CN109182368B

CN109182368B - 一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法

Info

Publication number: CN109182368B
Application number: CN201811251416.5A
Authority: CN
Inventors: 聂鑫怡; 张轶; 王银春; 李博文; 王秀娜; 汪世华
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2038-10-25
Also published as: CN109182368A

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，属于微生物学领域。该方法包括以下步骤：双元载体pAg1‑H3酶切去除潮霉素抗性基因片段，与含有来源于米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段连接，构建成pAg1‑Pt双元载体；双元载体pAg1‑Pt质粒转化农杆菌，获得农杆菌阳性转化子，制备菌液；制备黄曲霉菌丝均质液；将制备所得菌液与制备所得的菌丝均质液混合后共培养，进行黄曲霉的遗传转化；选择性培养，筛选黄曲霉转化子并鉴定阳性克隆。本发明以黄曲霉菌丝体作为转化受体，不受黄曲霉菌株产孢能力的限制，转化效率高且稳定，对不同遗传背景和营养缺陷型的黄曲霉菌株均适用。

Description

一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法。

背景技术

黄曲霉（Aspergillus flavus）可以寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖，并产生黄曲霉毒素，其中以黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的危害最大，具有强肝脏毒性和致癌效应。目前全球每年有25%农作物被霉菌毒素污染，其中最为严重的就是黄曲霉毒素的污染。我国花生和玉米被黄曲霉污染的情况比较普遍，畜禽饲料和水产饲料的黄曲霉污染则更为严重。因此，预防和控制黄曲霉污染具有重大的意义。目前，研究人员尝试了多种不同的方法来防控黄曲霉及黄曲霉毒素的污染，例如培育抗黄曲霉作物、用不产毒黄曲霉菌株进行种群替换以及运用一些分子生物学手段来控制黄曲霉产毒等。这些方法都依赖于对黄曲霉菌株进行遗传操作和分子生物学研究。而建立高效、稳定的黄曲霉遗传转化体系，则是对黄曲霉进行遗传操作和分子生物学研究的前提和基础。

目前，常用的丝状真菌的遗传转化方法包括原生质体转化法、农杆菌转化法、电转化法、基因枪转化法等。在黄曲霉遗传转化的操作中，多采用原生质体转化法，即先使用细胞壁水解酶类处理黄曲霉新鲜菌丝，以产生的原生质体为受体，通过PEG-CaCl₂介导使外源DNA与原生质体融合转化。该方法的缺点是原生质体的制备过程繁琐，耗时长，所需的水解酶费用高昂，且制备的原生质体较脆弱，容易死亡，再生培养难度大，融合诱导剂PEG对原生质体具有一定的毒性，其后期得到的转化子数量有限。虽然也曾有报道用农杆菌转化法对黄曲霉进行遗传操作，但他们是以孢子作为农杆菌侵染的受体进行转化（Liu W, Sun Y,Chen W et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2012, 56(5):2598-2603; Han G,Shao Q, Li C et al., J. Microbiol. 2018, 56(5):356-364）。这种农杆菌介导的黄曲霉转化法依赖于无性分生孢子的产生，对于不产孢的黄曲霉菌株，特别是生物学研究过程中构建的基因突变菌株，以孢子作为受体的农杆菌转化就无法施行，也就无法对这些菌株继续进行遗传操作和深入研究。另外，在对黄曲霉进行生物学研究时，往往需要几种不同的遗传转化筛选标记。由于不同黄曲霉菌株的遗传背景和营养缺陷存在差异，有限的几种筛选标记常常不能充分满足科学研究的需求。吡啶硫胺抗性基因ptrA来源于米曲霉，以往是在黄曲霉的原生质体转化中应用，不受菌株遗传背景和营养缺陷的限制，是个有效的抗性筛选标记，但还未在农杆菌介导的黄曲霉转化中应用过。因此，黄曲霉还缺少一套简单高效、费用低廉且不受菌株产孢能力、遗传背景和营养缺陷类型限制的农杆菌遗传转化系统。构建一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝体为受体的遗传转化方法，对于推动黄曲霉功能基因组学及分子生物学等研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，以解决黄曲霉遗传转化通常需要制备原生质体，且步骤繁琐、费用高昂的问题，同时能够解决不产孢黄曲霉菌株的遗传转化问题。

本发明的另一目的在于提供一种吡啶硫胺抗性基因ptrA在农杆菌介导的黄曲霉遗传转化中的应用，以吡啶硫胺抗性基因ptrA作为黄曲霉抗性筛选标记，从而解决不同遗传背景、营养缺陷型的黄曲霉菌株进行农杆菌介导的遗传转化时筛选标记受限的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，该转化方法以携带双元载体的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染黄曲霉（Aspergillus flavus）的菌丝。

一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，该转化方法农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染受体为黄曲霉（Aspergillus flavus）的菌丝。

