KR20160025602A

KR20160025602A - Aba 반응을 유도하는 화합물

Info

Publication number: KR20160025602A
Application number: KR1020167002408A
Authority: KR
Inventors: 신 알. 커틀러; 세바스챤 보커 윈데본; 피에르 조셉 정; 마씰드 데니스 라치아; 라파엘 두메니어
Original assignee: 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아; 신젠타 파티서페이션즈 아게
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2016-03-08
Also published as: EA201690097A1; CA2917030A1; MX2015017838A; AU2014302097A1; CN105722825A; WO2014210555A1; EP3013800A1; JP2016531091A; BR112015032441A2; US20160280651A1

Abstract

본 발명은 ABA 수용체를 활성화하는 작용제 화합물, 및 상기 작용제 화합물을 포함하는 농업용 제형을 제공한다. 농업용 제형은 식물 영양 조직에서 ABA 반응을 유도하고, 식물에서 비-생물적 스트레스를 낮추고, 식물 종자의 발아를 저해하는데 유용하다. 또한, 본 화합물은 내인성 또는 이종의 ABA 수용체를 발현하는 세포에서 ABA-응답성 유전자들의 발현을 유도하는데에도 유용하다.

Description

ABA 반응을 유도하는 화합물 {COMPOUNDS THAT INDUCE ABA RESPONSES}

본 출원은 2013년 6월 28일자 미국 가출원 번호 61/840,967에 대한 우선권을 주장하며, 이 미국 가출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

앱시스산 (ABA: Abscisic acid)은 비-생물적 스트레스 반응과 관련된 신호 전이를 조절하는 식물 호르몬이다 (Cutler et al., 2010, Abscisic Acid: Emergence of a Core Signaling Network. Annual Review of Plant Biology 61:651-679). ABA 신호전달 경로는 수많은 접근 방식을 통해 식물 스트레스 반응 및 관련된 수확 형질을 개선시키기 위해 이용되어 왔다 (Yang et al., 2010). 식물에서의 직접적인 ABA 사용은 식물의 물 이용 효율을 개선시키는데 (Raedmacher et al., 1987); 이런 이유로, ABA 작용제 분자가 농작물의 수확량 개선에 유익할 수 있어 (Notman et al., 2009), ABA 작용제 (Park et al., 2009; Melcher et al., 2010, Identification and mechanism of ABA receptor antagonism. Nature Structural & Molecular Biology 17(9):1102-1110)에 대한 관심이 높아지고 있다. 최초로 동정된 합성 ABA 작용제는 피라박틴 (pyrabactin)으로 지칭되는 나프탈렌 설폰아미드로서 (Park et al., 2009), 이것은 종자에서 ABA 신호전달을 효과적으로 활성화하지만, 비-생물적 스트레스 내성의 가장 중요한 양상들이 발생하는 영양 조직에서는 제한적인 활성을 가진다. 파라박틴과 매우 유사한 설폰아미드가 ABA 작용제 (미국 특허 공개공보 20130045952) 및 비-생물적 스트레스 조절 화합물 (미국 특허 공개공보 20110230350)로서 개시되었으며; 또한, 비-설폰아미드 ABA 작용제도 언급된 바 있다 (미국 특허 공개공보 20130045952 및 20110271408). ABA 경로를 활성화하기 위한 보완적인 방법은 유전학적 방법을 통해 식물의 ABA 감수성 (sensitivity)을 높이는 것을 포함한다. 예를 들어, 파르네실 트렌스퍼라제 베타 서브유닛 유전자의 조건 안티센스 (conditional antisense)는 식물의 ABA 감수성을 증가시키는 것으로서, 카놀라와 아라비돕시스 모두에서 보통 수준의 가뭄에서 수확성을 개선시킨다 (Wang et al., 2005). 따라서, 수확율에 기여하는 형질을 개선시키기 위한 ABA 신호전달의 조작은 현재 잘 확립되어 있다.

최근, ABA가 PYR/PYL 단백질로 지칭되는 가용성 수용체 패밀리에 결합함으로써 다수의 세포성 반응들을 일으키는 것으로 확인되었다. PYR/PYL 단백질은 START 슈퍼패밀리로 지칭되는 거대 리간드-결합 단백질 패밀리에 속한다 (Iyer et al., 2001; Ponting et al., 1999). 이들 단백질은, 중앙의 알파 나선을 둘러싸 "나선-그립 (helix-grip)" 모티프를 형성하는, 7개의 역-평행 베타 시트로 구성되어 있으며; 더불어, 이들 구조 요소들은 ABA 또는 다른 작용제와 결합하기 위한 리간드-결합 포켓을 형성한다.

본 발명은 소분자 ABA 작용제, 즉 PYR/PYL 단백질을 활성화하는 화합물을 제공한다. 일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 ABA 작용제 화합물 및 이러한 화합물을 포함하는 농업용 제형 (agricultural formulation)을 제공한다. 일부 구현예들에서, 식 I의 화합물, 또는 이의 염 또는 이성질체가 제공된다:

상기 식 (I)에서,

R¹은 C_2-6　알케닐 및 C_2-6　알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고,

R²는 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이들 각각은 선택적으로 1-4개의 R^2a 기로 치환되며,

각각의 R^2a는 독립적으로 H, 할로겐, C_1-6　알킬, C_1-6　알콕시, C_1-6　할로알킬, C_1-6　할로알콕시, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐, -OH, C_1-6　알킬하이드록시, -CN, -NO₂, -C(O)R^2b, -C(O)OR^2b, -OC(O)R^2b, -C(O)NR^2bR^2c, -NR^2bC(O)R^2c, -SO₂R^2b, -SO₂OR^2b, -SO₂NR^2bR^2c 및 -NR^2bSO₂R^2c로 이루어진 군으로부터 선택되고,

각각의 R^2b 및 R^2c는 독립적으로 H 및 C_1-6　알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,

각각의 R³, R⁴ 및 R⁵는 독립적으로 H 및 C_1-6　알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R³또는 R⁴ 중 적어도 하나는 메틸이고,

L은 결합 및 C_1-6　알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고,

아랫 첨자 m은 0 내지 4의 정수이고,

아랫 첨자 n은 0 내지 3의 정수이고, 및

m + n은 1 이상이다.

일부 구현예들에서, 농업용 제형은 식물 생장 촉진, 잡초 억제 또는 해충 억제에 유용한 농화학제 (agricultural chemical)를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 농업용 제형은 살진균제, 제초제, 농약 (pesticide), 살선충제 (nematicide), 살충제 (insecticide), 식물 활성제 (plant activator), 상승제 (synergist), 제초제 약해경감제 (herbicide safener), 식물 생장 조절제, 곤충 기피제, 살비제 (acaricide), 연체동물 살충제 (molluscicide) 또는 비료 중 하나 이상을 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 농업용 제형은 계면활성제를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 농업용 제형은 담체를 더 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은, 제형과 접촉되지 않은 식물에서의 비-생물적 스트레스 내성과 비교해, 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이기 위한 충분한 양으로 상기 제형을 식물에 접촉시키는 단계를 포함하는, 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 식물은 외떡잎 식물이다. 일부 구현예들에서, 식물은 쌍떡잎 식물이다. 일부 구현예들에서, 비-생물적 스트레스 내성은 내건성 (drought tolerance)을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은, 식물, 식물의 일부 또는 식물 종자에 발아를 저해하기 위한 충분한 양의 상기 제형을 접촉시키는 단계를 포함하는, 식물에서 종자의 발아를 저해하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 제형과 접촉되는 식물 또는 식물의 일부를 제공한다. 일부 구현예들에서, 식물은 종자이다.

다른 측면에서, 본 발명은 PYR/PYL 단백질의 활성화 방법을 제공한다. 본 발명의 일부 구현예들에서, PYR/PYL 단백질은, PYR/PYL 단백질이 작용제 화합물 LC66C6 (퀴나박틴이라고도 함)과 결합하였을 때, 2형 단백질 포스파타제 (PP2C) 폴리펩타이드에 결합한다. 일부 구현예들에서, 본 방법은 PYR/PYL 단백질을 본원에 기술된 임의의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 활성화되는 PYR/PYL 단백질은 서열번호 1-119 중 임의의 하나와 실질적으로 동일하다. 일부 구현예들에서, PYR/PYL 단백질은 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예들에서, PYR/PYL 단백질은 식물 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예들에서, PYR/PYL 단백질은 내인성 단백질이다. 일부 구현예들에서, PYR/PYL 단백질은 외인성 단백질이다. 일부 구현예들에서, 세포는 2형 단백질 포스파타제 (PP2C)를 추가로 발현한다. 일부 구현예들에서, 2형 단백질 포스파타제는 HAB1 (ABI1과 상동함), ABI1 (앱시스산 둔감성 1) 또는 ABI2 (앱시스산 둔감성 2)이다.

정의

"작용제"는, 예를 들어, 언급된 타겟 단백질의 발현을 유도 또는 활성화하거나, 또는 하나 이상의 식물 PYR/PYL 단백질 (또는 코딩 폴리뉴클레오티드)에 결합하거나, 활성을 자극, 증대, 개시 (open), 활성화, 촉진, 활성화를 강화, 민감화 또는 상향-조절하는, 물질이다. 작용제는 천연 분자 및 합성 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 작용제는 농화학제와 조합되어, 농업용 제형으로 제조된다. 적합한 농화학제의 예로는 살진균제, 제초제, 농약, 비료 및/또는 계면활성제를 포함한다. 작용제가 PYR/PYL 단백질을 "아고나이징 (agonize)"하거나 "아고나이징하지 않는"지를 확인하기 위한 분석은, 예를 들어, 추정의 작용제를 정제된 PYR/PYL 단백질(들)과 접촉시킨 후 본원에 기술된 바와 같이 PYR/PYL 단백질 활성에 대한 기능적인 효과를 확인하는 것을 포함하거나, 또는 추정의 작용제를 PYR/PYL 단백질(들)을 발현하는 세포에 접촉시킨 다음 본원에 기술된 바와 같이 기술된 타겟 단백질에 대한 기능적인 효과를 확인하는 것을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자는, 작용제가 PYR/PYL 단백질을 아고나이징하거나 아고나이징하지 않는 지를 확인하는데 분석이 적합한지를 정할 수 있을 것이다. 추정의 작용제로 처리되는 PYR/PYL 단백질을 포함하는 샘플 또는 분석은, 작용제가 처리되지 않은 대조군 샘플과 비교하여, 효능의 정도를 조사한다. (작용제 무처리) 대조군 샘플은 상대적인 활성도 100%로 배정된다. 대조군에 대해 상대적인 활성도가 110%, 선택적으로 150%, 선택적으로 200, 300%, 400%, 500% 또는 1000 - 3000% 또는 그 이상일 경우에, PYR/PYL 단백질의 아고니즘 (agonism)이 달성된다.

용어 "PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드"는, 야생형 형태에서 앱시스산 (ABA) 및 ABA 유사체 신호전달을 매개하는, 폴리케티드 사이클라제 도메인 2 (PF10604), 폴리케티드 사이클라제 도메인 1 (PF03364) 및 Bet V I 도메인 (PF03364) 중 하나 이상 또는 전체의 존재로 일부 특정되는 단백질을 지칭한다. PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드 서열들은 매우 다양하게 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예들에서, PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드는 서열번호 1-119 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, PCR 출원 공개공보 WO 2011/139798을 참조한다.

용어 "활성 분석"은 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드의 활성을 측정 또는 검출하는 모든 분석을 의미한다. PYR/PYL 수용체의 활성을 측정하는 예시적인 분석은, 실시예들에 기술된 바와 같이 PYR/PYL 폴리펩타이드의 2형 단백질 포스파타제 (PP2C) 폴리펩타이드로의 결합을 검출하는, 효모 2-하이브리드 분석이다.

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드는, 2개의 서열에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 각각의 서열이 후술한 최대한 대응되게 정렬되었을 때 동일하다면, "동일하다"로 지칭된다. 2 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열에 대한 문맥에서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" %는, 다음과 같은 서열 비교 알고리즘들 중 한가지를 이용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정되는 바와 같이, 비교 창에서 최대 일치성에 대해 비교 및 정렬되었을 때, 동일한 2개 이상의 서열 또는 서브 서열을 지칭하거나, 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드들의 구체적인 퍼센트를 가지는 것을 의미한다. 서열 동일성 퍼센트가 단백질 또는 펩타이드에 대해 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치들은, 종종 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성 (예, 전하 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기로 치환되어 분자의 기능적 특성은 바뀌지 않는, 보존적인 아미노산 치환 차이가 종종 있는 것으로 인지된다. 서열에 보존적인 치환 차이가 있는 경우, 서열 동일성 %는 보존적인 치환 특성을 보완하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 이루는 방식은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이는 전체 미스매치 보다는 부분적으로서 보존적인 치환을 점수로 추가하여, 서열 동일성 %를 높이는 것을 포함한다. 즉, 예를 들어, 동일한 아미노산이 1점이고, 비-보존적인 치환이 0점으로 매겨진다면, 보존적인 치환은 0과 1 사이의 점수로 매긴다. 보존적인 치환의 점수는 예를 들어 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA)에 구현된 바와 같이, Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988)의 알고리즘에 따라, 계산된다.

2종의 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 사용되는 "실질적으로 동일한"이라는 표현은, 서열이 기준 서열과 60% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 의미한다. 다른 예로, 동일성%는 60% 내지 100% 중 임의 정수일 수 있다. 일부 구현예는, 본원에 언급된 프로그램, 바람직하게는 후술된 바와 같이 표준 파라미터를 이용한 BLAST를 이용하여, 기준 서열 대비 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 본 발명의 구현예들은, 서열번호 1-119 중 임의의 서열과 실질적으로 동일한, 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 코딩 핵산을 제공한다.

서열 비교를 위해, 전형적으로, 하나의 서열은 테스트 서열과 비교하기 위한 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 테스트 서열과 기준 서열을 컴퓨터에 입력하여, 서브서열 배치 (subsequence coordinate)를 필요에 따라 설정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 설정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하거나, 또는 다른 파라미터를 설정할 수 있다. 그런 후, 서열 비교 알고리즘으로 프로그램 파라미터를 토대로 기준 서열 대비 테스트 서열의 서열 동일성 %를 계산한다.

본원에서, "비교 창"은, 2개의 서열이 최적으로 정렬되었을 때 하나의 서열이 연속 위치들의 갯수가 동일한 기준 서열과 비교될 수 있는, 20 - 600, 통상적으로 약 50 - 약 200, 보다 일반적으로 약 100 - 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택되는 복수의 연속적인 위치들 중 임의의 하나의 세그먼트에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위해 서열들을 정렬하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 검색법, 이들 알고리즘의 전산 구현 (Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해, 비교를 위해 서열들의 최적 정렬을 수행할 수 있다.

서열 동일성% 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘은, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 및 Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402에 각각 기술된, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학정보센터 (NCBI) 웹사이트를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘에서는, 먼저 쿼리 서열에서, 데이타베이스 서열과 동일 길이의 워드로 정렬하였을 때 일부 파지티브-값의 역치값 T에 매칭 또는 충족하는, 길이 W의 약자를 식별함으로써, HSP (high scoring sequence pairs)를 확인한다. T는 이웃 워드 스코어 역치 (neighborhood word score threshold)로도 언급된다 (Altschul et al, supra). 최초 이웃 워드 히트 (hit)는 이를 포함하는 더 긴 HSP를 검색하기 위한 검색 개시의 시드로서 작용한다. 그런 후, 워드 히트는 누적 정렬 스코어를 증가시킬 수 있을 때까지 각 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 스코어는, 뉴클레오티드 서열의 경우 파라미터 M (매칭 잔기 한쌍에 대한 리워드 스코어; 항상 >0) 및 N (미스매칭 잔기들에 대한 패널티 스코어; 항상 <0)을 이용해 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 사용해 누적 스코어를 계산한다. 각 방향에서의 워드 히트들의 연장은, 누적 정렬 스코어가 최고 달성값으로부터 X 값만큼 하락하거나; 누적 스코어가 하나 이상의 네거티브-스코링 잔기 정렬들의 누적으로 인해 0 또는 그 이하가 되거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 말단에 도달하게 되면, 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감수성과 스피드를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 워드 사이즈 (W) 28, 기대값 (E) 10, M=1, N=-2 및 양쪽 가닥 비교를 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 사이즈 (W) 3, 기대값 (E) 10 및 BLOSUM62 스코링 매트릭스를 이용한다 (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

또한, BLAST 알고리즘 역시 2개의 서열 간의 유사성을 통계적으로 분석한다 (Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성 척도는 최소 합 확률 (smallest sum probability) (P(N))로서, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 발생할 확률을 표시한다. 예를 들어, 테스트 핵산을 기준 핵산과 비교하였을 때 최소 합 확률이 약 0.01 미만, 더 바람직하게는 약 10^-5 미만, 가장 바람직하게는 약 10^-20 미만이라면, 그 핵산 서열은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열과 핵산 서열 둘다에 적용된다. 특정 핵산 서열에서, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 또는 기본적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 기본적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드 축중 (degeneracy)으로 인해, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산들이 임의의 소정의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌으로 지정된 각 위치에서, 코돈은 코딩되는 폴리펩타이드를 변형시키지 않으면서 기재된 해당 코돈들 중 임의의 코돈으로 변형될 수 있다. 이러한 핵산 변이체는 "침묵 변이 (silent variation)"로, 이는 보존적으로 변형된 변형의 일종이다. 폴리펩타이드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열 역시 모든 가능한 핵산의 침묵 변이를 나타낸다. 당해 기술 분야의 당업자는, 핵산의 각 코돈 (본래 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG는 제외됨)을 변형시켜 기능적으로 동일한 분자를 만들 수 있음을 알 것이다. 즉, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 언급된 서열에 내포된다.

아미노산 서열의 경우에도, 당해 기술 분야의 당업자는, 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에서 코딩된 서열내 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산들을 변형시키는, 개개 치환이, 변형으로 아미노산을 화학적으로 비슷한 아미노산으로 치환시키는 경우, "보존적으로 변형된 변이체"임을 알 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적인 치환 표는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.

아래 6개의 그룹은 각각 서로 보존적인 치환인 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);

5) 이소루신 (I), 루신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);

6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).

(Creighton, Proteins (1984)을 참조함).

용어 "식물"은 전체 식물, 줄기 영양 기관 및/또는 구조물 (예, 잎, 줄기 및 덩이줄기), 뿌리, 꽃 및 화기 (floral organ) (예, 포엽, 꽃받침, 꽃잎, 수술, 심피, 꽃밥), 배주 (난 세포 및 중심 세포가 포함됨), 종자 (접합자, 배 (embryo), 내배유 및 종피), 열매 (예, 성숙 난소), 묘목, 식물 조직 (예, 유관속 조직 (vascular tissue), 기본 조직 (ground tissue) 등), 세포 (예, 공변 세포 (guard cell), 난 세포, 사상체 등) 및 이의 후대를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물 유형은 속씨식물 (외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물), 겉씨식물, 양치류, 선태류 및 다세포성 및 단세포성 조류를 포함한다. 이수체, 배수체, 이배체, 반수체 및 반접합 (hemizygous) 등의 다양한 배수성 (ploidy) 수준을 가진 식물을 포함한다.

본원에서, 용어 "형질전환"은, 식물이 자신의 게놈에 동일하거나 또는 다른 식물 종으로부터 유래될 수 있는 외인성 핵산 분자를 포함하는 경우, 사람에 의해 변형된 게놈을 포함하는 비-천연 식물을 지칭한다. 외인성 핵산 분자는 프로모터, 인핸서 또는 다른 조절 인자와 같은 유전자 조절 인자일 수 있거나, 또는 이종의 유전자 조절 인자에 연결될 수 있는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 유성 교배 또는 자가 증식으로 발생되는 형질전환 식물은 이러한 식물의 자손이며, 이 역시 "형질전환성"인 것으로 간주된다.

본원에서, 용어 "건조 저항성 (drought-resistance)" 또는 "내건성 (drought-tolerance)"은 이의 임의 변형어를 포함하여, 식물이 건조 스트레스 기간 (즉, 수일 기간 동안 물이 거의 또는 전혀 없음)으로부터 회복하는 능력을 지칭한다. 전형적으로, 건조 스트레스는 적어도 5일일 것이며, 예를 들어 식물 종에 따라서는, 예를 들어 18 - 20일 또는 그 이상 (예, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 이상)으로 길 수 있다.

본원에서, 용어 "비-생물적 스트레스", "스트레스" 또는 "스트레스 상태"는 식물, 식물 세포 등이 식물의 대사, 생장, 발생, 증식 또는 생존 (총괄하여, "생장")에 유해한 효과를 미치는 살아있지 않은 ("비-생물") 물리적 또는 화학적 물질에 노출되는 것을 의미한다. 스트레스는, 예를 들어, 물 (예, 홍수, 가뭄 또는 탈수), 혐기성 상태 (예, 낮은 산소 수준 또는 높은 CO₂ 수준), 비정상적인 삼투성 상태, 염도 또는 온도 (예, 뜨거움/열, 추위, 동결 또는 서리)와 같은 환경 인자, 영양 부족 또는 오염원에의 노출, 또는 호르몬, 2차 메신저 또는 다른 분자에 의해, 식물에 부여될 수 있다. 혐기성 스트레스는, 예를 들어, 스트레스 반응을 발생시키기에 충분한 산소 수준의 저하 (저산소증 또는 무산소증)로 인한 것이다. 홍수 스트레스는 식물, 식물의 일부, 조직 또는 분리된 세포가 몬순, 풍수기, 돌발 홍수 또는 식물의 과도한 관수 동안에 발생하는 바와 같이 액체 매질 중에 장기간 또는 일시적인 침지로 인한 것일 수 있다. 한랭 스트레스 또는 열 스트레스는 각각 특정 식물 종에 대한 최적의 생장 온도 범위에서 각각 온도의 감소 또는 상승으로 인해 발생할 수 있다. 이러한 최적의 생장 온도 범위는 당해 기술 분야의 당업자가 쉽게 정하거나 공지되어 있다. 탈수 스트레스 (dehydration stress)는 수분 감소, 팽압 감소 또는 세포, 조직, 기관 또는 전체 식물의 수분 감소로 인해 유도될 수 있다. 가뭄 스트레스는 세포, 조직, 기관 또는 유기체로의 물 공급 감소 또는 물 고갈로 인해 유도되거나 또는 이와 관련있을 수 있다. 염분-유발성 스트레스 (염-스트레스)는 세포내 삼투 퍼텐셜 또는 세포의 세포외 환경의 교란과 관련있거나 또는 이로 인해 유도될 수 있다. 본원에서, 용어 "비-생물적 스트레스 내성" 또는 "스트레스 내성"은 정상 조건 하의 식물과 비교해 비-생물적 스트레스에 대한 저항성 또는 내성이 식물에서 증가되고, 비-생물적 스트레스 상황에 처했을 때 상대적으로 탁월한 방식으로 헤쳐가나는 능력을 의미한다.

