CN111616048B - 一种天冬组培快繁新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药用植物组织培养领域，具体公开了一种天冬组培快繁新方法,包括以下步骤：外植体的选择：选择天冬雄株幼嫩枝芽，去掉叶片，将其剪成2～3厘米的带芽茎段；外植体的消毒：为75%酒精15～20s，饱和漂白粉溶液10～20min，0.05%升汞溶液5～7min；以及初代诱导培养、继代增殖培养和生根培养等步骤，采用的本发明的组培方法，获得生根苗，表现为矮壮、有部分叶片展开、根系中部略有膨大，天冬组培苗在驯化过程中成活率高，同时可在驯化期内形成少量块根。
Description
技术领域
本发明涉及药用植物组织培养领域，具体涉及一种天冬组培快繁新方法。
背景技术
天冬（Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.）又名天门冬，为百合科天门冬属多年生草本植物，以块根入药，有养阴润燥，清肺生津的功效，常用于治疗肺燥干咳，咽干口渴，肠燥便秘等症状，也可用作滋补品。
自2001年，天门冬的种植开始逐渐发展起来，目前主要在广西、云南、贵州等省市开始规模化种植，按目前各区域进行的种植品种分类主要分为广西小天冬以及云南大天冬。《中国药典》2015版对天冬的分种来看天冬药材的植物来源只有天冬一个种，而天门冬属植物在我国有24个种，且形态相似、差异较小、极易混淆，导致许多种植户种植的天冬很大一部分不是《中国药典》规定的品种；另外，天冬为雌雄异株植物，同品种的天冬种植3～4年后雄株产量一般比雌株高20～30%。因此，在天冬的种植上，应选择纯化的优质天冬品种进行繁殖，同时用雄株来进行种植。目前天冬主要采用种子繁殖来获得种苗，不能通过种子性状来区分各种、各品种，在品种方面可以通过母株筛选后获得纯化的优良种子，但周期极长，成本极高；而在选择雄株方面，不论是天冬种子还是天冬小种苗，均不能被识别，因此，种植过程中选择采用种子繁殖的方式选择天冬雄株按目前技术几乎不能达到。天冬还可用分株繁殖的方式来进行繁殖，此种繁殖方式的优点在于缩短种植周期（缩短1年左右），能选择优良植株进行种植，可直接筛选雄株进行种植，但其存在繁殖率低，病虫害积累严重并易导致流行，种质退化等缺点。
综上所述的天冬传统繁殖的优缺点，天冬组培技术的研究就逐步发展起来。而就目前的组培技术看，组培过程中存在增殖系数不高，增殖与分化不能同步进行，且所获得的组培苗生根率低。
发明内容
本发明的主要目的针对以上天冬传统繁殖技术的缺点以及现有组培技术的不足，提供了一种增殖系数高，增殖与分化同步进行以减少组培程序及成本，生根率高的一种天冬组培新方法。
为实现上述目的，本发明具体提供了以下技术方案：
一种天冬组培快繁新方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的选择：选择天冬雄株幼嫩枝芽，去掉叶片，将其剪成2～3厘米的带芽茎段；
（2）外植体的消毒：为75%酒精15～20s，饱和漂白粉溶液10～20min，0.05%升汞溶液5～7min；
（3）初代诱导培养，使用的初代诱导培养基为MS+NAA 0.2～0.4mg/L+2,4-D 0.05～0.2 mg/L +6-BA 1.0～3.0 mg/L +活性炭1.0 g/L +糖30 g/L；
（4）继代增殖培养，使用的继代增殖培养基为MS+NAA0.05～0.2mg/L+TDZ1.0～3.0mg/L+椰子水100～150ml/L +糖30 g/L；
（5）生根培养，使用的生根培养基为MS+NAA0.5～1.0mg/L +KT0.05～0.1 mg/L +PP333 0.4～0.8 mg/L +椰子水100～150ml/L +活性炭1.0 g/L +糖15 g/L。
进一步地，所述步骤（1）中外植体选择后，还包括外植体清洁，将剪短的外植体置于肥皂液中清洗10min，后清水冲洗2～3次至无肥皂液残留，加入1～2滴吐温-80，振摇10min，再用流水冲淋60～120min。
进一步地，所述步骤（3）中初代诱导培养还包括在温度25±2℃，前15d为暗培养，后35天以光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养。
