO- und NO-Metabolismus aus. Mit SNO vorbehandelte Zellen produzieren unter aeroben Bedingungen verstärkt Nitrat und weniger Nitrit aus SNO und NO, und diese Stoffwechseländerung weg vom Nitrit war HMP-abhängig (Tabelle 2). Interessanterweise konnte die wiedergewonnene Menge an NO_x (d. h. Nitrit und Nitrat) nicht auf das zugegebene SNO (und zu einem geringeren Umfang auf NO) zurückgeführt werden, was auf die Existenz eines zusätzlichen (reduktiven) Pfades des (S)NO Abbaus hinweist, der zumindest in Teilen HMP unabhängig. In E. coli scheint es, dass mehrere konstitutive Aktivitäten die SNO-Aufspaltung vermitteln, unter denen mehrere Lyasen sind, die NO bilden. Allerdings ist der aerobe HMP-Stoffwechselpfad für SNO und NO wesentlich für den Erwerb einer Resistenz auf eine nitrosative Challenge.
Tabelle 2: HMP-Induktion steigert die Nitrat-Ausbeute in vivo. Die Zellen waren entweder mit 200 μM SNO-Cys vorbehandelt oder nicht vorbehandelt und wurden dann entweder 200 μM SNO-Cys oder Diethylamin-NO ausgesetzt. Nach 90 Minuten wurde das Nährmedium auf Nitrit und Nitrat mittels Kapillarelektrophorese untersucht.
Aus einem überexprimierenden Stamm gereinigtes HMP wurde verwendet, um den Mechanismus des NO/GSNO-Abbaus aufzuklären. Das Protein zeigte die gleichen NO- (9A) und GSNO- (10A) Stoffwechselaktivitäten, die wir bei Wildtyp-Zellen isoliert hatten. Das Bild, das sich aus spektroskopischen Untersuchungen und Analysen der Substratnutzung ergab, zeigte, dass O₂ an das Häm während der aeroben NO-Umwandlung (9B, 9C) gebunden ist. Darüber hinaus wurde eine Nitrosyl-Häm, das anaerob gebildet war, nicht umgewandelt und der NO-Ligand wurde schnell durch O₂ ersetzt (9B). Folglich wurde eine NO-Transformation durch die Häm-Domäne nur mit gebundenem O₂ beobachtet. Cyanid inhibierte die NADH-Oxidation signifikant und verzögerte den NO-Verbrauch, was darauf hinweist, dass die NO-Reaktionstelle das OxyHäm ist (9D). Produktbestimmungen unter Bedingungen, bei denen HMP die NO-Konzentration im Fleißgleichgewicht unter 50 nM hielt, zeigten, dass HMP NO zu Nitrat (NO₃ ^–) und zu einem gewissen Grad zu Nitrit (NO₂)(9E) oxidierte. Nur geringe N₂O-Mengen wurden detektiert und SOD beeinflusste die Produktausbeuten nicht. Von SOD würde erwartet werden, dass es NO/Superoxid-Reaktionen modifiziert, die Nitrat bilden. Messungen des Sauerstoffverbrauchs zeigten, dass die Raten in Anwesenheit von NO verdoppelten, und dass ein Molekül Sauerstoff pro Molekül NO verbraucht wurde (9F). Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass das Häm im bakteriellen Hämoglobin als eine Oxygenase fungiert. Wenn wir auch nicht wollen, auf einen bestimmten Mechanismus festgelegt zu werden, wird ein Reaktionsmechanismus vorgeschlagen, worin NO an Fe(II)O₂ bindet und einen Nitrosyldioxyl-Komplex (Fe[II]-O-O-N=O) bildet. Bei Freisetzung von Nitrat verbleibt dann ein Fe[III]. Eine alternative Bildung von Nitrit kann durch die Reaktion von NO mit dem OONO-Intermediat (Gleichung 20) erklärt werden (D. A. Wink, et al., J. Biol. Chem., 272: 11147–11151 (1997)). In jedem Fall reduzieren Elektronen von NADH das oxidierte Eisen, und regenerieren das Fe(II)Häm. Ein neuer Katalysecyclus wird dann durch das Binden von O₂ an Häm gestartet (Gleichung 21), von dem gezeigt worden ist, dass dies sehr schnell und mit einer hohen Affinität geschieht (R. K. Poole, et al., Microbiology, 142: 1141–1148 (1996)). Gleich. 19: HMP(FeII)O₂ + NO → HMP(FeIII) + NO₃ ^– Gleich. 20: HMP(FeIII)^δ+OONO^δ + 2NO → HMP(FeIII) + NO₂ ^– + N₂O₃ Gleich. 21: HMP(FeIII) + O₂ + 0,5 NADH → HMP(FeII)O₂ + 0,5 NAD^–
Verschiedene Beweisführungen zeigten, dass sich der Mechanismus des GSNO-Abbaus sich von dem des NO-Abbaus unterschied. Erstens, die GSNO-Umwandlung war von Cyanid weitgehend unbeeinflusst (10A) und steigerte den Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von NADH (10B) nicht. Darüber hinaus wurde GSNO unter aeroben Bedingungen effizient abgebaut, während dies bei NO nicht der Fall war. Diese Ergebnisse schlossen eine Beteiligung sowohl des Häms als auch des O₂ in dem Reaktionsmechanismus aus. Zweitens, steigerte GSNO eine NADH-Oxidation mehr als NO (10C). Drittens, N₂O und oxidiertes Glutathion waren die Hauptreaktionsprodukte, während nur geringe Mengen an Nitrit und Nitrat gebildet wurden (10D) und reduziertes Glutathion wurde weder aerob noch anaerob detektiert.
