WO2010084969A1 - 藻類を形質転換するために用いられる新規プロモーター - Google Patents

藻類を形質転換するために用いられる新規プロモーター Download PDF

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WO2010084969A1
WO2010084969A1 PCT/JP2010/050843 JP2010050843W WO2010084969A1 WO 2010084969 A1 WO2010084969 A1 WO 2010084969A1 JP 2010050843 W JP2010050843 W JP 2010050843W WO 2010084969 A1 WO2010084969 A1 WO 2010084969A1
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promoter
vector
algae
polynucleotide
gene
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PCT/JP2010/050843
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真佐雄 足立
長崎　慶三
外丸　裕司
Original Assignee
国立大学法人高知大学
独立行政法人水産総合研究センター
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi

Definitions

  • the present invention relates to a novel promoter used for transforming algae, a vector containing the promoter, and a method for transforming algae using the vector.
  • algae inhabit abundant seawater and fresh water, so the amount is enormous and has a remarkable photosynthesis ability.
  • some algae produce useful compounds such as unsaturated fatty acids and antitumor compounds.
  • diatoms produce useful inorganic substances, a technique called biomineralization using diatoms has attracted attention.
  • algae can be said to be important organisms as useful resources.
  • transformation techniques for introducing useful genes are used. This transformation technique is also used for knocking out a specific gene or suppressing its function in order to elucidate the function of the gene.
  • virus-derived promoters are widely used instead of endogenous promoters.
  • CaMV35S promoter isolated from cauliflower mosaic virus (CaMV) that infects cruciferous plants is not limited to cruciferous plants and is used for transformation of a wide range of plants.
  • CMV promoter isolated from cytomegalovirus (CMV) and the SV40 promoter isolated from siamine virus 40 (SV40) are widely used.
  • Non-Patent Document 1 describes an experimental example in which the diatom Cycrotela cryptica was transformed using the CaMV35S promoter, but no transformant was obtained.
  • Non-Patent Document 2 when the GUS gene was introduced into the diatom Phaeodactylum tricornutum using CMV promoter, CaMV35S promoter and Rous sarcoma virus (RSV) promoter, GUS ( ⁇ -glucuronidase) was expressed in all cases. Is described.
  • Non-Patent Document 3 describes that GUS was expressed when the GUS gene was introduced into the dinoflagellates Amphidinium and Symbiodinium using the CaMV35S promoter.
  • Non-patent document 4 it has been reported that despite the hard efforts, other groups have succeeded in transforming dinoflagellates.
  • the CaMV35S promoter widely used for transformation of other plants has a very narrow range of application to algae. Since the algae is present in an enormous amount and there are species with various usefulness, it is desirable that the promoter used for transformation is applicable to a wide variety of algae. Furthermore, in general, the transformation efficiency of algae, especially marine algae is very low, and therefore, development of a highly efficient transformation technique is eagerly desired.
  • a problem to be solved by the present invention is to provide a highly efficient transformation technique as well as being applicable to a wide variety of algae.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems. As a result, the inventors found that a promoter located upstream of a gene thought to encode a replication protein of Chaetoceros debilis DNA virus (CdebDNAV) can efficiently transform a plurality of algae exceeding eyes (moku). completed.
  • CdebDNAV Chaetoceros debilis DNA virus
  • novel promoter according to the present invention is characterized by having any one of the following base sequences (1) to (3).
  • a polynucleotide constituting a non-coding region located upstream of a gene encoding a protein involved in CdebDNA virus replication (2) One or more nucleotides of the polynucleotide (1) are deleted, substituted or added
  • a polynucleotide that activates the expression of a gene encoding any protein in an algal cell (3) hybridizes with the above polynucleotide (1) under stringent conditions, and any protein A polynucleotide that activates the expression of a gene coding for algae in algal cells
  • the vector according to the present invention is characterized by containing the above novel promoter and a gene encoding an arbitrary protein.
  • the algal transformation method according to the present invention includes a step of preparing the vector; and a step of introducing the vector into an algal cell.
  • the Core element is included in the sequence between ⁇ 72 and ⁇ 33 in the upstream region of the gene encoding the protein involved in the replication of the CdebDNA virus. It is a figure which shows an example of the structure of the plasmid vector containing the promoter which concerns on this invention. It is a photograph which shows the result of the transformation experiment of C. fusiformis which is marine algae. (1) shows the results when the promoter of the present invention is used, and (2) shows the results when the promoter of the present invention is not used.
  • the first promoter according to the present invention comprises (1) a polynucleotide constituting a non-coding region located upstream of a gene encoding a protein involved in CdebDNA virus replication.
  • the Cdeb DNA virus is a virus that infects the diatom Chaetoceros debilis. Until now, there have been few reports of viruses that are infectious against algae, especially marine algae, but in recent years, the present inventors have succeeded in separating various viruses from algae such as raffido algae, dinoflagellates and diatoms. is doing.
  • the Cdeb DNA virus according to the present invention is one of marine algae infectious viruses isolated by the present inventors.
  • the gene encoding a protein involved in replication is not particularly limited as long as it is involved in replication of CdebDNA virus and is actively expressed.
  • the coding region refers to a portion that is translated into a protein via mRNA
  • the non-coding region refers to a portion other than the coding region. That is, the non-coding region refers to a portion located upstream of the start codon such as ATG, and includes a portion that is not transcribed into mRNA but a portion that is transcribed into mRNA but not translated into protein.
  • a promoter has a core element that holds the key to transcription and a regulatory element that promotes or suppresses transcription, and it is particularly important to use the core element when introducing a gene.
  • a core element a TATA box, an initiator element (Inr), a down-street element, and the like are known, and as a regulatory element, a CAAT box, a GATA box, and the like are known.
  • the polynucleotide (1) according to the present invention can exhibit high transformation ability, not at least for a TATA box or an initiator element, and there is a possibility that a completely unknown sequence works as a core element. It can be said that it is expensive.
  • polynucleotide (1) examples include those having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 5 corresponds to about 40 bases from about 30 bases upstream of Inr in the upstream sequence of the gene encoding the protein involved in Cdeb DNA virus replication. In the sequence, Inr is Of course, neither CAAT box nor GATA box is accepted.
  • the second promoter according to the present invention is (2) a polynucleotide in which one or more nucleotides of the polynucleotide (1) are deleted, substituted or added, and expresses a gene encoding any protein.
  • the number of nucleotides to be deleted, substituted or added is preferably 1 or more and 200 or less, more preferably 1 or more and 100 or less, further preferably 1 or more and 70 or less, and more preferably 1 or more. 30 or less, more preferably 1 or more and 20 or less, further preferably 1 or more and 10 or less, and particularly preferably 1 or more and 5 or less.
  • the third promoter according to the present invention is (3) a polynucleotide that hybridizes with the above polynucleotide (1) under stringent conditions and activates expression of a gene encoding an arbitrary protein in algal cells, It is.
  • stringent conditions refer to hybridization at 65 ° C. in 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS and then twice with 0.1 ⁇ SSC-0.1% SDS. It means washing.
  • a polynucleotide that activates expression of a gene encoding an arbitrary protein in an algal cell is bound to the downstream by being introduced into the algal cell.
  • the homology with the polynucleotide (1) is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, further preferably 80% or more, and more preferably 90% or more.
  • 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is particularly preferable.
  • the polynucleotides (1) to (3) can be isolated from upstream of a gene encoding a protein involved in the replication of CdebDNA virus or a mutant thereof. However, it may be chemically synthesized. These polynucleotides (1) to (3) can be used after being amplified from a template by PCR.
  • the vector according to the present invention contains the above promoter and a gene encoding an arbitrary protein.
  • the type of vector is not particularly limited as long as it can be introduced into algal cells, and either a plasmid vector or a viral vector can be used. However, since it is difficult to say that research on viruses that infect algae, especially marine algae, is sufficiently advanced, plasmid vectors are preferably used.
  • arbitrary protein is not particularly limited, and may be any useful protein desired to be produced.
  • the vector according to the present invention may contain other sequences included in general vectors.
  • sequences include a selectable marker gene for identifying the algae into which the vector of the present invention has been introduced, and a terminator that works in algal cells.
  • each sequence and the donor vector may be cleaved with a restriction enzyme, annealed, and bound by DNA ligase.
  • each sequence can be cloned into a vector by a simple and well-known method using a clonase reaction.
  • the algal transformation method according to the present invention includes a step of preparing the vector; and a step of introducing the vector into an algal cell.
  • a method for introducing the vector of the present invention into algal cells known methods such as a particle gun method, a glass bead stirring method, a microinjection method, an Agrobacterium method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, and a protoplast method can be used.
  • a particle gun method a glass bead stirring method
  • a microinjection method a microinjection method
  • an Agrobacterium method a lithium acetate method
  • a calcium phosphate method a protoplast method
  • electroporation is not appropriate because it is necessary to grow in a medium with a high salt concentration.
  • Algal cells transformed with the vector of the present invention can be identified by culturing in a selective medium according to the introduced selection marker gene.