作为优选，所述的农杆菌采用农杆菌菌株AGL-1、GV3101、LBA4404、EHA105；最优选，农杆菌为农杆菌菌株AGL-1。

作为优选，所述农杆菌的双元载体以pAg1-H3载体（Zhang A, Lu P, Dahl-RoshakAM et al., Mol. Genet. Genomics, 2003, 268(5):645-655）酶切去除潮霉素抗性基因片段后的部分为骨架，再与含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因（Pyrithiamineresistant gene）ptrA作为黄曲霉遗传转化筛选标记的目的片段连接，构建pAg1-Pt表达载体进行农杆菌介导的黄曲霉的遗传转化。该载体也能广泛应用于其他对吡啶硫胺敏感的丝状真菌的遗传操作和生物学研究。

上述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，该方法包括以下步骤：

（1）先将双元载体pAg1-H3酶切去除潮霉素抗性基因片段，再与含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段连接，构建成pAg1-Pt双元载体；

（2）将双元载体pAg1-Pt质粒转化农杆菌，获得农杆菌阳性转化子，制备阳性转化子农杆菌菌液；

（3）制备黄曲霉菌丝均质液；

（4）将步骤（2）制备所得阳性转化子农杆菌菌液与步骤（3）制备所得黄曲霉菌丝均质液混合后共培养，进行黄曲霉的遗传转化；

（5）选择性培养，筛选黄曲霉转化子并鉴定阳性克隆。

作为优选，上述的步骤（1）包括以下具体步骤：

（a）将双元载体pAg1-H3用酶切去除潮霉素抗性基因片段，回收pAg1载体片段；（b）将步骤（a）回收的pAg1载体片段与含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段连接，构建pAg1-Pt双元载体。进一步的，步骤（b）所述含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段，从米曲霉基因组DNA上通过PCR方法扩增得到，或以含有来源于米曲霉ptrA基因的各种载体质粒为模板通过PCR扩增得到，或从含有来源于米曲霉ptrA基因的各种载体质粒上通过酶切回收得到；更进一步的，所述含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段，除了具有筛选标记基因ptrA元件外，还包括启动子（P_gpdA、P_trpC、P_glaA、P_alcA、P_alcC、P_amdS、P_tpiA、P_exlA、P_glaA、P_gdhA、P_amyA、P_amyB、P_aphA、P_sucA、P_adhA、P_pkiA、P_sodM、P_pgkA、P_hlyA和P_enoA等）、报告基因（mcherry、rfp、Dsred、gfp、egfp、sgfp、yfp、eyfp、cfp、ecfp、bfp、ebfp、cat、gal、gus、lux、luc、Rluc和seap等）和终止子（T_trpC、T_gpdA、T_sumO、T_CYC1和T_cgrA等）中的任意一个或多个其他核苷酸序列。该pAg1-Pt双元载体也能广泛应用于其他对吡啶硫胺敏感的丝状真菌的遗传操作和生物学研究。

作为优选，上述的步骤（2）包括以下具体步骤：（a）步骤（1）构建的双元载体pAg1-Pt质粒转化农杆菌；（b）筛选鉴定获得农杆菌阳性转化子；（c）挑取农杆菌阳性转化子，接种到含有利福平和卡那霉素的LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm振荡培养20~48 h，离心，收集菌体；（d）用含有利福平、卡那霉素和乙酰丁香酮的IM培养基重悬菌体，将菌体浓度稀释至OD₆₀₀=0.1~0.2，28 ℃，220 rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.6~0.8，即得阳性转化子农杆菌菌液。其中，步骤（a）所述将双元载体pAg1-Pt质粒转化农杆菌的方法为本领域的技术人员所熟知，例如化学转化法、电穿孔转化法。

作为优选，上述步骤（3）包括以下具体步骤：（a）将黄曲霉菌丝或孢子接种于PDA培养基，37 ℃避光培养1~3 d；最优选，培养2 d；（b）洗脱PDA培养基表面的气生菌丝接种到YGT或GMM液体培养基中，最优选为GMM液体培养基，37 ℃，180rpm培养至菌丝球直径1~3mm；最优选，2 mm；（c）用无菌滤纸过滤去除培养基，收集50~100 mg菌丝球于1.5 mL无菌Eppendorf离心管；最优选，80 mg；（d）加入无菌小钢珠，用均质器将菌丝球均质化，用4~7mL含有利福平、卡那霉素和乙酰丁香酮的IM培养基重悬混匀得到黄曲霉菌丝均质液；最优选为5 mL。

作为优选，上述步骤（4）包括以下具体步骤：（a）将步骤（2）制备携带目的基因的农杆菌菌液与步骤（3）制备的黄曲霉菌丝均质液混合均匀；最优选，农杆菌菌液和黄曲霉菌丝均质液等体积混合均匀；（b）混合后的菌液涂布在预先铺有无菌玻璃纸的含有利福平、卡那霉素和乙酰丁香酮的CM培养基上；28 ℃避光培养12~36 h；最优选，培养24 h。