60–70% Thiol-Substrat wurde in GSSG unter anaeroben Bedingungen aber nur 10% aerob umgesetzt, was die Möglichkeit erhöht, dass Thiyl-Radikalintermediate oder Glutathiondisulfid-Produkte einer weiteren Oxidation unterliegen. Bemerkenswert ist, dass die sehr hohe O₂-Affinität von HMP (in Gegenwart von NADH) eine etwas höhere Oxidation von Glutathion ermöglichen kann, trotz größter Anstrengungen, anaerobe Bedingungen zu schaffen. Ein Reaktionsmechanismus wird vorgeschlagen, in dem Elektronen auf GSNO übertragen werden, NO^– und GS^– ergeben, die dann N₂O beziehungsweise Glutathiondisulfid bilden (Gleichung 22). Gleich. 22: 2 GSNO + NADH + H⁺ → 2 GSSG + NAD⁺ + N₂O + H₂O
Da das Nitrosyl-Anion (NO^–) wahrscheinlich in dieser Reaktion gebildet wird, könnte Hydroxylamin wohl ein alternatives Produkt in Thiol-haltigen Systemen sein (Arnelle, D. R. & Stamler, J. S., Arch. Biochem. Biophys. 318: 279–285 (1995)). Ein reduzierender GSNO-Metabolismus wird wahrscheinlich von der Flavoreduktase-Domäne katalysiert. Diese Reaktion, die ähnlich der Oxygenase gut bei physiologischen Substratkonzentrationen (1–10 μM) funktioniert, erhöhte die Möglichkeit eines zusätzlichen Reduktionsmechanismus für NO. Tatsächlich katalysiert HMP eine NO-Transformation zu N₂O anaerob und die Reaktion war nicht durch Cyanid gehemmt. Jedoch war die Reduktion von NO ~250mal langsamer als die von GSNO, was die Frage nach der physiologischen Relevanz stellt.
Beispiel 5: Demonstration einer NADPH-abhängigen HMP-induzierten Konstriktion von Blutgefäßen unter Verwendung eines biologischen Tests für arteriellen Tonus.
Methoden
Männliche weiße Neuseeland-Kaninchen (2–3 Kg) wurden mit intravenös verabreichtem Natriumpentobarbital (10 mg/Kg) narkotisiert und anschließend über die Carotis ausbluten gelassen. Die absteigende Thorax-Aorta wurde dem Tier vorsichtig entnommen, um nicht die Intimaloberfläche zu beschädigen. Das Gewebe wurde in eiskaltem Krebs-Bicarbonatpuffer (pH 7,4) verbracht und für biologische Tests innerhalb von 24 Stunden verwendet.