  • Example 1 Isolation of Cdeb DNA Virus Promoter According to the Present Invention (1) Extraction of Genomic DNA of Virus Infecting Marine Algae Tomaru, Y. et al., Aquatic Microbial Ecology, vol. 50, pp. 103-112 (2008) The genome was extracted from the Chaetoceros debilis DNA virus (CdebDNAV) CdebDNAV18 strain using the central diatom Chaetoceros debilis as a host.
  • CdebDNAV Chaetoceros debilis DNA virus
  • the virus liquid (10 mL) was filtered through a 0.22 ⁇ m filter (MILLIPORE, Millex-GS, pore size: 0.22 ⁇ m) to remove algal cell debris and the like.
  • a 40% polyethylene glycol 6000 solution (manufactured by Woko) was added to the obtained filtrate so that the final concentration was 10 w / v%, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • the liquid is transferred to a centrifuge tube (Nalgen, UltraBottle Assemblies) and centrifuged at 57,000 ⁇ g for 1.5 hours at 4 ° C. using an ultracentrifuge (BECKMAN, Ultracentrifuge L8-70M). After that, the supernatant was removed.
  • Virus particles were washed by adding and mixing a phosphate buffer (10 mM sodium dihydrogen phosphate, 10 mM sodium hydrogen phosphate, pH 7.2, 5 mL) to the resulting precipitate. Again, after centrifuging at 217,000 ⁇ g for 4 hours at 4 ° C. and removing the supernatant in the same manner, the resulting precipitate was dissolved in sterilized purified water (Millipore, milliQ (registered trademark), 300 ⁇ L). did.
  • a phosphate buffer (10 mM sodium dihydrogen phosphate, 10 mM sodium hydrogen phosphate, pH 7.2, 5 mL
  • the solution was transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube, and proteinase K and 10% sarkosyl were added to final concentrations of 1 mg / mL and 1 w / v%, respectively, and incubated at 55 ° C. for 1.5 hours. Thereafter, phenol / chloroform treatment and chloroform treatment were performed using a conventional method, and 1 volume of 3M sodium acetate (pH 4.8) was added to the resulting supernatant, followed by 2.5 times the amount of ethanol. Was added. The solution was allowed to stand at ⁇ 80 ° C. for 1 hour. Thereafter, centrifugation was performed at 14,000 rpm and 4 ° C.
  • TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) was added to the DNA solution to make the total volume 200 ⁇ L.
  • a CTAB solution (1.6 M NaCl, 0.1 M EDTA, 2 w / v% CTAB, 200 ⁇ L) was added to the DNA solution and incubated at 65 ° C. for 1 hour.
  • Chloroform 400 ⁇ L was added to the solution, shaken and stirred for 5 minutes, and then centrifuged at 14,000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes using the above-described micro high-speed centrifuge. Two times the amount of ethanol was added to the solution and allowed to stand at ⁇ 80 ° C. for 1 hour.
  • the base sequences 5 to 31 in SEQ ID NO: 2 and the base sequences 5 to 29 in SEQ ID NO: 3 represent the attB sequence necessary for the BP clonase reaction for constructing the plasmid described later.
  • the base sequence of the obtained CdebDNA virus promoter is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the ATG shown in SEQ ID NO: 1 is a start codon and is not included in the promoter.
  • PCR reaction conditions are shown below.
  • 10 ⁇ buffer (TaKaRa, 5 ⁇ L)
  • dNTP Mix (TaKaRa, 4 ⁇ L)
  • Ex Taq (TaKaRa, 0.25 ⁇ L, 5 U / ⁇ L)
  • CdebDNA virus genomic DNA (1 ⁇ L)
  • two kinds of primers (10 pmol / ⁇ L, 5 ⁇ L each)
  • sterilized milliQ water was added and mixed so that the total amount was 50 ⁇ L.
  • a cycle of 98.0 ° C. for 10 seconds, 45.0 ° C. for 30 seconds, and 72.0 ° C. for 60 seconds was repeated 40 times, and finally, the reaction was performed at 72.0 ° C. for 5 minutes.
  • Electrophoresis was performed to confirm the amplification of the fragments.
  • TAE buffer Tris acetate buffer
  • Agarose S Naippon Gene 1.5% gel were used for electrophoresis.
  • 1 ⁇ L of 10 ⁇ loading buffer (manufactured by TaKaRa) was added to 9 ⁇ L of each PCR product and mixed.
  • a 100 bp ladder (manufactured by TOYOBO, code No. DNA-030X, 2 ⁇ L) was used as a DNA molecular weight marker, and electrophoresis was performed simultaneously.
  • staining was performed using ethidium bromide by a conventional method (Sambrook and Russell 2001), and a photograph was taken under ultraviolet irradiation.
  • Example 2 Preparation of vector containing Cdeb DNA virus promoter according to the present invention
  • (1) Preparation of each entry clone plasmid Cdeb DNA virus promoter obtained in Example 1 above, Zeocin resistance gene (ble) (Drocourt, D. et al. , Nucleic Acids Research, 18, p.4009 (1990)), and an entry clone plasmid into which Cylindrotheca fusiformis fcp terminator (Poulsen, N. et al., FEBS Journal, 272, pp.3413-3423 (2005)) was introduced.
  • the vector was prepared using Multisite Gateway (registered trademark) Pro Kit (manufactured by Invitrogen).
  • the CdebDNA virus promoter solution obtained in Example 1 having the attB sequence necessary for the clonase reaction for constructing the plasmid was purified with a 30% PEG8000 / 30 mM magnesium chloride solution (manufactured by Invitrogen). That is, sterilized milliQ water (75 ⁇ L) was added to a CdebDNA virus promoter solution (25 ⁇ L) to make a 100 ⁇ L solution. A 30% PEG8000 / 30 mM magnesium chloride solution (50 ⁇ L) was added to the solution and mixed, followed by centrifugation at 14,000 rpm for 15 minutes using a micro high-speed centrifuge (KUBOTA3740, manufactured by KUBOTA).
  • KUBOTA3740 micro high-speed centrifuge
  • the donor vector has an attP sequence necessary for the BP clonase reaction for constructing a plasmid.
  • BP clonase (trademark) II Enzyme Mix manufactured by Invitrogen, 2 ⁇ L was added and mixed, and reacted at 25 ° C. for 1 hour. Thereafter, proteinase K (manufactured by Invitrogen, 1 ⁇ L) was added to the reaction solution, followed by treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the reaction solution 2.5 ⁇ L was mixed with One Shot (registered trademark) Mach1 (registered trademark) T1 R chemically competent cells (manufactured by Invitrogen, 25 ⁇ L) and allowed to stand on ice for 30 minutes. Thereafter, heat shock treatment was performed at 42 ° C.
  • the obtained colonies were inoculated into LB liquid medium (10 mL) using platinum ears and cultured with shaking at 37 ° C. overnight. From the culture solution (3 mL), using the Pure Yield Plasmid Miniprep System (manufactured by Promega), an entry clone plasmid into which the CdebDNA virus promoter having the attL sequence necessary for the LR clonase reaction was introduced was extracted.
  • a zeocin resistance gene (ble) having an attB sequence necessary for the BP clonase reaction for constructing a plasmid is amplified in the same manner as in Example 1 and has the attP sequence necessary for the BP clonase reaction in the same manner as described above.
  • An entry clone plasmid into which an antibiotic resistance gene having an attL sequence necessary for the LR clonase reaction was introduced was obtained by introducing it into the donor vector pDONR221rP4r-P3r.
  • the fcp terminator of Cylindrotheca fusiformis having the attB sequence necessary for the BP clonase reaction for constructing the plasmid was amplified in the same manner as in Example 1 above, and the donor having the attP sequence necessary for the BP clonase reaction in the same manner as above
  • An entry clone plasmid into which a terminator having an attL sequence necessary for LR clonase reaction was introduced was obtained by introducing the vector into pDONR221NRP3-P2.
  • pBluescript SK- (2 ⁇ g) was digested with restriction enzyme EcoRI 20U (manufactured by TOYOBO, 10 U / ⁇ L) at 37 ° C. for 3 hours. DNA was precipitated and recovered by adding ethanol to the reaction solution according to a conventional method. Next, the ends were blunted using T4 DNA polymerase. That is, 10 ⁇ buffer (5 ⁇ L), 2.5 mM dNTP (manufactured by TAKARA, 2 ⁇ L), T4 DNA polymerase (TOYOBO, 0.5 U / ⁇ L, 1 ⁇ L) and sterile milliQ water (42 ⁇ L) are added to the recovered DNA. The reaction solution was prepared so that the total amount was 50 ⁇ L.
  • the obtained pBluescript SK- having blunt ends and Reading Frame Casette A (Invitrogen, RfA) were mixed and ligated using T4 DNA ligase attached to pGEM-T Vector Systems Kit (Promega).
  • 2 ⁇ rapid ligation buffer Promega, 5 ⁇ L
  • pBluescript SK- 100 ng / ⁇ L, 0.5 ⁇ L
  • RfA 5 ng / ⁇ L, 2 ⁇ L
  • T4 DNA ligase Promega, 3 U / ⁇ L, 1 ⁇ L
  • sterilized milliQ water 1.5 ⁇ L
  • This reaction solution was stored at room temperature for 1 hour, and incubated at 4 ° C. overnight (16 hours or longer).