作为优选，上述步骤（5）包括以下具体步骤：（a）将步骤（4）共培养后的玻璃纸转移到含有噻孢霉素和吡啶硫胺的选择性固体培养基上，进行初次筛选，37 ℃培养至出现可见的单菌落；（b）挑取单克隆接种于新的含有吡啶硫胺的选择性固体培养基上进行二次筛选，并鉴定阳性克隆；（c）将步骤（b）获得的阳性克隆培养至产生无性分生孢子，分离孢子，涂布于新的含有吡啶硫胺的选择性固体培养基上，进一步筛选纯化阳性转化子；对于不产孢的菌株，将阳性克隆的菌丝在含有吡啶硫胺的选择性固体培养基上连续划线3~6次，进一步筛选纯化阳性转化子。其中，步骤（a）、（b）和（c）所述选择性固体培养基，最优选为GMM固体培养基；次优选为YGT固体培养基。

一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法中，所述利福平的终浓度为20或25 μg/mL；所述卡那霉素的终浓度为50、100或150 μg/mL；所述乙酰丁香酮的终浓度为100、200或400 μM,；所述噻孢霉素的终浓度为100、300或500 μg/mL；所述吡啶硫胺的终浓度为0.1、0.5或1 μg/mL；其中，优选的利福平终浓度为25 μg/mL，卡那霉素终浓度为100μg/mL，乙酰丁香酮终浓度为200 μM，噻孢霉素终浓度为300 μg/mL；初次筛选的吡啶硫胺的终浓度为0.5 μg/mL，二次筛选及进一步筛选的吡啶硫胺的终浓度为1μg/mL。

本发明所述培养基配方为：

LB液体培养基：Tryptone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0；

LB固体培养基：LB液体培养基配方的基础上加入1.5 %的琼脂；

GMM液体培养基：KH₂PO₄ 1.45 g/L；K₂HPO₄2.0 g/L；NaCl 0.3 g/L；MgSO₄·7H₂O0.6 g/L；CaCl₂·2H₂O 0.01 g/L；ZnSO₄·7H₂O 0.001 g/L；CuSO₄·5H₂O 0.001 g/L；MnSO₄·H₂O 0.001 g/L；NaMoO₄·2H₂O 0.001 g/L；H₃BO₃0.001 g/L；FeSO₄0.001 g/L；(NH4)₂NO₃0.5 g/L；Glucose 2.0 g/L；依据菌株营养缺陷背景需要补加相应营养物质；

GMM固体培养基：GMM液体培养基配方的基础上加入1.5 %的琼脂；

IM培养基：GMM培养基配方的基础上加入5% glycerol和40 mM MES (pH 5.3)；

CM培养基：IM培养基配方中的Glucose浓度改为1.0 g/L并加入终浓度为1.5% 的琼脂；

YGT液体培养基：Yeast extract 5.0 g/L；Glucose 20.0 g/L；FeSO₄·7H₂O 0.005g/L；MnCl₂·4H₂O 0.005 g/L；ZnSO₄·7H₂O 0.022 g/L；CuSO₄·5H₂O 0.002 g/L；CoCl₂·5H₂O 0.002 g/L；(NH4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.001 g/L；H₃BO₃0.011 g/L；EDTA 0.05 g/L；依据菌株营养缺陷背景需要补加相应营养物质；

YGT固体培养基：在YGT液体培养基的基础上加入终浓度为1.5 %的琼脂。

进一步的，LB培养基在使用时根据实际需要选择加入利福平和卡那霉素。

进一步的，IM培养基和CM培养基在使用时加入利福平、卡那霉素和乙酰丁香酮。

进一步的，GMM培养基和YGT培养基在使用时根据实际需要选择加入噻孢霉素和吡啶硫胺。

黄曲霉DNA提取裂解液成分包括：Tris-HCl (pH 8.0) 400 mM；EDTA（pH8.0） 60mM；NaCl 150 mM和1% SDS。

本发明的优点在于：本发明以黄曲霉菌丝体作为转化受体，利用农杆菌为介导，将目的基因转入黄曲霉的基因组中，获得了黄曲霉转基因菌株。该转化方法既无需制备黄曲霉原生质体，也不受黄曲霉菌株产孢能力的限制，过程简单，费用低廉，转化效率高且稳定，对于不同遗传背景和营养缺陷型的黄曲霉菌株，均能用此方法进行遗传转化，适用于黄曲霉基因组学及生物学等研究。

附图说明

图1为本发明中pAg1-Pt-gmC载体质粒构建过程中菌落PCR验证的琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道DS10000 marker表示DNA分子量标识，Positve表示阳性对照，Negative表示阴性对照，ddH₂O表示PCR扩增模板为无菌水，Transformant 1#和2#表示两个大肠杆菌转化子，箭头表示PCR鉴定扩增的目的片段ptrA- P_gpdA -mcherry。

