CN108410909B

CN108410909B - 一种利用植物激素aba及小分子物质pyr调节细胞通路的方法

Info

Publication number: CN108410909B
Application number: CN201810323843.3A
Authority: CN
Inventors: 左泽乘; 张力; 莫伟亮; 张峻川; 李苏迪; 石翔; 肖勇; 张文礼; 张宝昌
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2018-04-12
Filing date: 2018-04-12
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2038-04-12
Also published as: CN108410909A

Abstract

本发明提供了一种利用植物激素ABA及小分子物质PYR调节细胞通路的方法。将拟南芥内ABA受体蛋白ABI1以及PYR1构建在人细胞表达载体上，然后分别转入HEK293T细胞，加入ABA，两个受体蛋白就会发生诱导性互作，加入抑制剂PYR后，互作程度会减弱。将其他人细胞信号通路关键蛋白与这两个受体蛋白融合后，两个受体蛋白在ABA诱导下互作，导致融合的信号通路也发生ABA诱导性聚集。本发明选择了人Wnt通路上的关键蛋白LRP6。融合表达ABA受体以及LRP6以后，LRP6会在ABA诱导下聚集，进而促进β‑连环蛋白的产生，打开细胞内的信号通路，加入PYR抑制后，β‑连环蛋白产生量减少，细胞通路关闭。

Description

一种利用植物激素ABA及小分子物质PYR调节细胞通路的方法

技术领域

本发明涉及生物方法发明领域，具体的说，是一种利用植物激素ABA及小分子物质PYR调节细胞通路的方法。

背景技术

光遗传学（Optogenetics）主要是利用光受体在收到光诱导后能够发生多聚化或者光受体能够和其互作蛋白发生光特异性互作，然后偶联上相关信号转导蛋白来调控细胞信号转导。到目前为止，许多光受体被改良，用于融合信号通路上的关键蛋白，来调控和控制生物体内的众多通路，如受体酪氨酸激酶Ras-MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和Wnt信号通路。在基因水平上, 研究者利用CRY2-CIB1、FKF1-GI、UVR8-COP1和LOV蛋白等元件来调控哺乳动物细胞中特定基因的转录表达。有研究将拟南芥蓝光受体CRY2与Wnt信号通路内的LRP6蛋白融合表达，实验证明，蓝光诱导下CRY2的聚集同样使融合表达的LRP6发生聚集作用。

2015年，麻省理工大学的张峰实验室利用免疫抑制因子雷帕霉素（Rapamycin）以及其受体蛋白与dCas9构成了一个转录激活系统。张峰将受体蛋白FKBP与dCas9的C端以及转录激活子VP64融合表达；FRB与dCas9的N端融合表达。将这两个载体以及sgRNA共同转入细胞内，雷帕霉素处理后，靶基因的转录被激活。然而，此方法和光遗传学都有一定限制。雷帕霉素是免疫抑制子，对免疫系统有一定伤害；光遗传学的系统不适合于细胞内的光信号通路的调控。

受到光遗传学（optogenetics）中利用光受体进而调控相关细胞信号通路的启发，我们设想利用化学小分子物质植物激素ABA来诱导受体蛋白的互作，从而来调控细胞信号转导。

脱落酸（Abscisic Acid，ABA）作为一种植物激素，自20世纪60年代发现和鉴定以来，多项研究表明其可参与植物中许多细胞信号转导途径，在植物的生长发育以及对胁迫环境的抗逆性中具有极其重要的作用。ABA是一种天然的植物激素，具有对生物无毒害作用，方便易得，成本低廉等优点。2009年,Ma和Park研究小组分别利用酵母双杂交和化学方法来筛选突变体等手段在拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.) Heynh)中确定出一种新的ABA受体家族— PYR/PYL/RCAR 蛋白受体家族,并证实了其在ABA信号转导途径中扮演着一种重要角色。研究表明，2C型蛋白磷酸酶（PP2Cs）是ABA信号途径中的负调控因子,PYR/PYL/RCAR受体蛋白家族可以和ABA结合，只有结合了ABA的受体蛋白才可以与PP2C家族蛋白产生互作，抑制PP2C的磷酸酶活性进而启动ABA信号的转导。ABA抑制剂Pyrabactin（PYR）和ABA有相似的结构，都能被ABA受体蛋白所结合，然而，结合了PYR的受体蛋白无法与PP2C蛋白家族产生互作，所以可以说，PYR是ABA的竞争性抑制剂。