Das Aorta-Segment wurde von allen Fett- und anderen Geweberesten sorgfältig gesäubert und 3–4 mm Ringe wurden mit Hilfe einer neuen Skalpellklinge geschnitten. Die Ringe wurden an einem isometrischen Kraftumwandler (FT01, Grass Instruments) befestigt, der mit einem Multikanal-Polygraph-Schreiber (Grass Modell 7a) verbunden war. Die Ringe wurden dann in 25 ml ummantelten Organkammern (Radnoti), die mit 95% O₂ und 5% CO₂, pH 7,4, belüfteten Krebs-Bicarbonatpuffer, 37°C, enthielten, suspendiert. Die Grundspannung würde graduell auf die Gefäßringe mittels einer mechanischen Vorrichtung bis zu einem Optimum von 2 Gramm ausgeübt. Die Ringe wurden dann mit Phenylephrin (PE; 10^–7 M) kontrahiert und konnten ein stabiles Tonusniveau erreichen. Zu diesem Zeitpunkt wurde Acetylcholin (ACh; 10^–7 bis 10^–6 M) zugefügt, um das Vorhandensein eines vollständig intakten Endothels zu bestätigen. Wenn sich die ACh-induzierte Relaxation stabilisierte, wurden die Ringe dreimal mit frischem Krebs-Puffer gespült und durften wieder auf den Grundlinientonus äquilibrieren.
Um die Wirkungen von HMP auf den Gefäßtonus zu bestimmen, wurden die Ringe mit PE auf ein stabiles Tonusniveau, wie oben beschrieben, kontrahiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde HMP (1–100 nM) in Anwesenheit oder Abwesenheit von 0,1 mM NADH zu den Gewebekammern gegeben. Tonusänderungen können als eine prozentuale Änderung des PE-induzierten Tonus dargestellt werden. Um die Rolle des Gefäßendothels bei der Antwort auf HMP zu bestimmen, wurden bei ausgewählten Aortaringen das Endothel mittels Reiben der Intimaloberfläche mit dem Schaft einer 22er Nadel zerstört und anschließend 60 min reäquilibriert. Die Entfernung des Endothels kann durch die Abnahme der Relaxationsantwort auf ACh (10^–7 M) nach einer Kontraktion mit PE bestätigt werden. Antworten auf HMP ± NADH wurden wie oben beschrieben wiederholt.
Ergebnisse
12A zeigt die NADH-abhängige HMP-induzierte Konstriktion von Blutgefäßen. Aortaringe von Kaninchen wurden an einem Kraftumwandler zur Messung des isometrischen Tonus befestigt. Die Ringe wurden mit Phenylephrin (PE) vorkonstringiert. HMP wurde dann mit den angegebenen Konzentrationen in Anwesenheit (linke 4 Spuren) oder Abwesenheit (rechte 4 Spuren) von 0,1 mM NADH zugefügt. Für die in 12B gezeigten Spuren wurde eine EDRF/NO-abhängige Relaxation durch Zugabe von Acetylcholin (ACh) induziert, 0,1 mM NADH und die angegebenen Konzentrationen an HMP wurden dann zugefügt. Bei dem 100 nM HMP enthaltenden Test wurde eine zweite Dosis 0,1 mM NADH gegeben (Pfeil, 12A).
Beispiel 6: Messung des Arteriolen-Durchmessers und Blutflusses im Tumor im dorsalen Hautlappen-Fensterkammer-Präparat der Ratte
Ratten R3230AC Mamma-Adenocarcinome wurden in einer dorsalen Hautlappen-Fensterkammer in Fischer 344 Ratten wachsen gelassen. Nach Anästhesie und Anlegen einer Kanüle in die Femur-Arterie und Vene wurde die Fensterkammer in eine spezielle Plexiglashalterung platziert, um das Fenster zu stabilisieren. Zur Beobachtung wurde die Ratte auf einen geheizten Mikroskoptisch platziert. Eine den Tumor versorgende Arteriole wurde lokalisiert und auf Video aufgezeichnet. Der Durchmesser wurde offline bestimmt. Eine Laser-Doppler-Durchflussmesssonde (LDF) wurde unterhalb des Tumors positioniert, um den Tumorblutfluss (TBF) zu bestimmen. Diese Messungen wurden über 30 Minuten vor der Infusion mit HMP oder Träger und dann für 60 Minuten nach der Infusion durchgeführt. In dieser Untersuchungsreihe wurden zwei unterschiedliche HMP-Dosen infundiert. Es gab drei experimentelle Gruppen: Träger-Kontrollgruppe, Dosis 1 Gruppe und Dosis 2 Gruppe.