图2为本发明中pAg1-Pt-gmC双元载体转化农杆菌AGL-1菌株转化子的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，图中DS2000 marker表示DNA分子量标识，Positve表示阳性对照，Negative表示阴性对照，ddH₂O表示PCR扩增模板为无菌水，AGL+pAg1-Pt-gmC T1#、T2#和T3#表示携带pAg1-Pt-gmC质粒的农杆菌阳性转化子，箭头表示PCR鉴定扩增的目的片段mcherry。

图3 为本发明中含终浓度为300 μg/mL噻孢霉素和终浓度为0.5 μg/mL吡啶硫胺的GMM固体培养基上长出的黄曲霉转化子图。

图4为本发明中农杆菌介导黄曲霉NRRL3357菌株遗传转化子的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，图中DS2000 marker表示DNA分子量标识，Positve表示阳性对照，Negative表示阴性对照，ddH₂O表示PCR扩增模板为无菌水，mcherry transformants 表示转化了外源目的基因mcherry的黄曲霉NRRL3357遗传转化子，箭头表示PCR鉴定扩增的目的片段mcherry。

图5 为本发明筛选所得遗传转化子的遗传稳定性鉴定图。筛选所得遗传转化子在不含吡啶硫胺的PDA固体培养基上，连续传代培养六次，扩增的目的片段mcherry。图中DS2000 marker表示DNA分子量标识；Positve表示阳性对照；Negative表示阴性对照；ddH₂O表示PCR扩增模板为无菌水；mcherry transformants 表示转化了外源目的基因mcherry的黄曲霉NRRL3357遗传转化子；箭头表示PCR鉴定扩增的目的片段mcherry。

图6展示了黄曲霉NRRL3357菌株转化外源目的基因mcherry的阳性转化子的荧光观察结果，其中A为明场观察结果，B为荧光观察结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或试剂生产商推荐的条件进行。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本实施例的使用材料来源如下：

农杆菌菌株AGL-1和载体pAg1-H3为中国农业科学院生物技术研究所岳群博士惠赠。大肠杆菌DH5α化学感受态细胞购自TransGen公司。

Phusion DNA polymerase，rTaq DNA polymerase，Restriction endonuclease购自Invitrogen公司；PDA培养基购自BD Difco公司；吡啶硫胺购自Sigma Aldrich公司；酵母提取物和琼脂糖为Oxiod公司产品；乙酰丁香酮、噻孢霉素、利福平、链霉素、卡那霉素、D-glucose和玻璃纸为Solarbio公司产品。其他常规化学试剂购自Sangon公司。

本实施方式中GMM液体培养基和IM培养基配方出自(Jan Utermark & PetrKarlvosky, Protocol Exchange, 2008. Doi:10.1038/nprot.2008.83.)并进行部分改动。GMM液体培养基具体成分如下：KH₂PO₄ 1.45 g/L；K₂HPO₄ 2.0 g/L；NaCl 0.3 g/L；MgSO₄·7H₂O 0.6 g/L；CaCl₂·2H₂ O 0.01 g/L；ZnSO₄·7H₂O 0.001 g/L；CuSO₄·5H₂O0.001 g/L；MnSO₄·H₂O 0.001 g/L；NaMoO₄·2H₂O 0.001 g/L；H₃BO₃ 0.001 g/L；FeSO₄0.001 g/L；(NH4)₂NO₃0.5 g/L；Glucose 2.0 g/L。本实施方式中，在GMM液体培养基配方的基础上加入5% glycerol和40 mM MES (pH 5.3)即为IM培养基。本实施方式中，将IM培养基配方中的Glucose浓度改为1.0 g/L并加入1.5% 的琼脂即为共培养的CM培养基。IM培养基和CM培养基在使用时加入终浓度为25 mg/L的利福平、终浓度为100 mg/L的卡那霉素和终浓度为200 μM的乙酰丁香酮。

本实施方式中黄曲霉DNA提取裂解液成分包括：Tris-HCl (pH 8.0)，400 mM；EDTA（pH8.0），60 mM；NaCl，150 mM和1% SDS。

本实施方式中黄曲霉菌丝均质化所需均质器为Bullet Blender Storm （ModelBBY24M, Next Advance, USA）。

实施例1、携带目的片段的pAg1-pt-mC双元载体的构建

将双元载体pAg1-H3用Hind III和Sma I双酶切去除潮霉素抗性基因片段，回收pAg1载体片段；通过PCR方法以pPTR I-mCherry质粒（Nie X, Yu S, Qiu M et al., J. Agric. Food Chem., 2016, 64(35):6772-6782）作为模板，用正向引物5’-TCGGTACCAAGGCCCGGGCATCCGG

