CN116355914A - 提高作物抗旱性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物育种领域，具体涉及一种提高作物抗旱性的方法。本发明靶向作物CYP707A内含子区域中的至少两个CTCTGYTY基序，能够实现提高作物抗旱性且不减产的技术效果。
Description
技术领域
本发明属于植物育种领域，具体涉及一种提高作物抗旱性的方法。
背景技术
在当今世界，水资源短期是全球可持续发展面临的重要挑战，在世界总耕地面积中，干旱及半干旱地区占了43.9％(张木清，陈如凯.作物抗旱分子生理与遗传改良[M].2005，北京：科学出版社.)。因此培育抗旱作物具有很大的应用前景。
虽然抗旱是一个由多基因控制的复杂性状，然而随着生物技术的发展，基因工程手段也逐渐开始成为培育抗旱作物的重要手段。利用cspB基因培育的耐旱转基因玉米MON87460(商品名DroughtGardTM)从2013年上市以来，在美国的年种植面积已经增加到上百万公顷。利用HaHB4基因培育的转基因抗旱小麦也已经获得了美国、阿根廷、巴西、尼日利亚、澳大利亚等各大洲主要农业国的商业化批准。这些都展现出抗旱性状生物育种的强劲前景。
不过，抗旱性状培育的一个关键难点是如何在提高植物抗旱能力的同时不造成产量损失，达到干旱条件下增产、非干旱条件下不减产的技术效果。杜邦先锋公司曾尝试利用CRISPR-Cas9技术将玉米内源组成型启动子GOS2定点插入到玉米ARGOS8的5’-UTR或替换内源的ARGOS8基因的启动子，以通过控制ARGOS8基因表达实现抗旱不减产的技术效果(ShiJ,Gao H,Wang H,et al.ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maizegrain yield under field drought stress conditions[J].Plant Biotechnol J,2017,15(2):207-216.)。
因此，为了拓展抗旱性状的应用前景，有必要开发更多能够实现上述技术效果的技术方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在提高作物抗旱性且不减产的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供CYP707A基因在提高作物抗旱性且不减产的应用，其特征在于：上述基因选自说明书表2中列出的任意一个。
在一些实施方案中，上述作物选自小麦、玉米、水稻、高粱、大豆、油菜任意一个。
本发明还提供一种提高作物抗旱性且不减产的方法，其特征在于：使用外源蛋白靶向上述CYP707A基因内含子中的至少两个CTCTGYTY(Y＝T/C)基序，选择抗旱性提高且不减产的植株。
在一些实施方案中，上述使用外源蛋白靶向结合基序的方法为使用无切割活性的核酸编程酶靶向结合人工选定的靶标。上述核酸编程酶包括ZFN、TALEN、Cas9、Cas12、TnpB等任何能够靶向结合目标核酸区域的编程酶。
在一些实施方案中，上述的无切割活性的核酸编程酶为包含D10A和H840A突变的Cas9蛋白或Cas9蛋白变体，例如SpCas9、SpCas9NG、SaCas9、ScCas9、SqCas9、XCas9等。
上述靶标选自说明书表2中列出的任意一组序列。
在一些实施方案中，上述作物选自小麦、玉米、水稻、高粱、大豆、油菜任意一个。
本发明还提供一种试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)能够识别上述基因内含子中的至少两个CTCTGYTY(Y＝T/C)基序的RNA分子；
(2)编码(1)所述RNA和蛋白的DNA分子；
(3)表达(1)所述RNA和蛋白的载体。
在一些实施方案中，上述RNA分子选自能够识别说明书表2中列出的任意一组靶标序列的RNA分子；上述RNA分子可以是包含gRNA、crRNAs和tracrRNA结构的sgRNA分子，也可以是gRNA、crRNAs和tracrRNA单独形成的复合体，或包括gRNA、crRNAs的复合体。
上述试剂盒在作物体内表达出的RNA分子与包括Cas9、Cas12、TnpB等任何能够在上述RNA分子的指导下靶向结合目标核酸区域的编程酶所形成的组合物能够提高目标作物的抗旱性且不减产。
本发明还提供上述的方法、试剂盒在提高作物抗旱性且不减产的应用。
在一些实施方案中，上述作物选自小麦、玉米、水稻、高粱、大豆、油菜任意一个。
本发明的优点及有益效果如下：本发明使用无切割活性的编程酶靶向结合CYP707A内含子区域中的REF6蛋白结合基序，能够实现提高作物抗旱性且不减产的技术效果。这不仅为培育具有商业化价值的抗旱作物产品提供了新的有效技术方案。
附图说明
图1敲除TaCYP707A5和TaCYP707A6基因分析基因功能。左：TaCYP707A5和TaCYP707A6的靶位点以及tacyp707a5、tacyp707a-6a和tacyp707a-6b的编辑后基因型。右：野生型(Fielder)、tacyp707a5，tacyp707a-6a和tacyp707a-6b两周龄幼苗叶片中的ABA含量。数值是平均值±标准差(n＝3)。星号表示由Student’s t-test确定的显著性差异(NS＝无显著性，**P<0.01)。