폴리펩타이드 서열은, 이것이 외래 종으로부터 기원한다면 유기체에 "이종"이거나 또는 제2 폴리펩타이드 서열이거나, 또는 동일한 종으로부터 기원한다면 이의 오리지날 형태로부터 변형된다.

도 1A-B. 새로운 ABA 작용제는 복수의 PYR/PYL들에 결합한다. (A) 천연 (+)-ABA, 이의 (-) 유사체 및 ABA 선택 작용제의 화학 구조. (B) 시험 화학제 5 μM에 대한 PYR/PYL 수용체 감수성을 확인하는 효모 2-하이브리드 작용제 분석. 구체적인 PYR/PYL 수용체와 PP2C HAB1은 본문에 기술된 바와 같이 각각 Gal4 BD 또는 AD 융합 단백질로서 발현된다.
도 2A-C. 새로운 ABA 작용제는 복수의 PYR/PYL들을 통해 PPC2 활성을 저해한다. (A) 천연 (+)-ABA 및 ABA 선택 작용체의 화학 구조. (B) 및 (C) 각 시험 화합물 10 μM의 존재 또는 부재 하의 다양한 수용체에 대한 HAB1, ABI1, 및 ABI2 PP2C 효소 활성 기반의 ABA-작용제 분석.
도 3A-B. (A) ABA 작용제 및 유사체에 의한 PP2C 효소 활성의 수용체-매개 용량-의존적인 저해. (B) 효소적 HAB1 PP2C-기반의 ABA-작용제 분석에서 관찰된 화합물의 IC₅₀ 값.
도 4A-B. 퀴나박틴은 복수의 ABA 수용체들을 활성화한다. (A) ABA, 피라박틴 및 퀴나박틴의 화학 구조들. (B) ABA 수용체에 의한 HAB1의 화학제-의존적인 저해. IC₅₀ 값 (nM)은 50 nM HAB1, 50 nM 및 복수 농도의 화합물을 이용하여 본 방법에 기술된 바와 같이 결정하였다; 전체 용량 반응 곡선은 도 3에서와 같이 제공된다. (nd)는 활성 단백질로서 제조되지 않은 수용체이다. 계통수 (phylogenetic tree)는 MEGA5에서 JTT 거리 행열 (distance matrix)을 이용해 제작된 Neighbor-Joining tree이다 (Tamura K, et al. (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28(10):2731-2739).
도 5A-D. 새로운 ABA 작용제는 피라박틴 보다 더 강력하게 아라비돕시스 종자의 발아를 저해한다. (A) 및 (B) ABA 작용제에 의한 종자 발아 저해 비교. (C) 및 (D) 발아 (C) 및 묘목 확립 (D)에 대한 아라비돕시스 ABA 신호전달- 및 생합성-결함 돌연변이에서의 ABA 및 LC66C6 (퀴나박틴이라고도 함)의 효과. 종자는 화학제가 함유된 1/2X MS 아가 플레이트에 심고, 4일간 4℃에 보관한 후 22±2℃로 이동시켰다. 사진 (A 및 C) 및 발아 (B) 또는 녹자엽 (D) 스코어를 연속 조명 하에 4일 인큐베이션한 후 평가하였다. 패널 C는 5 μM ABA 또는 LC66C6에서의 발아 분석 결과를 보여준다.
도 6A-C. LC66C6는 식물의 생장을 저해한다. (A) 야생형, abi1-1 및 PYR/PYL 4중 돌연변이 아라비돕시스 유전자형에서의 ABA, 피라박틴 및 LC66C6의 효과를 도시한 사진. ABA, LC66C6 및 파라박틴에 의한 (B) 뿌리 생장 저해 및 (C) 식물 생장 저해. 2일된 묘목을 화학제가 함유된 1/2X MS 플레이트로 옮긴 다음, 시험 화합물에서 5일 인큐베이션한 후 표현형 스코어를 매기거나 사진을 촬영하였다.
도 7A-E. LC66C6는 가뭄 스트레스 내성을 강화한다. LC66C6는 야생형 (A) 및 aba2 돌연변이 유전자형 (B)에서 분리된 잎의 증산성 수분 상실을 억제한다. (C) LC66C6는 ABA-둔감성 유전자형 abi1-1의 표현형을 구제할 수 없다. (D) LC66C6는 abi1-1 유전자형이 아니라 야생형과 aba2 유전자형에서 기공 차단 (기공 폐쇄)을 유도한다. (E) 대두에 건조 처리 후 토양의 수분 함량에 대한 화합물의 효과. 토양의 수분 함량은 실시예들에 기술된 바와 같이 측정하였다.
도 8A-B. 퀴나박틴은 아생형 식물에 가뭄 스트레스 내성을 부여한다. (A) 아라비돕시스 내건성에 대한 퀴나박틴의 효과. 2주된 식물에 물 공급을 차단하여 가뭄 스트레스를 가하고, 12일 후 사진을 촬영하였다. 건조 기간 동안에, 식물에 화합물 25 μM을 3일마다 처리하였다. 2주간의 건조 처리 후 식물에 수분을 다시 공급하고; 각 처리에 따른 (전체 처리 식물 주 중) 살아있는 식물의 수를 각 사진 옆에 표시한다. (B) 대두에 대한 퀴나박틴의 효과. 2주된 식물에 물 공급을 차단하여 가뭄 스트레스를 가하고, 8일간의 건조 처리 후 사진을 촬영하였다. 모든 가뭄 스트레스 처리들에서, 화합물 (아라비돕시스의 경우 25 μM, 대두의 경우 50 μM 처리)은 0.05% Tween-20이 함유된 용액 중에 사용하고, 가뭄 상황 동안 3일 마다 에어로졸로서 적용하였다. 전체 실험의 값은 평균 ± SEM이다 (n = 6, 실험 당 사용되는 식물 주 3주).
도 9A-D. LC66C6는 수많은 ABA-응답성 유전자들을 유도한다. (A)는 비히클 (DMSO), 피라박틴, LC66C6 또는 (+)-ABA로 처리된 야생형, abi1-1, pyr1/pyl1/pyl2/pyl4 4중 수용체 돌연변이 유전자형의 아라비돕시스 묘목에서의, ABA-응답성 리포터 유전자의 화학제 유발성 mRNA 발현 수준을 도시한 것이다. (B) LC66C6는 아라비돕시스 묘목에서 ABA-응답성 유전자들을 효과적으로 유도하는 반면, 피라박틴은 그렇지 않다. 10일된 묘목에 담체 용매 (DMSO), 또는 25 μM ABA, 피라박틴 또는 LC66C6 중 한가지를 8시간 동안 처리하였다. 그런 후, 전체 RNA를 표지하여 준비하고, ATH1 마이크로어레이에 혼성화하였다. 데이타는 전체 실험들에서 검출가능한 ~13K 프로브에 대한 평균 발현 값으로 log2 변환하여 도표화하였다. 데이타는 3번의 생물학적 리플리케이트로부터 결정된 평균으로 나타낸다. (C) 및 (D)는 비히클 (DMSO), 피라박틴, LC66C6 또는 (+)-ABA로 처리한 후 여러가지 식물 조직들에서 리포터 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 10. PYR/PYL 단일 돌연변이에서 ABA-응답성 유전자 발현. ABA-응답성 MAPKKK18, RD29A 및 RD29B mRNA의 LC66C6, ABA 및 피라박틴에 대한 반응을 Col 및 Ler 생태형 (ecotype)과, pyr1, pyl1, ply2, pyl3 및 pyl4 단일 돌연변이 유전자형들에서 규명하였다.
도 11. LC66C6는 야생형 식물, abi1-1 및 PYR/PYL 4중 돌연변이에서 ABA-응답성 유전자의 발현을 유도한다. Col 야생형 식물에서의 용량 의존적인 방식으로의 LC66C6 및 (+)-ABA 유발성 ABF3, GBF3, NCED3 및 RD29A 발현, 반면 피라박틴은 그렇지 않음.
도 12A-B. LC66C6 감수성은 CYP707A ABA-하이드록시화 효소에 의해 영향을 받지 않는다. (A)는 사진이며, (B)는 야생형 식물, CYP707A (CYP707AOX) 과다 발현 식물 및 DMSO, 40 μM (+)-ABA 및 40 μM LC66C6로 처리된 cyp707a의 이중 돌연변이 식물에서의 원뿌리 (primary root) 길이를 정량하여 나타낸 것이다. (C)는 생중량 (fresh weight)이고, (D)는 (A)에서와 같이 처리한 식물의 녹자엽 (green cotyledon) 퍼센트를 나타낸 것이다.
도 13A-E. LC66C6는 다양한 종들에서 ABA 반응을 조절한다. 표시된 화합물에 반응하여, 발아 저해 (A) 및 절단 (detachment) 2시간 후 분리된 잎에서의 증산에 의한 수분 감소 (B). 화학제 적용 후, 대두 (C), 보리 (D) 및 옥수수 (E)에서 ABA-응답성 마커 유전자들의 발현. D, P, L 및 A는 각각 DMSO, 피라박틴, LC66C6 및 (+)-ABA를 의미한다.
도 14. ABA 및 작용제들의 화학 구조
도 15A-C. 효모 분석 및 종자 발아에서 ABA 및 작용제들의 효과. (A)는 도 14에 나타낸 각각의 작용제에 대한 반응을 조사하기 위해 PYR/PYL 수용체들 PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 및 PYL4를 이용한 효모 2-하이브리드 분석 결과를 나타낸 것이다. (B)는 야생형 종자의 발아에 있어 도 14의 작용제들의 테스트 결과를 도시한 것이다. (C)는 ABA-유발성 아라비돕시스 유전자 MAPKKK18의 통제 하에 글루쿠로니다제를 발현하는 형질전환주에서 글루쿠로니다제 분석을 이용하여 측정한, ABA-리포터 주에서의 화합물들의 효과를 나타낸 것이다.
도 16A-B. LC66C6의 적용은 ABA-결함 돌연변이 aba2 에서 관찰되는 생장 결함을 회복할 수 있다. 화학제 용액 (25 μM)은 2주간 1일 2회로 14일된 식물에 살포하였다. 4주된 식물에서 이미지 (A)와 생중량 (B)을 수득하였다.
도 17A-D. 피스코미트렐라 파텐스 ( Physcomitrella patens ) 및 클라미도모나스 ( Chlamydomonas )에서 ABA 및 이의 작용제의 효과. 원사체 (Protonemal) 생장 이미지 (A) 및 (B) 피스코미트렐라 파텐스에서 ABA 및 작용제가 미치를 효과를 정량 분석한 결과. 원사체는 10일간 특정 시험 화학제 200 μM 하에 생장시켰다. LC66C6는 효과가 약하였지만, 원사체 생장을 현저하게 저해하였다. 피라박틴은 원사체를 탈색시켰다. (C) 피스코미트렐라 파텐스의 ABA-응답성 유전자들의 발현. 원사체에 200 μM 화학제 용액을 3시간 처리하였다. (D) 염 스트레스 및 삼투 스트레스 하의 화학제에서의 클라미도모나스의 콜로니 생장. 스트레스 적용 및 부재 하의 클라미도모나스 생장에 ABA 및 LC66C6는 영향이 없었다. 피라박틴은 피스코미트렐라 파텐스와 클라미도모나스를 탈색시켰는데, 이는 이 화합물이 ABA 작용제 활성과 무관한 이들 종들에서 독성을 가질 수 있음을 시사해준다.
도 18은 발아 및 pMAPKK18:Gus 리포터 발현의 저해 효과를 테스트한 작용제 화합물들을 요약 개시한 것이다. ++++++는 강력한 활성을 표시하고, + 하나는 약한 활성을, 대시 (-)는 무활성을, n.d.는 측정 안됨을 의미한다.

I. 서론

본 발명은 선택적인 앱시스산 (ABA) 작용제의 개발을 일부 토대로 한다. 기존의 ABA 작용제들과는 달리, 본원에 기술된 작용제들은 식물 영양 조직에서 ABA 경로를 강력하게 활성화하며, 비-생물적 스트레스 내성을 유도한다. 새로운 작용제를 사용해, 농작물 종의 식물에서 스트레스 내성을 유도할 수 있다. 작용제를 사용해, 비제한적인 예로, 브로콜리, 무 (radish), 알팔파 (alfalfa), 대두, 보리 및 콘(옥수수) 등의 외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물 종들에서 스트레스 내성을 유도할 수 있다.

앱시스산은, 눈 휴면 (bud dormancy), 종자 휴면 (seed dormancy) 및/또는 성숙, 잎과 열매의 탈리 (abscission), 및 매우 다양한 생물 스트레스 (예, 추위, 열, 염 및 가뭄)에 대한 반응 등의, 다양한 식물-보호 기능에 관여하는 다기능성 식물호르몬 (multifunctional)이다. 또한, ABA는 이산화탄소 농도와는 독립적인 기전에 의해 기공 폐쇄를 조절하는 역할을 담당한다. ABA 수용체 단백질인 PYR/PYL 패밀리는 ABA 신호전달을 매개한다. 지금까지 조사된 식물들은 PYR/PYL 수용체 단백질 패밀리에 속하는 구성원을 2종 이상 발현하며, 적어도 다소 과도한 활성을 가진다. PYR/PYL 수용체 단백질은 예를 들어 종자 발아, 발아 후 생장, 기공 개폐 (stomatal movement) 및 비제한적인 예로 가뭄 등의 스트레스에 대한 식물 내성에 파지티브 조절인자로서 ABA 신호전달을 매개한다.

당해 기술 분야에 매우 다양한 야생형 (천연) PYR/PYL 폴리펩타이드 서열들이 공지되어 있다. PYR1이 아라비돕시스에서 앱시스산 (ABA) 수용체로서 본래 동정되었지만, 실제 PYR1은 역시 ABA 신호전달을 아라비돕시스의 동일한 단백질 패밀리에 속하는 14종 이상의 단백질 (PYR/PYL 단백질)로 구성된 그룹의 구성원이다. 이러한 단백질 패밀리는 다른 식물에서도 존재하며 (예, 서열목록 참조), 폴리케티드 사이클라제 도메인 2 (PF10604), 폴리케티드 사이클라제 도메인 1 (PF03364) 및 Bet V I 도메인 (PF03364) 중 하나 이상 또는 전체의 존재로 일부 특정된다. START / Bet v 1 슈퍼패밀리 도메인은, 예를 들어, Radauer, BMC Evol. Biol. 8:286 (2008)에 기술되어 있다. 일부 구현예들에서, 야생형 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드는 서열번호 1-119 중 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 야생형 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드는 서열번호 1-119 중 임의의 것과 실질적으로 동일하다 (예, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일). 일부 구현예들에서, PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 또는 119 중 임의의 것과 실질적으로 동일하다 (예, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일).

II. ABA 작용제

본 발명은 소분자 ABA 작용제, 즉, PYR/PYL 단백질을 활성화하는 화합물을 제공한다. 예시적인 ABA 작용제로는, 예를 들어, 하기로부터 선택되는 화합물을 포함한다:

식 (I)의 화합물, 또는 이의 염 또는 이성질체:

상기 식에서,

아랫 첨자 m은 0 내지 4의 정수이고,

아랫 첨자 n은 0 내지 3의 정수이고, 및

m + n은 1 이상이다.

일부 구현예들에서, L은 CH₂이다. 일부 구현예들에서, R³는 CH₃이다. 일부 구현예들에서, R³는 CH₃이고, R⁴는 H이다. 일부 구현예들에서, R³는 H이고, R⁴는 CH₃이다. 일부 구현예들에서, R⁵는 H이다. 일부 구현예들에서, m은 2이고, 2개의 R³기 모두 CH₃이다.

일부 구현예들에서, 식 (I)의 화합물은 식 (I-A)로 표시된다:

.

일부 구현예들에서, 식 (I)의 화합물은 식 (I-B)로 표시된다:

.

일부 구현예들에서, R²는 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이들 각각은 선택적으로 1-4개의 R^2a 기로 치환된다.

일부 구현예들에서, 각각의 R^2a는 독립적으로 H, 할로겐 및 C_1-6　알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예들에서, R²는 페닐, 나프틸, 티오펜, 푸란, 피롤 및 피리딜로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예들에서, R²는 페닐 및 티오펜으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이들 각각은 1개의 R^2a 기로 선택적으로 치환되며; 각각의 R^2a는 독립적으로 H, F, Cl, 메틸 및 에틸로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 결합 및 메틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예들에서, 식 (I)의 화합물은 식 (I-C)로 표시된다:

.

일부 구현예들에서, 식 (I)의 화합물은 식 (I-D)로 표시된다:

.

일부 구현예들에서, m은 4이고, n은 3이다. 선택적으로, m이 4이고 n이 3인 식 I의 화합물은 하기와 같이 식 I-E의 화합물로 표시될 수 있다.

식 I-E에서, R^3a, R^3b, R^3c 및 R^3d는 각각 독립적으로 식 I에서 R³에 대해 정의된 바와 같이 정의된다. 또한, 식 I-E에서, R^4a, R^4b 및 R^4b는 각각 독립적으로 식 I에서 R⁴에 대해 정의된 바와 같이 정의된다.

일부 구현예들에서, 식 I-E는 아래에 나타낸 구조 1 - 59 중 어느 하나로서 표시될 수 있다:

구조 1, 구조 2, 구조 3, 구조 4, 구조 5, 구조 6, 구조 7, 구조 8, 구조 9, 구조 10, 구조 11, 구조 12, 구조 13, 구조 14, 구조 15, 구조 16, 구조 17, 구조 18, 구조 19, 구조 20, 구조 21, 구조 22, 구조 23, 구조 24, 구조 25, 구조 26, 구조 27, 구조 28, 구조 29, 구조 30, 구조 31, 구조 32, 구조 33, 구조 34, 구조 35, 구조 36, 구조 37, 구조 38, 구조 39, 구조 40, 구조 41, 구조 42, 구조 43, 구조 44, 구조 45, 구조 46, 구조 47, 구조 48, 구조 49, 구조 50, 구조 51, 구조 52, 구조 53, 구조 54, 구조 55, 구조 56, 구조 57, 구조 58 및 구조 59에 따른 예시적인 화합물들은 아래 표 1에 나타낸다. 표 1에서, 각 화합물에 대해 치환기 R¹, R^3a, R^3b, R^3c, R^3d, R^4a, R^4b, 및 R^4b가 열거된다. 표 1에 열거된 치환기들의 각 조합이 구조 1-59의 각 화합물에 사용될 수 있다.

참조를 위해, 각 개개 화합물은 표 1에 나타낸 구조 번호와 치환기 ID (identification)로 식별된다. 예를 들어, R¹이 CH₂CH=CH₂이고; R^3a가 메틸이고; 및 R^3b, R^3c, R^3d, R^4a, R^4b 및 R^4c가 각각 H인, 구조 1의 화합물은 화합물 1.001로서 표시된다. 다른 예로, R¹이 CH₂CH=CHCH₃ (E)이고; R^3a, R^3b, R^3c, R^3d, R^4a, R^4b 및 R^4c가 각각 H인 구조 24의 화합물은 화합물 24.016로 표시된다.