ATGTCGAAGGCTTG-3’（SEQ ID NO.1）；和反向引物5’-GGGAGTCACGAAGCTTGGGC

AATTGATTACGGGA-3’（SEQ ID NO.2）扩增5227 bp目的片段ptrA-P_gpdA -mcherry，该目的片段含有来源于米曲霉的ptrA基因及其启动子和终止子序列（SEQ ID NO.3）、来源于构巢曲霉的gpdA启动子P_gpdA序列（SEQ ID NO.4）和来源于珊瑚纲动物的红色荧光蛋白基因序列mcherry（SEQ ID NO.5）。

将上述回收的pAg1载体片段与ptrA-P_gpdA -mcherry目的片段连接，导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有终浓度为100 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上筛选转化子，并用上述引物（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）进行菌落PCR鉴定阳性克隆。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，结果表明转化子Transformant 1#和2#都能扩增出5227 bp的ptrA-P_gpdA -mcherry目的片段，均为阳性克隆。DNA测序结果确认转化子1#和2#确实为阳性克隆，双元载体pAg1-Pt-gmC构建成功。本实施例挑取转化子1#载体质粒进行后续实验。

实施例2、携带目的基因的农杆菌菌液的制备

将农杆菌AGL-1菌株从-80 ℃取出，接种到含有终浓度为25 μg/mL利福平的LB固体培养基上，28 ℃活化培养至出现单克隆；挑取单克隆接种到3 mL LB液体培养基（含有终浓度为25 μg/mL利福平）中，28 ℃，220 rpm振荡培养24 h；取上述菌液按1:50比例接种到100 mL LB液体培养基（含有终浓度为25 μg/mL利福平）中，28 ℃，220 rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.5；冰浴菌液30 min，4200 rpm，4 ℃离心10 min，收集菌体，去上清，用预冷的20 mMCaCl₂重悬洗涤菌体，冰上放置20 min；4200 rpm，4 ℃离心10 min，收集菌体，去上清，用5mL预冷的含有20wt %甘油的20 mM CaCl₂重悬菌体，分装成100 μL/管，液氮速冻后保存于-80℃，即为农杆菌感受态细胞。

将上述农杆菌感受态细胞置于冰上融化，加入约1 μg实施例1中构建的pAg1-Pt-gmC质粒，轻轻混匀，在液氮中速冻5 min；42 ℃热击2 min，冰上放置2 min，加入500 μL LB液体培养基，于28 ℃，220 rpm振荡培养2 h；4200 rpm，离心10 min，吸去500μL LB液体培养基，余下100 μL LB液体培养基重悬菌体，涂布于LB固体培养基（含有终浓度为25 μg/mL利福平和终浓度为100 μg/mL卡那霉素）上筛选转化子，并用mcherry基因片段的正向引物5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’（SEQ ID NO.6）和反向引物5’-CTTGTACAGCTCGTCCAT-3’（SEQID NO.7）进行菌落PCR鉴定阳性克隆。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，结果表明转化子AGL+pAg1-Pt-gmC T1#、T2#和T3#都能扩增出与阳性对照大小一致的711 bp的mcherry基因片段，均为阳性克隆。本实施例挑取农杆菌转化子T1#进行后续实验。

将上述农杆菌阳性转化子T1#接种到LB液体培养基（含有终浓度为25 μg/mL利福平和终浓度为100 μg/mL卡那霉素）中，28 ℃，220 rpm振荡培养48 h，离心，收集菌体；用IM培养基（含有终浓度为25 μg/mL利福平、终浓度为100 μg/mL卡那霉素和终浓度为200 μM乙酰丁香酮）重悬菌体，将菌体浓度稀释至OD₆₀₀=0.2，28 ℃，220 rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.6，即得到携带目的基因的农杆菌菌液。

实施例3、黄曲霉菌丝均质液的制备

接种黄曲霉NRRL3357菌株孢子或菌丝于PDA固体培养基上，37 ℃避光培养2天；洗脱培养基表面的气生菌丝接种于GMM液体培养基中，37 ℃，180rpm振荡培养12小时至菌丝球直径为2 mm；用无菌滤纸过滤去除培养基，收集80 mg菌丝球于1.5 mL无菌离心管，加入直径2 mm的无菌小钢珠，用均质器在第12档均质化菌丝球20 min，用5 mL IM培养基（含有终浓度为25 μg/mL利福平、终浓度为100 μg/mL卡那霉素和终浓度为200 μM乙酰丁香酮）重悬混匀得到黄曲霉菌丝均质液。