  • This ligation solution (5 ⁇ L) was mixed with ccdB Survival Competent Cells (manufactured by Invitrogen, 50 ⁇ L) and allowed to stand on ice for 30 minutes. Thereafter, heat shock treatment was performed at 42 ° C. for 30 seconds, immediately transferred onto ice, and allowed to stand for 2 minutes. Then, SOC (250 mL) was added, and cultured with shaking at 37 ° C. for 1.5 hours.
  • the cultured bacterial solution (300 ⁇ L) was smeared on an LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL chloramphenicol and 50 ⁇ g / mL ampicillin. The medium was inverted and cultured overnight at 37 ° C. in a multi-shaker oven.
  • the obtained colonies were inoculated into LB medium (10 mL) using platinum ears and cultured with shaking at 37 ° C. overnight. From the culture solution (3 mL), the destination plasmid was extracted using PurePYield Plasmid Miniprep System (manufactured by Promega).
  • the reaction solution (2.5 ⁇ L) was mixed with One Shot (registered trademark) Mach1 (registered trademark) T1 R chemically competent cells (manufactured by Invitrogen, 25 ⁇ L) and allowed to stand on ice for 30 minutes. Next, heat shock treatment was performed at 42 ° C. for 30 seconds, immediately transferred onto ice and allowed to stand for 2 minutes. Then, SOC (250 mL) was added, and cultured with shaking at 37 ° C. for 1.5 hours. The cultured bacterial solution (275 ⁇ L) was smeared on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. The medium was inverted and cultured overnight at 37 ° C. in a multi-shaker oven.
  • the obtained colony was inoculated into LB medium (10 mL) using a platinum loop, and cultured with shaking at 37 ° C. overnight.
  • An expression clone plasmid vector was extracted from the culture solution (3 mL) using Pure Yield Plasmid Miniprep System (manufactured by Promega).
  • Cycle sequencing PCR was performed using the expression clone plasmid vector (200 ng) prepared in Example 2 (3) above as a template.
  • the reaction conditions are shown below.
  • the reaction solution (10 ⁇ L) was prepared using template DNA (100 ng / ⁇ L, 2 ⁇ L), Big Dye Terminator Cycle Sequencing ver. 3.1 (Applied Biosystems, 0.5 ⁇ L), 5 ⁇ sequencing buffer (2 ⁇ L), primers (1.6 pmol / ⁇ L, 0.66 ⁇ L), and sterilized distilled water (4.84 ⁇ L).
  • M13M3 primer SEQ ID NO: 4
  • As reaction conditions after heating at 95 ° C. for 5 minutes, the reaction was carried out for 40 cycles of 96 ° C.
  • reaction solution was transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube, 3M sodium acetate (1 ⁇ L), 99.5% ethanol (25 ⁇ L) and 125 mM EDTA solution (1 ⁇ L) were added, and after mixing with fingers, Left at room temperature for 15 minutes. After centrifugation at 14,000 rpm and 4 ° C. for 20 minutes, the supernatant was carefully removed with a yellow chip, 70% ethanol (35 ⁇ L) was added and mixed well. Again, after centrifugation at 14,000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes, the supernatant was completely removed with a yellow chip, and the precipitate was dried by leaving it at room temperature for 10 minutes with the lid open.
  • Formamide (Applied Biosystems, 10 ⁇ L) was added to the dried pellet, and analysis was performed using ABI PRISM (registered trademark) 3100-Avant Genetics Analyzer (Applied Biosystems) in the Kochi University Research Center Gene Experiment Facility. In advance, using the gene analysis software Vector NTI Advance Ver10.0 (manufactured by Invitrogen, http://www.invitrogen.com/vntigateway), the nucleotide sequence of the destination plasmid is added to the base of the promoter, antibiotic resistance gene and terminator. The nucleotide sequence of the expression clone plasmid vector was prepared by incorporating the sequence.
  • Example 3 Preparation of Vector Containing CdebDNA Viral Promoter According to the Present Invention Using a northeosricin resistance gene (nat) (Krugel et al., 1993) as an antibiotic resistance gene, an fcp terminator derived from Thalassiosira pseudonana (Poulsen, N Et al., Journal of Phycology, 42, pp. 1059-1065 (2006)), a vector containing a Cdeb DNA virus promoter was prepared in the same manner as in Example 2 above.
  • nat northeosricin resistance gene
  • fcp terminator derived from Thalassiosira pseudonana
  • Comparative Examples 1 to 4 Preparation of a vector containing a conventional viral promoter In the same manner as in Example 2 above, it has an endogenous promoter of pterygium diatom, and also has a zeocin resistance gene (ble) as an antibiotic resistance gene and a terminator.
  • a plasmid vector into which the fcp terminator of Cylindrotheca fusiformis has been introduced (Comparative Example 1), a central diatom endogenous promoter, a norseosricin resistance gene (nat) as an antibiotic resistance gene, and a Thalassiosira pseudonana as a terminator
  • a plasmid vector (Comparative Example 2) into which the derived fcp terminator was introduced was prepared.
  • a cauliflower mosaic virus-derived promoter (CaMV promoter) was introduced, a zeocin resistance gene (ble) as an antibiotic resistance gene and a fcp terminator of Cylindrothecaffusiformis as a terminator were introduced.
  • a plasmid vector (Comparative Example 3) and a plasmid vector (Comparative Example 4) into which a Norceosricin resistance gene (nat) as an antibiotic resistance gene and an fcp terminator derived from Thalassiosira pseudonana as a terminator were introduced were prepared.
  • Example 4 Transformation of Pinaceae Diatoms Using the plasmid vectors of Example 2, Comparative Example 1 and Comparative Example 3 above, Pleiodactylum tricornutum was transformed.
  • each plasmid vector was attached to tungsten particles M17 having an average particle diameter of 1.1 ⁇ m.
  • pterygium diatom P. Tricornutum was smeared on a solid phase medium at 5 ⁇ 10 7 cells per plate.
  • the tungsten particles were implanted into the cells at a He gas pressure of 1350 psi or 1100 psi using a panggle gun (Bio-Rad, Biolistic PDS-1000 / He Particle Delivery System).
  • the cells were cultured in 1.0% agar f / 2 medium containing 150 ⁇ g / mL zeocin. The results are shown in Table 1.
  • M is a molecular weight marker
  • “1” is a lane of a plasmid vector into which an antibiotic gene (ble) has been introduced
  • 2 is P.P.
  • the lane of tricornutum wild strain, “3-5” is the lane of a strain transformed with a cauliflower mosaic virus-derived promoter and an antibiotic gene (ble), and “6-8” is the promoter and antibiotic according to the present invention. It is a lane of a strain transformed with a plasmid vector containing a substance gene (ble).
  • Example 5 Transformation of the central diatom Using the plasmid vectors of the above Example 3, the above Comparative Example 2 and the above Comparative Example 4, the central diatom Chaetoceros sp. Was transformed. However, 500 ⁇ g / mL norseosricin was added to the medium for culturing the cells. The results are shown in Table 1.
  • FIG. 4 shows an electrophoresis photograph obtained by analyzing the obtained amplified DNA.
  • M is a molecular weight marker
  • 1 is a lane of a plasmid vector into which an antibiotic gene (nat) has been introduced
  • 2 is Chaetoceros sp.
  • the wild type lanes “3-4” are the lanes of the strain transformed with the plasmid vector containing the promoter and antibiotic gene (nat) according to the present invention.
  • Example 6 Identification of Core Element Region of Promoter According to the Present Invention
  • the primer of SEQ ID NO: 3 in addition to the use of the primer of SEQ ID NO: 6 to 9, it is related to the replication of CdebDNA virus in the same manner as in Example 1 above.
  • DNA fragments of bases from +107, which is upstream of the translation start point of the region encoding the protein considered, to ⁇ 72, ⁇ 32, ⁇ 2 and +34 were amplified.
  • C. fusiformis is a pterygium diatom different from the above examples.
  • a zeocin resistance gene (ble)
  • a terminator derived from the fcp gene of C. fusiformis A plasmid (FIG. 6) in which was incorporated was used.
  • the plasmid was immobilized on tungsten particles and transformed.
  • FIG. 7 (1) A photograph of a diatom when using a plasmid incorporating the promoter of the present invention is shown in FIG. 7 (1), and a photograph of a diatom when using a plasmid not incorporating the promoter of the present invention is shown in FIG. 7 (2).
  • diatoms are broadly classified into pterygium diatoms and central diatoms, while the promoters of the present invention have low specificity, while the promoters of the present invention have low specificity. It has been shown that it can be widely used for efficient transformation.
  • the eukaryotic promoter region has a core promoter region to which a transcription binding factor for initiating transcription binds and a gene transcription regulatory region located upstream thereof.