图2A：qRT-PCR方法检测干旱处理7天后2周龄幼苗根系中TaCYP707A-5A、TaCYP707A-5B、TaCYP707A-5D、TaCYP707A-6A、TaCYP707A-6B和TaCYP707A-6D的表达。数值是平均值±标准差(n＝3)。B：tacyp707a-6a、tacyp707a-6b在干旱胁迫后的存活率表现。C：tacyp707a5在干旱胁迫后的存活率表现。D：tacyp707a-6a、tacyp707a-6b在干旱胁迫后的存活率数据。E：tacyp707a5在干旱胁迫后的存活率数据。数值以平均值±标准差表示(3个生物学重复，每个重复有24株)。F：干旱和非干旱胁迫下，tacyp707a-6b的成熟期表现。比例尺＝10cm，1个月大的植株在不浇水的条件下生长10天，然后在浇水条件下生长。G：干旱胁迫对tacyp707a-6b穗粒数的影响。H：干旱胁迫对tacyp707a-6b结实率的影响。数值以平均值±标准差表示。字母a、b和c表示组间差异显著(*P<0.05，Student’s t-test检验)。
图3野生型和jmj突变体中AtCYP707A1/A3上的REF6结合和H3K27me3富集图。
图4CTCTGYTY基序的物种分布和结合验证。左：不同植物物种CYP707As基因中保守的CTCTGYTY基序位置示意图。右：EMSA验证CYP707As内含子中CTCTGYTY基序的DNA片段与REF6锌指结构域的结合。第1-6泳道分别代表TaCYP707A-6A、TaCYP707A-6B、TaCYP707A-6D、Os02g47470、AtCYP707A1和Sb3004G268700中含有CCTTGYTY基序的DNA。
图5dCas9NG靶向小麦CCTTGYTY基序的载体图。
图6CSS21在干旱胁迫和非干旱胁迫条件下的表现。比例尺＝10厘米。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。
除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm(热力学熔点)可以近似自Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。
除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。如本文所使用的术语“约”，当指代可测量的值例如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着涵盖在一些实施例中与规定量相比±20％的变化、在一些实施例中与规定量相比±10％的变化、在一些实施例中与规定量相比±5％的变化、在一些实施例中与规定量相比±1％的变化、在一些实施例中与规定量相比±0.5％的变化、以及在一些实施例中与规定量相比±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所披露的方法和/或使用所披露的组合物、核酸、多肽等。因此，除非相反地指出，在本说明书和所附权利要求书中所列出的数值参数是可以取决于试图通过本申请披露的主题获得的期望特性而变化的近似值。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
实施例1小麦TaCYP707A基因的功能分析
细胞色素P450蛋白CYP707A编码一种ABA 8’-羟基酶，在拟南芥包括4个成员，与种子萌发和ABA代谢有关(Kushiro T,Okamoto M,Nakabayashi K,et al.The Arabidopsiscytochrome P450 CYP707A encodes ABA 8'-hydroxylases:key enzymes in ABAcatabolism[J].EMBO J.2004,23(7):1647-56.)。使用化合物(-)-Abz-E2B抑制CYP707A能够提高植物的抗旱性，但是产量损失也很严重。使用(-)-Abz-E3M能够改善上述问题，但在提高抗旱性的同时还要保证产量的效果上依然难以达到农业生产的要求(Takeuchi J,Okamoto M,Mega R,et al.Abscinazole-E3M,a practical inhibitor of abscisic acid8'-hydroxylase for improving drought tolerance[J].Sci Rep.,2016,6:37060)，且化合物的施用也会造成农业生产成本的增加。本发明打算开发新的技术方案，尤其是能够在小麦等作物中应用的技术方案。