R3230Ac Mamma-Adenocarcinome waren bis zu 1 cm im Durchmesser im Rattenhinterlauf gewachsen. Unter Pentobarbital-Anästhesie wurde in die Femur-Arterie und Vene zur Überwachung des arteriellen Blutdrucks beziehungsweise für Infusion des Arzneimittels eine Kanüle gelegt. Ein den Tumor bedeckendes 2–3 mm großes Hautstück wurde entfernt, um die Tumoroberfläche freizulegen. Eine 400 μm Durchmesser Laser-Doppler-Durchfluss-(LDF)-Messsonde wurde gegenüber der freigelegten Oberfläche inseriert, um den TBF zu messen. Eine zweite LDF-Sonde wurde in den an den Tumor grenzenden Quadrizepsmuskel inseriert und eine dritte Sonde wurde in den Deltamuskel inseriert. Eine Sauerstoffmikroelektrode mit einer Aussparung von 6 bis 15 μm im Durchmesser an der Spitze wurde in den Tumor durch die freigelegte Oberfläche hindurch inseriert. Ein pO₂-Wert größer null wurde ermittelt und die Elektrode verblieb dort während des restlichen Experiments. Messungen des pO₂ und TBF wurden unter Grundlinien-Bedingungen 30 Minuten durchgeführt. Dann wurde HMP (25–100 mg) oder Träger intravenös mit einer konstanten Rate infundiert. Die Messungen wurden weitere 60 Minuten fortgesetzt. Zwei Dosen des Mittels oder des Trägers wurden insgesamt drei Gruppen verabreicht. 14 zeigt, dass eine HMP-Infusion (t = 0 min.) den Blutfluss in einem Mamma-Adenocarcinom-Modell vermindert.
Verfahren, die in einem Modell für septischen Schock angewandt sein können (Beispiel 7 und 8)
Weiße Neuseeland-Kaninchen (2–3 kg) wurden mit Ketaminhydrochlorid (50 mg/Kg i. m.) sediert und mit Natriumpentobarbital (30 mg/Kg i. v.) anästhesiert. Die Anästhesie wurde durch ergänzende intravenöse Pentobarbital-Gaben, je nach Bedarf, aufrechterhalten. Eine Tracheotomie wurde durchgeführt und die Trachea wurde mit einem speziell entwickelten endotrachealen Tubus intubiert. Die Körpertemperatur wurde mit einer homöothermischen Deckensystem (Harvard Apparatus Ltd.) aufrechterhalten und in die Femur-Arterie und Vene wurden Kanülen mit einer Polyethylenröhre (PE-90, Clay Adams) gelegt. Der arterielle Druck wurde mit einem Druckumwandler (Cobe, Inc.) kontrolliert und mit einen Gould Physiograph (Modell RS-3800, Gould Elektronics, Inc.) aufgezeichnet. Die Kaninchen wurden 20 Minuten nach der Operation vor Beginn des Versuchsprotokolls kontrolliert.
Beispiel 7: Wirkung von Lipopolysaccharid (LPS) auf den arteriellen Druck, Blutplättchen-cGMP und NO-Plasma-Gesamtgehalt (freies NO + SNO) (Prognose)
Die Tiere wurden für 20 Minuten beobachtet, um einen stabilen hämodynamischen Status zu schaffen und Blut (4 ml) wurde für Plasma-NO und cGMP-Gesamtgehalt gewonnen. Den Tieren wurde LPS (150 μg/kg i. v. 1 Minute) verabreicht; nach LPS-Verabreichung erfolgte Entnahme von Blutproben und Aufzeichnen des arteriellen Drucks in stündlichen Intervallen über einen sechsstündigen Zeitraum. Jede Blutprobe wurde mit einem gleichen Volumen 0,9% Saline ersetzt, um den Volumen-Status beizubehalten.
Beispiel 8: Wirkung von HMP ± NADH auf LPS-induzierten septischen Schock (Prognose)
HMP kann in Therapieverfahren eingesetzt sein, um Endotoxin-induzierte Hypotension zu revertieren. Ein Modellsystem zum Testen der Wirkungen von HMP bei septischem Schock kann zur Demonstration seiner Wirksamkeit eingesetzt sein (Keaney, J. F. et al., Circ. Res. 74: 1121–1125 (1994)).
Nach Etablierung eines stabilen hämodynamischen Zustands wird Blut (4 ml) zur Bestimmung des Blutplättchen-cGMP und NO-Plasma-Gesamtgehalts entnommen. LPS (150 μg/kg) wird als eine intravenöse Bolus-Injektion 1 Minute verabreicht und die Tiere werden 3 Stunden oder, bis der durchschnittliche arterielle Druck auf 55% des Grundwerts fällt, beobachtet. Nach Erreichen jeweiligen des Endpunkts wird HMP intravenös mit Dosen von 0,1, 1 und 10 μg/kg nacheinander verabreicht. Vor HMP-Verabreichung und 20 Minuten nach jeder Dosis wird Blut, wie oben beschrieben, entnommen. Die Wirkung von ausschließlich HMP ± NADH allein wird in 10 Kaninchen nachgewiesen unter Verwendung des obigen Protokolls, außer dass LPS durch ein Placebo ersetzt ist.