利用ABA诱导PYR1与ABI1蛋白互作，PYR抑制这个过程的特性，以及光遗传学的原理，我们试着研发一种以无毒害的天然植物激素为诱导剂，调控细胞内信号通路的系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用植物激素ABA及小分子物质PYR调节细胞通路的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用植物激素ABA及小分子物质PYR调节细胞通路的方法，包括以下方法：

（1）载体设计以及构建：

首先利用权利要求1所述的引物，以拟南芥cDNA和HEK293T细胞cDNA为模板，利用pcr技术将各基因片段扩增出来，然后利用对应引物，用两段片段为模板，进行overlapPCR；此时将ABI1以及PYR1与Wnt信号通路内的关键蛋白质LRP6的C端，融合到一起，利用琼脂糖凝胶回收ABI1、PYR1、ABI1-LRP6C、PYL1-LRP6C等PCR产物，用内切酶XbaI XmaI双酶切线性化的pCIi 4xmyc、pCI egfp、以及pCI mcherry载体，利用Infusion的方法连接，转化DH5a，菌落pcr验证，挑取克隆送测序，测序正确的保菌；利用以上操作，构建好了动物表达载体pCI-neo egfp ABI1、pCI-neo 4xMYC PYR1、pCI-neo mcherry PYR1-LRP6C、pCI-neo4xMYC PYR1-LRP6C、pCI-neo egfp ABI1-LRP6C；

（2）动物细胞的培养以及转染：

将冻存的HEK293T细胞从液氮中取出，37℃水浴迅速复苏细胞，接着放入离心机，800g离心5min，弃上清，加入1ml DMEM高糖细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液加入含有预热过的10mlDMEM培养基的细胞培养瓶中，24h后更换培养基，待细胞的生长率到90%，将细胞重悬并且转移至6孔板内，转移24h后，进行PEI细胞转染，在六孔板每孔转染pCI-neo egfpABI1、pCI-neo 4xMYC PYR1或pCI-neo 4xMYC PYR1-LRP6C、pCI-neo egfp ABI1-LRP6C2种质粒各2微克；

（3）ABA以及PYR的给药

转染24h后，加入终浓度为250μM的ABA，和细胞在37℃，5%CO₂中共同孵育12h，再加入终浓度为10μM的抑制剂PYR，孵育3h。孵育完成后，重悬细胞，利用细胞裂解液裂解，利用Western进行检测。

所述的pci 4xmyc以及pci mcherry载体构建方法为：分别设计PCR引物如下：

Myc F :ctagcctcgagaattcatggggttaattaacggtg；

Myc R: TACCACGCGTGAATTCGCTACCGTTCAAGTCTTCC；

mcherry F： ctagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagg；

mcherry R： TACCACGCGTGAATTCCTACTTGTACAGCTCGTCCA；

以4xmyc（SEQ ID NO.19）、mcherry（SEQ ID NO.20）为模板，扩增出来myc，mcherry片段，然后利用EcoRI酶单酶切pci neo载体，将其分别和线性化载体连接，构建成pci 4xmyc以及pci mcherry。

Pci Egfp载体：设计Egfp引物如下：

Egfp F‘ cagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagga

Egfp R‘：TACCACGCGTGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG

pcr扩增出egfp产物，然后和EcoRI线性化的PCI（neo）载体连接构建成pci egfp载体。

本发明的优点在于：

以往人为调控细胞内信号通路的方式都是由一些抗生素，如雷帕霉素，或者是由光，如光遗传学来实现的，这些方法都或多或少会对细胞有一定的损伤。本发明通过以对人细胞完全没有副作用的天然植物激素ABA作为诱导剂，不仅仅能降低调控时对人细胞的损伤，而且可以方便，高效，低成本的对大批量的细胞进行诱导。

附图说明

图1 pCI-neo 4xMYC PYR1相关载体设计图。

图2 pCI-neo egfp ABI1相关载体设计图。

图3 pCI-neo 4xMYC PYR1-LRP6C相关载体设计图。

图4 pCI-neo egfp ABI1-LRP6C相关载体设计图。

图5 pCI-neo mcherry PYR1-LRP6C相关载体设计图。

图6 CoIP实验图，其中 ABI1与PYR1转染细胞后加入250Μ ABA，12h后加入10μM抑制剂PYR, 3h后wenstern检测蛋白，发现ABI1和PYR1在ABA存在互作作用，加入抑制剂后互作减少。