표 1: 화합물 예

치환기 ID	R¹	R^3a	R^3b	R^3c	R^3d	R^4a	R^4b	R^4c
.001	CH₂CH=CH₂	Me	H	H	H	H	H	H
.002	CH₂CH=CH₂	Me	Me	H	H	H	H	H
.003	CH₂CH=CH₂	H	H	Me	H	H	H	H
.004	CH₂CH=CH₂	H	H	Me	Me	H	H	H
.005	CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	Me	H	H
.006	CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	H	Me	H
.007	CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	H	H	Me
.008	CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	H	H	H
.009	CH₂CH=CHCH₃ (E)	Me	H	H	H	H	H	H
.010	CH₂CH=CHCH₃ (E)	Me	Me	H	H	H	H	H
.011	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	Me	H	H	H	H
.012	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	Me	Me	H	H	H
.013	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	Me	H	H
.014	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	Me	H
.015	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	H	Me
.016	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	H	H
.017	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	Me	H	H	H	H	H	H
.018	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	Me	Me	H	H	H	H	H
.019	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	Me	H	H	H	H
.020	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	Me	Me	H	H	H
.021	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	Me	H	H
.022	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	H	Me	H
.023	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	H	H	Me
.024	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	H	H	H
.025	CH₂CH=C(CH₃)₂	Me	H	H	H	H	H	H
.026	CH₂CH=C(CH₃)₂	Me	Me	H	H	H	H	H
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.037	CH₂C(CH₃)=CH₂	H	H	H	H	Me	H	H
.038	CH₂C(CH₃)=CH₂	H	H	H	H	H	Me	H
.039	CH₂C(CH₃)=CH₂	H	H	H	H	H	H	Me
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.054	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	Me	H
.055	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	H	Me
.056	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	H	H
.057	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	Me	H	H	H	H	H	H
.058	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	Me	Me	H	H	H	H	H
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.060	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	Me	Me	H	H	H
.061	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	Me	H	H
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.063	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	H	H	Me
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.065	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	Me	H	H	H	H	H	H
.066	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	Me	Me	H	H	H	H	H
.067	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	Me	H	H	H	H
.068	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	Me	Me	H	H	H
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.070	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	H	H	H	Me	H
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.077	CH₂C≡CH	H	H	H	H	Me	H	H
.078	CH₂C≡CH	H	H	H	H	H	Me	H
.079	CH₂C≡CH	H	H	H	H	H	H	Me
.080	CH₂C≡CH	H	H	H	H	H	H	H
.081	CH₂C≡CMe	Me	H	H	H	H	H	H
.082	CH₂C≡CMe	Me	Me	H	H	H	H	H
.083	CH₂C≡CMe	H	H	Me	H	H	H	H
.084	CH₂C≡CMe	H	H	Me	Me	H	H	H
.085	CH₂C≡CMe	H	H	H	H	Me	H	H
.086	CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	Me	H
.087	CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	H	Me
.088	CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	H	H
.089	CH₂CH₂C≡CH	Me	H	H	H	H	H	H
.090	CH₂CH₂C≡CH	Me	Me	H	H	H	H	H
.091	CH₂CH₂C≡CH	H	H	Me	H	H	H	H
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.093	CH₂CH₂C≡CH	H	H	H	H	Me	H	H
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.095	CH₂CH₂C≡CH	H	H	H	H	H	H	Me
.096	CH₂CH₂C≡CH	H	H	H	H	H	H	H
.097	CH₂CH₂C≡CMe	Me	H	H	H	H	H	H
.098	CH₂CH₂C≡CMe	Me	Me	H	H	H	H	H
.099	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	Me	H	H	H	H
.100	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	Me	Me	H	H	H
.101	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	H	H	Me	H	H
.102	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	Me	H
.103	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	H	Me
.104	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	H	H
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.108	CH₂CH₃	H	H	Me	Me	H	H	H
.109	CH₂CH₃	H	H	H	H	Me	H	H
.110	CH₂CH₃	H	H	H	H	H	Me	H
.111	CH₂CH₃	H	H	H	H	H	H	Me
.112	CH₂CH₃	H	H	H	H	H	H	H
.113	CH₂CH₂CH₃	Me	H	H	H	H	H	H
.114	CH₂CH₂CH₃	Me	Me	H	H	H	H	H
.115	CH₂CH₂CH₃	H	H	Me	H	H	H	H
.116	CH₂CH₂CH₃	H	H	Me	Me	H	H	H
.117	CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	Me	H	H
.118	CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	Me	H
.119	CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	H	Me
.120	CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	H	H
.121	CH₂CH₂CH₂CH₃	Me	H	H	H	H	H	H
.122	CH₂CH₂CH₂CH₃	Me	Me	H	H	H	H	H
.123	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	Me	H	H	H	H
.124	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	Me	Me	H	H	H
.125	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	Me	H	H
.126	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	Me	H
.127	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	H	Me
.128	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	H	H
.129	CH₂CH=CH₂	Et	H	H	H	H	H	H
.130	CH₂CH=CH₂	Et	Et	H	H	H	H	H
.131	CH₂CH=CH₂	H	H	Et	H	H	H	H
.132	CH₂CH=CH₂	H	H	Et	Et	H	H	H
.133	CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	Et	H	H
.134	CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	H	Et	H
.135	CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	H	H	Et
.136	CH₂CH=CHCH₃ (E)	Et	H	H	H	H	H	H
.137	CH₂CH=CHCH₃ (E)	Et	Et	H	H	H	H	H
.138	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	Et	H	H	H	H
.139	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	Et	Et	H	H	H
.140	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	Et	H	H
.141	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	Et	H
.142	CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	H	Et
.143	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	Et	H	H	H	H	H	H
.144	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	Et	Et	H	H	H	H	H
.145	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	Et	H	H	H	H
.146	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	Et	Et	H	H	H
.147	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	Et	H	H
.148	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	H	Et	H
.149	CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	H	H	Et
.150	CH₂CH=C(CH₃)₂	Et	H	H	H	H	H	H
.151	CH₂CH=C(CH₃)₂	Et	Et	H	H	H	H	H
.152	CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	Et	H	H	H	H
.153	CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	Et	Et	H	H	H
.154	CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	H	H	Et	H	H
.155	CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	H	H	H	Et	H
.156	CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	H	H	H	H	Et
.157	CH₂C(CH₃)=CH₂	Et	H	H	H	H	H	H
.158	CH₂C(CH₃)=CH₂	Et	Et	H	H	H	H	H
.159	CH₂C(CH₃)=CH₂	H	H	Et	H	H	H	H
.160	CH₂C(CH₃)=CH₂	H	H	Et	Et	H	H	H
.161	CH₂C(CH₃)=CH₂	H	H	H	H	Et	H	H
.162	CH₂C(CH₃)=CH₂	H	H	H	H	H	Et	H
.163	CH₂C(CH₃)=CH₂	H	H	H	H	H	H	Et
.164	CH₂CH₂CH=CH₂	Et	H	H	H	H	H	H
.165	CH₂CH₂CH=CH₂	Et	Et	H	H	H	H	H
.166	CH₂CH₂CH=CH₂	H	H	Et	H	H	H	H
.167	CH₂CH₂CH=CH₂	H	H	Et	Et	H	H	H
.168	CH₂CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	Et	H	H
.169	CH₂CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	H	Et	H
.170	CH₂CH₂CH=CH₂	H	H	H	H	H	H	Et
.171	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	Et	H	H	H	H	H	H
.172	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	Et	Et	H	H	H	H	H
.173	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	Et	H	H	H	H
.174	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	Et	Et	H	H	H
.175	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	Et	H	H
.176	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	Et	H
.177	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (E)	H	H	H	H	H	H	Et
.178	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	Et	H	H	H	H	H	H
.179	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	Et	Et	H	H	H	H	H
.180	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	Et	H	H	H	H
.181	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	Et	Et	H	H	H
.182	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	Et	H	H
.183	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	H	Et	H
.184	CH₂CH₂CH=CHCH₃ (Z)	H	H	H	H	H	H	Et
.185	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	Et	H	H	H	H	H	H
.186	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	Et	Et	H	H	H	H	H
.187	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	Et	H	H	H	H
.188	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	Et	Et	H	H	H
.189	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	H	H	Et	H	H
.190	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	H	H	H	Et	H
.191	CH₂CH₂CH=C(CH₃)₂	H	H	H	H	H	H	Et
.192	CH₂C≡CH	Et	H	H	H	H	H	H
.193	CH₂C≡CH	Et	Et	H	H	H	H	H
.194	CH₂C≡CH	H	H	Et	H	H	H	H
.195	CH₂C≡CH	H	H	Et	Et	H	H	H
.196	CH₂C≡CH	H	H	H	H	Et	H	H
.197	CH₂C≡CH	H	H	H	H	H	Et	H
.198	CH₂C≡CH	H	H	H	H	H	H	Et
.199	CH₂C≡CMe	Et	H	H	H	H	H	H
.200	CH₂C≡CMe	Et	Et	H	H	H	H	H
.201	CH₂C≡CMe	H	H	Et	H	H	H	H
.202	CH₂C≡CMe	H	H	Et	Et	H	H	H
.203	CH₂C≡CMe	H	H	H	H	Et	H	H
.204	CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	Et	H
.205	CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	H	Et
.206	CH₂CH₂C≡CH	Et	H	H	H	H	H	H
.207	CH₂CH₂C≡CH	Et	Et	H	H	H	H	H
.208	CH₂CH₂C≡CH	H	H	Et	H	H	H	H
.209	CH₂CH₂C≡CH	H	H	Et	Et	H	H	H
.210	CH₂CH₂C≡CH	H	H	H	H	Et	H	H
.211	CH₂CH₂C≡CH	H	H	H	H	H	Et	H
.212	CH₂CH₂C≡CH	H	H	H	H	H	H	Et
.213	CH₂CH₂C≡CMe	Et	H	H	H	H	H	H
.214	CH₂CH₂C≡CMe	Et	Et	H	H	H	H	H
.215	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	Et	H	H	H	H
.216	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	Et	Et	H	H	H
.217	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	H	H	Et	H	H
.218	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	Et	H
.219	CH₂CH₂C≡CMe	H	H	H	H	H	H	Et
.220	CH₂CH₃	Et	H	H	H	H	H	H
.221	CH₂CH₃	Et	Et	H	H	H	H	H
.222	CH₂CH₃	H	H	Et	H	H	H	H
.223	CH₂CH₃	H	H	Et	Et	H	H	H
.224	CH₂CH₃	H	H	H	H	Et	H	H
.225	CH₂CH₃	H	H	H	H	H	Et	H
.226	CH₂CH₃	H	H	H	H	H	H	Et
.227	CH₂CH₂CH₃	Et	H	H	H	H	H	H
.228	CH₂CH₂CH₃	Et	Et	H	H	H	H	H
.229	CH₂CH₂CH₃	H	H	Et	H	H	H	H
.230	CH₂CH₂CH₃	H	H	Et	Et	H	H	H
.231	CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	Et	H	H
.232	CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	Et	H
.233	CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	H	Et
.234	CH₂CH₂CH₂CH₃	Et	H	H	H	H	H	H
.235	CH₂CH₂CH₂CH₃	Et	Et	H	H	H	H	H
.236	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	Et	H	H	H	H
.237	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	Et	Et	H	H	H
.238	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	Et	H	H
.239	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	Et	H
.240	CH₂CH₂CH₂CH₃	H	H	H	H	H	H	Et

일부 구현예들에서, 본 화합물은 표 1에 나타낸 치환기들의 조합을 가진 구조 1-59 중 어느 하나이다.

추가적인 ABA 작용제의 예로는, 예를 들어 하기로부터 선택되는 화합물을 포함한다:

식 II의 화합물, 또는 그것의 염 또는 이성질체:

상기 식에서,

R¹은 n-프로필로 이루어진 군으로부터 선택되고,

아랫 첨자 m은 0 내지 4의 정수이고,

아랫 첨자 n은 0 내지 3의 정수이고, 및

m + n은 1 이상이다.

식 III의 화합물, 또는 그것의 염 또는 이성질체:

상기 식에서,

각각의 R³, R⁴ 및 R⁵는 독립적으로 H 및 C_1-6　알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R³또는 R⁴는 중 적어도 하나는 알킬이고,

아랫 첨자 m은 0 내지 4의 정수이고,

아랫 첨자 n은 0 내지 3의 정수이고, 및

m + n은 1 이상이다.

일 구현예에서, R³또는 R⁴ 중 적어도 하나는 에틸이다.

전술한 화합물은 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 동일한 화학적 스캐폴드를 기반으로 한 화합물들이 미국 특허 5,498,755 및 미국 특허 6,127,382에 기술된 바와 같이 합성되었으며, 이들 문헌의 전체 내용이 원용에 의한 본 명세서에 포함된다.

III. ABA 작용제 제형

본 발명은, 본 발명의 ABA 작용제를 포함하는, 식물에 접촉시키도록 제형화된 농화학적 제형 (agricultural chemical formulation)을 제공한다. 일부 구현예들에서, 작용제와 접촉되는 식물은 내인성 PYR/PYL 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 발현한다. 일부 구현예들에서, 작용제와 접촉되는 식물은 이종의 PYR/PYL 폴리펩타이드를 포함하지 않거나, 또는 발현하지 않는다 (예, 식물은 형질전환주가 아니거나, 또는 형질전환주이나 내인성 PYR/PYL 폴리펩타이드가 아닌 다른 이종의 단백질을 발현함). 일부 구현예들에서, 작용제와 접촉되는 식물은 본원에 기술된 바와 같이 이종의 PYR/PYL 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 발현한다.

제형은, 본 발명에 따라, 예를 들어 담체 중에, 식물 또는 종자와 같은 식물 증식 물질을 처리하는데 적합할 수 있다. 적절한 첨가제로는 완충화제, 습윤제, 코팅제, 다당류 및 마모제 (abrading agent)를 포함한다. 담체의 예로는 물, 수성 용액, 슬러리, 고체 및 건조 산제 (예, 이탄, 밀, 왕겨, 질석, 점토, 저온살균된 흙 (pasteurized soil), 여러가지 형태의 칼슘 카보네이트, 백운석, 다양한 등급의 석고, 벤토나이트 및 그외 점토 미네랄, 인광석 (rock phosphate) 및 그외 인 화합물, 티타늄 다이옥사이드, 부식 (humus), 탈크, 알기네이트 및 활성탄 (activated charcoal)을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 농업에 적합한 임의 담체가 허용되며, 본 발명에 사용하는 것으로 간주된다. 선택적으로, 제형은 한가지 이상의 계면활성제, 제초제, 살진균제, 농약 또는 비료를 더 포함할 수 있다.

일부 구현예들에서, 농화학적 제형은, 계면활성제, 제초제, 비제한적인 예로, 살진균제, 살세균제, 살충제, 살비제 및 살선충제와 같은 농약, 식물 활성제, 상승제, 제초제 약해 경감제, 식물 생장 조절제, 곤충 기피제 또는 비료 중 하나 이상을 포함한다.

일부 구현예들에서, 농화학적 제형은, 파라쿼트 (592), 메소트리온 (500), 술코트리온 (710), 클로마존 (159), 펜트라자미드 (340), 메페나세트 (491), 옥사지클로메폰 (583), 인다노판 (450), 글리포세이트 (407), 프로설포카르브 (656), 몰리네이트 (542), 트리아설푸론 (773), 할로설푸론-메틸 (414), 프레틸라클로르 (632), 토프라메존, 템보트리온, 이속사플루톨, 포메사펜, 클로디나포프-프로파길, 플루아지포프-P-부틸, 디캄바, 2,4-D, 피녹사덴, 바이사이클로피론, 메톨라클로르 및 피록사설폰으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제초제를 유효량으로 포함한다. 상기 제초제 활성 성분들은 예를 들어 "The Pesticide Manual", Editor C. D. S. Tomlin, 12th Edition, British Crop Protection Council, 2000에 괄호 안에 기재된 엔트리 번호로 기술되어 있으며; 예를 들어, 메소트리온 (500)은 엔트리 번호 500으로 문헌에 기술되어 있다. 상기 화합물들은, 예를 들어 US 7,338,920에 기술되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

일부 구현예들에서, 농화학적 제형은 세닥산 (sedaxane), 플루디옥소닐 (fludioxonil), 펜티오피라드 (penthiopyrad), 프로티오코나졸 (prothioconazole), 플루트리아폴 (flutriafol), 디페노코나졸 (difenoconazole), 아족시스트로빈 (azoxystrobin), 캅탄 (captan), 시프로코나졸 (cyproconazole), 시프로디닐 (cyprodinil), 보스칼리드 (boscalid), 디니코나졸 (diniconazole), 에폭시코나졸 (epoxiconazole), 플루옥사스트로빈 (fluoxastrobin), 트리플옥시스트로빈 (trifloxystrobin), 메탈락실 (metalaxyl), 메탈락실-M (메페녹삼 (mefenoxam)), 플루퀸코나졸 (fluquinconazole), 페나리몰 (fenarimol), 누아리몰 (nuarimol), 피리페녹스 (pyrifenox), 피라클로스트로빈 (pyraclostrobin), 티아벤다졸 (thiabendazole), 테부코나졸 (tebuconazole), 트리아디메놀 (triadimenol), 베날락실 (benalaxyl), 베날락실-M, 베노밀 (benomyl), 카르벤다짐 (carbendazim), 카르복신 (carboxin), 플루톨라닐 (flutolanil), 푸베리자돌 (fuberizadole), 구아자틴 (guazatine), 미클로부타닐 (myclobutanil), 테트라코나졸 (tetraconazole), 이마잘릴 (imazalil), 메트코나졸 (metconazole), 비테르타놀 (bitertanol), 시목사닐 (cymoxanil), 입코나졸 (ipconazole), 이프로디온 (iprodione), 프로클로라즈 (prochloraz), 펜시쿠론 (pencycuron), 프로파모카르브 (propamocarb), 실티오팜 (silthiofam), 티람 (thiram), 트리아족시드 (triazoxide), 트리티코나졸 (triticonazole), 톨릴플루아니드 (tolylfluanid), 이소피라잠 (isopyrazam), 만디프로파미드 (mandipropamid), 티아벤다졸 (thiabendazole), 플룩사피록사드 (fluxapyroxad), 및 망간 화합물 (예, 만코젭 (mancozeb), maneb)로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 살진균제를 유효량으로 포함한다. 일부 구현예들에서, 농화학적 제형은 티아메톡삼 (thiamethoxam), 이미다클로프리드 (imidacloprid), 클로티아니딘 (clothianidin), 람다-시할로트린 (lamda-cyhalothrin), 테플루트린 (tefluthrin), 베타-시플루트린 (beta-cyfluthrin), 퍼메트린 (permethrin), 아바멕틴 (abamectin), 피프로닐 (fipronil), 시아노트라닐리프롤 (cyanotraniliprole), 클로란트라닐리프롤 (chlorantraniliprole) 및 스피노사드 (spinosad)로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 살충제, 살비제 및/또는 살선충제를 유효량으로 포함한다. 일반명의 상기 농약 각각에 대한 상세한 설명 (예, 구조, 화학명, 시판 명 등)은 e-Pesticide Manual, version 3.1, 13th Edition, Ed. CDC Tomlin, British Crop Protection Council, 2004-05에서 확인할 수 있다. 상기 화합물들은 예를 들어 US 8,124,565에 기술되어 있으며, 이 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

일부 구현예들에서, 농화학적 제형은 시프로디닐 (Cyprodinil) ((4-사이클로프로필-6-메틸-피리미딘-2-일)-페닐-아민) (208), 도딘 (Dodine) (289); 클로로탈로닐 (Chlorothalonil) (142); 폴페트 (Folpet) (400); 프로티오코나졸 (Prothioconazole) (685); 보스칼리드 (Boscalid) (88); 프로퀴나지드 (Proquinazid) (682); 디티아논 (Dithianon) (279); 플루아지남 (Fluazinam) (363); 입코나졸 (Ipconazole) (468); 및 메트라페논 (Metrafenone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 살진균제를 유효량으로 포함한다. 이들 화합물들 중 일부는, 예를 들어, "The Pesticide Manual" [The Pesticide Manual--A World Compendium; Thirteenth Edition; Editor: C. D. S. Tomlin; The British Crop Protection Council, 2003]에 괄호 안에 기재된 엔트리 번호로 기술되어 있다. 상기 화합물들은 예를 들어 US 8,349,345에 기술되어 있으며, 이 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

일부 구현예들에서, 농화학적 제형은 플루디옥소닐 (fludioxonil), 메탈락실 (metalaxyl) 및 스트로빌루린 (strobilurin) 살진균제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 살진균제 또는 이들의 혼합물을 유효량으로 포함한다. 일부 구현예들에서, 스트로빌루린 살진균제는 아족시스트로빈 (azoxystrobin), 피콕시스트로빈 (picoxystrobin), 크레속심-메틸 (kresoxim-methyl) 또는 트리플록시스토르빈 (trifloxystorbin)이다. 일부 구현예들에서, 농화학적 제형은 페닐피라졸 (phenylpyrazole) 및 네오니코티노이드 (neonicotinoid)로부터 선택되는 하나 이상의 살충제를 유효량으로 포함한다. 일부 구현예들에서, 페닐피라졸은 피프로닐이고, 네오니코티노이드는 티아메톡삼 (thiamethoxam), 이미다클로프리드 (imidacloprid), 티아클로프리드 (thiacloprid), 클로티아니딘 (clothianidin), 니텐피람 (nitenpyram) 및 아세타미프리드 (acetamiprid)로부터 선택된다. 상기한 화합물들은 예를 들어, US 7,071,188에 기술되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예들에서, 농화학적 제형은 하나 이상의 생물 농약을 유효량으로 포함하며, 그 비제한적인 예로는 파스테리아 spp. (Pasteuria spp.), 패실리오마이세스 (Paeciliomyces), 포코니아 클라미도스포리아 (Pochonia chlamydosporia), 미로테시움 메타볼라이테스 (Myrothecium metabolites), 무스코도르 볼라틸레스 (Muscodor volatiles), 타게테스 spp. (Tagetes spp.), 바실러스 퍼무스 (bacillus firmus), 예를 들어 바실러스 퍼무스 CNCM I-1582를 포함한다.

IV. 식물에의 이용

ABA 작용제 제형 및 조성물은 다양한 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어, 증식 물질에 조성물을 살비 (spraying), 무화 (atomizing), 침지 (dipping), 붓기 (pouring), 관개 (irrigating), 더스팅 (dusting) 또는 흩뿌리기 (scattering)함으로써, 또는 식물로 또는 종자 상태에서 조성물을 브러싱 (brushing) 또는 붓거나 또는 접촉시킴으로써, 종자를 액체 조성물로 코팅, 캡슐화, 살비, 침지, 액침 (immersing)함으로써, 또는 종자에 처리함으로써, 식물에 적용할 수 있다. 식수하기 전에 식물 또는 종자에 직접 처리하는 다른 방법으로, 본 발명의 제형은 종자를 심을 흙 또는 그외 매질에 도입할 수도 있다. 예를 들어, 제형은 살비, 흩뿌리기, 붓기, 관개 또는 흙으로의 처리에 의해 흙에 도입시킬 수 있다. 일부 구현예들에서, 담체도 이러한 구현예에 사용된다. 담체는 전술한 바와 같이 고체 또는 액체일 수 있다. 일부 구현예들에서, ABA 작용제의 담체로서 이탄을 수중에 현탁시키고, 이 혼합물을 흙 또는 식수할 매질에 살비하거나 및/또는 식수한 종자에 살비한다.

본원에 기술된 ABA 작용제로 처리될 수 있는 식물의 유형은 보리, 호밀, 수수, 라이밀, 귀리, 벼, 밀, 대두 및 옥수수와 같은 곡물; 비트 (예, 사탕무 및 사료용 비트 (fodder beet)); 오이, 머스크멜론, 칸탈루프, 호박 및 수박 등의 박과 식물; 브로콜리, 양배추, 꽃양배추, 청경채 및 기타 녹엽채 등의 칼레 농작물 (cale crop), 토마토, 후추, 상추, 콩, 완두콩, 양파, 마늘 및 땅콩 등의 기타 야채; 카놀라, 땅콩, 해바라기, 평지 및 대두 등의 오일 농작물; 담배 등의 가짓과 식물; 감자, 얌, 무, 비트, 당근 및 고구마 등의 서류 (tuber and root crops); 딸기 등의 열매; 목화 및 대마 등의 섬유 농작물; 커피, 화단용 식물 (bedding plant), 다년생, 화목 (woody ornamental), 잔디 및 카네이션 및 장미 등의 절화 (cut flower)를 비롯한 기타 식물; 사탕수수; 용기묘 농작물 (containerized tree crop); 전나무 및 소나무 등의 상록수; 단풍나무 및 오크 등의 낙엽수; 및 체리, 사과, 배, 아몬드, 복숭아, 호두 및 시트러스 등의 열매 및 너트 식물을 포함한다. 본원에 기술된 ABA 작용제로 처리될 수 있는 추가적인 유형의 식물로는 제초제 또는 살진균제 등의 어떤 화학제에 내성을 가지는 농작물을 포함한다. 예를 들어, 제초제 내성이도록 유전자 조작된 농작물에 본원에 기술된 ABA 작용제를 처리할 수 있다.

본원에 기술된 ABA 작용제는 세포에서 ABA의 기능을 모방하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 세포에 ABA를 접촉시킴으로써 촉발되는 한가지 이상의 세포성 반응들은 본원에 기술된 ABA 작용제를 세포에 접촉시킴으로써 촉발시킬 수 있을 것으로 예상된다. 본원에 기술된 ABA 작용제는 ABA의 기능을 모방하며, 유용한 제형으로 제공된다.

일부 구현예들에서, 본원에 기술된 ABA 작용제의 적용은 식물의 비-생물적 스트레스 내성을 증가시킨다.

일부 구현예들에서, 본원에 기술된 ABA 작용제의 종자에의 적용은 종자의 발아를 저해한다.

또한, 본 발명은 본원에 기술된 ABA 제형과 접촉된 식물을 제공한다. ABA 제형과 접촉된 상태인 식물은 식물의 일부 및/또는 종자를 포함할 수 있다.

V. 새로운 ABA 작용제 및 길항제의 스크리닝

본 발명의 구현예는 또한 추정의 작용제가 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드와 접촉하였을 때 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드를 아고나이징하는지를 확인하기 위해, 추정의 화학적 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본원에서, 물질이 수용체의 활성을 활성화 또는 상향-조절, 예를 들어 PYR/PYL 수용체로부터 하류 신호전달을 증가시킨다면, 그 물질은 PYR/PYL 수용체 단백질을 "아고나이징한다". 본 발명에서, 물질이 200 μM 보다 높은 농도로 존재하는 경우에, PYR/PYL 수용체와의 접촉으로 PYR/PYL 수용체의 활성화 또는 활성의 상향-조절이 이루어진다면, 그 물질은 PYR/PYL 수용체를 아고나이징하는 것이다. 물질이 200 μM 보다 높은 농도로 존재하는 경우에 PYR/PYL 수용체 단백질의 활성화 또는 활성의 상향-조절을 유도하지 않는다면, 그 물질은 PYR/PYL 수용체를 유의하게 아고나이징하지 않는 것이다. 본원에서, "활성화"는 물질에 의해 유발되는 활성의 최소 역치를 필요로 한다. 이러한 활성의 최소 역치를 충족시키는지에 대한 확인은, 예를 들어, 유도되어야 하는 효소 활성의 수준에 대한 최소 값을 설정하는 효소적 포스파타제 분석을 이용하거나, 또는 색 변화가 관찰된다면 최소 활성 역치가 충족된 것인, 비색 검출 시약 (예, 파라-니트로페닐포스페이트)의 존재 하에 효소 포스파타제 분석을 이용함으로써, 달성할 수 있다.