Beispiel 9: Untersuchung der Verzögerung des Tumorwachstums (Prognose)
In diesen Untersuchungen werden Tumor tragende Tiere mit HMP, einem hypoxischen Cytotoxin, einer Kombination aus beiden oder Träger behandelt. Hypoxische Cytotoxine zeigen eine erhöhte Wirksamkeit in einer hypoxischen Umgebung, so dass wir vermuten, dass eine Abnahme von Perfusion und pO₂ im Tumor nach einer Verabreichung des Cytotoxins zu einer verstärkten Zellabtötung und signifikanter Wachstumsverzögerung des Tumors führt. In dieser Untersuchung werden wir höchstwahrscheinlich ein Alkylierungsmittel (z. B. Mitomycin C) als Cytotoxin einsetzen. Die Behandlung beginnt, wenn der Tumor 7–8 mm im Durchmesser erreicht. Die Ratten bekommen zunächst das Cytotoxin oder den Träger, anschließend entweder HMP oder den Träger. Die Tiere werden täglich auf Vergiftungserscheinungen untersucht und die Tumore werden dreimal pro Woche vermessen. Der Endpunkt, den wir für das Tumorneuwachstum setzen, entspricht dem dreifachen des Anfangsvolumens des Tumors. Die Zeit für Erreichen dieses Endpunktes wird unter den Versuchsgruppen verglichen. In diesem Versuch werden fünf Versuchsgruppen mit Ratten eingesetzt, die erhalten: 1) Mittel-Träger + Cytotoxin-Träger, 2) Mittel-Träger + Cytotoxin, 3) Mittel + Cytotoxin-Träger und 4) Mittel + Cytotoxin.

Claims

Verwendung eines Hämoproteins zur Herstellung eines Medikaments zur enzymatischen Reduzierung der Sauerstoffkonzentration in einem Säuger, worin eine wirksame Menge besagten Hämoproteins, das eine Desoxygenase-Aktivität besitzt, an besagten Säuger verabreicht werden soll.
Die Verwendung nach Anspruch 1: (a) außerdem umfassend Verabreichen entweder eines Reduktionsmittels an besagten Säuger, worin das Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus NADH, NADPH und einem Thiol, oder NO oder einer NO-Quelle an besagten Säuger; und/oder (b) worin besagtes Hämoprotein ein natürlich vorkommendes Hämoprotein oder eine enzymatisch aktive Variante davon ist, und gegebenenfalls worin besagtes Hämoprotein aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Ascaris Hämoglobin, Myoglobin, einem Flavohämoglobin und einer enzymatisch aktiven Variante eines der vorhergehenden Stoffe; und/oder (c) worin die Sauerstoffkonzentration in einem Tumor in einem Säuger reduziert wird, und gegebenenfalls entweder (i) worin besagtes Hämoprotein aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Ascaris Hämoglobin, Myoglobin, einem bakteriellen Flavohämoglobin und einer enzymatisch aktiven Variante eines der vorhergehenden Stoffe; und/oder (ü) außerdem umfassend Verabreichen eines Reduktionsmittels an besagten Säuger, und gegebenenfalls worin besagtes Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus NADH, NADPH und einem Thiol.
Die Verwendung nach Anspruch 1, worin der Säuger eine Erkrankung hat, die durch pathologisch proliferierende Zellen gekennzeichnet ist.
Die Verwendung nach Anspruch 3: (a) worin der Säuger einen Tumor hat; (b) worin der Säuger eine Prostatahypertrophie oder Restenose hat; (c) worin die Erkrankung Krebs ist und gegebenenfalls worin das Flavohämoglobin in einen Tumor lokal verabreicht wird, außerdem umfassend Verabreichen eines Reduktionsmittels an besagten Säuger, und worin besagtes Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus NADH, NADPH und einem Thiol.
Die Verwendung nach Anspruch 1, außerdem umfassend Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines oder mehrerer biologisch reduzierender cytotoxischer Mittel an besagten Säuger, worin besagter Säuger einen Tumor hat.