图7 BiFC实验图，其中将ABI1与PYR1各自和荧光蛋白YFP的两部分CYFP以及NYFP相连，转染293T细胞后，ABA以及PYR处理后，进行BiFC实验，荧光倒置显微镜检测荧光强度。

图8 融合表达蛋白CoIP实验图，其中将ABI1与PYR1和LRP6C融合表达后，共同转入HEK293T细胞中，ABA与PYR处理后进行CoIP检验，发现融合之后的蛋白一样能在ABA诱导下进行互作，而抑制剂可以减弱互作。

图9 融合表达蛋白mcherry荧光显色图，其中将GFP-ABI1-LRP6C以及mcherry-PYR1-LRP6C共同转入HEK293T细胞中，ABA以及PYR处理之后，放于荧光倒置显微镜中观测荧光情况。ABA诱导下，ABI1-LRP6C与PYR1-LRP6C产生聚集，而加入抑制剂后，聚集减少。

图10Western检测下游通路图，其中将ABI1-LRP6C以及PYR1-LRP6C共同转入HEK293T细胞中，ABA以及PYR处理之后，检测下游β-catenin的表达量。

具体实施方式

实施例1

一种利用植物激素ABA及小分子物质PYR调节人HEK293T细胞内Wnt信号通路的方法，包括以下方法：

（1）载体设计以及构建：

（3）动物细胞的培养以及转染：

将冻存的HEK293T细胞从液氮中取出，37℃水浴迅速复苏细胞，接着放入离心机，800g离心5min，弃上清，加入1ml DMEM高糖细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液加入含有预热过的10mlDMEM培养基的细胞培养瓶中，24h后更换培养基，待细胞的生长率到90%，将细胞重悬并且转移至6孔板内，转移24h后，进行PEI细胞转染，在六孔板每孔转染pCI-neo egfpABI1、pCI-neo 4xMYC PYR1各2微克；

（3）ABA以及PYR的给药

转染24h后，加入终浓度为250μM的ABA，和细胞在37℃，5%CO₂中共同孵育12h，再加入终浓度为10μM的抑制剂PYR，孵育3h。孵育完成后，重悬细胞，利用细胞裂解液裂解，利用Western进行检测。检测如图8-10，LRP6C在ABA的诱导下聚集，开启下游通路，下游蛋白β-连环蛋白的表达量上升。

Myc F :ctagcctcgagaattcatggggttaattaacggtg；

Myc R: TACCACGCGTGAATTCGCTACCGTTCAAGTCTTCC；

mcherry F： ctagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagg；

mcherry R： TACCACGCGTGAATTCCTACTTGTACAGCTCGTCCA；

以4xmyc（SEQ ID NO.19、mcherry（SEQ ID NO.20）为模板，扩增出来myc， mcherry片段，然后利用EcoRI酶单酶切pci neo载体，将其分别和线性化载体连接，构建成pci4xmyc以及pci mcherry。

Pci Egfp载体：设计Egfp引物如下：

Egfp F‘ cagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagga

Egfp R‘：TACCACGCGTGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大学

<120> 一种利用植物激素ABA及小分子物质PYR调节细胞通路的方法

<130> 22

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgtggtacc tctagaatgc cttcggagtt aacacc 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaagcggccg cccgggcgtc acctgagaac cacttc 36

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgtggtacc tctagaatgc cttcggagtt aacacc 36

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgagccaccg ccggaaccgc cacccgtcac ctgagaacca cttc 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcggtggct cgggaggtgg ctcaaggatg ttgtgtccac gtat 44

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagcggccg cccgggtcag gaggagtctg tacagg 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgtggtacc tctagaatgg tgagcaaggg cgagga 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaagcggccg cccgggtcag gaggagtctg tacagg 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcgtggtacc tctagaatgg aggaagtatc tccggc 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaagcggccg cccgggtcag ttcaagggtt tgctct 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcgtggtacc tctagaatgg aggaagtatc tccggc 36

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgagccaccg ccggaaccgc cacctcagtt caagggtttg ctct 44

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggcggtggct cgggaggtgg ctcaaggatg ttgtgtccac gtat 44