进一步地，所述步骤（4）中继代增殖培养还包括在温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养。
根据权利要求1所述的一种天冬组培快繁新方法，其特征在于，进一步地，所述步骤（5）中生根培养还包括以温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养。
进一步地，所述步骤（3）中使用的初代诱导培养基为MS+NAA 0.2mg/L+2,4-D0.1mg/L +6-BA 1.0 mg/L +活性炭1.0 g/L +糖30 g/L。
进一步地，所述步骤（4）使用的继代增殖培养基为MS+NAA0.05mg/L+TDZ3mg/L+椰子水150ml/L +糖30 g/L。
进一步地，所述步骤（5）使用的生根培养基为MS+NAA0.5mg/L +KT0.05 mg/L +PP333 0.8 mg/L +椰子水150ml/L +活性炭1.0 g/L +糖15 g/L
本发明的有益效果在于：
（1）本发明所述的一种天冬组培快繁技术新方法，增殖过程中培养基添加了0.05～0.2mg/L NAA、1.0～3.0mg/L TDZ 以及100～150ml/L椰子水，可在增殖过程中同步形成愈伤以及从生苗，不需单独进行愈伤增殖以及愈伤分化成从生苗，为常规的天冬组培程序中减少了一个程序，从而降低了天冬组培成本；
（2）本发明所述的一种天冬组培快繁技术新方法，增殖过程中培养基添加了100～150ml/L椰子水，使其在增殖培养过程中的增殖系数从不添加椰子水的7.2升到12.5，且增殖苗色泽亮绿，能发出少许叶片；
（3）本发明所述的一种天冬组培快繁技术新方法，生根培养过程中，添加了0.4～0.8 mg/L PPP333以及100～150ml/L椰子水，与0.5～1.0mg/L NAA +0.2～1.0 mg/L KT复配使用，35天生根率可达92%，解决了天冬组培过程中生根难，生根率低的困境；
（4）本发明所述的一种天冬组培快繁技术新方法，采用的上述生根培养基配方获得生根苗，表现为矮壮、有部分叶片展开、根系中部略有膨大（有形成肉质块根的趋势），天冬组培苗在驯化过程中成活率高，同时可在驯化期内形成少量块根。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知技术将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
一种天冬组培快繁技术新方法：
外植体的选择：选择新发出来的天冬雄株幼嫩枝芽，去掉叶片，将其剪成2～3厘米的带芽茎段；然后进行外植体清洁，一般的清洁方法是将外植体置于流水下冲洗，本发明将剪短的外植体置于肥皂液中清洗10min，后清水冲洗2～3次至无肥皂液残留，加入1～2滴吐温-80，振摇10min，再用流水冲淋60～120min，采用该方法，外植体清洁度较高，后期污染率低。
外植体的消毒：将清洁后的外植体，在超净台内用75%酒精消毒15～20s，无菌水涮洗2～3次，饱和漂白粉溶液10～20min，无菌水涮洗3～4次，0.05%升汞溶液5～7min，无菌水涮洗6～8次，7天污染率为23%左右，且外植体损伤较小，无菌体系的构建是植物组织培养关键因素，对外植体的消毒包括消毒剂和消毒时间的选择（吕校石，2004），天门冬的外植体消毒采用常规的消毒剂 75%乙醇和 0.1%升汞的组合使用，发现分别浸泡 5 min 和 8 min为最适消毒时间（潘丽梅等，2012），也有认为只采用单一的 0.1%的升汞处理 7min 为最适的消毒体系。而本发明创造性的添加了饱和漂白粉溶液，并降低了升汞的浓度，减少了操作过程中，高浓度升汞挥发而对操作员产生的伤害，在灭菌降低污染率的同时，避免了过度灭菌破坏外植体的组织结构从而引起褐变，降低外植体的成活率的情况发生。具体对比试验效果数据如表1所示：