또한, 본 발명은 작용제의 경우에 분자의 PYR/PYL- PP2C 결합을 유도하는 능력, 또는 길항제의 경우, PYR/PYL- PP2C 결합을 촉진시키는 ABA 및 기타 작용제의 능력을 파괴하는 능력을 스크리닝함으로써, ABA 작용제 및 길항제의 스크리닝 방법을 제공한다. 여러가지 스크리닝 프로토콜들 다수를 활용하여, PYR/PYL 폴리펩타이드를 아고나이징 또는 길항하는 물질을 동정할 수 있다.

스크리닝은 분리된, 정제된 또는 일부 정제된 시약을 이용해 이루어질 수 있다. 일부 구현예들에서, 정제된 또는 일부 정제된 PYR/PYL 폴리펩타이드가 사용될 수 있다.

다른 구현예에서, 세포-기반의 스크리닝 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, PYR/PYL 폴리펩타이드를 천연적으로 발현하는 세포, 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드를 재조합에 의해 발현하는 세포가 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 사용되는 세포는 식물 세포, 동물 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 예를 들어, 비제한적인 예로, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포이다. 일반적인 용어들에서, 스크리닝 방법은 복수의 물질을 스크리닝하여, 예를 들어 PYR/PYL 폴리펩타이드에 결합하거나, 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드를 활성화하거나, 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드를 코딩하는 전사체의 발현을 증가시킴으로써, PYR/PYL 폴리펩타이드의 활성을 조절하는 물질을 동정하는 단계를 포함한다.

1. PYR/ PYL 폴리펩타이드 결합 분석

선택적으로, 동정된 물질들 중 적어도 일부는 틀림없이 PYR/PYL 폴리펩타이드 모듈레이터이므로, PYR/PYL 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 물질을 스크리닝함으로써, 예비 스크리닝을 수행할 수 있다.

결합 분석은, PYR/PYL 폴리펩타이드를 하나 이상의 시험 물질과 접촉시키는 단계 및 단백질 및 시험 물질이 결합 복합체를 형성하기에 충분한 시간을 허용하는 단계를 포함할 수 있다. 형성된 임의의 결합 복합체들은 여러가지 확립된 분석 기법들 중 임의 방법을 이용해 검출할 수 있다. 단백질 결합 분석으로는, 비제한적인 예로, 공-침전 또는 비-변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서의 공동-이동, 및 웨스턴 블롯에서의 공동-이동을 측정하는 방법들을 포함한다 (예, Bennet, J.P. and Yamamura, H.I. (1985) "Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods," in Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura, H. I., et al., eds.), pp. 61-89을 참조함). 다른 결합 분석들은 PYR/PYL 폴리펩타이드에 결합된 분자를 동정하거나 또는 표지된 기질 (예, 표지된 ABA)의 치환을 동정하기 위한 질량 분광측정 또는 NMR 기법의 사용을 포함한다. 이러한 분석에서 이용되는 PYR/PYL 폴리펩타이드 단백질은 천연적으로 발현, 클로닝 또는 합성될 수 있다.

2. 활성

PYR/PYL 폴리펩타이드 작용제는 PYR/PYL 폴리펩타이드를 활성화하거나 또는 활성을 증가시키는 물질을 스크리닝함으로써 동정할 수 있다. 길항제는 활성 감소에 의해 동정할 수 있다.

한가지 활성 분석은, 후보 작용제가 PYR/PYL 폴리펩타이드의 2형 단백질 포스파타제 (PP2C) 폴리펩타이드와의 결합을 작용제-특이적인 양상으로 유도할 수 있는 지를 테스트하는 단계를 수반한다. 포유류 또는 효모 2-하이브리드 방식 (Bartel, P.L. et. al. Methods Enzymol, 254:241 (1995))을 사용해, 세포에서 함께 발현되었을 때, 상호작용하거나 결합하는 폴리펩타이드 또는 다른 분자를 동정할 수 있다. 일부 구현예들에서, PYR/PYL 폴리펩타이드를 아고나이징하는 물질은 PYR/PYL 폴리펩타이드와 2형 단백질 포스파타제 (PP2C) 폴리펩타이드 (예, ABI1 또는 2, 또는 이의 오솔로그 (ortholog), 예를 들어 PP2C의 그룹 A 서브패밀리로부터 유래된 것) 간의 2-하이브리드 분석에서 동정하며, 이때 ABA 작용제는 PYR/PYL 폴리펩타이드 및 PP2C 폴리펩타이드의 결합을 활성화하거나 또는 결합시킬 수 있는 물질로서 동정된다. 즉, 2종의 폴리펩타이드는 이 물질의 존재 하에서는 결합하지만, 부재시에는 결합하지 않는다. 일부 구현예들에서, 화학적 화합물 또는 물질은, 효모 세포가 효모 2-하이브리드 분석에서 청색으로 바뀌면, PYR/PYL 단백질의 작용제로서 동정된다.

PYR1, 및 PYR/PYL 단백질의 생화학적 기능은, 일반적으로, PP2C 활성을 저해하는 것이다. 이는, 효모 2-하이브리드 방법 또는 그외 세포-기반의 방법을 이용해 살아있는 세포에서 측정할 수 있다. 또한, 이는 비색 검출 시약 (예, 파라-니트로페닐포스페이트)의 존재 하에 효소적 포스파타제 분석을 이용하여 시험관내에서 측정할 수 있다. 전술한 효모-기반의 분석은 리간드 결합에 개한 간접 지표 (indirect indicator)를 제공한다. 이러한 잠재적인 제한을 해결하기 위해, 시험관내 경쟁 분석 또는 다른 유기체를 이용한 세포 기반의 분석을 약하게 결합하는 타겟 화합물을 동정하기 위한 다른 방식으로서 사용할 수 있다.

3. 발현 분석

또한, PYR/PYL 폴리펩타이드의 발현을 높이는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 스크리닝 방법은, 일반적으로, 시험 화합물을 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현하는 하나 이상의 세포와 접촉시키는 세포-기반의 분석 또는 식물-기반의 분석을 수행하는 단계, 및 PYR/PYL 발현 (전사체 또는 이의 번역 산물) 증가를 검출하는 단계를 수반한다. 분석은, 천연적으로 PYR/PYL을 발현하는 세포를 이용하거나, PYR/PYL을 발현하도록 재조합에 의해 변형된 세포에서, 또는 PYR/PYL 프로모터의 통제 하에 리포터 유전자를 발현하도록 재조합에 의해 변형된 세포에서 수행할 수 있다.

다양한 대조군을 이용하여, 리포터 구조체가 결여된 세포를 이용한 병렬 반응 수행을 포함하거나 또는 리포터 구조체를 보유한 세포를 시험 화합물과 접촉시키지 않음으로써, 관찰되는 활성에 대한 신뢰성을 확보할 수 있다.

4. 검증

전술한 임의의 스크리닝 방법에 의해 먼저 동정된 물질들은 추가로 조사하여, 겉보기 활성 (apparent activity)을 확인하거나 및/또는 물질의 다른 생물학적 효과를 결정할 수 있다. 일부 사례들에서, 동정된 물질은 식물 스트레스 (예, 내건성), 종자 발아 또는 ABA에 영향을 받는 다른 표현형을 유발하는 능력을 조사한다. 이러한 분석들과 표현형 다수가 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.

5. 고상 및 가용성 고성능 분석 (High Throughput Assay)

본 발명의 고성능 분석에서, 하루에 최대 수천개의 여러가지 모듈레이터 또는 리간드를 스크리닝할 수 있다. 특히, 마이크로타이터 플레이트의 각 웰을 이용해, 선택된 잠재적인 모듈레이터에 대해 분리된 분석을 운영하거나, 또는 농도 또는 인큐베이션 시간 효과들을 관찰하여야 한다면, 웰 5-10개 씩 사용해 하나의 모듈레이터를 테스트할 수 있다. 즉, 하나의 표준 마이크로타이터 플레이트는 약 100개 (예, 96개)의 모듈레이터를 분석할 수 있다. 만일 1536웰 플레이트를 사용한다면, 하나의 플레이트는 약 100 - 약 1500개의 서로 다른 화합물들을 쉽게 분석할 수 있다. 1일 당 수개의 여러 플레이트를 분석하는 것이 가능하며; 최대 약 6,000-20,000개 또는 그 이상의 서로 다른 여러 화합물들에 대한 분석 스크리닝은 본 발명의 통합 시스템을 이용해 가능하다. 아울러, 시약 조작을 위한 미세유체 접근법도 사용할 수 있다.

관심 분자 (예, PYR/PYL 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현하는 세포)를 직접 또는 공유 결합 또는 비-공유 결합을 통해 간접적으로 고상 성분에 결합시킬 수 있다.

본 발명은 PYR/PYL의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 화합물을 고성능 포맷으로 동정하기 위한 시험관내 분석을 제공한다.

비-생물적 스트레스 내성은 널리 공지된 다수 기법들 중 임의의 기법에 따라 분석할 수 있다. 예를 들어, 내건성의 경우, 식물은 최적의 물 함량 보다 적은 양이 식물에 제공되는 상황에서 생장시킬 수 있다. 내건성은 팽압 (turgor pressure), 생장, 생산량 등을 비롯한 다수의 임의의 표준 척도에 의해 측정할 수 있다.

VI. 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이는 방법

또한, 본 발명은 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 구현예들에서, 식물은 본원에 기술된 ABA 작용제 또는 ABA 작용제 제형과 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이기에 충분한 양으로 접촉시킨다. 식물에 적용되는 ABA 작용제 제형의 양은 ABA 작용제 제형과 접촉되지 않은 식물에 비해 비-생물적 스트레스 내성을 높이기에 충분할 수 있다. 식물은 본원에 언급된 임의 방법을 이용해 ABA 제형과 접촉시킬 수 있다. 비-생물적 스트레스 내성 증가는 식물의 생존 또는 생장에 유해하게 작용하는 비-생물적 스트레스 조건에 대한 식물 생장 및/또는 생존을 개선시킬 수 있다. 비-생물적 스트레스로는 본원에 기술된 물리적 또는 화학적 조건을 포함한다.

VII. 식물에서 종자의 발아를 저해하는 방법

또한, 본 발명은 종자의 발아를 저해하는 방법을 제공한다. 이에, 일부 구현예들에서, 식물, 식물의 일부 또는 종자는 종자의 발아를 저해하는데 충분한 양으로 ABA 작용제 제형과 접촉된다. 종자는 본원에 기술된 임의 방법을 이용해 ABA 제형과 접촉될 수 있다. 일부 구현예들에서, 종자는 ABA 작용제 제형과 직접 접촉된다. 일부 구현예들에서, 종자를 심거나 파종하기 전 또는 후에 토양 또는 흙에 ABA 작용제 제형을 접촉시킨다. 일부 구현예들에서, 식물은 식물로부터 향후 발생되는 종자의 발아를 저해하기에 충분한 ABA 작용제 제형과 접촉된다.

VIII. PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드의 활성화 방법

또한, 본 발명은 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드의 활성화 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, PYR/PYL 폴리펩타이드는 전술한 화합물과 접촉되며, 활성화된 PYR/PYL 폴리펩타이드는 PP2C 폴리펩타이드에 결합한다. 일부 구현예들에서, PYR/PYL 폴리펩타이드는 작용제 화합물 LC66C6에 의해 활성화될 수 있다. 일부 구현예들에서, 활성화되는 PYR/PYL 단백질은 서열번호 1-119 중 임의의 하나와 실질적으로 동일하다. 다양한 식물로부터 유래되는 ABA 수용체 서열의 예는 미국 특허 공개공보 2011/0271408에 제공되며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

일부 구현예들에서, 본 방법은 무-세포성 시험관내 분석에서 PYR/PYL 수용체를 활성화한다. 일부 구현예들에서, 본 방법은 세포에서 발현되는 PYR/PYL 수용체를 활성화한다. 일부 구현예들에서, 세포는 또한 PP2C 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 구현예들에서, 세포는 식물 세포이다. 일부 구현예들에서, 세포는 동물 세포 또는 포유류 세포이다. 일부 구현예들에서, 세포는 내인성 PYR/PYL 단백질을 발현한다. 일부 구현예들에서, 세포는 이종의 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예들에서, 세포는 이종의 PP2C 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 구현예들에서, 세포는 HAB1 (ABI1의 상동체), ABI1 또는 ABI2로부터 선택되는 PP2C 폴리펩타이드를 발현한다.

일부 구현예들에서, 활성화된 PYR/PYL 폴리펩타이드는 이종의 유전자들의 발현을 유도한다. 일부 구현예들에서, 이종의 유전자는 ABA 응답성 유전자들이다. 일부 구현예들에서, 유도되는 유전자 발현은 내인성 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현하는 세포에서 발생한다. 일부 구현예들에서, 유도되는 유전자의 발현은 이종의 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현하는 세포에서 이루어진다.

실시예들

실시예 1

본 실시예는 본원에 기술된 새로운 ABA 작용제들이 복수의 PYR/PYL 수용체들에 결합하여 활성화함을 입증해준다.

방법

화학적 스크리닝

기존에 기술된 효모 2-하이브리드 시스템을 고성능 스크린 (HTS)에서 사용하여, ABA 작용제들을 동정하였다 (Peterson FC, et al. (2010) Structural basis for selective activation of ABA receptors. Nature Structural & Molecular Biology 17(9):1109-1111). 이 시스템에서, 작용제는 수용체를 촉진하였다 - PP2C 상호작용은 URA3 또는 HIS3 리포터 유전자의 발현을 야기하며, 모균주의 우라실 또는 히스티딘 영양 요구성을 회복시킨다 (Peterson FC, et al. (2010); Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, & Boeke JD (1996) Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(19):10315-10320). PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 또는 PYL4에 대한 결합 도메인 (BD) 융합체를 발현하는 5종의 서로 다른 리포터 균주들을 이용해 HTS를 수행하였으며; 이들은 HAB1 (pACT-HAB1)에 대한 활성화 도메인 (AD) 융합체를 함께 발현하였으며; 사용된 구조체들은 기존에 개시된 바 있다 (Park et al. 2009). 본 발명자들은 2개의 별개 스크린으로 이들 균주를 이용하였다. 1차 스크린에서는, 캠브리지 (미국, 샌디에고)에서 입수한 약 65,000개의 화합물을, 기본적으로 Gassner NC, et al. (2007) (Accelerating the discovery of biologically active small molecules using a high-throughput yeast halo assay. Journal of Natural Products 70(3):383-390)에 언급된 바와 같이, 할로 분석을 이용해 작용제 활성을 분석하였다. 이 방법에서, 효모 균주를 선택 아가에 포매시키고, 화합물은 10 mM DMSO 스톡 용액으로부터 분석 플레이트로 핀 이동 (pin transfer)되며; 히트는 활성 화합물 주변의 세포 밀도 증가에 의해 확인한다. 할로 분석을 이용한 실험들은 효모 균주 PJ69-4A와 선택성을 향상시키기 위해 10 mM 3-아미노트리아졸이 첨가된 배지를 이용하였다. 할로 스크린은 자동화된 마이크로플레이트 호텔 (Thermo Cytomat)과 플레이트를 분석하기 위하 화합물을 스팟팅하는데 사용되는 384-핀 툴 (V & P Scientific)이 장착된 Biomek FX를 이용해 확립된다. 각 화합물을 이동시키기 전에, 핀을 DMSO/물 1:1 혼합물 중에 세척한 후 95% 에탄올로 세척하였다. 화합물 이동 후, 플레이트를 28℃에서 인큐베이션하였으며, 수동 검사로 후보 작용제를 확인하였다.

할로 스크리닝 방법이 처리량 측면에서 막강하지만, 본 발명자들은 후속적으로 Life Chemicals (Ukraine) 사로부터 입수한 12,0000-멤버 라이브러리의 2차 스크린을 위한 훨씬 간편한 스크리닝 방법을 적용하였다. 이러한 수정은 분석의 농도를 더욱 제어하고자 하는 요망이 동기가 되었다. 이러한 2차 스크린에서, 리포터 구조체를 GAL1 프로모터에 의해 구동되는 URA3 트랜스진을 통해 우라실-기반의 선택을 수행할 수 있는 효모 균주 MAV99에서 발현시켰다 (Peterson FC, et al. (2010)). 스크리닝 화합물을, 96웰 플레이트 포맷에서 최종 농도 25 μM로 리포터 균주가 접종된 선택적인 우라실-배지에 첨가하였으며; 약 3일 후 효모의 증식을 수동으로 검사하였다. 화합물을 Biomek FX 액체 핸들러를 사용해 2.5 mM 스톡 용액으로부터 스크리닝 웰로 이동시켰다.

3차 스크리닝 방식으로서, 0.5 X MS 염, 0.5% 슈크로스 및 25 μM 시험 화합물이 포함된 고체 아가 배지에서 아라비돕시스 발아 저해제에 대해 Life Chemicals 라이브러리를 스크리닝하였다. 발아 분석의 히트들은 이후 효모 2-하이브리드 분석에서 테스트하였다. 히트 화합물들은 이들의 오리지날 판매처로부터 다시 구입하여, 2차 스크린과 화합물 규명에 사용하였다. 퀴나박틴 및 이의 유사체는 Life Chemicals 사로부터 구입하였다.

PP2C 활성 분석

HAB1 단백질과 PYL 단백질을 기존에 기술된 방법 (Park SY, et al. (2009) Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science 324(5930):1068-1071)에 약간의 수정을 가하여 발현 및 정제하였다. GST-HAB1, GST-ABI1 및 GST-ABI2 융합 단백질을 수득하기 위해, HAB1 cDNA는 pGex-2T에 클로닝하고, ABI1과 ABI2의 cDNA는 벡터 pGex-4T-1에 클로닝하였다. 발현은 BL21[DE3]pLysS 숙주 세포에서 수행하였다. 형질전환된 세포를 밤새 예비-배양하여 LB 배지로 옮긴 다음 30℃에서 A₆₀₀ ~0.5까지 배양하였다. 이후, 배양물은 얼음 위에서 냉각시킨 후, MnCl₂를 4 mM로, IPTG를 0.3mM로 첨가하였다. 15℃에서 16시간 인큐베이션한 다음, 세포를 회수하고, 재조합 단백질을 기존에 기술된 바와 같이 글루타티온 아가로스에서 정제하였다 (Park SY, et al. (2009). 6X His-PYL 수용체 융합 단백질을 수득하기 위해, 모두 13개의 ABA 수용체들에 대한 수용체 cDNA를 벡터 pET28에 클로닝하고, 기존에 언급된 바 (Mosquna A, et al. (2011) Potent and selective activation of abscisic acid receptors in vivo by mutational stabilization of their agonist-bound conformation. PNAS 108(51):20838-20843)와 같이 발현 및 정제하고; 이로써 PYL7, PYL11 및 PYL12를 제외한 수용체들에 대해 가용성의 기능성 단백질 (수용체-매개 PP2C 저해 분석을 이용하여 분석됨)을 수득하였다. 이들 3종의 수용체들은 벡터 pMAL-c를 이용해 말토스 결합 (MBP) 융합 단백질로서 다르게 발현시켰으며; 이들 구조체들의 발현은 GST-HAB1에서 사용된 동일한 유도 조건을 적용하여 BL21[DE3]pLysS 숙주 균주에서 수행하였다. 재조합 MBP-PYL 융합 단백질은, 초음파처리되고 클리어링된 세포용혈물을 아밀로스 수지 (New England Biolab, Inc.)를 이용해 제조사의 정제 설명서에 따라 정제하여 수득하였다. 이러한 시도로 활성형 MBP-PYL11 융합 단백질이 수득되었지만, PYL7과 PYL12의 경우에는 실패하였다.

재조합 수용체 및 PP2C를 이용한 PP2C 활성 분석을 다음과 같이 수행하였다: 정제된 단백질을 10 mM MnCl₂, 3 ㎍ 소 혈청 알부민 및 0.1% 2-머캅토에탄올이 포함된 분석 완충제 80 ㎕에서 ABA 또는 ABA 작용제와 함께 22℃에서 30분간 예비-인큐베이션하였다. 반응은, 156 mM Tris-OAc, pH 7.9, 330 mM KOAc 및 5 mM 4-메틸움벨리페릴 포스페이트가 포함된 반응 용액 20 ㎕를 첨가한 후 개시하였고, 이후 형광 측정값을 여기 필터 355 nm 및 방사 필터 460 nm를 이용해 Wallac 플레이트 리더에서 즉각적으로 수집하였다. 반응물에는 각각 50 nM PP2C 및 100 nM PYR/PYL 단백질이 함유되었다.

도 1A는 일군의 ABA 작용제들을 보여준다. 도 1B에 나타낸 바와 같이, 효모 2-하이브리드 분석에서 LC66C6 등의 수종의 작용제에 의해 복수의 PYR/PYL 수용체들이 활성화된다. 이 분석에서, 기존에 언급된 바 (Park et al. 2009)와 같이 특정 수용체 및 PP2C를 GAL4 활성화 및 DNA-결합 도메인들과 각각 융합시켰을 때, PYR/PYL 단백질과 클레이드 A PP2C 단백질의 작용제-촉매화된 물리적 상호작용이 기록되었다. 이들 효모-기반의 분석은, ABA 또는 새로운 작용제 LC66C6 보다 수용체 선택성이 매우 높은 기존에 기술된 작용제 피라박틴과는 다르게, LC66C6이 복수의 PYR/PYL 수용체들의 작용제임을 보여준다. 기존에 기술된 바와 같이, 수용체의 작용제-촉매화된 클레이드 A PP2C의 결합은 PP2C의 포스파타제 활성을 저해한다. 아라비돕시스의 경우, PYR/PYL 수용체는 14종이며, 이들 중 13종은 원형질체-기반의 분석 시스템에서 ABA-반응을 매개할 수 있었다 (Fujii et al. 2009). LC66C6의 선택성을 더욱 세밀히 조사하기 위해, 14종 모두에 대해 재조합 6X-His-PYR/PYL 단백질을 발현 및 정제하였고, 기술적인 이유로 활성 형태로 생산할 수 없었던 PYL7, 12 및 13을 제외한 수용체들의 경우에는 ABA-응답성 수용체들을 확보하였다. 이러한 재조합 수용체 패널은 아라비돕시스 PYR/PYL 수용체 패밀리에 속하는 멤버들에 대해 거의 완전한 ABA-작용제 활성 패턴을 나타낼 수 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, HBA1, ABI1 및 ABI2의 PPC2 효소 활성은 테스트한 모든 ABA 수용체들의 존재 하에 10 μM ABA에 의해 >90%까지 저해된다 (도 2B). LC66C6 (Quinabactin)에 대한 반응에서는, HBA1, ABI1 및 ABI2의 >70% PP2C 저해율이 수용체 PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 및 PYL5에서 관찰되었다.