Die Verwendung nach Anspruch 5: (a) worin besagtes Hämoprotein aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Ascaris Hämoglobin, Myoglobin, einem bakteriellen Flavohämoglobin und einer enzymatisch aktiven Variante eines der vorhergehenden Stoffe; (b) außerdem umfassend Verabreichen eines Reduktionsmittels an besagten Säuger, und gegebenenfalls worin besagtes Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus NADH, NADPH und einem Thiol; (c) worin besagtes Hämoprotein und besagtes biologisch reduzierendes cytotoxisches Mittel lokal verabreicht werden.
Verwendung eines NO-verbrauchenden Hämoproteins zur Herstellung eines Medikaments zur enzymatischen Reduzierung der Stickstoffmonoxid-Konzentration in einem Säuger, worin eine wirksame Menge des NO-verbrauchenden Hämoproteins an besagten Säuger verabreicht werden soll.
Die Verwendung nach Anspruch 7, worin besagtes Hämoprotein aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Ascaris Hämoglobin, Myoglobin, einem Flavohämoglobin und einer enzymatisch aktiven Variante eines der vorhergehenden Stoffe, und gegebenenfalls worin besagtes Hämoprotein ein bakterielles Flavohämoglobin ist.
Die Verwendung nach Anspruch 7, worin Blutgefäße in besagtem Säuger konstringiert werden.
Die Verwendung nach Anspruch 7, worin der Blutfluss in einem Tumor des Säugers reduziert wird, und worin das Hämoprotein in den Tumor eingeführt wird.
Die Verwendung nach Anspruch 7, worin das Hämoprotein ein Flavoprotein ist und der Säuger eine Krankheit oder Erkrankung hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Entzündung, Schlaganfall, septischem Schock, Arthritis, Iritis, Colitis ulcerosa, akutem Atemnotsyndrom (ARDS) und Herzinsuffizienz.
Die Verwendung nach Anspruch 11, worin das Flavohämoglobin ist: (a) mittels lokaler Injektion verabreicht; (b) intravenös verabreicht; (c) von Escherichia coli; oder (d) von Saccharomyces cerevisiae.
Verwendung von Hämoprotein zur Herstellung eines Medikaments zur enzymatischen Erzeugung toxischer reaktiver Sauerstoff-Spezies in einem Säuger, worin eine wirksame Menge des Hämoproteins an den Säuger verabreicht werden soll.
Die Verwendung nach Anspruch 13: (a) worin das Hämoprotein ein Flavohämoglobin ist; (b) außerdem umfassend Verabreichen eines Reduktionsmittels an besagten Säuger, und gegebenenfalls worin besagtes Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus NADH, NADPH und einem Thiol; oder (c) worin besagte reaktive Sauerstoff-Spezies Wasserstoffperoxid oder Superoxid ist.
Die Verwendung nach Anspruch 13, umfassend Verabreichen einer Bestrahlung oder Chemotherapie an den Säuger zur Behandlung eines Tumors.
Eine Zusammensetzung umfassend ein oder mehrere Hämoproteine mit Desoxygenase-Aktivität oder NO-verbrauchender Aktivität und einen physiologisch verträglichen Träger.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 16: (a) außerdem umfassend ein oder mehrere cytotoxische Mittel und gegebenenfalls worin mindestens eines der besagten cytotoxischen Mittel ein biologisch reduzierendes toxisches Mittel ist; (b) worin mindestens ein Hämoprotein ein natürlich vorkommendes Hämoprotein oder eine enzymatisch aktive Variante davon ist, worin besagtes Hämoprotein aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Ascaris Hämoglobin, einem Myoglobin, einem Flavohämoglobin und einer enzymatisch aktiven Variante eines der vorhergehenden Stoffe; und gegebenenfalls ein Flavohämoglobin wie beispielsweise ein bakterielles Flavohämoglobin, ein Hefe-Flavohämoglobin oder ein E. coli Flavohämoglobin ist; und/oder (c) worin besagte Zusammensetzung außerdem ein Reduktionsmittel umfasst, und gegebenenfalls worin das besagte Reduktionsmittel NADH, NADPH oder ein Thiol ist.
Ein Hämoprotein mit Desoxygenase-Aktivität außer Myoglobin zur therapeutischen Anwendung.
Das Hämoprotein gemäß Anspruch 18, worin die Therapie wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert ist.
Das Hämoprotein gemäß Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin das Hämoprotein entweder Ascaris Hämoglobin oder Flavohämoglobin ist.