实施例4、农杆菌介导的黄曲霉菌丝的遗传转化

将100 μL上述实施例2所得的携带目的基因的农杆菌菌液与100 μL上述实施例3所得的黄曲霉菌丝均质液混匀，涂布于预先铺有无菌玻璃纸的CM培养基（含有终浓度为25μg/mL利福平、终浓度为100 μg/mL卡那霉素和终浓度为200 μM乙酰丁香酮）上，28 ℃避光共培养24 h；将玻璃纸转移到GMM固体培养基（含有终浓度为300 μg/mL噻孢霉素和0.5 μg/mL吡啶硫胺）上，37 ℃培养至长出可见的单克隆，进行初次筛选（如图3）。

实施例5、黄曲霉转化子的筛选和鉴定

挑取单克隆接种于新的GMM固体培养基（含有终浓度为1 μg/mL吡啶硫胺）上进行二次筛选，再接种菌丝于GMM液体培养基（含有终浓度为1 μg/mL吡啶硫胺）中，37 ℃，180rpm振荡培养16 h；室温10000 rpm离心3 min，吸去培养基，加入500 μL黄曲霉DNA提取裂解液，65 ℃水浴30 min，加入150 μL KAc（5M，pH 4.8），混匀，12000 rpm，离心10 min；取上清，加入等体积异丙醇，12000 rpm，离心10 min沉淀基因组DNA；去上清，加入300 μL 70 %的乙醇洗涤沉淀，12000 rpm，离心5 min；去上清，干燥DNA，加入20 μL无菌水溶解DNA，用于后续PCR鉴定。

以上述抽提的黄曲霉转化子基因组DNA为模板，用上述mcherry基因片段的引物（SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7）进行PCR鉴定阳性克隆。图4所示为部分转化子PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果，表明这些黄曲霉转化子均能扩增出mcherry片段，均为阳性克隆。

由于本发明是将菌丝作为农杆菌介导的黄曲霉遗传转化的受体，菌丝均质液中可能仍然存在多细胞的菌丝碎片，因此我们看到的黄曲霉转化子可能不是由单一细胞长出的克隆。为了得到纯净的黄曲霉转化子，本实施例中进一步收集上述所筛到的阳性克隆所产生的无性分生孢子，按每个克隆50个孢子/板涂布在GMM固体培养基（含有终浓度为1 μg/mL吡啶硫胺）上，37 ℃培养至出现可见的单克隆，再次抽提基因组DNA进行PCR鉴定，即得纯净的转化了外源目的基因mcherry的黄曲霉NRRL3357遗传转化子；对于不产孢的菌株，将阳性克隆的菌丝在含有1 μg/mL吡啶硫胺的GMM固体培养基上连续划线3~6次，进一步筛选纯化阳性转化子。

实施例6 遗传转化子的遗传稳定性鉴定

经过多次试验，我们共挑取了128个单克隆，PCR鉴定得到102个阳性转化子，阳性率为79.7%。这些遗传转化子将进一步进行遗传稳定性检测。将转化了外源目的基因mcherry的黄曲霉NRRL3357遗传转化子接种于不含吡啶硫胺的PDA固体培养基上，连续传代培养六次，再转接到GMM液体培养基中37 ℃培养2 d，抽提基因组DNA，PCR鉴定外源基因mcherry是否还稳定存在，结果如图5所示。结果表明，95.2%的遗传转化子的基因组DNA仍然能够扩增出mcherry片段。说明用本发明建立的农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化系统是一个高效、稳定的遗传转化系统。

实施例7 遗产转化子的荧光性检测

本实施例进一步用荧光观察来更直观的验证之前PCR筛选得到的转化了外源目的基因mcherry的黄曲霉NRRL3357遗传转化子。用无菌吸头或接种针挑取上述黄曲霉遗传转化子新鲜的菌丝和分生孢子头，涂抹在滴有无菌水的载玻片上，盖上盖玻片，避免产生气泡，用荧光显微镜在552 nm激发波长下观察黄曲霉转化子的菌丝和孢子头中的mCherry荧光蛋白的表达情况。结果如图6所示，转化子的菌丝和孢子头都发出明显的红色荧光，证明本实施例通过PCR筛选鉴定得到的转化了外源目的基因mcherry的黄曲霉NRRL3357遗传转化子为正确的阳性转基因菌株。

以上实施例和实验结果从分子和细胞水平上证明了本发明构建的农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法的有效性，为黄曲霉基因组学和生物学等的研究提供了一种重要的方法和工具。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法

<130> 7

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcggtaccaa ggcccgggca tccggatgtc gaaggcttg 39

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggagtcacg aagcttgggc aattgattac ggga 34