初代诱导培养：将消毒好的外植体，置于无菌吸水纸上吸取表面水分，并剪去两端伤口，平铺接种MS+NAA 0.2～0.4mg/L+2,4-D 0.05～0.2 mg/L +6-BA 1.0～3.0 mg/L +活性炭1.0 g/L +糖30 g/L初代诱导培养基上，诱导得到丛生芽和小部分愈伤组织；优选的培养基为MS+NAA 0.2mg/L+2,4-D 0.1mg/L +6-BA 1.0 mg/L +活性炭1.0 g/L +糖30 g/L，进一步地，本发明初代诱导培养的环境条件设置为温度25±2℃，前15d为暗培养，后35天以光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养，本发明50天丛生芽诱导率可达到69%左右。
继代增殖培养，将诱导出的丛生芽以及诱导出的愈伤组织，剪成1～2厘米小段或1平方厘米的带芽小块，平铺接种于MS+NAA0.05～0.2mg/L+TDZ1.0～3.0mg/L+椰子水100～150ml/L +糖30 g/L的继代培养基上进行增殖培养，优选的培养基为MS+NAA0.05mg/L+TDZ3mg/L+椰子水150ml/L +糖30 g/L，进一步地，继代增殖培养还包括在温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养，增殖培养40天增殖系数可达12.5左右（含愈伤），在增殖过程中培养基创造性添加了100～150ml/L椰子水，使其在增殖培养过程中的增殖系数从不添加椰子水的7.2升到12.5，且增殖苗色泽亮绿，能发出少许叶片，且该培养基配比可在增殖过程中同步形成愈伤以及从生苗，不需单独进行愈伤增殖以及愈伤分化成从生苗，为常规的天冬组培程序中减少了一个程序，从而降低了天冬组培成本。
生根培养，将增殖获得的丛生芽，剪成2～3厘米小段，按极性直立接种于MS+NAA0.5～1.0mg/L +KT0.05～0.1 mg/L +PP333 0.4～0.8 mg/L +椰子水100～150ml/L +活性炭1.0 g/L +糖15 g/L的生根培养基上，优选的，培养基为MS+NAA1.0mg/L +KT0.1 mg/L +PP333 0.6 mg/L +椰子水150ml/L +活性炭1.0 g/L +糖15 g/L，进一步地，生根培养还包括以温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养35天，生根率达92%左右，解决了天冬组培过程中生根难，生根率低的困境，采用的上述生根培养基配方获得生根苗，表现为矮壮、有部分叶片展开、根系中部略有膨大（有形成肉质块根的趋势），天冬组培苗在驯化过程中成活率高，同时可在驯化期内形成少量块根。具体对比试验效果数据如表2所示：
苗驯化步骤为现有技术，苗高约5 cm 时开始炼苗，移栽前先把试管苗移出培养室，闭瓶炼苗6 d，再将培养瓶盖打开，在全天自然光照、温度25 ℃的通风条件下炼苗3～5d，移栽时用镊子或玻璃棒将生根苗从培养瓶中取出，用清水洗干净根部残留培养基，移栽入已灭过菌的基质中（菜园土与河沙等体积混匀），移栽后7～10 d 内用塑料薄膜保湿，光照强度以遮光率为60％左右最为适宜，保持空气湿度在85％以上，每天喷雾1 次。
椰子水主要来源于椰子的嫩果，也叫椰青。印度等国家的一些椰子研究机构对椰子水的研究表明，椰子水中含有丰富的营养物质，椰子水蛋白质中的精氨酸、丙氨酸、胱氨酸和丝氨酸的含量比牛奶还高，游离氨基酸有17种以上，含有VC和VB类，如烟酸、泛酸、叶酸、VH、VB1、VB2等。此外，椰子水中的矿物质有Na、Ca、Fe、Mg、Cu、S、P、Cl等元素；几种能使高等植物的成熟细胞迅速而不规则分裂从而刺激植物生长的活性物质，其中有2种已被鉴别为1,3-二苯基脲和吲哚已基阿糖。椰子水中所含矿物质元素中K+、Fe2+含量最高。本发明在继代培养基和生根培养基中，特异性的添加椰子水，在一定程度上，为植物生长的培养基增添了营养元素，优化了生长环境，且椰子水中的各种氨基酸，微量元素是天然存在，促使了植物的吸收和适应性增强。
下面结合实例，对本发明做进一步的说明。本发明的实施方式包括但不限于下列实施实例。
实施例1
1、外植体的选择与清洁
选择新发出来的幼嫩茎，去掉叶片，将其剪成2～3厘米的带芽茎段，置于肥皂液中清洗10min，后清水冲洗3次至无肥皂液残留，加入1滴吐温-80，振摇10min，再用流水冲淋120min；
2、外植体的消毒