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaagcggccg cccgggtcag gaggagtctg tacagg 36

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctagcctcga gaattcatgg ggttaattaa cggtg 35

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

taccacgcgt gaattcgcta ccgttcaagt cttcc 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctagcctcga gaattcatgg tgagcaaggg cgagg 35

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

taccacgcgt gaattcctac ttgtacagct cgtcca 36

<210> 19

<211> 174

<212> DNA

<213> 4xmyc

<400> 19

atggggttaa ttaacggtga acaaaagcta atctccgagg aagacttgaa cggtgaacaa 60

aaattaatct cagaagaaga cttgaacgga ctcgacggtg aacaaaagtt gatttctgaa 120

gaagatttga acggtgaaca aaagctaatc tccgaggaag acttgaacgg tagc 174

<210> 20

<211> 708

<212> DNA

<213> mcherry

<400> 20

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cagcctcgag aattcatggt gagcaagggc gagga 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

taccacgcgt gaattccttg tacagctcgt ccatg 35

Claims

1.一种利用植物激素ABA及小分子物质PYR调节细胞通路的方法，其特征在于：采用以下引物：

PYR-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGCCTTCGGAGTTAACACC，

PYR-R：GAAGCGGCCGCCCGGGCGTCACCTGAGAACCACTTC；

PYR1-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGCCTTCGGAGTTAACACC，

PYR-LRP6C-R：CGAGCCACCGCCGGAACCGCCACCCGTCACCTGAGAACCACTTC；

LRP6C-F：GGCGGTGGCTCGGGAGGTGGCTCAAGGATGTTGTGTCCACGTAT，

LRP6C-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGGAGGAGTCTGTACAGG；

PYR1-mcherry-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA，

LRP6C-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGGAGGAGTCTGTACAGG；

ABI1-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGGAGGAAGTATCTCCGGC，

ABI1-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGTTCAAGGGTTTGCTCT；

ABI1-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGGAGGAAGTATCTCCGGC，

ABI-LRP6C-R：CGAGCCACCGCCGGAACCGCCACCTCAGTTCAAGGGTTTGCTCT；

LRP6C-F：GGCGGTGGCTCGGGAGGTGGCTCAAGGATGTTGTGTCCACGTAT，

LRP6C-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGGAGGAGTCTGTACAGG；

包括以下步骤：

（1）载体设计以及构建：

首先利用所述的引物，以拟南芥cDNA和HEK293T细胞cDNA为模板，利用pcr技术将各基因片段扩增出来，然后利用对应引物，用两段片段为模板，进行overlap PCR；此时将ABI1以及PYR1与Wnt信号通路内的关键蛋白质LRP6的C端，融合到一起，利用琼脂糖凝胶回收PCR产物ABI1、PYR1、ABI1-LRP6C、PYL1-LRP6C ，用内切酶XbaI XmaI双酶切线性化的pCIi 4xmyc、pCI egfp、以及pCI mcherry载体，利用Infusion的方法连接，转化DH5a，菌落pcr验证，挑取克隆送测序，测序正确的保菌；利用以上操作，构建动物表达载体pCI-neo egfp ABI1、pCI-neo 4xMYC PYR1、pCI-neo mcherry PYR1-LRP6C、pCI-neo 4xMYC PYR1-LRP6C、pCI-neoegfp ABI1-LRP6C；

（2）动物细胞的培养以及转染：

将冻存的HEK293T细胞从液氮中取出，37℃水浴迅速复苏细胞，接着放入离心机，800g离心5min，弃上清，加入1ml DMEM高糖细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液加入含有预热过的10ml DMEM培养基的细胞培养瓶中，24h后更换培养基，待细胞的生长率到90%，将细胞重悬并且转移至6孔板内，转移24h后，进行PEI细胞转染，在六孔板每孔转染pCI-neo egfpABI1、pCI-neo 4xMYC PYR1或pCI-neo 4xMYC PYR1-LRP6C、pCI-neo egfp ABI1-LRP6C各2微克；

（3）ABA以及PYR的给药

转染24h后，加入终浓度为250μM的ABA，和细胞在37℃，5%CO₂中共同孵育12h，再加入终浓度为10μM的抑制剂PYR，孵育3h;

孵育完成后，重悬细胞，利用细胞裂解液裂解，利用Western进行检测。