<210> 3

<211> 2008

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggcaattga ttacgggatc ccattggtaa cgaaatgtaa aagctaggag atcgtccgcc 60

gatgtcagga tgatttcact tgtttcttgt ccggctcacc ggtcaaagct aaagaggagc 120

aaaaggaacg gatagaatcg ggtgccgctg atctatacgg tatagtgccc ttatcacgtt 180

gactcaaccc atgctattta actcaacccc tccttctgaa ccccaccatc ttcttccttt 240

tcctctcatc ccacacaatt ctctatctca gatttgaatt ccaaaagtcc tcggacgaaa 300

ctgaacaagt cttcctccct tcgataaacc tttggtgatt ggaataactg accatcttct 360

atagttccca aaccaaccga caatgtaaat acactcctcg attagccctc tagagggcat 420

acgatggaag tcatggaata cttttggctg gactctcaca atgatcaagg tatcttaggt 480

aacgtctttg gcgtgggccg gtgttcgttc ccagtcatcg atgcattcac atgccctccc 540

taagctgggc cctagactct aggatcctag tctagaagga catggcatcg atggactggg 600

ttcgttctga gattatacgg ctaaaacttg atctggataa taccagcgaa aagggtcatg 660

ccttctctcg ttcttcctgt tgatggaatg gctaacagat gatagtcatt gcaacttgaa 720

acatgtctcc tccagctgcc atctacgaac ccactgtggc cgctaccggc ctcaagggta 780

aggtcgtggt ttctgagacc gtccccgttg agggagcttc tcagaccaag ctgttggacc 840

atttcggtgg caagtgggac gagttcaagt tcgcccctat ccgcgaaagc caggtctctc 900

gtgccatgac cagacgttac tttgaggacc tggacaagta cgctgaaagt gacgttgtca 960

ttgttggtgc tggttcctgc ggtctgagca ctgcgtacgt cttggccaag gctcgtccgg 1020

acctgaagat tgctatcgtc gaggccagcg tctctcctgg tcagtagtcc atgatggatt 1080

gccttgcact cagctttccg gaactaacgt gcaataggtg gcggtgcctg gttgggtggc 1140

caactctttt ctgctatggt catgcgccgt cccgcggaag tcttcctgaa cgagctgggt 1200

gttccttacg aagaggacgc aaaccccaac tacgttgtcg tcaagcacgc ctccctgttt 1260

acctcgacac tcatgtcgaa ggttctctcc ttccccaatg tcaagctctt caatgctacc 1320

gctgttgagg acttgatcac ccgtccgacc gagaacggca acccccagat tgctggtgtt 1380

gtcgtcaact ggacgctggt cacccttcac cacgatgatc actcctgcat ggaccccaac 1440

actatcaacg ctcctgtcat catcagtacc actggtcacg atgggccatt cggcgccttc 1500

tgtgcgaagc gcttggtgtc catgggcagc gtcgacaagc taggtggcat gcgtggtctc 1560

gacatgagct cggccgagga tgccatcgtc aagaacaccc gcgaggttac taagggcttg 1620

ataatcggcg gtatggagct gtctgaaatt gatggcttta accgcatggg ccctaccttc 1680

ggtgccatgg ttctcagtgg tgtcaaggct gccgaggagg cattgaaggt gttcgacgag 1740

cgtcagcgcg agtgtgctga gtaaatgact cactacccga atgggttcag tgcatgaacc 1800

ggatttgtct tacggtcttt gacgataggg gaatgatgat tatgtgatag ttctgagatt 1860

tgaatgaact cgttagctcg taatccacat gcatatgtaa atggctgtgt cccgtatgta 1920

acggtggggc attctagaat aattatgtgt aacaagaaag acagtataat acaaacaaag 1980

atgcaagagc ggctcatcgt caccccat 2008

<210> 4

<211> 1357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catccggatg tcgaaggctt ggggcacctg cgttggttga atttagaacg tggcactatt 60