将清洁后的外植体，在超净台内用75%酒精消毒15s，无菌水涮洗2次，饱和漂白粉溶液15min，无菌水涮洗3次，0.05%升汞溶液5min，无菌水涮洗6次，7天污染率为22.3%；
3、丛生芽的诱导培养
将消毒好的外植体，置于无菌吸水纸上吸取表面水分，并剪去两端伤口，平铺接种在MS+NAA 0.2mg/L+2,4-D 0.1 mg/L +6-BA 1.0mg/L +活性炭1.0 g/L +糖30 g/L的诱导培养基上，在温度25±2℃，前15d为暗培养，后35天以光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养，50天丛生芽诱导率为71.2%，；
4、丛生芽的继代增殖培养
将诱导出的丛生芽以及诱导出的愈伤组织，剪成1～2厘米小段或1平方厘米的带芽小块，平铺接种于MS+NAA0.2mg/L + TDZ 3.0mg/L +椰子水100ml/L +糖30 g/L的增殖培养基上，在在温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养，增殖培养40天增殖系数可达11.81（含愈伤）；
5、丛生芽的生根培养
将增殖获得的丛生芽，剪成2～3厘米小段，按极性直立接种于MS+NAA0.5mg/L +KT0.05 mg/L +PP333 0.8 mg/L +椰子水150ml/L +活性炭1.0 g/L +糖15 g/L，以温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养35天，生根率达92.8%，根系粗壮且根中部略有肉质膨大，苗色泽鲜绿，部分叶片展开，下地驯化成活率达86.3%。
实施例2
1、外植体的选择与清洁
选择新发出来的幼嫩茎，去掉叶片，将其剪成2～3厘米的带芽茎段，置于肥皂液中清洗10min，后清水冲洗3次至无肥皂液残留，加入2滴吐温-80，振摇10min，再用流水冲淋60min；
2、外植体的消毒
将清洁后的外植体，在超净台内用75%酒精消毒20s，无菌水涮洗2次，饱和漂白粉溶液20min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液5min，无菌水涮洗8次，7天污染率为21.9%；
3、丛生芽的诱导培养
将消毒好的外植体，置于无菌吸水纸上吸取表面水分，并剪去两端伤口，平铺接种在MS+NAA 0.4mg/L+2,4-D 0.05 mg/L +6-BA 3.0 mg/L +活性炭1.0 g/L +糖30 g/L的诱导培养基上，在温度25±2℃，前15d为暗培养，后35天以光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养，50天丛生芽诱导率为69%，；
4、丛生芽的继代增殖培养
将诱导出的丛生芽以及诱导出的愈伤组织，剪成1～2厘米小段或1平方厘米的带芽小块，平铺接种于MS+NAA0.05mg/L + TDZ 3.0mg/L +椰子水150ml/L +糖30 g/L的增殖培养基上，在在温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养，增殖培养40天增殖系数可达13.3（含愈伤）；
5、丛生芽的生根培养
将增殖获得的丛生芽，剪成2～3厘米小段，按极性直立接种于MS+NAA1.0mg/L +KT0.1 mg/L +PP333 0.6 mg/L +椰子水150ml/L +活性炭1.0 g/L +糖15 g/L，以温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养35天，生根率达93.1%，根系粗壮且根中部略有肉质膨大，苗色泽鲜绿，部分叶片展开，下地驯化成活率达88.8%。
实施例3
1、外植体的选择与清洁
选择新发出来的幼嫩茎，去掉叶片，将其剪成2～3厘米的带芽茎段，置于肥皂液中清洗10min，后清水冲洗3次至无肥皂液残留，加入2滴吐温-80，振摇10min，再用流水冲淋60min；
2、外植体的消毒
将清洁后的外植体，在超净台内用75%酒精消毒20s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液10min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液7min，无菌水涮洗8次，7天污染率为22.1%；