  • motifs commonly found in eukaryotic core promoter regions such as TATA box (5'-TATAWAW-3 '(where W represents A or T)) and initiator elements (Inr) It is known that a sequence exists. Based on this, the base sequence of the promoter of SEQ ID NO: 1 according to the present invention was analyzed and compared using PLACE Signal Scan Search (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/).
  • 5′-CAAT-3 ′ ( ⁇ 97 to ⁇ 94) which is CAAT box I in the upstream region and 5′-WGATAR-3 ′ which is the GATA box Further, 5′-CCA + 1 TACC-3 ′ ( ⁇ 2 to +5), which is considered to be an initiator element, was found.
  • This initiator element includes mammalian 5′-YYA +1 NWYY-3 ′ (Javahery, R., et al., Molecular and Cellular Biology, 14, pp. 116-127 (1994)), oocyte fungal 5′-YCA + 1 TTYY-3 ′ (Mcleod, A et al., Eukaryotic Cell, 3, pp. 91-99 (2004)), Drosophila 5′-TCA +1 KTY-3 ′ (where K represents G or T) (Purnell, BA, et al., Genes & Development, 8, pp.
  • Tricomonas 5′-TCA + 1 YW-3 ′ (Liston, DR, et al., Molecular and Cellular Biology). , 19, pp. 2380-2388 (1999)), and 5′-CCA +1 TTCC-3 ′ in fcpA-1A, the promoter of C. fusiformis (Poulsen, N. et al., FEBS Journal, 272, pp. 3413-3423 (2005)).
  • the initiator element found in the promoter of SEQ ID NO: 1 worked on both pterygium diatoms and central diatoms as Core elements and could be transformed.
  • fcpA-1A which is a C. fusiformis promoter similar to the initiator element, central diatoms cannot be transformed.
  • the polynucleotide (1) according to the present invention shows a high transformation ability, not at least for the TATA box or the initiator element, and it is highly possible that an entirely unknown sequence works as the Core element.
  • the core element of the promoter of the present invention is a sequence between ⁇ 72 and ⁇ 33 in the region encoding a protein considered to be related to CdebDNA virus replication. It is considered that there is a high possibility of being present in (SEQ ID NO: 5). Since the sequence of SEQ ID NO: 5 is located approximately 30 to 70 bases upstream of the initiator element located in the upstream region of the replication protein gene, it is unlikely that the initiator element functioned as a core element. .
  • the SEQ ID NO: 5 was analyzed by PLACE Signal Scan Search (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/), but a known motif sequence could not be found. Therefore, it is considered that the core element of the promoter of the present invention is a novel one that has not been known so far.
  • a vector containing a promoter according to the present invention is used, various types of algae can be efficiently transformed. Therefore, by using the present invention, it has high photosynthetic ability, has excellent properties such as the ability to produce useful substances, and is present in a large amount, but it is difficult to transform and the technology has been sufficiently developed so far. Algae that has not been studied can be transformed widely and efficiently beyond "eyes".

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Abstract

　本発明は、幅広い種の藻類に適用可能である上に、効率の高い形質転換技術を提供することを目的とする。　本発明に係るプロモーターは、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド等を有することを特徴とする。

Description

藻類を形質転換するために用いられる新規プロモーター
　本発明は、藻類を形質転換するために用いられる新規のプロモーター、当該プロモーターを含むベクター、および当該ベクターを用いる藻類の形質転換方法に関するものである。
　恒久的かつ安定的なエネルギー源である太陽光を利用することは、エネルギー対策を考える上で非常に重要である。植物類による光合成は、太陽光エネルギーを最も効率的に化学エネルギーへ変換できる優れたシステムであり、環境中の二酸化炭素や過剰栄養塩を吸収同化する上に、酸素も放出する。よって植物を利用する技術の開発は、エネルギー問題を解決し得るものとして期待されているところである。
　植物類の中でも藻類は、多量に存在する海水および淡水中に生息することからその量は莫大なものであり、また、著しい光合成能を有する。さらに、藻類の中には不飽和脂肪酸や抗腫瘍化合物などの有用化合物を生産するものがある。また、珪藻類の中には有用な無機物を生産するものがあるので、珪藻類によるバイオミネラリゼーションという技術が注目されている。このように、藻類は有用資源として重要な生物といえる。
　一般的に、生物を産業で利用する場合には、有用な遺伝子を導入する形質転換技術が用いられる。この形質転換技術は、遺伝子の機能を解明すべく、特定遺伝子をノックアウトしたりその働きを抑制したりするためにも用いられる。
　これまでにも、珪藻や緑藻を中心として藻類の形質転換が行われている。しかし、かかる方法は内在性のプロモーターを分離し、それに遺伝子を結合させて藻類に導入するものであった。それでは、内在性プロモーターの分離に多大な労力と時間がかかるために、決して効率的なものではなかった。また、藻類、とりわけ海産藻類の形質転換効率自体が極めて低いという問題もある。
　一方、藻類以外の植物や動物の形質転換では、内在性のプロモーターではなく、ウィルス由来のプロモーターが汎用されている。例えば、アブラナ科植物に感染するカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）より分離されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが、アブラナ科植物に限定されず幅広い植物の形質転換に利用されている。また、動物細胞の形質転換には、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）より分離されたＣＭＶプロモーターや、シアミンウィルス４０（ＳＶ４０）より分離されたＳＶ４０プロモーターが広く利用されている。
　それに対して、藻類の形質転換においては、外来性のウィルスプロモーターが用いられた例はほとんど知られていない。
　例えば非特許文献１には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いて珪藻Cycrotela crypticaを形質転換した実験例が記載されているが、形質転換体は得られなかったとされている。
　一方、非特許文献２には、ＣＭＶプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターを用いて珪藻Phaeodactylum tricornutumへＧＵＳ遺伝子を導入したところ、いずれの場合もＧＵＳ（β－グルクロニダーゼ）が発現したことが記載されている。
　さらに非特許文献３には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いて渦鞭毛藻AmphidiniumとSymbiodiniumへＧＵＳ遺伝子を導入したところ、ＧＵＳが発現したことが記載されている。しかし他文献（非特許文献４）によれば、懸命の努力にもかかわらず、他のグループが渦鞭毛藻類の形質転換に成功したとの報告はされていないとのことである。
Dunahay，T.G.ら，Journal of Phycology（ジャーナル・オブ・ファイコロジー），vol.31，pp.1004-1012（1995） Sakaue，Kら，Physiologia plantarum（フィジオロジア・プランタラム），vol.133，pp.59-67（2008） Lohuis，M.R.ら，The Plant Journal（ザ・プラント・ジャーナル），vol.13，pp.427-435（1998） Walker，T.L.ら，Journal of Phycology（ジャーナル・オブ・フィコロジー），vol.41，pp.1077-1093（2005）
　上述したように、その数は極めて少ないものの、カリフラワーモザイクウィルスに由来するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどのウィルスプロモーターを用いて藻類を形質転換した報告例はある。
　しかし、形質転換体が得られなかったり再現性が無いという報告もある。また、本発明者らの知見によれば、他の植物類の形質転換に汎用されているＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、藻類に対する適用範囲が極めて狭い。藻類の存在量は莫大であり、また、様々な有用性を秘めた種があることから、形質転換に用いるプロモーターとしては幅広い種の藻類に適用可能であるものが望ましい。さらに、一般的に、藻類、とりわけ海産藻類の形質転換効率は非常に低いことから、高効率な形質転換技術の開発が切望されている。
　そこで本発明が解決すべき課題は、幅広い種の藻類に適用可能である上に、効率の高い形質転換技術を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、Chaetoceros debilis ＤＮＡウィルス（ＣｄｅｂＤＮＡＶ）の複製タンパク質をコードすると考えられる遺伝子の上流に位置するプロモーターが、目（モク）を超える複数の藻類を効率的に形質転換できることを見出して、本発明を完成した。
　本発明に係る新規プロモーターは、下記（１）～（３）の何れかの塩基配列を有することを特徴とする。
　（１）　ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド
　（２）　上記ポリヌクレオチド（１）の１または複数のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
