JP5733609B2 - 藻類を形質転換するために用いられる新規プロモーター - Google Patents
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Description
(2) 上記ポリヌクレオチド(1)の1または複数のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
(3) 上記ポリヌクレオチド(1)とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
また、本発明に係る藻類の形質転換方法は、上記ベクターを調製する工程;および、上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程;を含むことを特徴とする。
(1) 海産藻類に感染するウィルスのゲノムDNAの抽出
Tomaru,Y.ら,Aquatic Microbial Ecology,vol.50,pp.103-112(2008)に記載の方法に従って、中心目珪藻Chaetoceros debilisを宿主とするChaetoceros debilis DNAウィルス(CdebDNAV) CdebDNAV18株からゲノムを抽出した。
上記(1)で得たCdebDNAウィルスのゲノムDNAの配列情報を、Blast(DDBJ)を用いてデータベースと比較し、さらにORF finder(NCBI)を用いて、CdebDNAウィルスDNAに含まれるORFを検索し、ウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域を検出した。この配列中の翻訳開始点と思われるATG配列の上流+107から−370の領域を、CdP1L/attB1プライマー(配列番号2)およびCdP1−2R/attB4プライマー(配列番号3)を用いたPCR反応により増幅させた。なお、配列番号2における5〜31の塩基配列および配列番号3における5〜29の塩基配列は、後述するプラスミドの構築のためのBPクロナーゼ反応に必要なattB配列を示す。また、得られたCdebDNAウィルスプロモーターの塩基配列を配列番号1に示す。なお、配列番号1に示されているATGは開始コドンであり、プロモーターには含まれない。
(1) 各エントリークローンプラスミドの調製
上記実施例1で得たCdebDNAウィルスプロモーター、導入遺伝子としてゼオシン耐性遺伝子(ble)(Drocourt,D.ら,Nucleic Acids Research,18,p.4009(1990))、およびCylindrotheca fusiformisのfcpターミネーター(Poulsen,N.ら,FEBS Journal,272,pp.3413-3423(2005))がそれぞれ導入されたエントリークローンプラスミドベクターを、Multisite Gateway(登録商標) Pro Kit(invitrogen社製)を用いて調製した。
Gateway(登録商標) Vector Conversion System with One Shot(登録商標) ccdB Survival(登録商標) Competent Cells(invitrogen社製)を用いて、pBluescript SK-(Stratagene社製)へLRクロナーゼ反応に必要なattR配列を持つReading Frame Casetteを組み込むことにより、ディスティネーションプラスミドを調製した。
Multisite Gateway Pro Kit(invitrogen社製)を用い、上記実施例2(1)で得たエントリークローンプラスミドと、上記実施例2(2)で得たディスティネーションプラスミドとの間でLRクロナーゼ反応を行うことにより、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子およびターミネーターが連結されたエクスプレッションクローンプラスミドベクターを調製した。
目的とするエクスプレッションクローンプラスミドベクターが作製されたことを確認するために、Dideoxy法を用いて塩基配列を決定した。
抗生物質耐性遺伝子としてノールセオスリシン耐性遺伝子(nat)(Krugelら,1993年)を用い、ターミネーターとしてThalassiosira pseudonana由来のfcpターミネーター(Poulsen,N.ら,Journal of Phycology,42,pp.1059-1065(2006))を用い、上記実施例2と同様にCdebDNAウィルスプロモーターを含むベクターを調製した。
上記実施例2と同様にして、羽状目珪藻の内在性プロモーターを有し、また、抗生物質耐性遺伝子としてゼオシン耐性遺伝子(ble)とターミネーターとしてCylindrotheca fusiformisのfcpターミネーターが導入されたプラスミドベクター(比較例1)、および、中心目珪藻の内在性プロモーターを有し、また、抗生物質耐性遺伝子としてノールセオスリシン耐性遺伝子(nat)とターミネーターとしてThalassiosira pseudonana由来のfcpターミネーターが導入されたプラスミドベクター(比較例2)を調製した。
上記実施例2、上記比較例1および上記比較例3のプラスミドベクターを用い、羽状目珪藻Phaeodactylum tricornutumを形質転換した。
上記実施例3、上記比較例2および上記比較例4のプラスミドベクターを用い、上記実施例4と同様にして、中心目珪藻Chaetoceros sp.を形質転換した。ただし、細胞を培養する培地には、500μg/mLノールセオスリシンを添加した。結果を表1に示す。