퀴나박틴의 활성을 추가로 규명하고 이의 수용체 선택성을 정의하기 위해, 10종의 재조합 수용체를, PP2C, 즉 HAB1, ABI1 또는 ABI2와 조합 사용하여 수용체-매개 PP2C-저해 분석을 수행하였다. 이들 실험에서, 퀴나박틴이 PYR1, PYL 1 - 3 및 PYL5를 활성화하며, IC₅₀ 값이 마이크로몰 미만이며, 이량성 수용체 부위에 대해 실질적으로 보다 높은 활성을 나타내는 것으로, 확인되었다 (도 2, 3 및 4). 이러한 결과는, 또한, 퀴나박틴이 ABA 보다 강력한 PYR1 또는 PYL1 작용제임을 보여준다 (도 2 및 3). 아울러, 테스트한 모든 수용체들에서 퀴나박틴에 의해 관찰되는 최대 PP2C 저해는 피라박틴에서 관찰되는 수준 보다 높았다. 피라박틴은 IC50 0.90 μM으로 PYL5를 활성화할 수 있지만, ~40% PP2C 저해로 포화되는데, 이는 이것이 불완전/부분 PYL5 작용제임을 의미한다. 즉, 본 실시예는, 피라박틴에 비해 보다 넓은 수용체 스펙트럼 활성과 증가된 생활성을 가진 새로운 설폰아미드 작용제의 동정을 입증해준다.

실시예 2

본 실시예는 새로운 ABA 작용제들이 발아 및 식물 생장을 저해함을 보여준다.

아라비돕시스 발아 및 배축 생장 저해 분석

아라비돕시스 발아 및 배축 생장 저해 분석을 위해, 약 4주간 성숙시킨 후 종자를 5% NaClO 및 0.05% Tween-20이 포함된 용액에서 10분간 표면-살균한 다음, 물로 4회 헹구었다. 살균된 종자를 0.1% 아가에 현탁한 다음, 1/2 무라시게-스쿠그 (MS) 염이 포함된 0.8% 고체 아가 배지 (Sigma-Aldrich)에 화학제의 존재 하에 파종한 후, 4일간 4℃에 둔 다음 암 또는 명 조건의 22℃로 이동시켰다. 4일 인큐베이션한 후 발아를 확인하고, 배축 성장은 6일 인큐베이션한 후 사진을 촬영하였다.

식물 재료

아래 대립유전자/돌연변이 균주를 사용하였으며: aba2-1 (Leon-Kloosterziel KM, et al. (1996) Isolation and characterization of abscisic acid-deficient Arabidopsis mutants at two new loci. Plant J 10(4):655-661), abi1-1 (Umezawa T, et al. (2009) Type 2C protein phosphatases directly regulate abscisic acid-activated protein kinases in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(41):17588-17593), abi3-9, abi4-11 (Nambara E, et al. (2002) A screen for genes that function in abscisic acid signaling in Arabidopsis thaliana. Genetics 161(3):1247-1255), 및 pry1pyl1pyl2ply4 quadruple (Park SY, et al. (2009) Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science 324(5930):1068-1071); 이들 균주들 모두 콜롬비아 백그라운드를 가진다. 이용한 pry1pyl1pyl2ply4 4중 돌연변이 균주를 콜롬비아와 3회 역교배하였다. 보리와 대두의 종자는 Living Whole Foods, Inc. 사에서 구입하였고, 옥수수 종자는 W. Atlee Burpee & Co 사에서 구입하였다. 이들 재료를 이용한 생리학적 실험들에 사용되는 방법의 상세 내용은 뒷받침되는 정보로서 제공된다.

LC66C의 고유한 작용제 특성으로 인한 생리학적 결과를 조사하기 위해, 아라비돕시스 종자, 묘목 및 성체 식물에 대한 영향을 규명하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 본원에 언급된 ABA 작용제들은 아라비돕시스에서 종자의 발아를 강하게 저해한다. 도 5A 및 5B는, LC66C6 등의 수종의 작용제들이 용량 의존적인 방식으로 종자의 발아를 저해함을 보여준다. 구체적으로, LC66C6은 1 몰 당 (+)-ABA로서 발아를 저해하는데 대체로 유효하였으며, 다른 테스트한 작용제들 보다 효과가 우수하였다.

도 5C 및 5D는 다양한 ABA-둔감성 돌연변이로부터 나온 종자의 발아를 저해하는데 있어 작용제 (+)-ABA 및 LC66C6의 효과를 나타낸 것이다. 도 5C에 나타낸 바와 같이, 5 μM 농도에서, LC66C6은, PYR/PYL 4중 돌연변이 (pyr1/pyl1/pyl2/pyl4) 및 pyr1 단일 돌연변이를 제외한, 모든 테스트 돌연변이들에서, (+)-ABA와 유사한 발아 저해 패턴을 나타내었다. 도 4에서 앞서 제시된 IC₅₀ 데이타와 조합하면, 이들 유전자 데이타는, LC66C6의 발아-저해 활성이 PYR1, PYL1 및 PYL2를 아고나이징하는 능력에 의해 치환된 것임을 제시해준다. 4중 돌연변이에서 발아를 저해하는 ABA의 저해력은 다른 수용체에 대한 작용제 활성에 의한 것으로 설명될 가능성이 높다. 본 유전자 데이타는, pyr1 돌연변이가 5 μM LC66C6 또는 파라박틴의 존재시 발아하기 때문에, PYR1이 ABA에 대한 응답성 종자 발아에 중요하지만 잉여적인 역할을 수행한다는 가설과 일치된다 (Park et al. 2009).

도 6에 나타낸 바와 같이, LC66C6는 발아 이후의 식물 생장도 저해한다. 도 6A 및 6B는, LC66C6가 야생형, abi1 및 4중 돌연변이에서 뿌리 신장을 저해하며, 이는 테스트한 모든 농도들에서 저해 효과가 (+)-ABA와 비슷하거나 또는 약간 더 효과적임을 보여준다. 나아가, 도 6C는, LC66C6가 야생형 식물과 돌연변이 식물의 생장을 농도 의존적인 방식으로 저해함을 보여준다. LC66C6에 의한 식물 생장의 저해는 피라박틴에 의한 저해 보다 현저하게 우수하며, (+)-ABA과 비슷하다.

본 실시예는, LC66C6이 야생형 식물과 ABA-둔감 돌연변이 식물 둘다에서 종아 발아와 생장을 저해하는 강력한 저해제임을 설명해준다.

실시예 3

본 실시예는 작용제 LC66C6이 가뭄 스트레스 내성을 유도함을 설명한다.

생리학적 분석

22 ± 2℃ 및 상대 습도 (RH) 45 ± 10%에서 16/8-h 명/야 사이클 하에 생장시킨 아라비돕시스 식물에서 생리학적 분석을 수행하였다. 아라비돕시스에서 증산에 의한 수분 감소 분석을 위해, 25 μM 화합물과 0.05% Tween-20이 포함된 용액 4 ml을 에어로졸 분무하여, 식물을 전처리하였다. 4주령의 식물 12주에 분석할 각 화합물 또는 대조군을 분무하였다. 밤새 화합물을 전처리한 후, 뿌리에서 호기부 (aerial portion)를 취하여, 2시간 동안 20분 간격으로 생중량을 측정하였다. 기공 개도 (stomatal aperture)를 측정하기 위해, 전술한 화합물을 식물에 전처리하고, 플라스틱 뚜껑을 덮어 높은 RH를 유지시키고, 밤새 전처리한 후, 스즈키 유니버셜 마이크로-프린팅 (SUMP) 방법을 SUMP 임프레션 용액과 SUMP B 플레이트 (SUMP Laboratory)를 이용해 잎 상피 임프레션 (leaf epidermal impression)을 수득하였다. 광 현미경을 이용해 잎 임프레션을 분석하고, 기공 개도를 ImageJ 1.43v software (National Institutes of Health, USA)로 포어 너비로부터 계산하였다. 아라비돕시스 가뭄 스트레스 분석을 위해, 3일간 매일 식물에 에어로졸을 분무함으로써 25 μM 화학제 용액 약 1.5 ml을 적용하였다. 식물은 포트 당 흙 100 g이 든 6 X 6 X 5 cm 사각형 포트에서 생장시켰다. 대두의 가뭄 스트레스 분석은 25 ±2℃, 65 ±10% RH에서 16/8-h 명/야 주기로 생장시킨 식물을 대상으로 수행하였다. 0.05% Tween-20이 포함된 50 μM 화학제 용액 약 20 ml을 3일간 매일 4회 포트 당 분무하였다 (식물 3주/포트). 사용한 포트는 250 ml 크기이며, 포트 당 흙 200 g이 담겨있다. 증산에 의해 매개되는 수분 감소를 측정하기 위해 포트를 파라필름으로 덮었다. 토양의 수분율 %은 포트 무게를 측정하고, 전체 중량에서 흙의 건조 중량을 제하여 계산하여 결정하였다.

대두, 보리 및 옥수수에서 수분 감소 분석

대두, 보리 및 옥수수를 이용한 수분 감소 분석을 위해, 0.05% Tween-20이 포함된 100 μM 화학제 용액을 식물의 호기부로 분무하였다. 사용된 대두, 보리 및 옥수수는 각각 약 4주, 2주 및 2주 키운 것이었다. 화합물은 수준 감소 분석 수행하기 전 16시간 전에 적용하였다. 수분 감소를 측정하기 위해, 줄기 전체를 취하여, 생중량을 모니터링하였다.

도 7은 가뭄 스트레스와 관련된 다양한 파라미터에 대한 LC66C의 효과를 도시한 것이다. 도 7A 및 7B에 나타낸 바와 같이, LC66C6은 야생형 식물과 aba2 (ABA-결핍 돌연변이 2) 돌연변이 식물에서 취한 잎들에서 증산에 의한 수분 감소량을 감소시켰다. 그러나, 도 7C에 나타낸 바와 같이, LC66C6은 abi1-1 돌연변이에서 취한 잎들에서는 증산에 의한 수분 감소를 감소시키지 못하였다. 도 7D는, LC66C6이 야생형 식물과 aba2 돌연변이 식물에서 기공 폐쇄를 유도하지만, abi1-1 돌연변이에서는 그렇지 않았다는 것을 보여준다. 도 7E는 대두 식물에 대한 가뭄 처리 기간 동안 토양의 수분율에 대한 작용제 화합물들의 효과를 보여준다.

도 8A는, 퀴나박틴을 식물에 처리하면, (+)-ABA 처리에 의해 부여되는 바와 유사하게 아라비돕시스 식물들에서 가뭄 스트레스 내성이 부여됨을 보여준다. 본 실시예에서, 2주 자란 식물에, 물 공급을 차단하여 가뭄 스트레스를 가하였고, 12일 후 사진을 촬영하였다. 2주간의 가뭄 처리한 후 식물에 물을 재공급하였다. 시험 식물 총 수 당 생존 식물의 수를 사진 옆에 표시한다. 도 8B는, 퀴나박틴을 대두 식물에 처리하면, (+)-ABA 처리에 의해 부여되는 바와 유사하게 가뭄 스트레스 내성이 부여됨을 보여준다. 본 실시예에서, 2주 자란 식물에, 물 공급을 차단하여 가뭄 스트레스를 가하였고, 8일간 가뭄 처리 후 사진을 촬영하였다. 모든 가뭄 스트레스 처리시, 화합물 (아라비돕시스에는 25 μM로, 대두에는 50 μM로 처리됨)은 0.05% Tween-20이 포함된 용액 중에 적용하였고, 가뭄 처리 기간 동안 3일마다 에어로졸로서 적용하였다. 모든 실험들의 값은 평균 ± SEM으로 나타낸다 (n = 6, 실험 당 식물 3주가 사용됨).

본 실시예는, LC66C6가 야생형 아라비돕시스 식물과 aba2 돌연변이 아라비돕시스 식물들 및 야생형 대두 식물들에서 (+)-ABA에 의해 부여되는 바와 유사하게 가뭄 스트레스 내성을 유도함을, 입증해준다.

실시예 4

본 실시예는, LC66C6가 (+)-ABA에 의해 유도되는 바와 유사한 방식으로 ABA-응답성 유전자들을 유도함을, 설명해준다.

마이크로어레이 분석

RNAeasy Plant Mini Kit (Qiagen, USA)를 제조사의 지침서에 따라 사용해 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성, 표지 및 아라비돕시스 ATH1 칩 (Affymetrix, USA)으로의 혼성화를, 리버사이드에 위치한 캘리포니아 대학 IIGB Core Instrumentation Facility에서 Affymetrix 프로토콜을 이용해 수행하였다. 3배수의 생물 샘플들을, DMSO 대조군, ABA, 피라박틴 및 퀴나박틴 처리에 대해 혼성화하였고; 화합물은 25 μM 최종 농도로 적용하였고, 화합물 또는 대조군에 6시간 노출시킨 후, 냉동 조직으로부터 RNA를 수득하였다. 프로브 세트에 대한 발현 시그널을 MAS5 Statistical Algorithm (Affymetrix, USA)에 의해 계산 및 표준화하였다. 모든 실험들에서 시그널 존재에 대해 어레이 데이타의 실험 필터링을 수행하였다. 각 화학적 처리시 전사체 평균 수준을 대조군 실험에서의 값과 비교하였고, 이를 이용해 배수-변화 값을 계산하였다. Log₂-변환된 배수-변환 값들을 이용해, 실험 조건들 간의 피어슨 상관계수를 계산하였다.

정량적인 RT-PCR 분석

식물 RNA 정제 시약 (Invitrogen, USA)을 제조사의 지침서에 따라 사용해 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA 1 ㎍으로부터 QantiTec 역전사 키트 (Qiagen, USA)를 이용해 cDNA를 합성하였다. Maxima^® SYBR 그린/플루오레세인 qPCR 마스터 믹스 (Fermentas)를 이용한 실시간 PCR을 iQ5 실시간 PCR 검출 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용해 수행하였다. 타겟 mRNA의 상대적인 양을 상대적인 표준 곡선 그래프를 이용해 결정하고, 내부 대조군 mRNA의 상대적인 양으로 표준화하였다. 생물학적 실험을 3세트로 수행하였다. 이들 실험에 사용된 프라이머 서열들을 표 2에 나타낸다.

표 2. 정량적인 RT-PCR용 프라이머 세트들

아라비돕시스
AGI 유전자 코드	약어	정방향 프라이머	역방향 프라이머
AT1G05100	MAPKKK18	AAGCGGCGCGTGGAGAGAGA	GCTGTCCATCTCTCCGTCGC
AT5G52310	RD29A	TGAAGTGATCGATGCACCAGG	GACACGACAGGAAACACCTTTG
AT5G52300	RD29B	TATGAATCCTCTGCCGTGAGAGGTG	ACACCACTGAGATAATCCGATCCT
AT4G34000	ABF3F	GTTGATGGTGTGAGTGAGCAGC	AACCCATTACTAGCTGTCCCAAG
AT2G46270	GBF3	GACGCTTTTGAGCATCGACACT	ACTGTTTCCTTCGCTCCCGTTTC
내부 대조군	ACT2	CTCATGAAGATCCTTACAG	CTTTCAGGTGGTGCAACGAC

대두	약어	정방향 프라이머	역방향 프라이머
	GmNAC4	ACGTCAGTTCCGCAAAAGAT	GGACCCGTTGGTTTCTCAC
	GmbZIP1	GGGAATGGGAATTTGGGTGAGAA	CCTTCTGCCAGGGCTAGCATG
내부 대조군	Gm18S	CCTGCGGCTTAATTTGACTCAAC	TAAGAACGGCCATGCACCA

보리	약어	정방향 프라이머	역방향 프라이머
	HVA1	AACACGCTGGGCATGGGAG	CGAACGACCAAACACGACTAAA
	HvDRF1	CGGGCGGCGCGATTGCGAGC	ACGGAATTAGGGCCATCACG
내부 대조군	Hvtubulin2	TCCATGATGGCCAAGTGTGA	GACATCCCCACGGTACATGAG

옥수수	약어	정방향 프라이머	역방향 프라이머
	ZmLEA	GCAGCAGGCAGGGGAGAA	GCCGAGCGAGTTCATCATC
	ZmRAB17	ATGAGTACGGTCAGCAGGGGCAG	CTCCCTCGCAGGCTGGAACTG
내부 대조군	ZmUbi	TGCCGATGTGCCTGCGTCGTCTGGTGC	TGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG

ABA-응답성 리포터 유전자 분석

기존 ABA-응답성 프로모터-GUS 융합체는, 본 발명자의 경험 상, ABA에 반응하여 유도되는 수준 보다 상대적으로 낮거나 백그라운드 수준 보다 높기 때문에, 이상적이지 않다. MAPKKK18은 백그라운드 수준이 낮은 고도의-ABA 유도성 유전자로서 (Matsui A, et al., Plant Cell Physiol 49(8):1135-1149 (2008)); MAPKKK18은 또한 가뭄 및 염 스트레스 시 강하게 유도된다. 이에, MAPKKK18 프로모터::GUS 리포터 형질전환 식물에서 작용제의 효과를 규명하였다. GUS 염색은 다음과 같은 조성의 반응 완충액 중에서 수행하였다: 50 mM 소듐 포스페이트 완충제 pH 7.0, 0.05% Tween-20, 2.5 mM 포타슘 페로시아니드, 2.5 mM 포타슘 페리시아니드, 1 mM X-gluc. 반응 완충액은 10분간 1번 테스트 샘플로 진공 투입시킨 다음 37℃에서 5시간 인큐베이션하였다. 샘풀을 70% 에탄올로 헹구어 반응을 정지시키고, 65℃에서 인큐베이션하여 엽록소 색소를 탈색시켰다.

도 9는 피라박틴, LC66C6 및 (+)-ABA에 반응하여 유도되는 유전자 발현 변화를 보여준다. 도 9A에 나타낸 바와 같이, LC66C6는 야생형 식물에서 용량 의존적인 방식으로 RD29B 및 MAPKKK18 mRNA의 발현을 유도하였으며, abi1-1 및 PYR/PYL 4중 돌연변이 식물들에서는 유도 수준이 충분하지 않았다. LC66C6에 의한 유전자 발현 유도는 (+)-ABA에서 관찰되는 결과와 유사하다. (+)-ABA 및 LC66C6와는 대조적으로, 피라박틴은 보다 고 농도로 사용되었을 때 묘목에서 중간 수준의 ABA-관련 유전자 발현을 유도함에도 불구하고, 야생형 식물에서는 유전자 발현을 유도하지 못하였다 (Park et al., 2009).

도 9B는 대조군 처리와 비교하여, 야생형 묘목들에서, 표지된 RNA의 ATH1 마이크로어레이로의 혼성화에 의해 측정되는 바와 같이, ABA 및 LC66C6 또는 피라박틴 효과들을 게놈-와이드 비교한 결과를 보여준다. 도 9B에 나타낸 바와 같이, LC66C6는 마이크로어레이 실험에서 ABA에 의해 유도되는 결과와 유사한 유전자 세트를 유도하였다. 반면, 피라박틴은 ABA와 유사한 발현 패턴을 유도하지 못하였다.

도 9C 및 9D는, LC66C6가 동일 조직에서 (+)-ABA와 같이 리포터 유전자들의 발현을 유도함을 도시한 것이다. 리포터 유전자의 발현은 잎과 뿌리의 가이드 세포 및 도관 조직들, 및 흡수된 종자의 유근 팁 (radicle tip)에서 관찰되었다.

도 10은 PYR/PYL 단일 돌연변이들에서의 ABA-응답성 유전자의 발현을 도시한 것이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, Col 및 Ler 생태형과, pyr1, pyl1, ply2, pyl3 및 pyl4 단일 돌연변이 유전자형에서, LC66C6 및 (+)-ABA 둘다에 의해 ABA-응답성 MAPKKK18, RD29A 및 RD29B mRNA들이 유도되었다. 반면, 피라박틴은 단일 돌연변이 또는 야생형 생태형 중 임의에서 분석된 임의의 유전자들의 발현을 현저하게 유도하지 못하였다.

도 11은 야생형 식물, abi1-1 돌연변이 식물 및 PYR/PYL 4중 돌연변이 식물에서의 ABA-응답성 유전자의 발현을 도시한 것이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, LC66C6 및 (+)-ABA 둘다 Col 야생형 식물에서 용량 의존적인 방식으로 ABF3, GBF3, NCED3 및 RD29A의 발현을 유도하는 반면, abi1-1 돌연변이 식물과 PYR/PYL 4중 돌연변이 식물에서는 유도 수준이 낮았다. 전술한 결과와 일치되게, 피라박틴은 야생형 식물에서 분석한 임의의 유전자의 발현을 현저하게 유도하지 않았다.

실시예 5

본 실시예는 ABA 이화작용의 주요 효소들이 LC66C6에 의해 유도되는 반응에 영향을 미치지 않음을 설명해준다.

도 12에 나타낸 바와 같이, ABA에 의한 식물 생장 및 발아의 저해는 ABA 이화 작용의 주 효소인 cyp707a에 대한 이중 돌연변이 식물에서 강화되지만, CYP707A를 과다 발현하는 식물에서는 감소된다 (CYP707AOX; 도 12A-D 참조). 반면, LC66C6의 식물 생장 및 발아에 대한 효과는 cyp707a에 대한 이중 돌연변이 식물, 야생형 식물 또는 CYP707AOX 과다발현 식물에서 유의한 차이가 없었다 (도 12A-D 참조).

본 실시예는, ABA의 파괴에 관여하는 효소들이 LC66C6에 의해 조절되는 표현형에 영향을 미치지 않음을 입증해준다.

실시예 6

본 실시예는 LC66C6가 외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물을 비롯한 다양한 식물 종들에서 활성형임을 보여준다.

도 13A는, LC66C6가 브로콜리, 무, 알팔파, 대두, 보리, 밀, 수수 및 옥수수 종자의 발아를 저해함을 보여준다. LC66C6에 의한 발아 저해 수준은 피라박틴 보다 높다. 도 13B에 나타낸 바와 같이, LC66C6는 상기 종들에서 취한 잎들에서 2시간 동안 증산에 의해 수분 감소를 감소시킨다. 나아가, LC66C6는 대두에서 ABA-응답성 유전자들, 즉, GmNAC4 및 GmbZIP1의 발현을 강하게 유도하고 (도 13C), 보리에서는 ABA-응답성 유전자들 즉 HVA1 및 HvDRF1의 발현을 보통 수준으로 유도하고 (도 13D), 옥수수에서는 ABA-응답성 유전자들 즉 ZmRab17 및 ZmLEA의 발현을 약하게 유도한다 (도 13E).