　（３）　上記ポリヌクレオチド（１）とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
　本発明に係るベクターは、上記新規プロモーター、および任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とする。
　また、本発明に係る藻類の形質転換方法は、上記ベクターを調製する工程；および、上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程；を含むことを特徴とする。
本発明に係るプロモーターを含むプラスミドベクターの構造の一例を示す図である。 本発明に係るプロモーターを含むプラスミドベクターの構造の一例を示す図である。 本発明方法により形質転換された藻類細胞等に含まれる導入遺伝子の有無の確認実験の結果を示す電気泳動写真である。 本発明方法により形質転換された藻類細胞等に含まれる導入遺伝子の有無の確認実験の結果を示す電気泳動写真である。 本発明に係るプロモーターのＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔを特定するための実験結果を示すグラフである。当該結果より、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流領域における－７２から－３３の間の配列中に、Ｃｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔが含まれていることが分かる。 本発明に係るプロモーターを含むプラスミドベクターの構造の一例を示す図である。 海産藻類であるC. fusiformisの形質転換実験の結果を示す写真である。（１）は本発明プロモーターを用いた場合の結果を示し、（２）は本発明プロモーターを用いない場合の結果を示す。
　本発明に係る第一のプロモーターは、（１）ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド、を有する。
　ＣｄｅｂＤＮＡウィルスは、珪藻Chaetoceros debilisに感染するウィルスである。これまで藻類、とりわけ海産藻類に対して感染性を示すウィルスの報告例は少なかったが、近年、本発明者らは、ラフィド藻、渦鞭毛藻、珪藻などの藻類から様々なウィルスの分離に成功している。本発明に係るＣｄｅｂＤＮＡウィルスは、本発明者らにより分離された海産藻類感染性ウィルスの一つである。
　複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するものであり且つ活発に発現するものであれば特に制限されないものとする。
　本発明において、コード領域とはｍＲＮＡを経てタンパク質に翻訳される部分をいうものをいい、非コード領域とはコード領域以外の部分をいう。即ち、非コード領域は、ＡＴＧなどの開始コドンの上流に位置する部分をいい、ｍＲＮＡに転写されない部分の他、ｍＲＮＡに転写はされるがタンパク質には翻訳されない部分を含むものとする。
　一般的に、プロモーターは、転写の鍵を握るＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔと、転写を促進または抑制するＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔを有し、遺伝子を導入する際には、特にＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔを利用することが重要である。Ｃｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔとしては、ＴＡＴＡボックス、イニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）、ダウンストリートエレメントなどが知られており、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔとしてはＣＡＡＴボックスやＧＡＴＡボックスなどが知られている。本発明者らがＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流域の塩基配列を調べたところ、ＣＡＡＴボックスＩである５’－ＣＡＡＴ－３’、ＧＡＴＡボックスである５’－ＷＧＡＴＡＲ－３’（式中、ＷはＡまたはＴを示し、ＲはＡまたはＧを示す）、およびイニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）である５’－ＹＹＡ+1Ｎ（Ａ／Ｔ）ＹＹ－３’（式中、ＹはＣまたはＴを示す）が見られた一方で、真核生物などのプロモーターに見られるＴＡＴＡボックスは見られなかった。よって、上記遺伝子の上流配列中に見付かったＩｎｒが、羽状目珪藻と中心目珪藻の両方でＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔとして働き、形質転換が可能になると考えられたが、その一方で、上記Ｉｎｒと酷似した配列のＩｎｒを含む羽状目珪藻内在性プロモーター（Ｃｆ　ｆｃｐＡ－１Ａ）を用いると、中心目珪藻を形質転換することができない。結論として、本発明に係るポリヌクレオチド（１）で高い形質転換能を発揮できるのは、少なくともＴＡＴＡボックスやイニシエーターエレメントなどのためではなく、全く未知の配列がＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔとして働いている可能性が高いといえる。
　上記ポリヌクレオチド（１）としては、配列番号１および配列番号５の塩基配列を有するものを挙げることができる。なお、配列番号５の塩基配列は、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流配列中のＩｎｒの約３０塩基上流からの約４０塩基に相当し、当該配列中には、ＩｎｒはもとよりＣＡＡＴボックスやＧＡＴＡボックスも認められない。
　本発明に係る第二のプロモーターは、（２）上記ポリヌクレオチド（１）の１または複数のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド、である。
　上記ポリヌクレオチド（２）において、欠失、置換または付加されるヌクレオチドの数としては、１以上、２００以下が好ましく、１以上、１００以下がより好ましく、１以上、７０以下がさらに好ましく、１以上、３０以下がさらに好ましく、１以上、２０以下がさらに好ましく、１以上、１０以下がさらに好ましく、１以上、５以下が特に好ましい。
　本発明に係る第三のプロモーターは、（３）上記ポリヌクレオチド（１）とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド、である。
　上記ポリヌクレオチド（３）において、ストリンジェントな条件とは、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、６５℃でハイブリダイズさせた後、０．１×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳで２回洗浄することをいう。
　また、上記ポリヌクレオチド（２）および（３）において、任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチドとは、藻類細胞内に導入されることによって、その下流に結合された任意のタンパク質をコードする遺伝子を発現させることができるものをいう。
　上記ポリヌクレオチド（２）および（３）において、上記ポリヌクレオチド（１）との相同性としては、５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　上記ポリヌクレオチド（１）～（３）は、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスまたはその変異体の複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流から分離することができる。但し、化学的に合成してもよい。これらポリヌクレオチド（１）～（３）は、鋳型からＰＣＲにより増幅して用いることができる。
　本発明に係るベクターは、上記プロモーターと、任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有する。
　ベクターの種類は、藻類細胞へ導入され得るものであれば特に制限されず、プラスミドベクター、ウィルスベクターの何れも用いることができる。但し、藻類、とりわけ海産藻類に感染するウィルスの研究は十分に進んでいるとはいい難いので、好適にはプラスミドベクターを用いる。
　ここで「任意のタンパク質」は特に限定されるものではなく、生産の望まれる有用なタンパク質であればよい。
　本発明に係るベクターには、一般的なベクターに含まれるその他の配列を含んでいてもよい。かかる配列としては、例えば、本発明ベクターが導入された藻類を特定するための選択マーカー遺伝子や、藻類細胞で働くターミネーターを挙げることができる。
　本発明ベクターの調製方法としては、常法を用いることができる。例えば、上記各配列とドナーベクターとを制限酵素で切断した後にアニーリングし、ＤＮＡリガーゼにより結合させればよい。或いは、クロナーゼ反応を利用した簡便な公知方法により、各配列をベクターにクローニングすることも可能である。
　本発明に係る藻類の形質転換方法は、上記ベクターを調製する工程；および、上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程；を含むことを特徴とする。
　本発明ベクターの調整方法は、上述したとおり、当業者公知の方法を用いることができる。
　本発明ベクターの藻類細胞への導入方法としては、パーティクルガン法、ガラスビーズ攪拌法、マイクロインジェクション法、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法などの公知方法を用いることができる。但し、海産藻類の場合、塩濃度の高い培地で増殖せしめる必要があるので、エレクトロポーレーション法は適切でない。
　本発明ベクターにより形質転換された藻類細胞は、導入されている選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することにより特定することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　実施例１　本発明に係るＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターの分離
　（１）　海産藻類に感染するウィルスのゲノムＤＮＡの抽出
　Tomaru，Y.ら，Aquatic Microbial Ecology，vol.50，pp.103-112（2008）に記載の方法に従って、中心目珪藻Chaetoceros debilisを宿主とするChaetoceros debilis ＤＮＡウィルス（ＣｄｅｂＤＮＡＶ）　ＣｄｅｂＤＮＡＶ１８株からゲノムを抽出した。
　具体的には、まず、ウィルス液（１０ｍＬ）を０．２２μｍフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製，Millex-GS，孔径：０．２２μｍ）で濾過することにより、藻細胞の破片などを除いた。得られた濾液に４０％ポリエチレングリコール６０００溶液（Ｗｏｋｏ社製）を最終濃度が１０ｗ／ｖ％となるように加え、４℃にて一晩静置した。当該液を遠心分離用チューブ（Ｎａｌｇｅｎ社製，UltraBottle Assemblies）に移し、超遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ社製，Ultracentrifuge L8-70M）を用いて５７，０００×ｇ、４℃で１．５時間遠心分離した後、その上清を除いた。得られた沈殿にリン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム，１０ｍＭリン酸水素ナトリウム，ｐＨ７．２，５ｍＬ)を加え混合することによりウィルス粒子を洗浄した。再度、２１７，０００×ｇ、４℃で４時間遠心分離し、同様に上清を除いた後、得られた沈殿を滅菌した精製水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，ｍｉｌｌｉＱ（登録商標），３００μＬ）に溶解した。当該溶液を１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに移し、プロテイナーゼＫと１０％サルコシルを、それぞれ最終濃度が１ｍｇ／ｍＬおよび１ｗ／ｖ％となるように加え、５５℃にて１．５時間インキュベートした。その後、常法を用いてフェノール／クロロホルム処理とクロロホルム処理を行い、得られた上清に、その１０分１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を加え、さらにその２．５倍量のエタノールを加えた。当該溶液を－８０℃にて１時間静置した。その後、微量高速遠心機（ＫＵＢＯＴＡ社製，KUBOTA3740）を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離を行い、得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させた。これを滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（２０μＬ）に溶解してＤＮＡ溶液を得た。さらに、上記文献（Tomaru，Y.ら（2008））に記載のCetyl trimethyl ammonium bromide法（ＣＴＡＢ法）を用いて精製した。まず、上記ＤＮＡ溶液にＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を加え、その全量を２００μＬにした。当該ＤＮＡ溶液にＣＴＡＢ溶液（１．６Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，２ｗ／ｖ％ＣＴＡＢ，２００μＬ）を加え、６５℃にて１時間インキュベートした。当該溶液にクロロホルム（４００μＬ）を加え、５分間振とう攪拌した後、前述した微量高速遠心機を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。当該溶液に２倍量のエタノールを加え、－８０℃にて１時間静置した。その後、同微量高速遠心機を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、得られた沈殿を７０％エタノールにより洗浄した後、乾燥させた。当該沈殿を滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（３００μＬ）に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