本实施例首先通过进化树分析找到了小麦中的CYP707A家族成员。在小麦基因组中发现了AtCYP707A1/A3的6个同源基因，分别被命名为TaCYP707A-5A、TaCYP707A-5B、TaCYP707A-5D、TaCYP707A-6A、TaCYP707A-6B和TaCYP707A-6D。这6个基因中究竟哪一个基因会影响小麦中的ABA代谢尚不知道。本实施例在小麦品种Fielder中使用CRISPR/Cas技术敲除TaCPY707A基因，成功获得了TaCYP707A-5A/5B/5D的三重突变体tacyp707a-5a/5b/5d和TaCYP707A6的单基因突变体tacyp707a-6a和tacyp707a-6b(图1左)，但未能获得TaCYP707A6的三重突变体，这可能是由于TaCYP707A6完全丧失功能会引起植株致死。通过分析这些突变体的ABA含量发现，与野生型受体相比，tacpy707a-6a和tacpy707a-6b的ABA含量显着增加，而tacyp707a-5a/5b/5d突变体中ABA含量没有显著变化(图1右)。这些结果表明TaCPY707A6基因参与了ABA分解代谢，而TaCYP707A5基因没有参与。
进一步通过干旱处理确认CYP707A5和CYP707A6基因的作用。首先检测了干旱胁迫后基因的表达量，结果显示，干旱处理后TaCYP707A-6A/6B/6D和TaCYPY707A-5D的表达降低，而TaCYP707A-5A的表达增加，未检测到TaCYP707A-5B的表达(图2A)。在通过分析突变体植株表现型，发现tacyp707a-6a和tacpy707a-6b的存活率显著高于野生型对照(图2B、D)，但tacyp707a-5a/5b/5d和野生型之间没有显著差异(图2C、E)。这些结果再次证明了在小麦干旱响应中起关键作用的是TaCYP707A6基因，而不是TaCYP707A5基因。
进一步统计植株产量时发现，在干旱的条件下，突变体的籽粒数量和结实率均比野生型更低(图2F、G、H)，产量下降。这可能是由于CYP707A活性下降，导致ABA水平升高，从而对植物发育造成了不利影响。因此需要更加精细的调控CYP707A活性，以规避抗旱性的提高所造成的产量损失。
实施例2TaCYP707A基因中的结合基序鉴定
公开资料显示，CYP707A基因会受到组蛋白修饰因子REF6的激活，因此，阻止REF6对CYP707A的激活作用有望实现对CYP707A的活性微调，从而实现增强抗旱性且不影响产量的技术效果。
发明人分析了拟南芥的野生型和jmj突变体中REF6的ChIP-seq数据和H3K27me3水平，确认了REF6与AtCYP707A1/3的结合，并且发现结合位点位于CTCTGYTY(Y＝T/C)基序中(图3)。在CYP707A基因的内含子中存在三个CTCTGYTY基序的串联序列，并且该串联重复序列在物种中是保守的(图4左)。进一步利用EMSA(电泳迁移率偏移分析)验证REF6蛋白与TaCYP707A-6A/6B/6D以及水稻和高粱CYP707A同源基因内含子的结合能力，结果证实REF6蛋白的锌指结构域会与所有测试的CYP707A的DNA探针结合(图4右)。EMSA实验测试过的结合序列如下：
TaCYP707A-6A：
ATTCCCCGCCACTTGCTCTGCTTTCCTCTGCTCTGCTCTAGTGCTA；
TaCYP707A-6B：
ATCCATTCCCACTTGCTCTGCTTCCCTCTGCTCTGCTCTACTGCTA；
TaCYP707A-6D：
ATCCATTCCCGCTTGCTCTGCTTTCCTCTGCTCTGCTCTACTGCTA；
Os02g47470：
ATCCCACTCTGCTTTGCTCTGCTCTACTCTGCTTTGCTGA；
AtCYP707A1：
AGCTCCTCTGTTTTGTTTTTCCTCTGCTAGAAACAGAGCTA；
Sb3004G268700：
ATATATGCTCTGCTCTGCCGCTCTGTTCCTTCCCTTCCA。
实施例3编辑TaCYP707A-6B基因实现抗旱不减产效果
本发明进一步尝试通过阻止REF6对TaCYP707A-6基因中的CTCTGYTY基序结合，抑制REF6对TaCYP707A-6基因的激活作用，从而实现增强抗旱性且不影响产量的技术效果。
发明人首先利用基因编辑工具删除TaCYP707A-6中含有结合位点的内含子区域，以阻断REF6对TaCYP707A-6基因的结合，结果发现这种技术方案会影响基因的正常剪接。发明人进一步通过使用没有切割活性的核酸编程酶蛋白(例如包含D10A和H840A突变的Cas9蛋白)来靶向结合CTCTGYTY基序，从而阻断REF6的结合。序列分析结果显示，在CTCTGYTY基序两侧没有合适的可用于Cas9识别的NGG PAM基序，因此发明人拟利用失活的dCas9NG(蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。N端包含15个氨基酸的核定位信号。可在前方或后方进一步增加FLAG、HA等蛋白标签，以方便检测，并不影响蛋白功能)，来靶向TaCYP707A基因中的串联CTCTGYTY序列。靶标序列选择CTTGCTCTGCTTCCCTCTGC和CTGCTCTGCTCACCTTGGTA，其中第一个靶标来自TaCYP707A-6B，第二个靶标来自TaCYP707A-6A/D。载体中的表达盒包括识别靶标的gRNA序列以及人工合成的表达crRNAs和tracrRNA scaffold分子的DNA核酸序列：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC TTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC。含有dCas9NG表达盒和sgRNA表达盒的表达载体图见图5。