본 실시예는, LC66C6가 농업적으로 중요한 다양한 그룹의 종들에서 증산에 의한 수분 감소를 감소시키고 발아를 저해함을 입증해주며, 이는 LC66C6가 복수의 종들에서 가뭄 스트레스를 낮추는데 유용함을 시사해준다.

실시예 7

본 실시예는, ABA와 본원에 기술된 작용제들의 화학적 구조들과, 작용제들의 시험관내 및 생체내 효과를 보여준다.

도 14와 18은 테스트한 ABA와 작용제의 화학 구조를 도시한 것이다. 도 15A는 도 14에 나타낸 각 작용제들에 대한 반응을 조사하기 위한, PYR/PYL 수용체들, 즉, PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 및 PYL4를 이용한 효모 2-하이브리드 분석 결과들을 도시한 것이다. 도 15B는 야생형 종자의 발아에 대한 도 14의 작용제들을 조사한 결과를 도시한 것으로, LC66C6가 야생형 종자의 발아를 저해하는데 있어, (+)-ABA 다음으로 가장 효과적인 작용제들 중 하나인 것으로 나타났다. 도 15C는 ABA-유도성 아라비돕시스 유전자 MAPKKK18의 통제 하에 글루코로니다제를 발현하는 형질전환주에서 글루쿠로니다제 분석을 이용해 측정한 ABA-리포터 주에 대한 화합물의 효과를 보여준다.

본 실시예는 LC66C6가 시험관내와 생체내 모두에서 테스트한 가장 효과적인 작용제들 중 하나임을 입증해준다.

실시예 8

본 실시예는, LC66C6가 ABA-결핍성 돌연변이 식물의 크기를 증대시킬 수 있음을, 보여준다.

본 실시예에서, 14일된 야생형 식물과 aba2 돌연변이 식물에, 2주간 매일 2회로 작용제를 25 μM로 함유한 용액을 분무하였다. 4주된 식물에서 사진 촬영하고 생중량을 구하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, aba2 돌연변이 식물에 LC66C6를 처리하면, 담체 DMSO를 단독 처리한 대조군 식물과 비교해, 돌연변이 식물의 크기가 현저하게 증가하였다.

본 실시예는, LC66C6가 (+)-ABA와 유사한 방식으로 aba2 돌연변이에서 관찰되는 생장 표현형을 보완할 수 있음을 입증해준다.

실시예 9

본 실시예는, LC66C6가 이끼에서 원사체 생장을 약하게 저해할 수 있지만, 단세포 녹조류인 클라미도모나스 (Chlamydomonas)의 생장에는 효과가 없음을 보여준다.

도 17A 및 17B에 나타낸 바와 같이, LC66C6는 이끼류인 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens)의 원사체 생장에 약하지만 유의한 저해를 나타내었다. 피라박틴은 원사체를 탈색시켰는데, 이는 이들 종에 유해할 수 있음을 시사해준다.

도 17C는, LC66C6가 이끼류에서 ABA-응답성 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 보여준다. 그러나, 이들 유도 수준은 ABA 보다 약하였다.

도 17D에 나타낸 바와 같이, (+)-ABA와 LC66C6는 둘다 염 및 삼투성 스트레스 존재 및 부재 시에 클라미도모나스의 생장에는 영향을 미치지 않았다. 또한, 피라박틴은 클라미도모나스를 탈색시켰으며, 이는 이 종들에 물론 유해함을 의미한다.

본 실시예는, LC66C6가 원사체 생장을 약하게 저해할 수 있으며, 이끼인 피스코미트레랄 파텐스에서 ABA-응답성 유전자 발현을 약하게 유도하지만, 단세포 조류인 클라미도모나스의 생장에는 효과가 없음을, 보여준다.

실시예 10: 화합물 합성

10.1 화합물 1.001의 제조

1) 1-알릴-6-니트로-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온

6-니트로-3,4-다이하이드로-1H-퀴놀린-2-온 (19.2g)을 DMF (150ml)에 용해하, 5℃로 냉각 후 K2CO3 (18.2g)를 첨가하였다. 3-브로모프로펜 (15.7g)을 점적 첨가하고, 반응물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음/물에 붓고, 석출되는 산물을 여과하여, 물로 세척하였다. 수득되는 젖은 결정을 에탄올 (60ml)에서 교반 후, 다이에틸 에테르를 첨가하고, 현탁물을 다시 여과한 다음, 수득되는 필터 케이크를 다이에틸 에테르로 헹군 후 진공 건조하여 산물 21.7 g을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 8.10 (m, 2H), 7.08 (d, 1H), 5.85 (m, 1H), 5.25 (d, 1H), 5.12 (d, 1H), 4.60 (m, 2H), 3.05 (dd, 2H), 2.73 (dd, 2H).

2) 1-알릴-3-메틸-6-니트로-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온

1-알릴-6-니트로-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온 (929mg)을 드라이 THF (32ml)에 용해하고 탈기 후 -15℃로 냉각시켰다. MeI (1.14g)를 첨가한 후 LiHMDS (THF 중의 1 M 용액 4.4 ml)을 점적 첨가하였다. 반응물을 20분간 교반하고, NH4Cl(aq)에 부어 EtOAc로 2번 추출하였다. 유기층을 Na2SO4에서 건조, 농축 및 크로마토그래피로 정제하여, 산물 886 mg을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 8.10 (m, 2H), 7.03 (d, 1H), 5.85 (m, 1H), 5.22 (d, 1H), 5.12 (d, 1H), 4.60 (m, 2H), 3.05 (dd, 1H), 2.75 (m, 2H), 1.30 (d, 3H).

3) 1-알릴-6-아미노-3-메틸-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온

1-알릴-3-메틸-6-니트로-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온 (880mg)을 에탄올 (8.8ml)과 물 (4.4ml)에 현탁하였다. NH4Cl (1.91g)와 Fe (환원 분말 (reduced powder))(600mg)를 첨가하고, 반응물을 환류 가열하였다. 1.5시간 후, NH4Cl (850mg)와 Fe (환원 분말) (300mg)를 첨가하고, 다시 1.5시간 동안 계속 환류하였다. 반응 혼합물을 냉각시켜, CH2Cl2로 희석 후 셀라이트로 여과하였다. 여과물을 CH2Cl2 및 물로 세척하였다. 용액에 HCl(aq)를 첨가하여 산성화하고, CH2Cl2로 2번 헹구었다. 산성의 수상을 K2CO3 수용액에 붓고, 수득되는 중성 수용액을 CH2Cl2로 2번 추출하였다. 유기층을 농축하여, 산물 627 mg을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 6.25 (d, 1H), 6.5 (m, 2H), 5.85 (m, 1H), 5.10 (m, 2H), 4.49 (m, 2H), 3.5 (bs, 2H), 2.9-2.5 (m, 3H), 1.22 (d, 3H).

4) 화합물 1.001

1-알릴-6-아미노-3-메틸-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온 (130mg)을 CH2Cl2 (3ml)에 용해하여, 0℃로 냉각시켰다. iPr2NEt (117mg)와 p-톨릴메탄설포닐클로라이드 (129mg)를 첨가하였다. 실온까지 승온시키면서, 반응물을 7시간 교반한 다음 CH2Cl2로 희석하여 NaHCO3 (aq)와 HCl(aq)로 헹구었다. 유기층을 농축한 다음 크로마토그래피로 정제하여, 산물 140mg을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 7.17 (m, 4H), 6.90 (m, 2H), 6.30 (s, 1H), 5.85 (m, 1H), 5.10 (m, 2H), 4.50 (m, 2H), 4.28 (s, 2H), 2.9-2.6 (m, 3H), 2.33 (s, 3H), 1.22 (d, 3H).

10.2 화합물 15.001의 제조

화합물 15.001을 화합물 1.001과 유사한 방식으로 제조하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 7.4-7.3 (m, 4H), 6.90 (m, 2H), 6.28 (s, 1H), 5.85 (m, 1H), 5.15 (m, 2H), 4.50 (m, 2H), 4.3 (s, 2H), 2.9-2.6 (m, 3H), 1.23 (d, 3H).

10.3 빌딩 블럭의 제조

아래 화합물들은 본 발명의 화합물 제조에 빌딩 블럭으로서 사용하였다.

A. 1-알릴-6-아미노-8-메틸-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온

1) N-(o-톨릴)-3-페닐-프로프-2-엔아미드

아세톤 (200ml) 중의 신나모일 클로라이드 (181g) 용액을, 아세톤 (1L) 중의 o-톨루이딘 (107.7g) 냉각 (-20℃) 용액에 점적 첨가하고, 얼음 (1kg)과 K2CO3 (153g)를 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 1시간 교반한 다음, 얼음/물에 붓고, 석출물을 여과하여 물로 헹군 후 진공 하 100℃에서 건조시켜, 산물 239g을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 8.0-7.1 (m, 9H), 6.6 (bd, 1H), 4.8 (s, 2H), 2.3 (s, 3H)

2) 8-메틸-1H-퀴놀린-2-온

N-(o-톨릴)-3-페닐-프로프-2-엔아미드 (9.5g)와 AlCl3 (17.8g)를 180℃에서 용융시킨 후, 1시간 동안 100℃에서 가열하였다. 제조되는 혼합물을 물/얼음 (2L)에 붓고, 석출되는 갈색빛의 고체를 여과하여 물, HCl(aq), 물로 순차적으로 헹군 다음 100℃에서 진공 건조하여 산물 5.0 g을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 9.2 (bs, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.35 (d, 1H), 7.13 (dd, 1H), 6.65 (d, 1H), 2.45 (s, 3H)

3) 8-메틸-3,4-다이하이드로-1H-퀴놀린-2-온

8-메틸-1H-퀴놀린-2-온 (108g)을 AcOH (800ml)에 용해하고, 탈기하였다. 아르곤 분위기 하에, 10% Pd/C (10.8g)를 첨가하고, 제조되는 혼합물을 수소 분위기 (1atm) 하에 두어, 10시간 동안 90℃에서 교반하였다. 수소 분위기를 아르곤으로 치환하고, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과한 후 EtOAc로 헹구었다. Pd-폐기물을 적절하게 폐기하였다. 수득되는 용액을 농축하였다. 조상물을 재결정화하여, 산물 51g을 수득하였다. 나머지 모액은 EtOAc로 희석하여 물로 헹군 후 농축하여 산물 30g을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 7.55 (bs, 1H), 7.05 (m, 2H), 6.90 (dd, 1H), 2.95 (m, 2H), 2.63 (m, 2H), 2.21 (s, 3H)

4) 8-메틸-6-니트로-3,4-다이하이드로-1H-퀴놀린-2-온

8-메틸-3,4-다이하이드로-1H-퀴놀린-2-온 (10g)과 황산 (186ml)을 기계 교반기가 장착된 플라스크에서 혼합하였다. 맑은 용액을 0℃까지 냉각시킨 다음 HNO3 (6.0g)를 15분에 걸쳐 점적 첨가하고, 동시에 반응물을 왕성하게 교반하였다. 교반은 0.5시간 동안 계속하였고, 반응 혼합물을 얼음/물에 부은 후, 현탁물을 여과하였다. 조산물을 EtOAc로부터 재결정화하여 산물 9.1g을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 8.0 (m, 2H), 7.85 (bs, 1H), 3.05 (m, 2H), 2.70 (m, 2H), 2.31 (s, 3H).

5) 1-알릴-8-메틸-6-니트로-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온

8-메틸-6-니트로-3,4-다이하이드로-1H-퀴놀린-2-온 (3.0g)을, DMF (58ml) 중의 NaH (1.45g) 현탁액에 실온에서 첨가하였다. 이 혼합물을 20분간 교반한 후, 알릴 브로마이드 (10.9g)를 점적 첨가하고, 제조되는 혼합물을 48시간 교반한 다음 물로 퀀칭 후 EtOAc로 추출하였다. 유기 상을 Na₂SO₄ 상에서 건조, 농축 및 크로마토그래피로 정제하여, 산물 2.59g을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 7.95 (d, 1H), 7.9 (d, 1H), 5.7 (m, 1H), 5.1 (m, 2H), 4.58 (m, 2H), 2.94 (m, 2H, 2.63 (M, 2H), 2.41 (s, 3H).

6) 1-알릴-6-아미노-8-메틸-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온

8-메틸-6-니트로-3,4-다이하이드로-1H-퀴놀린-2-온 (2.6g)을 에탄올 (26ml)과 물 (13 ml)에 현탁하였다. NH4Cl (8.44g)와 반응물을 환류 가열하였다. Fe (환원 분말) (2.94g)를 1시간 동안 조금씩 첨가하였다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 냉각시킨 후 EtOAc로 희석하고, 셀라이트로 여과한 다음, 유기층을 농축하고 크로마토그래피로 정제하여 산물 2.1g을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 6.39 (s, 2H), 5.72 (m, 1H), 5.1 (m, 2H), 4.48 (m, 2H), 3.5 (bs, 2H), 2.70 (m, 2H), 2.52 (m, 2H), 2.23 (s, 3H).

B. 6-아미노-8-메틸-1-프로프-2-이닐-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온

1) 8-메틸-6-니트로-1-프로프-2-이닐-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온

8-메틸-6-니트로-3,4-다이하이드로-1H-퀴놀린-2-온 (2.0g)을 DMF (38 ml) 중의 NaH (970mg) 현탁액에 실온에서 첨가하였다. 이 혼합물을 20분간 교반한 후, 프로파길 브로마이드 (톨루엔 중의 80% 용액 6.48ml)를 점적 첨가하고, 제조되는 혼합물을 16시간 교반한 다음 물로 퀀칭하여 EtOAc로 추출하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조, 농축 및 크로마토그래피에 의한 정제 후, 산물 2.07g을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 8.03 (d, 1H), 7.93 (d, 1H),, 4.72 (s, 2H), 2.95 (m, 2H), 2.65 (m, 2H), 2.56 (s, 3H), 2.20 (t, 1H).

2) 6-아미노-8-메틸-1-프로프-2-이닐-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온

8-메틸-6-니트로-1-프로프-2-이닐-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온 (2.07g)을 에탄올 (21ml)과 물 (10.5 ml)에 현탁하였다. NH4Cl (6.8g)과 반응물을 환류 가열하였다. Fe (환원 분말) (2.37g)를 1시간 동안 나누어 첨가하였다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, EtOAc로 희석하여 셀라이트로 여과한 다음 유기층을 농축한 후 크로마토그래피로 정제하여 산물 1.32g을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ = 6.35 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 3.55 (s, 2H), 2.73 (m, 2H), 2.52 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.18 (t, 1H).

10.4 빌딩 블럭과 화합물 1.079 (N-(8-메틸-2-옥소-1-프로프-2-이닐-3,4-다이하이드로퀴놀린-6-일)-1-(p-톨릴)메탄설폰아미드)의 커플링

에틸 아세테이트 (0.5 ml) 중의 6-아미노-8-메틸-1-프로프-2-이닐-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온 (0.1 mmol) 용액에, 휘니그 염기 (Hunig's base) (0.15 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음-에탄올 조 안에서 0℃까지 냉각시켰다. 에틸 아세테이트 (0.75 ml) 중의 p-톨릴메탄설포닐 클로라이드 (0.15 mmol) 용액을 점적 첨가하고, 반응 혼합물을 4시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하였다. 나머지 혼합물은 N,N-다이메틸아세트아미드 (0.3 ml) 및 메탄올 (1.25 ml)로 희석하고, HPLC로 정제하여, N-(8-메틸-2-옥소-1-프로프-2-이닐-3,4-다이하이드로퀴놀린-6-일)-1-(p-톨릴)메탄설폰아미드, 화합물 1.079를 수득하였다.

화합물은 UPLC-MS로 동정하였다: 체류 시간 (RT) = 1.33분; M (계산치): 382.14; (M+H) (측정치): 383.06

UPLC-MS 조건

Waters SQD2 Mass Spectrometer (단일 사중극자 질량 분광측정기)

이온화 방법: 전기방사

극성: 양이온

Capillary (kV) 3.50, Cone (V) 30.00, Extractor (V) 3.00, 소스 온도 (℃) 150, 탈용매화 온도 (℃) 400 Cone 기체 유속 (L/Hr) 60, 탈용매화 기체 유속 (L/Hr) 700

질량 범위: 140 - 800 Da

DAD 파장 범위 (nm): 210 - 400

방법: 하기 HPLC 농도구배 조건을 적용한 Waters ACQUITY UPLC

(용매 A: 물/메탄올 9:1, 0.1% 포름산 및 용매 B: 아세토니트릴, 0.1% 포름산)

시간(분)	A (%)	B (%)	유속 (ml/min)
0	100	0	0.75
2.5	0	100	0.75
2.8	0	100	0.75
3.0	100	0	0.75

10.5 빌딩 블럭 A 또는 B의 커플링을 통한 그외 화합물들의 제조

6-아미노-8-메틸-1-프로프-2-이닐-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온과 1-알릴-6-아미노-8-메틸-3,4-다이하이드로퀴놀린-2-온을 이용하여, 전술한 방법으로, 아래 표 3에 나타낸 6.007, 1.079, 4.007, 1.007, 15.007, 6.079 및 15.079의 화합물들을 병렬 합성으로 제조하였다.

표 3:

화합물	구조	식	RT	M (계산치)	(M+H) ⁺ (측정치)
6.007		C20H21BrN2O3S	1.45	448.1	448.94
1.079		C21H22N2O3S	1.33	382.1	383.06
4.007		C20H21ClN2O3S	1.43	404.1	405.03
1.007		C21H24N2O3S	1.41	384.2	385.10
15.007		C21H21F3N2O4S	1.54	454.1	455.01
6.079		C20H19BrN2O3S	1.38	446.0	446.93
15.079		C21H19F3N2O4S	1.48	452.1	453.00

실시예 11: PP2C 활성 분석

단백질 HAB1인 2형 단백질 포스파타제 (PP2C)는 앱시스산 또는 기타 길항제에 의존하여 PYR/PYL 단백질에 의해 저해된다. 길항제의 효능은 PP2C의 저해 수준과 상관성이 있으며, 따라서 IC50 (PYR1-HAB1)을 이용해 여러가지 화학 유사체들의 상대적인 활성화 비교할 수 있다. PP2C의 저해는 종자-발아 저해 및 식물의 물-사용 효율 증가와 연관되어 있기 때문에, 이는 앱시스산의 유사체로서 작용하는 화학제의 생물학적 잠재성을 정량하기 위한 강력한 툴로서 제공된다.

Park et al. ((2009) Science 324(5930):1068-1071)에 기술된 방법에 약간의 수정을 가하여 HAB1과 PYL 단백질을 발현시켜 정제하였다. GST-HAB1, -ABI1 및 -ABI2 융합 단백질을 제조하기 위해, HAB1 cDNA를 pGex-2T에 클로닝하고, ABI1과 ABI2 cDNA는 벡터 pGex-4T-1에 클로닝하였다. 발현은 BL21[DE3]pLysS 숙주 세포에서 수행하였다. 형질전환된 세포를 밤새 예비-배양한 후 LB 배지로 이동시켜 30℃에서 A600 ~0.5까지 배양하였다.

그런 후, 배양물을 얼음 위에서 냉각시키고, MnCl₂를 4 mM로, IPTG를 0.3mM로 첨가하였다. 15℃에서 16시간 인큐베이션한 다음, 세포를 회수하고, 재조합 단백질을 Park et al.에 기술된 바와 같이 글루타티온 아가로스에서 정제하였다. 6XHis-PYL 수용체 융합 단백질을 수득하기 위해, 모두 13개의 ABA 수용체들에 대한 수용체 cDNA를 벡터 pET28에 클로닝하고, Mosquna et al. ((2011) PNAS 108(51):20838-20843)에 언급된 바와 같이 발현 및 정제하고; 이로써 PYL7, PYL11 및 PYL12를 제외한 수용체들에 대해 가용성의 기능성 단백질 (수용체-매개 PP2C 저해 분석을 이용하여 분석됨)을 수득하였다. 이들 3종의 수용체들은 벡터 pMAL-c를 이용해 말토스 결합 (MBP) 융합 단백질로서 다르게 발현시켰으며; 이들 구조체들의 발현은 GST-HAB1에서 사용된 동일한 유도 조건을 적용하여 BL21[DE3]pLysS 숙주 균주에서 수행하였다. 초음파처리되고 클리어링된 세포용혈물을 아밀로스 수지 (New England Biolab, Inc.)를 이용해 제조사의 정제 설명서에 따라 정제하여, 재조합 MBP-PYL 융합 단백질을 수득하였다. 이러한 시도로 활성형 MBP-PYL11 융합 단백질이 수득되었지만, PYL7과 PYL12의 경우에는 실패하였다.

재조합 수용체 및 PP2C를 이용한 PP2C 활성 분석을 다음과 같이 수행하였다: 정제된 단백질을 10 mM MnCl₂, 3 ㎍ 소 혈청 알부민 및 0.1% 2-머캅토에탄올이 포함된 분석 완충제 80 ㎕에서 ABA 또는 ABA 작용제 (본 발명의 화합물)와 함께 22℃에서 30분간 예비-인큐베이션하였다. 반응은, 156 mM Tris-OAc, pH 7.9, 330 mM KOAc 및 5 mM 4-메틸움벨리페릴 포스페이재조합 수용체 및 PP2C를 이용한 PP2C 활성 분석을 다음과 같이 수행하였다: 정제된 단백질을 10 mM MnCl₂, 3 ㎍ 소 혈청 알부민 및 0.1% 2-머캅토에탄올이 포함된 분석 완충제 80 ㎕에서 ABA 또는 ABA 작용제와 함께 22℃에서 30분간 예비-인큐베이션하였다. 반응은, 156 mM Tris-OAc, pH 7.9, 330 mM KOAc 및 5 mM 4-메틸움벨리페릴 포스페이트가 포함된 반응 용액 20 ㎕를 첨가한 후 개시하였고, 이후 형광 측정값을 여기 필터 355 nm 및 방사 필터 460 nm를 이용해 Wallac 플레이트 리더에서 즉각적으로 수집하였다. 반응물에는 각각 50 nM PP2C 및 100 nM PYR/PYL 단백질이 함유되어 있었다. 그 결과는 표 4에 나타낸다.

표 4: PP2C의 저해

화합물	IC50 (PYR1-HAB1) nM
퀴나박틴	0.016
화합물 15.007	0.020
화합물 15.079	0.042
화합물 6.007	0.034
화합물 1.007	0.030
화합물 4.007	0.052
화합물 6.079	0.069
화합물 1.079	0.074

그 결과, 본 발명의 화합물들은 퀴나박틴과 비슷한 수준에서 PP2C를 저해하는 것으로 나타났다.