　（２）　ＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターの分離
　上記（１）で得たＣｄｅｂＤＮＡウィルスのゲノムＤＮＡの配列情報を、Ｂｌａｓｔ（ＤＤＢＪ）を用いてデータベースと比較し、さらにＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ（ＮＣＢＩ）を用いて、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスＤＮＡに含まれるＯＲＦを検索し、ウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域を検出した。この配列中の翻訳開始点と思われるＡＴＧ配列の上流＋１０７から－３７０の領域を、ＣｄＰ１Ｌ／ａｔｔＢ１プライマー（配列番号２）およびＣｄＰ１－２Ｒ／ａｔｔＢ４プライマー（配列番号３）を用いたＰＣＲ反応により増幅させた。なお、配列番号２における５～３１の塩基配列および配列番号３における５～２９の塩基配列は、後述するプラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を示す。また、得られたＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターの塩基配列を配列番号１に示す。なお、配列番号１に示されているＡＴＧは開始コドンであり、プロモーターには含まれない。
　ＰＣＲ反応の条件を以下に示す。ＰＣＲ反応液として、１０×バッファー（ＴａＫａＲａ社製，５μＬ）、ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社製，４μＬ）、Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製，０．２５μＬ，５Ｕ／μＬ）、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスのゲノムＤＮＡ（１μＬ）、および２種のプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ，各５μＬ）を混合し、最後に滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を全量が５０μＬとなるように添加混合した。次いで、９８．０℃で１０秒間、４５．０℃で３０秒間、７２．０℃で６０秒間のサイクルを４０回繰り返し、最後に７２．０℃で５分間反応させた。
　フラグメントの増幅を確認するために電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＡＥバッファー（トリス酢酸緩衝液）と、アガロースＳ（ニッポンジーン社製）１．５％ゲルを用いた。電気泳動用試料として、ＰＣＲ産物各９μＬに１０×ローディングバッファー（ＴａＫａＲａ社製）を１μＬずつ添加し、混合したものを用いた。また、ＤＮＡ分子量マーカーとして１００ｂｐラダー（ＴＯＹＯＢＯ社製，コードＮｏ．ＤＮＡ－０３０Ｘ，２μＬ）を用い、同時に泳動した。また、Ｍｕｐｉｄ電気泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ社製）を用い、１００Ｖの条件下で約３０分間泳動した。泳動終了後、臭化エチヂウムを用い、定法（Sambrook and Russell 2001）により染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。
　実施例２　本発明に係るＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターを含むベクターの調製
　（１）　各エントリークローンプラスミドの調製
　上記実施例１で得たＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーター、導入遺伝子としてゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）（Drocourt，D．ら，Nucleic Acids Research，18，p.4009（1990））、およびCylindrotheca fusiformisのｆｃｐターミネーター（Poulsen，N．ら，FEBS Journal，272，pp.3413-3423（2005））がそれぞれ導入されたエントリークローンプラスミドベクターを、Multisite Gateway（登録商標） Pro Kit（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて調製した。
　詳しくは、プラスミドの構築のためのクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を有する、上記実施例１で得たＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーター溶液を、３０％ＰＥＧ８０００／３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で精製した。即ち、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーター溶液（２５μＬ）に、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（７５μＬ）を加えて１００μＬの溶液とした。当該溶液に３０％ＰＥＧ８０００／３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液（５０μＬ）を加えて混合し、微量高速遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製，KUBOTA3740）を用いて１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その後、上清を取り除き、得られた沈殿を滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（１０μＬ）に溶解した。次に、当該溶液（５０ｆｍｏｌｅｓ）とドナーベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，ｐＤＯＮＲ２２１ Ｐ１－Ｐ４，１００ｎｇ／μＬ）を混合し、当該溶液へ滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を加えることにより計８μＬの混合液とした。なお、当該ドナーベクターは、プラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＰ配列を有する。当該混合液へ、さらにＢＰクロナーゼ（商標）II Enzyme Mix（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２μＬ）を加えて混合し、２５℃で１時間反応させた。その後、反応液にプロテイナーゼＫ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，１μＬ）を加え、３７℃で１０分間処理した。当該反応液（２．５μＬ）を、One Shot（登録商標）Mach１（登録商標）T1R chemically competent cells （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２５μＬ）に混合し、氷上にて３０分間静置した。その後、４２℃にて３０秒間ヒートショック処理を行い、直ちに氷上に移し、２分間静置した。次いで、ＳＯＣ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２５０ｍＬ）を加え、３７℃にて１．５時間振とう培養した。培養した菌液（２７５μＬ）を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン，０．５％イーストエクストラクト，１％ＮａＣｌ，１．５％アガー）に塗抹した。当該培地をマルチシェーカーオーブン（タイテック社製）内で３７℃にて一晩（１０時間程度）倒置培養した。得られたコロニーは、白金耳を用いてＬＢ液体培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。当該培養液（３ｍＬ）より、Pure Yield Plasmid Miniprep System（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＬ配列を有するＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターが導入されたエントリークローンプラスミドを抽出した。
　また、プラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を有するゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）を上記実施例１と同様に増幅し、上記と同様にしてＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＰ配列を有するドナーベクターであるｐＤＯＮＲ２２１ Ｐ４ｒ－Ｐ３ｒへ導入し、ＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＬ配列を有する抗生物質耐性遺伝子が導入されたエントリークローンプラスミドを得た。
　さらに、プラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を有するCylindrotheca fusiformisのｆｃｐターミネーターを上記実施例１と同様に増幅し、上記と同様にしてＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＰ配列を有するドナーベクターであるｐＤＯＮＲ２２１ Ｐ３－Ｐ２へ導入し、ＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＬ配列を有するターミネーターが導入されたエントリークローンプラスミドを得た。
　（２）　ディスティネーションプラスミドの調製
　Gateway（登録商標） Vector Conversion System with One Shot（登録商標） ccdB Survival（登録商標） Competent Cells（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、pBluescript SK-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）へＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＲ配列を持つReading Frame Casetteを組み込むことにより、ディスティネーションプラスミドを調製した。
　まず、pBluescript SK-（２μｇ）に対し、制限酵素ＥｃｏＲＩ ２０Ｕ（ＴＯＹＯＢＯ社製，１０Ｕ／μＬ）を用いて、３７℃にて３時間消化した。当該反応液へ常法に従ってエタノールを添加することにより、ＤＮＡを沈殿させて回収した。次に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。即ち、回収したＤＮＡへ、１０×バッファー（５μＬ）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ社製，２μＬ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製，０．５Ｕ／μＬ，１μＬ）および滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（４２μＬ）を加え、計５０μＬとなるように反応液を調製した。この反応液を１２℃にて１５分間インキュベートした。この反応液に滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（３５０μＬ）を直ちに加え、常法に従ってフェノール／クロロホルム処理とクロロホルム処理をした後、続いてエタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。次に、制限酵素にて切断したプラスミドの再環状化を防ぐために、ＣＩＡＰ（ＴａＫａＲａ社製，Calf intestine Alkaline Phosphatase）を用いて、その切断断片の５’末端の脱リン酸処理を行った。平滑化処理を施したＤＮＡに１０×ＣＩＡＰバッファー（５μＬ）とＣＩＡＰ（０．１Ｕ／μＬ，１μＬ）を加え、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水により計５０μＬになるように反応液を調製した。当該反応液を３７℃にて１５分間、続いて５６℃にて１５分間インキュベートした後、ＣＩＡＰ（０．１Ｕ／μＬ，１μＬ）を再び加え、３７℃にて１５分間、続いて５６℃にて１５分間インキュベートした。当該反応液に、１０％ＳＤＳ溶液（２．５μＬ）、５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（０．５μＬ）、プロテイナーゼＫ溶液(２０ｍｇ／μＬ，０．５μＬ）をそれぞれ加えた後、５６℃にて３０分間、続いて７５℃にて１０分間インキュベートした。その後、常法に従ってフェノール/クロロホルム処理とクロロホルム処理を施した。次に、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（１０μＬ）に溶解した。