配列番号3のプライマーに加え、配列番号6〜9のプライマーを用いた以外は上記実施例1と同様にして、CdebDNAウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域の翻訳開始点の上流部位である+107から、−72、−32、−2および+34までの塩基のDNA断片を、それぞれ増幅した。これらのエントリークローンと、上記実施例3において調製したノールセオスリシン耐性遺伝子(nat)を含むエントリークローンおよびThalassiosira pseudonana由来のfcpターミネーターを含むエントリークローンを用い、上記実施例2と同様にして、上記各エントリークローン、natおよびfcpターミネーターを連結したプラスミドを調製した。これらプラスミドは、図2と同様の構造を有する。これらプラスミドに加え、比較例2のプラスミドと、プロモーターを連結していないプラスミド(pNat/TpfcpTer)を用い、上記実施例4と同様の方法により形質転換を行った。結果を図5に示す。
本発明のプロモーターが、様々な珪藻種に対して適用か否か確認するために、上記実施例と異なる羽状目珪藻であるC. fusiformisを用いて形質転換を行った。CdebDNAウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域の翻訳開始点の上流部位である+107から−72までの塩基に加え、ゼオシン耐性遺伝子(ble)と、C. fusiformisのfcp遺伝子由来のターミネーターを組み込んだプラスミド(図6)を用いた。上記実施例4と同様に、プラスミドをタングステン粒子に固定化し、形質転換を行った。対照として、上記プロモーターを組み込まない以外は同様のプラスミド(pBle/CffcpTer)を用い、同様の実験を行った。本発明プロモーターを組み込んだプラスミドを用いた場合の珪藻の写真を図7(1)に、本発明プロモーターを組み込んでいないプラスミドを用いた場合の珪藻の写真を図7(2)に示す。
(1) 形質転換能について
上記実施例4〜5の結果のとおり、羽状目珪藻の内在性プロモーターを用いた場合には、羽状目珪藻は良好に形質転換できる一方で、中心目珪藻は全く形質転換できなかった。植物一般の形質転換によく用いられるカリフラワーモザイクウィルスプロモータの場合でも同様であり、羽状目珪藻は形質転換できたが、中心目珪藻は全く形質転換できていない。
一般的に、真核生物のプロモーター領域には、転写を開始させる転写結合因子が結合するコアプロモーター領域と、その上流に位置する遺伝子転写調節領域が存在する。ウィルスプロモーターにおいても同様に、TATAボックス(5’−TATAWAW−3’(式中、WはAまたはTを表す))やイニシエーターエレメント(Inr)といった真核生物のコアプロモーター領域によく見られるモチーフ配列が存在することが知られている。このことを踏まえ、本発明に係る配列番号1のプロモーターの塩基配列をPLACE Signal Scan Search(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)を用いて解析し、比較した。
上記実施例6の結果により、本発明プロモーターのCore elementは、CdebDNAウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域の−72から−33の間の配列(配列番号5)に存在している可能性が高いと考えられる。配列番号5の配列は、当該複製タンパク質遺伝子の上流域に位置するイニシエーターエレメントのおよそ30から70塩基上流側に位置していることから、当該イニシエーターエレメントがCore elementとして機能したとは考え難い。当該配列番号5の配列番号をPLACE Signal Scan Search(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)で解析したが、既知のモチーフ配列を見出すことはできなかった。よって、本発明プロモーターのCore elementは、これまで知られていない新規なものであると考えられる。
Claims (3)
- 下記(1)〜(3)の何れかの構造を有することを特徴とするプロモーター。
(1) 配列番号1または配列番号5の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(2) 上記ポリヌクレオチド(1)の1以上、10以下のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
(3) 上記ポリヌクレオチド(1)とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記ポリヌクレオチド(1)との相同性が90%以上であり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド - 請求項1に記載のプロモーター、および任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とするベクター。
- 請求項2に記載のベクターを調製する工程;および
上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程;
を含むことを特徴とする藻類の形質転換方法。
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