3、丛生芽的诱导培养
将消毒好的外植体，置于无菌吸水纸上吸取表面水分，并剪去两端伤口，平铺接种在MS+NAA 0.3mg/L+2,4-D 0.2mg/L +6-BA 2.0 mg/L +活性炭1.0 g/L +糖30 g/L的诱导培养基上，在温度25±2℃，前15d为暗培养，后35天以光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养，50天丛生芽诱导率为70%，；
4、丛生芽的继代增殖培养
将诱导出的丛生芽以及诱导出的愈伤组织，剪成1～2厘米小段或1平方厘米的带芽小块，平铺接种于MS+NAA0.1mg/L + TDZ 2.0mg/L +椰子水150ml/L +糖30 g/L的增殖培养基上，在在温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养，增殖培养40天增殖系数可达12.5左右（含愈伤）；
5、丛生芽的生根培养
将增殖获得的丛生芽，剪成2～3厘米小段，按极性直立接种于MS+NAA1.0mg/L +KT0.1 mg/L +PP333 0.4mg/L +椰子水150ml/L +活性炭1.0 g/L +糖15 g/L，以温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养35天，生根率达91.9%，根系粗壮且根中部略有肉质膨大，苗色泽鲜绿，部分叶片展开，下地驯化成活率达87.1%。
Claims (4)
1.一种天冬组培快繁新方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的选择：选择天冬雄株幼嫩枝芽，去掉叶片，将其剪成2～3厘米的带芽茎段；将剪短的外植体置于肥皂液中清洗10min，后清水冲洗2～3次至无肥皂液残留，加入1～2滴吐温-80，振摇10min，再用流水冲淋60～120min；
（2）外植体的消毒：为75%酒精15～20s，饱和漂白粉溶液10～20min，0.05%升汞溶液5～7min；
（3）初代诱导培养，使用的初代诱导培养基为MS+NAA0.2～0.4mg/L+2,4-D0.05～0.2mg/L +6-BA 1.0～3.0 mg/L +活性炭1.0 g/L +糖30 g/L，温度25±2℃，前15d为暗培养，后35天以光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养；
（4）继代增殖培养，使用的继代增殖培养基为MS+NAA0.05～0.2mg/L+TDZ1.0～3.0mg/L+椰子水100～150ml/L +糖30 g/L，继代增殖培养还包括在温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间10h进行光暗交替培养；
（5）生根培养，使用的生根培养基为MS+NAA0.5～1.0mg/L +KT0.05～0.1 mg/L +PP3330.4～0.8 mg/L +椰子水100～150ml/L +活性炭1.0 g/L +糖15 g/L，温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养。
2.根据权利要求1所述的一种天冬组培快繁新方法，其特征在于，所述步骤（3）中使用的初代诱导培养基为MS+NAA 0.2mg/L+2,4-D 0.1mg/L +6-BA 1.0 mg/L +活性炭1.0 g/L+糖30 g/L。
3.根据权利要求1所述的一种天冬组培快繁新方法，其特征在于，所述步骤（4）使用的继代增殖培养基为MS+NAA0.05mg/L+TDZ3mg/L+椰子水150ml/L +糖30 g/L。
4.根据权利要求1所述的一种天冬组培快繁新方法，其特征在于，所述步骤（5）使用的生根培养基为MS+NAA1.0mg/L +KT0.1 mg/L +PP333 0.6 mg/L +椰子水150ml/L +活性炭1.0 g/L +糖15 g/L。
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