　得られた平滑末端を有するpBluescript SK-と、Reading Frame Casette A（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，ＲｆＡ）とを混合し、pGEM-T Vector Systems Kit（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）添付のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。まず、オートクレーブ滅菌した０．２ｍＬ容のＰＣＲ用チューブに、２×ラピッドライゲーションバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，５μＬ）、pBluescript SK-（１００ｎｇ／μＬ，０．５μＬ）、ＲｆＡ（５ｎｇ／μＬ，２μＬ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，３Ｕ／μＬ，１μＬ）および滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（１．５μＬ）を加え、計１０μＬとなるように反応液を調製した。この反応液を室温にて１時間保存し、４℃にて一晩（１６時間以上）インキュベートした。このライゲーション溶液（５μＬ）をccdB Survival Competent Cells （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，５０μＬ）に混合し、氷上にて３０分間静置した。その後、４２℃にて３０秒間ヒートショック処理を行い、直ちに氷上に移し、２分間静置した。次いでＳＯＣ（２５０ｍＬ）を加え、３７℃にて１．５時間振とう培養した。培養した菌液（３００μＬ）を、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。当該培地をマルチシェーカーオーブン内で３７℃にて一晩倒置培養した。
　得られたコロニーは、白金耳を用いてＬＢ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。当該培養液（３ｍＬ）より、Pure Yield Plasmid Miniprep System （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ディスティネーションプラスミドを抽出した。
　（３）　エクスプレッションクローンプラスミドベクターの調製
　Multisite Gateway Pro Kit（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、上記実施例２（１）で得たエントリークローンプラスミドと、上記実施例２（２）で得たディスティネーションプラスミドとの間でＬＲクロナーゼ反応を行うことにより、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子およびターミネーターが連結されたエクスプレッションクローンプラスミドベクターを調製した。
　具体的には、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子、ターミネーターがそれぞれ組み込まれた３種のエントリークローンプラスミド（それぞれ１０ｆｍｏｌｅｓ）とディスティネーションベクター（２０ｆｍｏｌｅｓ）を混合し、さらに滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を加えることにより計８μＬの混合液を調製した。当該液にLR Clonase II PLUS Enzyme Mix（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２μＬ）を加えて混合し、２５℃にて１６時間を反応させた。その後、当該反応液にプロテイナーゼＫ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，１μＬ）を加え、３７℃にて１０分間処理した。当該反応液（２．５μＬ）を、One Shot（登録商標） Mach1（登録商標） T1R chemically competent cells （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２５μＬ）に混合し、氷上にて３０分間静置した。次いで４２℃にて３０秒間ヒートショック処理を行い、直ちに氷上に移して２分間静置した。その後、ＳＯＣ（２５０ｍＬ）を加え、３７℃にて１．５時間振とう培養した。培養した菌液（２７５μＬ）を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。当該培地をマルチシェーカーオーブン内で３７℃にて一晩倒置培養した。得られたコロニーを、白金耳を用いてＬＢ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。当該培養液（３ｍＬ）より、Pure Yield Plasmid Miniprep System（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてエクスプレッションクローンプラスミドベクターを抽出した。
　（４）　ＤＮＡ配列の確認
　目的とするエクスプレッションクローンプラスミドベクターが作製されたことを確認するために、Ｄｉｄｅｏｘｙ法を用いて塩基配列を決定した。
　上記実施例２（３）にて調製したエクスプレッションクローンプラスミドベクター（２００ｎｇ）を鋳型として用いて、サイクルシークエンシングＰＣＲを行った。その反応条件を以下に示す。反応液（１０μＬ）は、鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ，２μＬ）、Big Dye Terminator Cycle Sequencing ver．3.1（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，０．５μＬ）、５×シークエンシングバッファー（２μＬ）、プライマー（１．６ｐｍｏｌ／μＬ，０．６６μＬ）、滅菌蒸留水（４．８４μＬ）からなる。プライマーは、Ｍ１３Ｍ３プライマー（配列番号４）を用いた。反応条件としては、９５℃で５分間加熱した後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分の反応を４０サイクル行った。反応後、反応液を１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム（１μＬ）、９９．５％エタノール（２５μＬ）および１２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（１μＬ）を加え、指ではじきよく混合させた後、１５分間室温で放置した。１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離後、上清をイエローチップで丁寧に除き、７０％エタノール（３５μＬ）を加え、よく混合した。再び、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清をイエローチップで完全に取り除き、蓋を開けたまま室温で１０分間放置して沈殿を乾燥させた。
　乾燥させたペレットにホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，１０μＬ）を加え、高知大学総合研究センター遺伝子実験施設内のABI PRISM（登録商標）3100-Avant Genetic Analyzer （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解析した。あらかじめ、遺伝子解析ソフト Vector NTI Advance Ver10.0（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，http://www.invitrogen.com/vntigateway）を用いて、ディスティネーションプラスミドの塩基配列に、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子およびターミネーターの塩基配列を組み込むことにより、エクスプレッションクローンプラスミドベクターの塩基配列を作成した。次に、このコンピューター上にて作成したエクスプレッションクローンプラスミドベクターの塩基配列と、上記の方法により実験的に決定したエクスプレッションクローンプラスミドベクターの塩基配列とを、Vector NTI Advance Ver10.0のAlignXを用いてアライメントを行うことにより比較することにより、上記実施例２（３）で調製したエクスプレッションクローンプラスミドベクターに目的遺伝子が導入されていることを確認した。
　得られたエクスプレッションクローンプラスミドベクターの構造を図１に示す。
　実施例３　本発明に係るＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターを含むベクターの調製
　抗生物質耐性遺伝子としてノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）（Krugelら，１９９３年）を用い、ターミネーターとしてThalassiosira pseudonana由来のｆｃｐターミネーター（Poulsen，N．ら，Journal of Phycology，42，pp.1059-1065（2006））を用い、上記実施例２と同様にＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターを含むベクターを調製した。
　得られたエクスプレッションクローンプラスミドベクターの構造を図２に示す。
　比較例１～４　従来ウィルスプロモーターを含むベクターの調製
　上記実施例２と同様にして、羽状目珪藻の内在性プロモーターを有し、また、抗生物質耐性遺伝子としてゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）とターミネーターとしてCylindrotheca fusiformisのｆｃｐターミネーターが導入されたプラスミドベクター（比較例１）、および、中心目珪藻の内在性プロモーターを有し、また、抗生物質耐性遺伝子としてノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）とターミネーターとしてThalassiosira pseudonana由来のｆｃｐターミネーターが導入されたプラスミドベクター（比較例２）を調製した。
　また、上記実施例２と同様にして、カリフラワーモザイクウィルス由来のプロモーター（ＣａＭＶプロモーター）を有し、また、抗生物質耐性遺伝子としてゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）とターミネーターとしてCylindrotheca fusiformisのｆｃｐターミネーターが導入されたプラスミドベクター（比較例３）、および、抗生物質耐性遺伝子としてノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）とターミネーターとしてThalassiosira pseudonana由来のｆｃｐターミネーターが導入されたプラスミドベクター（比較例４）を調製した。
　実施例４　羽状目珪藻の形質転換
　上記実施例２、上記比較例１および上記比較例３のプラスミドベクターを用い、羽状目珪藻Phaeodactylum tricornutumを形質転換した。
　具体的には、各プラスミドベクターを平均粒子径１．１μｍのタングステン粒子Ｍ１７に付着させた。別途、羽状目珪藻P．tricornutumを１プレートあたり５×１０7ｃｅｌｌｓを固相培地に塗抹した。パーティグルガン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製，Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System）を用い、上記タングステン粒子を、Ｈｅガス圧１３５０ｐｓｉまたは１１００ｐｓｉで細胞に打ち込んだ。次いで、ゼオシン１５０μｇ／ｍＬを含む１．０％寒天ｆ／２培地にて当該細胞を培養した。結果を表１に示す。