gatcatccga tagctctgca aagggcgttg cacaatgcaa gtcaaacgtt gctagcagtt 120

ccaggtggaa tgttatgatg agcattgtat taaatcagga gatatagcat gatctctagt 180

tagctcacca caaaagtcag acggcgtaac caaaagtcac acaacacaag ctgtaaggat 240

ttcggcacgg ctacggaaga cggagaagcc caccttcagt ggactcgagt accatttaat 300

tctatttgtg tttgatcgag acctaataca gcccctacaa cgaccatcaa agtcgtatag 360

ctaccagtga ggaagtggac tcaaatcgac ttcagcaaca tctcctggat aaactttaag 420

cctaaactat acagaataag atggtggaga gcttataccg agctcccaaa tctgtccaga 480

tcatggttga ccggtgcctg gatcttccta tagaatcatc cttattcgtt gacctagctg 540

attctggagt gacccagagg gtcatgactt gagcctaaaa tccgccgcct ccaccatttg 600

tagaaaaatg tgacgaactc gtgagctctg tacagtgacc ggtgactctt tctggcatgc 660

ggagagacgg acggacgcag agagaagggc tgagtaataa gcgccactgc gccagacagc 720

tctggcggct ctgaggtgca gtggatgatt attaatccgg gaccggccgc ccctccgccc 780

cgaagtggaa aggctggtgt gcccctcgtt gaccaagaat ctattgcatc atcggagaat 840

atggagcttc atcgaatcac cggcagtaag cgaaggagaa tgtgaagcca ggggtgtata 900

gccgtcggcg aaatagcatg ccattaacct aggtacagaa gtccaattgc ttccgatctg 960

gtaaaagatt cacgagatag taccttctcc gaagtaggta gagcgagtac ccggcgcgta 1020

agctccctaa ttggcccatc cggcatctgt agggcgtcca aatatcgtgc ctctcctgct 1080

ttgcccggtg tatgaaaccg gaaaggccgc tcaggagctg gccagcggcg cagaccggga 1140

acacaagctg gcagtcgacc catccggtgc tctgcactcg acctgctgag gtccctcagt 1200

ccctggtagg cagctttgcc ccgtctgtcc gcccggtgtg tcggcggggt tgacaaggtc 1260

gttgcgtcag tccaacattt gttgccatat tttcctgctc tccccaccag ctgctctttt 1320

cttttctctt tcttttccca tcttcagtat attcatc 1357

<210> 5

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggtgagca agggcgag 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cttgtacagc tcgtccat 18

Claims

1.一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于，以黄曲霉的菌丝作为农杆菌侵染的受体来进行黄曲霉的遗传转化；以来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA作为黄曲霉遗传转化的筛选标记；

包括以下步骤：

（3）制备黄曲霉菌丝均质液；

（5）选择性培养，筛选黄曲霉转化子并鉴定阳性克隆；

所述步骤（3）包括以下具体步骤：（a）将黄曲霉菌丝或孢子接种于PDA培养基，37 ℃避光培养1~3 d；（b）洗脱PDA培养基表面的气生菌丝接种到YGT或GMM液体培养基中，37 ℃，180rpm培养至菌丝球直径1~3 mm；（c）用无菌滤纸过滤去除培养基，收集50~100 mg菌丝球于1.5 mL无菌Eppendorf离心管；（d）加入无菌小钢珠，用均质器将菌丝球均质化，用4~7 mL含有利福平、卡那霉素和乙酰丁香酮的IM培养基重悬混匀得到黄曲霉菌丝均质液，即得黄曲霉菌丝均质液；

所述步骤（5）包括以下具体步骤：（a）将步骤（4）共培养后的玻璃纸转移到含有噻孢霉素和吡啶硫胺的选择性固体培养基上，进行初次筛选，37 ℃培养至出现可见的单菌落；（b）挑取单克隆接种于新的含有吡啶硫胺的选择性固体培养基上进行二次筛选，并鉴定阳性克隆；（c）将步骤（b）获得的阳性克隆培养至产生无性分生孢子，分离孢子，涂布于新的含有吡啶硫胺的选择性固体培养基上，进一步筛选纯化阳性转化子；对于不产孢的菌株，将阳性克隆的菌丝在含有吡啶硫胺的选择性固体培养基上连续划线3~6次，进一步筛选纯化阳性转化子。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤（1）包括以下具体步骤：（a）将双元载体pAg1-H3用酶切去除潮霉素抗性基因片段，回收pAg1载体片段；（b）将步骤（a）回收的pAg1载体片段与含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段连接，构建pAg1-Pt双元载体；所述含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段，除了具有筛选标记ptrA外，还包括启动子、报告基因、终止子中的任意一个或多个其他核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤（2）包括以下具体步骤：（a）双元载体pAg1-Pt质粒转化农杆菌；（b）筛选鉴定获得农杆菌阳性转化子；（c）挑取农杆菌阳性转化子，接种到含有利福平和卡那霉素抗生素的LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm振荡培养20~48 h，离心，收集菌体；（d）用含有利福平、卡那霉素和乙酰丁香酮的IM培养基重悬菌体，将菌体浓度稀释至OD₆₀₀=0.1~0.2，28 ℃，220 rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.6~0.8，即得阳性转化子农杆菌菌液。

4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法,其特征在于：步骤（4）包括以下具体步骤：（a）将步骤（2）制备阳性转化子农杆菌菌液与步骤（3）制备的黄曲霉菌丝均质液混合均匀；（b）混合后的菌液涂布在预先铺有无菌玻璃纸的含有利福平、卡那霉素和乙酰丁香酮的CM培养基上；28 ℃避光培养12~36 h。

5.根据权利要求4所述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于：步骤（a）中阳性转化子农杆菌菌液与黄曲霉菌丝均质液的混合比例为1:1。

6.根据权利要求1所述的任一项农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于：所述利福平的终浓度为20或25 μg/mL；所述卡那霉素的终浓度为50、100或150μg/mL；所述乙酰丁香酮的终浓度为100、200或400 μM；所述噻孢霉素的终浓度为100、300或500 μg/mL；所述初次筛选的吡啶硫胺的终浓度为0.5 μg/mL，二次筛选及进一步筛选的吡啶硫胺的终浓度为1μg/mL。