실시예 12: 아라비돕시스에 대한 발아 저해 분석

화합물들이 발아를 저해하는데 미치는 효과를 분석하기 위해, 아라비돕시스 종자를 약 4주간 성숙시킨 후 5% NaClO 및 0.05% Tween-20이 포함된 용액에서 10분간 표면-살균한 다음, 물로 4회 헹구었다. 살균된 종자를 0.1% 아가에 현탁한 다음, 1/2 무라시게-스쿠그 (MS) 염이 포함된 0.8% 고체 아가 배지 (Sigma-Aldrich)에 화학제의 존재 하에 파종한 후, 4일간 4℃에 둔 다음 암 조건의 22℃로 이동시켰다. 3일 후 발아를 평가하였다.

표 5: 아라비돕시스 종자들의 발아율

화합물	0.2uM	1uM	5uM	25uM
퀴나박틴	100	46	0	0
화합물 15.007	100	100	30	0
화합물 15.079	100	100	68	0
화합물 6.007	100	100	96	0
화합물 1.007	100	100	100	0
화합물 4.007	100	100	100	0
화합물 6.079	100	100	100	0
화합물 1.079	100	100	100	0
화합물 15.001	100	100	100	14
화합물 1.001	99	100	100	71

그 결과, 본 발명의 화합물들이 아라비돕시스 종자의 발아를 저해하는 것으로 확인되었다.

본원에 기술된 실시예들과 구현예들은 단순 예시의 목적일 뿐이며, 당해 기술 분야의 당업자라면 이러한 내용에 비추어 다양한 수정 또는 변화를 제시할 것이며, 이는 첨부된 청구항의 범위 및 본 출원의 사상과 범주에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 서열 접근 번호, 특허 및 특허 출원들은 어떠한 목적으로도 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA SYNGENTA PARTICIPATIONS AG <120> COMPOUNDS THAT INDUCE ABA RESPONSES <130> 061818-5129-KR <140> PCT/US14/044727 <141> 2014-06-27 <150> US 61/840,967 <151> 2013-06-28 <160> 119 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, Pyrabactin resistance 1, abscisic acid receptor PYR1 (PYR1), ABI1-binding protein 6 (ABIP6), regulatory components of ABA receptor 11 (RCAR11), At4g17870, T6K21.50 <400> 1 Met Pro Ser Glu Leu Thr Pro Glu Glu Arg Ser Glu Leu Lys Asn Ser 1 5 10 15 Ile Ala Glu Phe His Thr Tyr Gln Leu Asp Pro Gly Ser Cys Ser Ser 20 25 30 Leu His Ala Gln Arg Ile His Ala Pro Pro Glu Leu Val Trp Ser Ile 35 40 45 Val Arg Arg Phe Asp Lys Pro Gln Thr Tyr Lys His Phe Ile Lys Ser 50 55 60 Cys Ser Val Glu Gln Asn Phe Glu Met Arg Val Gly Cys Thr Arg Asp 65 70 75 80 Val Ile Val Ile Ser Gly Leu Pro Ala Asn Thr Ser Thr Glu Arg Leu 85 90 95 Asp Ile Leu Asp Asp Glu Arg Arg Val Thr Gly Phe Ser Ile Ile Gly 100 105 110 Gly Glu His Arg Leu Thr Asn Tyr Lys Ser Val Thr Thr Val His Arg 115 120 125 Phe Glu Lys Glu Asn Arg Ile Trp Thr Val Val Leu Glu Ser Tyr Val 130 135 140 Val Asp Met Pro Glu Gly Asn Ser Glu Asp Asp Thr Arg Met Phe Ala 145 150 155 160 Asp Thr Val Val Lys Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ala Thr Val Ala Glu 165 170 175 Ala Met Ala Arg Asn Ser Gly Asp Gly Ser Gly Ser Gln Val Thr 180 185 190 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL1, PYR1-like protein 1 (PYL1), ABI1-binding protein 6 (ABIP6), regulatory components of ABA receptor 9 (RCAR12), At5g46790, MZA15.21 <400> 2 Met Ala Asn Ser Glu Ser Ser Ser Ser Pro Val Asn Glu Glu Glu Asn 1 5 10 15 Ser Gln Arg Ile Ser Thr Leu His His Gln Thr Met Pro Ser Asp Leu 20 25 30 Thr Gln Asp Glu Phe Thr Gln Leu Ser Gln Ser Ile Ala Glu Phe His 35 40 45 Thr Tyr Gln Leu Gly Asn Gly Arg Cys Ser Ser Leu Leu Ala Gln Arg 50 55 60 Ile His Ala Pro Pro Glu Thr Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp 65 70 75 80 Arg Pro Gln Ile Tyr Lys His Phe Ile Lys Ser Cys Asn Val Ser Glu 85 90 95 Asp Phe Glu Met Arg Val Gly Cys Thr Arg Asp Val Asn Val Ile Ser 100 105 110 Gly Leu Pro Ala Asn Thr Ser Arg Glu Arg Leu Asp Leu Leu Asp Asp 115 120 125 Asp Arg Arg Val Thr Gly Phe Ser Ile Thr Gly Gly Glu His Arg Leu 130 135 140 Arg Asn Tyr Lys Ser Val Thr Thr Val His Arg Phe Glu Lys Glu Glu 145 150 155 160 Glu Glu Glu Arg Ile Trp Thr Val Val Leu Glu Ser Tyr Val Val Asp 165 170 175 Val Pro Glu Gly Asn Ser Glu Glu Asp Thr Arg Leu Phe Ala Asp Thr 180 185 190 Val Ile Arg Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ala Ser Ile Thr Glu Ala Met 195 200 205 Asn Arg Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ser Gln Val Arg 210 215 220 <210> 3 <211> 190 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL2, PYR1-like protein 2 (PYL2), ABI1-binding protein 6 (ABIP6), regulatory components of ABA receptor 14 (RCAR14), Bet v I allergen family protein, At2g26040, T19L18.15 <400> 3 Met Ser Ser Ser Pro Ala Val Lys Gly Leu Thr Asp Glu Glu Gln Lys 1 5 10 15 Thr Leu Glu Pro Val Ile Lys Thr Tyr His Gln Phe Glu Pro Asp Pro 20 25 30 Thr Thr Cys Thr Ser Leu Ile Thr Gln Arg Ile His Ala Pro Ala Ser 35 40 45 Val Val Trp Pro Leu Ile Arg Arg Phe Asp Asn Pro Glu Arg Tyr Lys 50 55 60 His Phe Val Lys Arg Cys Arg Leu Ile Ser Gly Asp Gly Asp Val Gly 65 70 75 80 Ser Val Arg Glu Val Thr Val Ile Ser Gly Leu Pro Ala Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Glu Arg Leu Glu Phe Val Asp Asp Asp His Arg Val Leu Ser Phe 100 105 110 Arg Val Val Gly Gly Glu His Arg Leu Lys Asn Tyr Lys Ser Val Thr 115 120 125 Ser Val Asn Glu Phe Leu Asn Gln Asp Ser Gly Lys Val Tyr Thr Val 130 135 140 Val Leu Glu Ser Tyr Thr Val Asp Ile Pro Glu Gly Asn Thr Glu Glu 145 150 155 160 Asp Thr Lys Met Phe Val Asp Thr Val Val Lys Leu Asn Leu Gln Lys 165 170 175 Leu Gly Val Ala Ala Thr Ser Ala Pro Met His Asp Asp Glu 180 185 190 <210> 4 <211> 209 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL3, PYR1-like protein 3 (PYL3), regulatory components of ABA receptor 13 (RCAR13), At1g73000, F3N23.20 <400> 4 Met Asn Leu Ala Pro Ile His Asp Pro Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr 1 5 10 15 Thr Ser Ser Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Thr Lys Asp Glu Phe Ser Thr 20 25 30 Leu Asp Ser Ile Ile Arg Thr His His Thr Phe Pro Arg Ser Pro Asn 35 40 45 Thr Cys Thr Ser Leu Ile Ala His Arg Val Asp Ala Pro Ala His Ala 50 55 60 Ile Trp Arg Phe Val Arg Asp Phe Ala Asn Pro Asn Lys Tyr Lys His 65 70 75 80 Phe Ile Lys Ser Cys Thr Ile Arg Val Asn Gly Asn Gly Ile Lys Glu 85 90 95 Ile Lys Val Gly Thr Ile Arg Glu Val Ser Val Val Ser Gly Leu Pro 100 105 110 Ala Ser Thr Ser Val Glu Ile Leu Glu Val Leu Asp Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Ile Leu Ser Phe Arg Val Leu Gly Gly Glu His Arg Leu Asn Asn Tyr 130 135 140 Arg Ser Val Thr Ser Val Asn Glu Phe Val Val Leu Glu Lys Asp Lys 145 150 155 160 Lys Lys Arg Val Tyr Ser Val Val Leu Glu Ser Tyr Ile Val Asp Ile 165 170 175 Pro Gln Gly Asn Thr Glu Glu Asp Thr Arg Met Phe Val Asp Thr Val 180 185 190 Val Lys Ser Asn Leu Gln Asn Leu Ala Val Ile Ser Thr Ala Ser Pro 195 200 205 Thr <210> 5 <211> 207 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL4, PYR1-like protein 4 (PYL4), ABI1-binding protein 2 (ABIP2), regulatory components of ABA receptor 10 (RCAR10), At2g38310, T19C21.20 <400> 5 Met Leu Ala Val His Arg Pro Ser Ser Ala Val Ser Asp Gly Asp Ser 1 5 10 15 Val Gln Ile Pro Met Met Ile Ala Ser Phe Gln Lys Arg Phe Pro Ser 20 25 30 Leu Ser Arg Asp Ser Thr Ala Ala Arg Phe His Thr His Glu Val Gly 35 40 45 Pro Asn Gln Cys Cys Ser Ala Val Ile Gln Glu Ile Ser Ala Pro Ile 50 55 60 Ser Thr Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp Asn Pro Gln Ala Tyr 65 70 75 80 Lys His Phe Leu Lys Ser Cys Ser Val Ile Gly Gly Asp Gly Asp Asn 85 90 95 Val Gly Ser Leu Arg Gln Val His Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ala 100 105 110 Ser Ser Thr Glu Arg Leu Asp Ile Leu Asp Asp Glu Arg His Val Ile 115 120 125 Ser Phe Ser Val Val Gly Gly Asp His Arg Leu Ser Asn Tyr Arg Ser 130 135 140 Val Thr Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Ser Gly Thr Val Val Val Glu 145 150 155 160 Ser Tyr Val Val Asp Val Pro Pro Gly Asn Thr Lys Glu Glu Thr Cys 165 170 175 Asp Phe Val Asp Val Ile Val Arg Cys Asn Leu Gln Ser Leu Ala Lys 180 185 190 Ile Ala Glu Asn Thr Ala Ala Glu Ser Lys Lys Lys Met Ser Leu 195 200 205 <210> 6 <211> 203 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL5, PYR1-like protein 5 (PYL5), ABI1-binding protein 3 (ABIP3), regulatory components of ABA receptor 8 (RCAR8), Bet v I allergen family protein, At5g05440, K18I23.25 <400> 6 Met Arg Ser Pro Val Gln Leu Gln His Gly Ser Asp Ala Thr Asn Gly 1 5 10 15 Phe His Thr Leu Gln Pro His Asp Gln Thr Asp Gly Pro Ile Lys Arg 20 25 30 Val Cys Leu Thr Arg Gly Met His Val Pro Glu His Val Ala Met His 35 40 45 His Thr His Asp Val Gly Pro Asp Gln Cys Cys Ser Ser Val Val Gln 50 55 60 Met Ile His Ala Pro Pro Glu Ser Val Trp Ala Leu Val Arg Arg Phe 65 70 75 80 Asp Asn Pro Lys Val Tyr Lys Asn Phe Ile Arg Gln Cys Arg Ile Val 85 90 95 Gln Gly Asp Gly Leu His Val Gly Asp Leu Arg Glu Val Met Val Val 100 105 110 Ser Gly Leu Pro Ala Val Ser Ser Thr Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp 115 120 125 Glu Glu Arg His Val Ile Ser Phe Ser Val Val Gly Gly Asp His Arg 130 135 140 Leu Lys Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Leu His Ala Ser Asp Asp Glu 145 150 155 160 Gly Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Ile Val Asp Val Pro Pro Gly Asn 165 170 175 Thr Glu Glu Glu Thr Leu Ser Phe Val Asp Thr Ile Val Arg Cys Asn 180 185 190 Leu Gln Ser Leu Ala Arg Ser Thr Asn Arg Gln 195 200 <210> 7 <211> 215 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL6, PYR1-like protein 6 (PYL6), ABI1-binding protein 5 (ABIP5), regulatory components of ABA receptor 9 (RCAR9), Bet v I allergen family protein, At2g40330, T7M7.15 <400> 7 Met Pro Thr Ser Ile Gln Phe Gln Arg Ser Ser Thr Ala Ala Glu Ala 1 5 10 15 Ala Asn Ala Thr Val Arg Asn Tyr Pro His His His Gln Lys Gln Val 20 25 30 Gln Lys Val Ser Leu Thr Arg Gly Met Ala Asp Val Pro Glu His Val 35 40 45 Glu Leu Ser His Thr His Val Val Gly Pro Ser Gln Cys Phe Ser Val 50 55 60 Val Val Gln Asp Val Glu Ala Pro Val Ser Thr Val Trp Ser Ile Leu 65 70 75 80 Ser Arg Phe Glu His Pro Gln Ala Tyr Lys His Phe Val Lys Ser Cys 85 90 95 His Val Val Ile Gly Asp Gly Arg Glu Val Gly Ser Val Arg Glu Val 100 105 110 Arg Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ala Phe Ser Leu Glu Arg Leu Glu 115 120 125 Ile Met Asp Asp Asp Arg His Val Ile Ser Phe Ser Val Val Gly Gly 130 135 140 Asp His Arg Leu Met Asn Tyr Lys Ser Val Thr Thr Val His Glu Ser 145 150 155 160 Glu Glu Asp Ser Asp Gly Lys Lys Arg Thr Arg Val Val Glu Ser Tyr 165 170 175 Val Val Asp Val Pro Ala Gly Asn Asp Lys Glu Glu Thr Cys Ser Phe 180 185 190 Ala Asp Thr Ile Val Arg Cys Asn Leu Gln Ser Leu Ala Lys Leu Ala 195 200 205 Glu Asn Thr Ser Lys Phe Ser 210 215 <210> 8 <211> 211 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL7, PYR1-like protein 7 (PYL7), ABI1-binding protein 7 (ABIP7), regulatory components of ABA receptor 2 (RCAR2), At4g01026 <400> 8 Met Glu Met Ile Gly Gly Asp Asp Thr Asp Thr Glu Met Tyr Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Thr Ala Gln Ser Leu Arg Leu Arg His Leu His His Cys Arg 20 25 30 Glu Asn Gln Cys Thr Ser Val Leu Val Lys Tyr Ile Gln Ala Pro Val 35 40 45 His Leu Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr 50 55 60 Lys Pro Phe Ile Ser Arg Cys Thr Val Asn Gly Asp Pro Glu Ile Gly 65 70 75 80 Cys Leu Arg Glu Val Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser 85 90 95 Thr Glu Arg Leu Glu Gln Leu Asp Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile 100 105 110 Asn Ile Ile Gly Gly Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Ile Leu 115 120 125 Thr Val His Pro Glu Met Ile Asp Gly Arg Ser Gly Thr Met Val Met 130 135 140 Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro Gln Gly Asn Thr Lys Asp Asp Thr 145 150 155 160 Cys Tyr Phe Val Glu Ser Leu Ile Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala 165 170 175 Cys Val Ser Glu Arg Leu Ala Ala Gln Asp Ile Thr Asn Ser Ile Ala 180 185 190 Thr Phe Cys Asn Ala Ser Asn Gly Tyr Arg Glu Lys Asn His Thr Glu 195 200 205 Thr Asn Leu 210 <210> 9 <211> 188 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL8, PYR1-like protein 8 (PYL8), ABI1-binding protein 1 (ABIP1), regulatory components of ABA receptor 3 (RCAR3), At5g53160, MFH8.10 <400> 9 Met Glu Ala Asn Gly Ile Glu Asn Leu Thr Asn Pro Asn Gln Glu Arg 1 5 10 15 Glu Phe Ile Arg Arg His His Lys His Glu Leu Val Asp Asn Gln Cys 20 25 30 Ser Ser Thr Leu Val Lys His Ile Asn Ala Pro Val His Ile Val Trp 35 40 45 Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Cys Val Val Lys Gly Asn Met Glu Ile Gly Thr Val Arg Glu 65 70 75 80 Val Asp Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Arg Ser Thr Glu Arg Leu 85 90 95 Glu Leu Leu Asp Asp Asn Glu His Ile Leu Ser Ile Arg Ile Val Gly 100 105 110 Gly Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Ser Leu His Pro 115 120 125 Glu Thr Ile Glu Gly Arg Ile Gly Thr Leu Val Ile Glu Ser Phe Val 130 135 140 Val Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val 145 150 155 160 Glu Ala Leu Ile Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Asp Ile Ser Glu 165 170 175 Arg Leu Ala Val Gln Asp Thr Thr Glu Ser Arg Val 180 185 <210> 10 <211> 187 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL9, PYR1-like protein 9 (PYL9), ABI1-binding protein 4 (ABIP4), regulatory components of ABA receptor 1 (RCAR1), At1g01360, F6F3.16 <400> 10 Met Met Asp Gly Val Glu Gly Gly Thr Ala Met Tyr Gly Gly Leu Glu 1 5 10 15 Thr Val Gln Tyr Val Arg Thr His His Gln His Leu Cys Arg Glu Asn 20 25 30 Gln Cys Thr Ser Ala Leu Val Lys His Ile Lys Ala Pro Leu His Leu 35 40 45 Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro 50 55 60 Phe Val Ser Arg Cys Thr Val Ile Gly Asp Pro Glu Ile Gly Ser Leu 65 70 75 80 Arg Glu Val Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Leu Leu Asp Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile Lys Ile 100 105 110 Ile Gly Gly Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Ile Leu Thr Val 115 120 125 His Pro Glu Ile Ile Glu Gly Arg Ala Gly Thr Met Val Ile Glu Ser 130 135 140 Phe Val Val Asp Val Pro Gln Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr Cys Tyr 145 150 155 160 Phe Val Glu Ala Leu Ile Arg Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Asp Val 165 170 175 Ser Glu Arg Leu Ala Ser Gln Asp Ile Thr Gln 180 185 <210> 11 <211> 183 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL10, PYR1-like protein 10 (PYL10), ABI1-binding protein 8 (ABIP8), regulatory components of ABA receptor 4 (RCAR4), At4g27920, T13J8.30 <400> 11 Met Asn Gly Asp Glu Thr Lys Lys Val Glu Ser Glu Tyr Ile Lys Lys 1 5 10 15 His His Arg His Glu Leu Val Glu Ser Gln Cys Ser Ser Thr Leu Val 20 25 30 Lys His Ile Lys Ala Pro Leu His Leu Val Trp Ser Ile Val Arg Arg 35 40 45 Phe Asp Glu Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Ile Ser Arg Cys Val Val 50 55 60 Gln Gly Lys Lys Leu Glu Val Gly Ser Val Arg Glu Val Asp Leu Lys 65 70 75 80 Ser Gly Leu Pro Ala Thr Lys Ser Thr Glu Val Leu Glu Ile Leu Asp 85 90 95 Asp Asn Glu His Ile Leu Gly Ile Arg Ile Val Gly Gly Asp His Arg 100 105 110 Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Thr Ile Ser Leu His Ser Glu Thr Ile Asp 115 120 125 Gly Lys Thr Gly Thr Leu Ala Ile Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro 130 135 140 Glu Gly Asn Thr Lys Glu Glu Thr Cys Phe Phe Val Glu Ala Leu Ile 145 150 155 160 Gln Cys Asn Leu Asn Ser Leu Ala Asp Val Thr Glu Arg Leu Gln Ala 165 170 175 Glu Ser Met Glu Lys Lys Ile 180 <210> 12 <211> 161 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL11, PYR1-like protein 11 (PYL11), regulatory components of ABA receptor 5 (RCAR5), Bet v I allergen family protein, At5g45860, K15I22.6 <400> 12 Met Glu Thr Ser Gln Lys Tyr His Thr Cys Gly Ser Thr Leu Val Gln 1 5 10 15 Thr Ile Asp Ala Pro Leu Ser Leu Val 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patens subsp. patens moss, ecotype Gransden 2004, hypothetical protein, predicted protein, locus tag PHYPADRAFT_222359, GenBank Accession No. XP_001778048.1 <400> 36 Met Gln Thr Lys Gly Arg Gln Ala Asp Phe Gln Thr Leu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Gln Asp Leu Ile Cys Arg Phe His Arg His Glu Leu Gln Pro His 20 25 30 Gln Cys Gly Ser Ile Leu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Pro Val Glu Thr 35 40 45 Val Trp Ser Val Ala Arg Ser Phe Asp Lys Pro Gln Val Tyr Lys Arg 50 55 60 Phe Ile Gln Thr Cys Glu Ile Ile Glu Gly Asp Gly Gly Val Gly Ser 65 70 75 80 Ile Arg Glu Val Arg Leu Val Ser Ser Ile Pro Ala Thr Ser Ser Ile 85 90 95 Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp Asp Glu Glu His Ile Ile Ser Phe Arg 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gly His Arg Leu Gln Asn Tyr Trp Ser Val Thr Ser 115 120 125 Leu His Ser His Glu Ile Asp Gly Gln Met Gly Thr Leu Val Leu Glu 130 135 140 Ser Tyr Val Val Asp Ile Pro Glu Gly Asn Thr Arg Glu Glu Thr His 145 150 155 160 Met Phe Val Asp Thr Val Val Arg Cys Asn Leu Lys Ala Leu Ala Gln 165 170 175 Val Ser 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153D02, similar to Casicum annuum CAPIP1, GenBank Accession No. ABB29920.1 <400> 48 Met Asn Ala Asn Gly Phe Cys Gly Val Glu Lys Glu Tyr Ile Arg Lys 1 5 10 15 His His Leu His Glu Pro Lys Glu Asn Gln Cys Ser Ser Phe Leu Val 20 25 30 Lys His Ile Arg Ala Pro Val His Leu Val Trp Ser Leu Val Arg Arg 35 40 45 Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Ile Ser Arg Cys Ile Val 50 55 60 Gln Gly Asp Leu Glu Ile Gly Ser Leu Arg Glu Val Asp Val Lys Ser 65 70 75 80 Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr Glu Arg Leu Glu Leu Leu Asp Asp 85 90 95 Glu Glu His Ile Leu Ser Val Arg Ile Val Gly Gly Asp His Arg Leu 100 105 110 Arg Asn Tyr Ser Ser Val Ile Ser Val His Pro Glu Val Ile Asp Gly 115 120 125 Arg Pro Gly Thr Val Val Leu Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro Glu 130 135 140 Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu Ala Leu Ile Asn 145 150 155 160 Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Asp Ile Ser Glu Arg Val Ala Val Gln 165 170 175 Asp Arg Thr Glu Pro Ile Asp Gln Val 180 185 <210> 49 <211> 190 <212> PRT <213> Medicago truncatula <220> <223> barrel medic unknown protein, clone MTYFP_FQ_FR_FS1G-E-17, GenBank Accession No. ACJ85952.1 <400> 49 Met Asn Asn Gly Cys Glu Gln Gln Gln Tyr Ser Val Ile Glu Thr Gln 1 5 10 15 Tyr Ile Arg Arg His His Lys His Asp Leu Arg Asp Asn Gln Cys Ser 20 25 30 Ser Ala Leu Val Lys His Ile Lys Ala Pro Val His Leu Val Trp Ser 35 40 45 Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Ile Ser 50 55 60 Arg Cys Ile Met Gln Gly Asp Leu Ser Ile Gly Ser Val Arg Glu Val 65 70 75 80 Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr Glu Arg Leu Glu 85 90 95 Gln Leu Asp Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile Arg Ile Val Gly Gly 100 105 110 Asp His Arg Leu Arg Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Val His Pro Gly 115 120 125 Val Ile Asp Gly Arg Pro Gly Thr Met Val Ile Glu Ser Phe Val Val 130 135 140 Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu 145 150 155 160 Ala Leu Ile Arg Tyr Asn Leu Ser Ser Leu Ala Asp Val Ser Glu Arg 165 170 175 Met Ala Val Gln Gly Arg Thr Asp Pro Ile Asn Ile 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150 155 160 Tyr Phe Val Glu Ala Leu Ile Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Asp 165 170 175 Val Ser Glu Gly Leu Ala Val Gln Asp Cys Thr Glu Pro Ile Asp Arg 180 185 190 Ile <210> 109 <211> 188 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma17g34800.1 protein <400> 109 Met Ala Ser Glu Thr His His His Val Gln Gly Leu Thr Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Thr Gln Leu Glu Pro Ile Ile Lys Lys Tyr His Leu Phe Glu Ala 20 25 30 Ser Ser Asn Lys Cys Phe Ser Ile Ile Thr His Arg Ile Glu Ala Pro 35 40 45 Ala Ser Ser Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Phe Asp Asn Pro Gln Lys 50 55 60 Tyr Lys His Phe Ile Lys Gly Cys Asn Met Lys Gly Asp Gly Ser Val 65 70 75 80 Gly Ser Ile Arg Glu Val Thr Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Ser Thr Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp Asp Asp Lys His Val Leu Ser 100 105 110 Phe Arg Val Val Gly Gly Glu His Arg Leu Gln Asn Tyr Arg Ser Val 115 120 125 Thr Ser Val Asn Glu Phe His Lys Glu Gly Lys Val Tyr Thr Ile Val 130 135 140 Leu Glu Ser Tyr Ile Val Asp Ile Pro Glu Gly Asn Thr Glu Glu Asp 145 150 155 160 Thr Lys Met Phe Val Asp Thr Val Val Lys Leu Asn Leu Gln Lys Leu 165 170 175 Gly Val Val Ala Met Ala Ser Ser Met Asn Gly Arg 180 185 <210> 110 <211> 177 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma18g43680.1 protein <400> 110 Met Leu Pro Asn Asn Pro Ser Thr Ile Val Pro Asp Ala Val Ala Arg 1 5 10 15 His His Thr His Val Val Ser Pro Gln Gln Cys Cys Ser Ala Val Val 20 25 30 Gln Glu Ile Ala Ala Pro Val Ser Thr Val Trp Ser Val Val Arg Arg 35 40 45 Phe Asp Asn Pro Gln Ala Tyr Lys His Phe Val Lys Ser Cys His Val 50 55 60 Ile Leu Gly Asp Gly Asp Val Gly Thr Leu Arg Glu Val His Val Ile 65 70 75 80 Ser Gly Leu Pro Ala Ala Val Ser Thr Glu Arg Leu Asp Val Leu Asp 85 90 95 Asp Glu Arg His Val Ile Gly Phe Ser Met Val Gly Gly Asp His Arg 100 105 110 Leu Phe Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Leu His Pro Arg Ser Ala Ala 115 120 125 Gly Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Val Val Asp Val Pro Pro Gly Asn 130 135 140 Thr Thr Glu Asp Thr Arg Val Phe Val Asp Thr Ile Leu Arg Cys Asn 145 150 155 160 Leu Gln Ser Leu Ala Lys Phe Ala Glu Asn Leu Thr Lys Leu His Gln 165 170 175 Arg <210> 111 <211> 185 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma07g06270.2 protein <400> 111 Met Asn Gly Gly Glu Ser Tyr Gly Ala Ile Glu Thr Gln Tyr Ile Arg 1 5 10 15 Arg His His Lys His Glu Pro Arg Glu Asn Gln Cys Thr Ser Ala Leu 20 25 30 Val Lys His Ile Arg Ala Pro Val His Leu Val Trp Ser Leu Val Arg 35 40 45 Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Val Ser Arg Cys Ile 50 55 60 Met Gln Gly Asp Leu Gly Ile Gly Ser Val Arg Glu Val Asn Val Lys 65 70 75 80 Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr Glu Arg Leu Glu Gln Leu Asp 85 90 95 Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile Arg Ile Val Gly Gly Asp His Arg 100 105 110 Leu Arg Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Val His Pro Glu Val Ile Asp 115 120 125 Gly Arg Pro Gly Thr Met Val Ile Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro 130 135 140 Asp Gly Asn Thr Arg Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu Ala Leu Ile 145 150 155 160 Arg Cys Asn Leu Ser Ser Leu Ala Asp Val Ser Glu Arg Met Ala Val 165 170 175 Gln Gly Arg Thr Asn Pro Ile Asn His 180 185 <210> 112 <211> 191 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma16g02910.1 protein <400> 112 Met Gly Ile Thr Ile Gly Ile Gln Cys Leu Glu Ile Glu Glu Ile Ser 1 5 10 15 Ile Cys Asp Gly Met Phe Cys Tyr Leu Val Asp Phe Val Asp Val Lys 20 25 30 Glu Lys Met Asn Tyr Cys Leu Met Trp Phe Gly Tyr Phe Pro Ser Gln 35 40 45 Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro 50 55 60 Phe Val Ser Arg Cys Ile Met Gln Gly Asp Leu Gly Ile Gly Ser Val 65 70 75 80 Arg Glu Val Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Gln Leu Asp Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile Arg Ile 100 105 110 Val Gly Gly Asp His Arg Leu Arg Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Val 115 120 125 His Pro Glu Val Ile Asp Gly Arg Pro Ser Thr Met Val Ile Glu Ser 130 135 140 Phe Val Val Asp Val Pro Asp Gly Asn Thr Arg Asp Glu Thr Cys Tyr 145 150 155 160 Phe Val Glu Ala Leu Ile Arg Cys Asn Leu Ser Ser Leu Ala Asp Val 165 170 175 Ser Glu Arg Met Ala Val Gln Gly Arg Thr Asp Pro Ile Asn His 180 185 190 <210> 113 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PYR/PYL receptor protein <400> 113 Met Asn Gly Gly Glu Ser Tyr Gly Ala Ile Glu Thr Gln Tyr Ile Arg 1 5 10 15 Arg His His Lys His Glu Pro Arg Glu Asn Gln Cys Thr Ser Ala Leu 20 25 30 Val Lys His Ile Arg Ala Pro Val His Leu Val Trp Ser Leu Val Arg 35 40 45 Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Val Ser Arg Cys Ile 50 55 60 Met Gln Gly Asp Leu Gly Ile Gly Ser Val Arg Glu Val Asn Val Lys 65 70 75 80 Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr Glu Arg Leu Glu Gln Leu Asp 85 90 95 Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile Arg Ile Val Gly Gly Asp His Arg 100 105 110 Leu Arg Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Val His Pro Glu Val Ile Asp 115 120 125 Gly Arg Pro Ser Thr Met Val Ile Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro 130 135 140 Asp Gly Asn Thr Arg Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu Ala Leu Ile 145 150 155 160 Arg Cys Asn Leu Ser Ser Leu Ala Asp Val Ser Glu Arg Met Ala Val 165 170 175 Gln Gly Arg Thr Asp Pro Ile Asn His 180 185 <210> 114 <211> 204 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb10g022200 protein <400> 114 Met Glu Thr His Val Glu Arg Ala Leu Arg Ala Thr Leu Thr Glu Ala 1 5 10 15 Glu Val Arg Ala Leu Glu Pro Ala Val Arg Glu His His Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Gly Arg Val Ala Ala Gly Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Thr Cys 35 40 45 Thr Ser Leu Val Ala Gln Arg Val Ser Ala Pro Val Arg Ala Val Trp 50 55 60 Pro Ile Val Arg Ser Phe Gly Asn Pro Gln Arg Tyr Lys His Phe Val 65 70 75 80 Arg Thr Cys Ala Leu Ala Ala Gly Asp Gly Ala Ser Val Gly Ser Val 85 90 95 Arg Glu Val Thr Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ser Ser Ser Thr Glu 100 105 110 Arg Leu Glu Val Leu Asp Asp Asp Arg His Ile Leu Ser Phe Arg Val 115 120 125 Val Gly Gly Asp His Arg Leu Arg Asn Tyr Arg Ser Val Thr Ser Val 130 135 140 Thr Glu Phe Gln Pro Gly Pro Tyr Cys Val Val Val Glu Ser Tyr Ala 145 150 155 160 Val Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Ala Glu Asp Thr Arg Met Phe Thr 165 170 175 Asp Thr Val Val Arg Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ala Ala Val Ala Glu 180 185 190 Glu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asn Arg Arg 195 200 <210> 115 <211> 204 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb04g008040 protein <400> 115 Met Glu Pro His Met Glu Thr Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Ser Glu 1 5 10 15 Leu Glu Gln Arg Glu Leu Glu Pro Val Val Arg Ala His His Thr Phe 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Pro Gly Thr Thr Cys Thr Ser Leu Val Thr Gln Arg 35 40 45 Val Asp Ala Pro Leu Ser Ala Val Trp Pro Ile Val Arg Gly Phe Ala 50 55 60 Ala Pro Gln Arg Tyr Lys His Phe Ile Lys Ser Cys Asp Leu Arg Ser 65 70 75 80 Gly Asp Gly Ala Thr Val Gly Ser Val Arg Glu Val Thr Val Val Ser 85 90 95 Gly Leu Pro Ala Ser Thr Ser Thr Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp Asp 100 105 110 Asp Arg His Ile Leu Ser Phe Arg Val Val Gly Gly Asp His Arg Leu 115 120 125 Arg Asn Tyr Arg Ser Val Thr Ser Val Thr Glu Phe His His His His 130 135 140 Gln Ala Ala Ala Gly Arg Pro Tyr Cys Val Val Val Glu Ser Tyr Val 145 150 155 160 Val Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Glu Glu Asp Thr Arg Met Phe Thr 165 170 175 Asp Thr Val Val Lys Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ala Ala Ile Ala Thr 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ser Asn Ser Ser Thr 195 200 <210> 116 <211> 258 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb01g028330 protein <400> 116 Met Val Glu Ser Pro Asn Pro Asn Ser Pro Ser Arg Pro Leu Cys Ile 1 5 10 15 Lys Tyr Thr Arg Ala Pro Ala Arg His Phe Ser Pro Pro Leu Pro Phe 20 25 30 Ser Ser Leu Ile Ile Ser Ala Asn Pro Ile Glu Pro Lys Ala Met Asp 35 40 45 Lys Gln Gly Ala Gly Gly Asp Val Glu Val Pro Ala Gly Leu Gly Leu 50 55 60 Thr Ala Ala Glu Tyr Glu Gln Leu Arg Ser Thr Val Asp Ala His His 65 70 75 80 Arg Tyr Ala Val Gly Glu Gly Gln Cys Ser Ser Leu Leu Ala Gln Arg 85 90 95 Ile Gln Ala Pro Pro Ala Ala Val Trp Ala Ile Val Arg Arg Phe Asp 100 105 110 Cys Pro Gln Val Tyr Lys His Phe Ile Arg Ser Cys Ala Leu Arg Pro 115 120 125 Asp Pro Glu Ala Gly Asp Ala Leu Arg Pro Gly Arg Leu Arg Glu Val 130 135 140 Ser Val Ile Ser Gly Leu Pro Ala Ser Thr Ser Thr Glu Arg Leu Asp 145 150 155 160 Leu Leu Asp Asp Ala Ala Arg Val Phe Gly Phe Ser Ile Thr Gly Gly 165 170 175 Glu His Arg Leu Arg Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Val Ser Glu Leu 180 185 190 Ala Asp Pro Gly Ile Cys Thr Val Val Leu Glu Ser Tyr Val Val Asp 195 200 205 Val Pro Asp Gly Asn Thr Glu Asp Asp Thr Arg Leu Phe Ala Asp Thr 210 215 220 Val Ile Arg Leu Asn Leu Gln Lys Leu Lys Ser Val Ala Glu Ala Asn 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala Ala Ser Phe Val Ser Val Val Pro Pro Pro Glu Pro 245 250 255 Glu Glu <210> 117 <211> 222 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb01g038150 protein <400> 117 Met Pro Cys Leu Gln Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Met Pro His Gln 1 5 10 15 His His Gly Arg Val Leu Ala Gly Val Gly Cys Ala Ala Glu Val Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Val Ala Ala Thr Ser Pro Ala Ala Gly Met Arg Cys Gly 35 40 45 Ala His Asp Gly Glu Val Pro Ala Glu Ala Ala Arg His His Glu His 50 55 60 Ala Ala Pro Gly Pro Gly Arg Cys Cys Ser Ala Val Val Gln His Val 65 70 75 80 Ala Ala Pro Ala Ser Ala Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp Gln 85 90 95 Pro Gln Ala Tyr Lys Arg Phe Val Arg Ser Cys Ala Leu Leu Ala Gly 100 105 110 Asp Gly Gly Val Gly Thr Leu Arg Glu Val Arg Val Val Ser Gly Leu 115 120 125 Pro Ala Ala Ser Ser Arg Glu Arg Leu Glu Val Leu Asp Asp Glu Ser 130 135 140 His Val Leu Ser Phe Arg Val Val Gly Gly Glu His Arg Leu Gln Asn 145 150 155 160 Tyr Leu Ser Val Thr Thr Val His Pro Ser Pro Ala Ala Pro Asp Ala 165 170 175 Ala Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Val Val Asp Val Pro Pro Gly Asn 180 185 190 Thr Pro Glu Asp Thr Arg Val Phe Val Asp Thr Ile Val Lys Cys Asn 195 200 205 Leu Gln Ser Leu Ala Thr Thr Ala Glu Lys Leu Ala Ala Val 210 215 220 <210> 118 <211> 211 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb04g009280 protein <400> 118 Met Val Glu Met Asp Gly Gly Val Gly Val Val Gly Gly Gly Gln Gln 1 5 10 15 Thr Pro Ala Pro Arg Arg Trp Arg Leu Ala Asp Glu Leu Arg Cys Asp 20 25 30 Leu Arg Ala Met Glu Thr Asp Tyr Val Arg Arg Phe His Arg His Glu 35 40 45 Pro Arg Asp His Gln Cys Ser Ser Ala Val Ala Lys His Ile Lys Ala 50 55 60 Pro Val His Leu Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln 65 70 75 80 Leu Phe Lys Pro Phe Val Ser Arg Cys Glu Met Lys Gly Asn Ile Glu 85 90 95 Ile Gly Ser Val Arg Glu Val Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr 100 105 110 Arg Ser Thr Glu Arg Leu Glu Leu Leu Asp Asp Asn Glu His Ile Leu 115 120 125 Ser Val Lys Phe Val Gly Gly Asp His Arg Leu Gln Asn Tyr Ser Ser 130 135 140 Ile Leu Thr Val His Pro Glu Val Ile Asp Gly Arg Pro Gly Thr Leu 145 150 155 160 Val Ile Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro Asp Gly Asn Thr Lys Asp 165 170 175 Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu Ala Leu Leu Lys Cys Asn Leu Lys Ser 180 185 190 Leu Ala Glu Val Ser Glu Arg Gln Val Ile Lys Asp Gln Thr Glu Pro 195 200 205 Leu Asp Arg 210 <210> 119 <211> 216 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb09g023180 protein <400> 119 Met Pro Tyr Thr Ala Pro Arg Pro Ser Pro Gln Gln His Ser Arg Val 1 5 10 15 Thr Gly Gly Gly Ala Lys Ala Ala Ile Val Ala Ala Ser His Gly Ala 20 25 30 Ser Cys Ala Ala Val Pro Ala Glu Val Ala Arg His His Glu His Ala 35 40 45 Ala Arg Ala Gly Gln Cys Cys Ser Ala Val Val Gln Ala Ile Ala Ala 50 55 60 Pro Val Gly Ala Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp Arg Pro Gln 65 70 75 80 Ala Tyr Lys His Phe Ile Arg Ser Cys Arg Leu Val Asp Asp Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr Val Ala Val Gly Ser Val 100 105 110 Arg Glu Val Arg Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Thr Ser Ser Arg Glu 115 120 125 Arg Leu Glu Ile Leu Asp Asp Glu Arg Arg Val Leu Ser Phe Arg Val 130 135 140 Val Gly Gly Glu His Arg Leu Ala Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Val 145 150 155 160 His Glu Ala Glu Ala Gly Ala Gly Gly Thr Val Val Val Glu Ser Tyr 165 170 175 Val Val Asp Val Pro Pro Gly Asn Thr Ala Asp Glu Thr Arg Val Phe 180 185 190 Val Asp Thr Ile Val Arg Cys Asn Leu Gln Ser Leu Ala Arg Thr Ala 195 200 205 Glu Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala 210 215