编辑载体转化小麦受体后，获得了两个独立的编辑株系，分别命名为CSS21和CSS29。对编辑材料中TaCYP707A-6基因的表达分析结果显示，仅TaCYP707A-6B的表达在CSS21和CSS29中下调，而TaCYP707A-6A和TaCYP707A-6D的表达没有显著变化。这些表明只针对TaCYP707A-6B基因的基序作为靶标即可产生干涉效果。
因此，只需要使用将GCAGAGGGAAGCAGAGCAAG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTT GAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC，表达成sgRNA(gRNA+scaffold)的表达盒或表达载体，再加上dCas9NG或表达成dCas9NG的表达盒或表达载体，即可实现下调TaCYP707A-6B的技术效果。
进一步分析显示，CSS21和CSS29的TaCYP707A-6B内含子中H3K27me3水平比野生型显著增加，ABA含量也显著高于野生型。干旱处理后，CSS21和CSS29的存活率均显著高于野生型。产量分析结果显示，水分充足条件下，编辑株系与野生型对照相比，产量差异不显著；而在干旱条件下，编辑株系的粒数、穗长和结实率性状均显著大于野生型对照(CSS21表现见图6，具体性状数据见表1)。TaCYP707A-6B基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
表1CSS21性状表现
数据来自3个生物学重复，每个重复24株，以平均值±标准差表示。字母a、b和c表示数值之间的显著差异(P<0.05，Student’s t-test检验)。
实施例4编辑其他物种中的CYP707A基因
测试上述技术方案在其他植物物种中的应用效果，选择油菜、大豆、高粱、玉米、水稻、棉花等主要作物的CYP707A基因，设计靶标(如表2)，使用编程酶靶向结合CYP707A基因内含子中的至少两个CTCTGYTY(Y＝T/C)基序，再转化了表达Cas蛋白和结合到靶标的gRNA载体后，转化植株的抗旱性均普遍提高，且在干旱和非干旱条件下与对照相比没有减产，表明该技术方案可用于各种植物物种中。
表2各物种CYP707基因和靶标序列
1：来自GeneBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.CYP707A基因在提高作物抗旱性且不减产的应用，其特征在于：所述基因选自说明书表2中列出的任意一个。
2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述作物选自小麦、玉米、水稻、高粱、大豆、油菜任意一个。
3.一种提高作物抗旱性且不减产的方法，其特征在于：使用外源蛋白靶向结合权利要求1中所述基因内含子中的至少两个CTCTGYTY(Y＝T/C)基序，选择抗旱性提高且不减产的植株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述使用外源蛋白靶向结合基序的方法为使用无切割活性的核酸编程酶靶向结合人工选定的靶标。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的无切割活性的核酸编程酶为包含D10A和H840A突变的Cas9蛋白或Cas9蛋白变体；所述靶标选自说明书表2中列出的任意一组序列。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述作物选自小麦、玉米、水稻、高粱、大豆、油菜任意一个。
7.一种试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)能够识别权利要求1中所述基因内含子中的至少两个CTCTGYTY(Y＝T/C)基序的RNA分子；任选地，所述的RNA分子能够识别说明书表2中列出的任意一组靶标序列；
(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述RNA的载体。
8.权利要求3-6所述的方法、权利要求7所述的试剂盒在提高作物抗旱性且不减产的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述作物选自小麦、玉米、水稻、高粱、大豆、油菜任意一个。
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