　また、上記抗生物質含有培地で生育した細胞のコロニーが形質転換していることを、ＰＣＲにて確認した。生育した細胞のコロニーを１００ｍＬの培地を用いて培養し、藻類細胞を回収した後、上記実施例１（１）と同様の方法によりゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、導入した抗生物質遺伝子（ｂｌｅ）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の条件は、基本的には上記実施例１（２）と同様とし、サイクル数は４０サイクル、アニーリング温度は６０℃とした。得られた増幅ＤＮＡを分析した電気泳動写真を図３に示す。
　図３中、「Ｍ」は分子量マーカーであり、「１」は抗生物質遺伝子（ｂｌｅ）が導入されたプラスミドベクターのレーン、「２」はP．tricornutum野生株のレーン、「３～５」はカリフラワーモザイクウィルス由来のプロモーターと抗生物質遺伝子（ｂｌｅ）を含むプラスミドベクターで形質転換した株のレーン、「６～８」は本発明に係るプロモーターと抗生物質遺伝子（ｂｌｅ）を含むプラスミドベクターで形質転換した株のレーンである。
　実施例５　中心目珪藻の形質転換
　上記実施例３、上記比較例２および上記比較例４のプラスミドベクターを用い、上記実施例４と同様にして、中心目珪藻Chaetoceros sp．を形質転換した。ただし、細胞を培養する培地には、５００μｇ／ｍＬノールセオスリシンを添加した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、上記抗生物質含有培地で生育した細胞のコロニーが形質転換していることを、上記実施例４と同様にしてＰＣＲにて確認した。得られた増幅ＤＮＡを分析した電気泳動写真を図４に示す。
　図４中、「Ｍ」は分子量マーカーであり、「１」は抗生物質遺伝子（ｎａｔ）が導入されたプラスミドベクターのレーン、「２」はChaetoceros sp．野生株のレーン、「３～４」は本発明に係るプロモーターと抗生物質遺伝子（ｎａｔ）を含むプラスミドベクターで形質転換した株のレーンである。
　実施例６　本発明に係るプロモーターのＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ領域の特定
　配列番号３のプライマーに加え、配列番号６～９のプライマーを用いた以外は上記実施例１と同様にして、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域の翻訳開始点の上流部位である＋１０７から、－７２、－３２、－２および＋３４までの塩基のＤＮＡ断片を、それぞれ増幅した。これらのエントリークローンと、上記実施例３において調製したノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）を含むエントリークローンおよびThalassiosira pseudonana由来のｆｃｐターミネーターを含むエントリークローンを用い、上記実施例２と同様にして、上記各エントリークローン、ｎａｔおよびｆｃｐターミネーターを連結したプラスミドを調製した。これらプラスミドは、図２と同様の構造を有する。これらプラスミドに加え、比較例２のプラスミドと、プロモーターを連結していないプラスミド（ｐＮａｔ／ＴｐｆｃｐＴｅｒ）を用い、上記実施例４と同様の方法により形質転換を行った。結果を図５に示す。
　図５のとおり、上記複製タンパク質遺伝子の翻訳開始点の上流部位における＋１０７から－３７０までの塩基配列（配列番号１）および＋１０７から－７２までの塩基配列をプロモーターとして用いた場合には形質転換できた一方で、＋１０７から－３２、－２および＋３４までの塩基配列をプロモーターとして用いた場合には、形質転換できなかった。かかる結果により、藻類の形質転換に有用なＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔは、上記複製タンパク質遺伝子の翻訳開始点の上流部位における－７２から－３３の間の配列（配列番号５）に存在している可能性が高いと結論付けられた。なお、形質転換が偶然起こっている可能性もあるため、プロモーターを有しないプラスミドでも同様の実験を行ったが、形質転換率は無視できる程度のものであった。また、中心目のプロモーターを用いて同様の実験を行ったところ、本発明プロモーターを用いた場合の方が、形質転換効率は明らかに高かった。
　実施例７　本発明プロモーターによる様々な海産藻類の形質転換
　本発明のプロモーターが、様々な珪藻種に対して適用か否か確認するために、上記実施例と異なる羽状目珪藻であるC. fusiformisを用いて形質転換を行った。ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域の翻訳開始点の上流部位である＋１０７から－７２までの塩基に加え、ゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）と、C. fusiformisのｆｃｐ遺伝子由来のターミネーターを組み込んだプラスミド（図６）を用いた。上記実施例４と同様に、プラスミドをタングステン粒子に固定化し、形質転換を行った。対照として、上記プロモーターを組み込まない以外は同様のプラスミド（ｐＢｌｅ／ＣｆｆｃｐＴｅｒ）を用い、同様の実験を行った。本発明プロモーターを組み込んだプラスミドを用いた場合の珪藻の写真を図７（１）に、本発明プロモーターを組み込んでいないプラスミドを用いた場合の珪藻の写真を図７（２）に示す。
　図７（２）のとおり、本発明プロモーターを組み込んでいない場合、おそらく形質転換されていないため、抗生物質により珪藻は死滅してしまった。それに対して本発明プロモーターを用いた場合、図７（１）のとおり、珪藻は形質転換されて抗生物質耐性を獲得したため、良好に生存している。このように上記実施例で用いた以外の珪藻も、本発明プロモーターを用いれば、形質転換が可能であることが明らかとなった。
　実験結果の考察
　（１）　形質転換能について
　上記実施例４～５の結果のとおり、羽状目珪藻の内在性プロモーターを用いた場合には、羽状目珪藻は良好に形質転換できる一方で、中心目珪藻は全く形質転換できなかった。植物一般の形質転換によく用いられるカリフラワーモザイクウィルスプロモータの場合でも同様であり、羽状目珪藻は形質転換できたが、中心目珪藻は全く形質転換できていない。
　それに対して、本発明に係るプロモーターを用いた場合には、羽状目珪藻についてはP. tricornutumとC. fusiformisの２種、中心目についてはChaetoceros sp.を形質転換することができた。これら３種の珪藻は、珪藻綱全体の分子系統樹において、それぞれの目の中でも系統的に離れた分類群に属するものである。よって、これらの種に適用可能な本発明プロモーターは、様々な珪藻に適用可能と考えられる。
　以上の結果により、珪藻は羽状目珪藻と中心目珪藻に大きく分類されるところ、従来のプロモーターの特異性が高いのに対して、本発明に係るプロモーターは特異性が低く、様々な珪藻の効率的な形質転換に幅広く用いられ得ることが示された。
　（２）　本発明プロモーターの塩基配列について
　一般的に、真核生物のプロモーター領域には、転写を開始させる転写結合因子が結合するコアプロモーター領域と、その上流に位置する遺伝子転写調節領域が存在する。ウィルスプロモーターにおいても同様に、ＴＡＴＡボックス（５’－ＴＡＴＡＷＡＷ－３’（式中、ＷはＡまたはＴを表す））やイニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）といった真核生物のコアプロモーター領域によく見られるモチーフ配列が存在することが知られている。このことを踏まえ、本発明に係る配列番号１のプロモーターの塩基配列をPLACE Signal Scan Search（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）を用いて解析し、比較した。
　その結果、本発明プロモーターにＴＡＴＡボックスは見られなかったが、上流領域にＣＡＡＴボックスＩである５’－ＣＡＡＴ－３’（－９７～－９４）、ＧＡＴＡボックスである５’－ＷＧＡＴＡＲ－３’（－１６２～－１６７）、さらにイニシエーターエレメントであると考えられる５’－ＣＣＡ+1ＴＡＣＣ－３’（－２～＋５）を見出した。
　このイニシエーターエレメントは、哺乳類の５’－ＹＹＡ+1ＮＷＹＹ－３’（Javahery，R．ら，Molecular and Cellular Biology，14，pp．116-127（1994））、卵菌類の５’－ＹＣＡ+1ＴＴＹＹ－３’（Mcleod，Aら，Eukaryotic Cell，3，pp．91-99（2004））、ショウジョウバエの５’－ＴＣＡ+1ＫＴＹ－３’（式中、ＫはＧまたはＴを表す）（Purnell，B．A．ら，Genes & Development，8，pp．830-842（1994））、 トリコモナスの５’－ＴＣＡ+1ＹＷ－３’（Liston，D．R．ら，Molecular and Cellular Biology，19，pp．2380-2388（1999））、およびC. fusiformisのプロモーターであるｆｃｐＡ－１Ａ中の５’－ＣＣＡ+1ＴＴＣＣ－３’（Poulsen，N．ら，FEBS Journal，272，pp.3413-3423（2005））というＩｎｒ配列に類似している。
　これら情報からは、配列番号１のプロモーター中に見出されたイニシエーターエレメントが、Ｃｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔとして羽状目珪藻と中心目珪藻の両方に働き、形質転換できたとも考えられる。しかし、当該イニシエーターエレメントに類似するC. fusiformisのプロモーターであるｆｃｐＡ－１Ａを用いても、中心目珪藻を形質転換することはできない。
　よって、本発明に係るポリヌクレオチド（１）が高い形質転換能を示すのは、少なくともＴＡＴＡボックスやイニシエーターエレメントなどのためではなく、全く未知の配列がＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔとして働いている可能性が高い。
　（３）　本発明プロモーターのＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔについて
　上記実施例６の結果により、本発明プロモーターのＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔは、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域の－７２から－３３の間の配列（配列番号５）に存在している可能性が高いと考えられる。配列番号５の配列は、当該複製タンパク質遺伝子の上流域に位置するイニシエーターエレメントのおよそ３０から７０塩基上流側に位置していることから、当該イニシエーターエレメントがＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔとして機能したとは考え難い。当該配列番号５の配列番号をPLACE Signal Scan Search（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）で解析したが、既知のモチーフ配列を見出すことはできなかった。よって、本発明プロモーターのＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔは、これまで知られていない新規なものであると考えられる。
　上記の実験結果のとおり、本発明プロモーターを用いれば目を超えて珪藻類を形質転換可能である理由として、配列番号５の配列に含まれる新規な配列がＣｏｒｅ　ｅｌｅｍｅｎｔとして機能したと考えられる。
　本発明に係るプロモーターを含むベクターを用いれば、様々な種類の藻類を効率的に形質転換し得る。よって本発明を用いれば、高い光合成能を有し、有用物質の産生能を有するなど優れた特性を有する上に、多量に存在するものでありながら、形質転換が難しくこれまで十分にその技術が検討されていなかった藻類を、“目（モク）”などを超えて幅広く且つ効率的に形質転換することが可能となる。

Claims (5)

  1. 　下記（１）～（３）の何れかの構造を有することを特徴とするプロモーター。
    　（１）　ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド
    　（２）　上記ポリヌクレオチド（１）の１または複数のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
    　（３）　上記ポリヌクレオチド（１）とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
  2. 　上記ポリヌクレオチド（１）が配列番号５の塩基配列を有するものである請求項１に記載のプロモーター。
  3. 　上記ポリヌクレオチド（１）が配列番号１の塩基配列を有するものである請求項１に記載のプロモーター。
  4. 　請求項１～３のいずれかに記載のプロモーター、および任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とするベクター。
  5. 　請求項４に記載のベクターを調製する工程；および
    　上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程；
    　を含むことを特徴とする藻類の形質転換方法。
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