Claims

식 I의 화합물, 또는 이의 염 또는 이성질체:

상기 식에서,
R¹은 C_2-6　알케닐 및 C_2-6　알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R²는 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이들 각각은 선택적으로 1-4개의 R^2a 기로 치환되며,
각각의 R^2a는 독립적으로 H, 할로겐, C_1-6　알킬, C_1-6　알콕시, C_1-6　할로알킬, C_1-6　할로알콕시, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐, -OH, C_1-6　알킬하이드록시, -CN, -NO₂, -C(O)R^2b, -C(O)OR^2b, -OC(O)R^2b, -C(O)NR^2bR^2c, -NR^2bC(O)R^2c, -SO₂R^2b, -SO₂OR^2b, -SO₂NR^2bR^2c 및 -NR^2bSO₂R^2c로 이루어진 군으로부터 선택되고,
각각의 R^2b 및 R^2c는 독립적으로 H 및 C_1-6　알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
각각의 R³, R⁴ 및 R⁵는 독립적으로 H 및 C_1-6　알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R³또는 R⁴ 중 적어도 하나는 메틸이고,
L은 결합 및 C_1-6　알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고,
아랫 첨자 m은 0 내지 4의 정수이고,
아랫 첨자 n은 0 내지 3의 정수이고, 및
m + n은 1 이상임.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 식:
을 가지는, 화합물.
제2항에 있어서,
상기 화합물이 식:
을 가지는, 화합물.
제2항에 있어서,
R²가 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들 각각이 선택적으로 1-4개의 R^2a 기로 치환되는, 화합물.
제4항에 있어서,
각각의 R^2a가 독립적으로 H, 할로겐 및 C_1-6　알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
제4항에 있어서,
R²가 페닐, 나프틸, 티오펜, 푸란, 피롤 및 피리딜로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
제4항에 있어서,
R²가 페닐 및 티오펜으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이들 각각이 선택적으로 1개의 R^2a 기로 치환되며;
각각의 R^2a가 독립적으로 H, F, Cl, 메틸 및 에틸로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L이 결합 및 메틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
제7항에 있어서,
상기 화합물이 식:
을 가지는, 화합물.
제7항에 있어서,
상기 화합물이 식:
을 가지는, 화합물.
제1항에 있어서, L이 CH₂인, 화합물.
제1항에 있어서, R⁵가 H인, 화합물.
제1항에 있어서, R³가 CH₃인, 화합물.
제1항에 있어서, R³가 CH₃이고, R⁴가 H인, 화합물.
제1항에 있어서, R³가 H이고, R⁴가 CH₃인, 화합물.
제1항에 있어서, m이 2이고, 2개의 R³ 기 모두 CH₃인, 화합물.
명세서 중 표 1의 열(row) 별로 열거된 치환기들의 조합을 가진, 구조 1-59 중 하나로 표시되는 화합물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한항에 따른 화합물을 포함하는 농업용 제형 (agricultural formulation).
제17항에 있어서, 살진균제 (fungicide), 제초제 (herbicide), 농약 (pesticide), 살선충제 (nematicide), 살충제 (insecticide), 식물 활성제 (plant activator), 상승제 (synergist), 제초제 약해경감제 (herbicide safener), 식물 생장 조절제 (plant growth regulator), 곤충 기피제 (insect repellant), 살비제 (acaricide), 연체동물 살충제 (molluscicide) 또는 비료 (fertilizer) 중 하나 이상을 더 포함하는, 농업용 제형.
제17항에 있어서, 계면활성제를 더 포함하는, 농업용 제형.
제17항에 있어서, 담체를 더 포함하는, 농업용 제형.
식물에서 비-생물적 스트레스 내성 (abiotic stress tolerance)을 높이는 방법으로서,
상기 식물에, 제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 제형을, 상기 제형과 접촉되지 않은 식물과 비교하여 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이기에 충분한 양으로 접촉시키는 단계를 포함하는,
식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이는 방법.
제21항에 있어서, 상기 식물이 외떡잎 식물인, 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이는 방법.
제21항에 있어서, 상기 식물이 쌍떡잎 식물인, 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이는 방법.
제21항에 있어서, 상기 비-생물적 스트레스 내성이 내건성 (drought tolerance)인, 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이는 방법.
제21항에 있어서, 상기 접촉 단계가 상기 제형을 상기 식물에 항공기 또는 관개 (irrigation)에 의해 전달하는 것을 포함하는, 식물에서 비-생물적 스트레스 내성을 높이는 방법.
식물에서 종자의 발아를 저해하는 방법으로서,
종자에, 제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 제형을, 발아를 저해하기에 충분한 양으로 접촉시키는 단계를 포함하는,
식물에서 종자의 발아를 저해하는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 제형과 접촉된 식물.
제27항에 있어서, 상기 식물이 종자인, 식물.
PYR/PYL 단백질을 활성화하는 방법으로서,
상기 PYR/PYL 단백질을 제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 제형과 접촉시키는 단계를 포함하는,
PYR/PYL 단백질을 활성화하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 PYR/PYL 단백질이 세포에 의해 발현되는, PYR/PYL 단백질을 활성화하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 세포가 식물 세포인, PYR/PYL 단백질을 활성화하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 PYR/PYL 단백질이 내인성 단백질인, PYR/PYL 단백질을 활성화하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 PYR/PYL 단백질이 이종의 단백질인, PYR/PYL 단백질을 활성화하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 세포가 2형 (type 2) 단백질 포스파타제 (PP2C)를 더 발현하는, PYR/PYL 단백질을 활성화하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 2형 단백질 포스파타제가 HAB1 (ABI1의 상동체), ABI1 (앱시스산 둔감형 1) 또는 ABI2 (앱시스산 둔감형 2)인, PYR/PYL 단백질을 활성화하는 방법.